KOIVUN (BETULA sp.) FOLIAARISTEN SIENTEN RASVAHAPOT KIRKKAIDEN JA HUMUSPITOISTEN JÄRVIEN LITORAALISSA
JUSSI VESAMÄKI
Pro gradu -tutkielma Itä-Suomen yliopisto Ympäristö- ja biotieteiden laitos
Biologia 2020
1 ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO
Ympäristö- ja biotieteiden laitos, biologia
VESAMÄKI, JUSSI: Koivun (Betula sp.) foliaaristen sienten rasvahapot kirkkaiden ja humuspitoisten järvien litoraalissa
Pro gradu -tutkielma (40 op.), 41 s.
Helmikuu 2020
Syksyisin puista järviin putoavat lehdet tarjoavat tärkeän orgaanisen aineksen ja ravinteiden lähteen litoraalin kuluttajille ja hajottajille. Lehtien sienten rooli akvaattisessa ravintoverkossa on kuitenkin edelleen huonosti tunnettu, vaikka sienten esiintymiseen vaikuttavia tekijöitä ja hajottajamikrobiston sukkessiota on tutkittu. Erityisesti sienten rooli järvien ravintoverkoissa on tuntematon, ja tutkimuksen tavoitteena on lisätä tietoa niiden osuudesta rasvahappojen lähteenä litoraalin kuluttajille.
Tutkimuksessa vertailtiin koivun (Betula sp.) lehtien epifyyttisten ja endofyyttisten sieniyhteisöjen rasvahappokoostumuksia kolmessa humuspitoisessa ja kolmessa kirkasvetisessä järvessä. Lehtien sieniä kasvatettiin hiivamallasagarilla noin 2 kuukauden ajan.
Lisäksi vertailtiin maahan ja rantaveteen (litoraaliin) päätyneiden koivun ja lepän (Alnus sp.) fyllosfäärien (lehti mikrobistoineen) rasvahappokoostumuksia. Rasvahapot määritettiin yhdistetyillä kaasukromatografilla ja massaspektrometrilla (GC-MS). Tilastoanalyyseina käytettiin PERMANOVA:a ja Mann-Whitneyn U-testiä, ja niihin sisällytettiin ainoastaan ne rasvahapot, joita esiintyi näytteessä vähintään 1 % sen koko rasvahappokoostumuksesta.
Tulosten perusteella sieniyhteisöjen rasvahappokoostumukset eivät eroa eri järvityyppien välillä. Myöskään maahan pudonneiden ja litoraaliin päätyneiden lehtien rasvahappokoostumukset eivät eronneet. Koivun ja lepän lehtien rasvahappokoostumukset erosivat toisistaan samoin kuin koivun fyllosfäärin ja kasvatettujen sienten rasvahappokoostumukset. Epifyyttisten ja endofyyttisten sienten rasvahappokoostumus erosi lähes merkitsevästi. Ympäristömuuttujien (pH, veden lämpötila ja happipitoisuus, järven koko) ei havaittu vaikuttavan lehtien eikä sieniyhteisöjen rasvahappokoostumuksiin. Eroja ja eroamattomuutta selittävät osin pieni näytekoko. Tutkimuksen tulokset ovatkin vasta alustavia, mutta tarjoavat silti tärkeää osviittaa myöhemmille jatkotutkimuksille.
Välttämättömistä rasvahapoista linoleenihappoa (LIN) esiintyi sekä epifyyttisillä että endofyyttisillä sienillä ja koivun fyllosfäärissä. α-linoleenihappoa (ALA) esiintyi ainoastaan koivun fyllosfäärissä. Endofyyttisienillä esiintyi arakidonihappoa (ARA) ja dokosaheksaeenihappoa (DHA), mutta näitä havaittiin vain yhdestä näytteestä Sompalammesta. Endofyyttisienillä esiintyi monipuolisemmin eri rasvahappoja (27) kuin epifyyteillä (15). Fyllosfäärissä kummallakin lajilla runsaimpina esiintyivät tyydyttyneet rasvat, kun taas sienillä runsain ryhmä olivat kertatyydyttymättömät.
2 UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND
Department of Environmental and Biological Sciences, biology
VESAMÄKI, JUSSI: Fatty acids of birch´s (Betula sp.) foliar fungi in littoral zones of clear and humic lakes
Master´s Thesis (40 cp.), 41 pp.
February 2020
Autumn leaves drift into lakes and offer an important source of organic matter and nutrients to consumers and decomposers in littoral zones. Role of foliar fungi in aquatic food web remains poorly understood although factors affecting their occurrence and microbial succession in and on detritus have been studied. In particular, the role of fungi in lake food web is unknown. Aim of the study is to increase knowledge about their role as a source of fatty acids (FA) for consumers in littoral zone.
In the research, FA compositions of epiphytic and endophytic fungi of birch (Betula sp.) leaves in three humic and three clear-water lake were compared. In addition, littoral and terrestrial FA compositions of phyllospheres (a leaf with its microbiome) of birch and alder (Alnus sp.) were compared. Foliar fungi were cultivated on yeast-malt agar for approximately two months. FAs were identified by gas chromatography and mass spectrometry (GC-MS). For statistical analysis, PERMANOVA and Mann-Whitney´s U-test were used. Only FAs that covered at least 1 % of total FA composition were included.
As a result, FA compositions of fungal communities did not differ between clear-water and humic lakes. In addition, there was no significant difference in FA compositions between leaves from littoral zone or shore. FA compositions of birch and alder were different, as well as FA composition of birch phyllosphere and cultivated fungi. FA compositions of epiphytic and endophytic fungi were almost significantly different. Environmental variables (pH, water temperature, water oxygen concentration and lake size) had no significant effect on neither FA composition of leaves nor fungal communities. Both the differences and lack of them can be partly explained by small amount of samples. Indeed, results of the research are only tentative but they still shed important light on further studies.
Linoleic acid (LIN) was detected both in epiphytic and endophytic fungi and birch´s phyllosphere. Instead, α-linoleic (ALA) acid was observed only in birch´s phyllosphere.
Arachidonic acid (ARA) and docosahexaenoic acid (DHA) were found from endophytic fungi but only from one sample from lake Sompalampi. As a total, FA compositions of endophytic fungi were more diverse (27 different FA) than epiphytic fungi (15 different FA). Within the both birch´s and alder´s phyllosphere, saturated FAs were the most abundant group, whereas monounsaturated FAs were the most abundant group within foliar fungi.
3 SISÄLLYSLUETTELO
1 JOHDANTO……….4
2 AKVAATTISET SIENET RAVINTOVERKOSSA………5
2.1 Kirkkaiden ja humuspitoisten järvien litoraalivyöhykkeet elinympäristöinä………5
2.2 ”Akvaattiset” sienet………..…6
2.2.1 Primäärit ja sekundääriset akvaattiset sienet……….7
2.2.2 Foliaariset sienet………...………....9
2.2.2.1 Epifyyttiset sienet………...………..9
2.2.2.2 Endofyyttiset sienet………...……….10
2.3 Rasvahappojen merkitys ravintoverkossa………...12
2.3.1 Akvaattisten sienten rasvahapot ja rooli ravintoverkossa……….…..…….13
2.3.2 Foliaaristen sienten rasvahapot………...15
3 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET………..17
4 MATERIAALIT JA MENETELMÄT………...17
4.1 Näytteiden kerääminen………...17
4.2 Sienten viljely………...…..18
4.3 Rasvahappoanalyysi………...20
4.4 Tilastolliset menetelmät………..21
5 TULOKSET………...22
5.1 Sienten viljely……….22
5.2 Fyllosfääri………...25
6 TULOSTEN TARKASTELU………31
6.1 Sienten viljely……….31
6.2 Foliaaristen sienten ravintoarvot……….32
6.3 Terrestrisen ja akvaattisen rasvahappokoostumuksen erot……….34
6.4 Humuspitoisten ja kirkasvetisten järvien rasvahapot………..35
7 JOHTOPÄÄTÖKSET………36
KIITOKSET………..37
LÄHDELUETTELO……….38
4 1 JOHDANTO
Litoraalivyöhyke on rannan ja ulappa-alueen (pelaginen vyöhyke) väliin jäävä alue, jossa kasvit kykenevät edelleen yhteyttämään (Wurzbacher ym. 2010). Litoraalivyöhykkeen laajuus vaihtelee järvikohtaisesti, sillä siihen vaikuttavat muiden muassa järven syvyys, muoto, kirkkaus ja koko (Wetzel 1990). Litoraalissa biodiversiteetti on runsasta ja energiavirrat muita järven osia suurempia, johtuen paitsi litoraalin eliöiden omasta tuotannosta myös rannoilta saatavasta alloktonisesta aineksesta (Jeppesen ym. 1997). Näiden tekijöiden takia litoraalivyöhyke on merkittävä koko järviekosysteemin ravintoverkkojen kannalta. Suuri orgaanisen aineksen määrä litoraalivyöhykkeellä tarjoaa suotuisan habitaatin sienille ja sienenkaltaisille eliöille (Wurzbacher ym. 2010). Bakteerien kanssa ne osallistuvat ravinnekiertoihin ja orgaanisen aineksen hajotukseen ollen tärkeitä ekosysteemin toiminnalle.
Siitä huolimatta akvaattisten sienten rooli järvissä on sangen vähän tutkittu aihe limnologisessa tutkimuksessa.
Koivu (Betula sp.) ja leppä (Alnus sp.) ovat yleisiä puita boreaalisella vyöhykkeellä (Global Biodiversity Information Facility 2020), ja niiden putoavat lehdet tarjoavat vesiekosysteemeihin päätyessään tärkeän ravintoaineiden ja energian lähteen. Jo boreaalisen vyöhykkeen laajuuden ja koivun ja lepän yleisyyden takia mikrobien vaikutuksia lehtien ravintoarvoihin on syytä tutkia, mutta sienten ravintoarvojen tunteminen on välttämätöntä myös paremman ymmärryksen saamiseksi ravintoverkon dynamiikasta ja sienten roolista ravintoverkossa, sillä mikrobien rasvahapot voivat vaikuttaa pohjaeläinten kautta kalojen rasvahappokoostumuksiin ja näin ollen edelleen ihmisten ravintoon. Lisäksi järveen päätyvien lehtien määrä on ekosysteemien kannalta merkittävä ja voi sisältää eliöille välttämättömiä rasvahappoja kuten α-linoleenihappoa (ALA) tai linoleenihappoa (LIN).
Lehti toimii paitsi suorana ravintona pohjaeläimille, myös kasvualustana muiden muassa leville, sienille ja bakteereille. Lehdellä on kuitenkin jo ennen veteen päätymistä oma mikrobiyhteisönsä, mikä vaikuttaa hajotusprosessiin (Taube ym. 2018). Esimerkiksi koivun lehdellä voi esiintyä useita kymmeniä samojen ja eri endofyyttisienten muodostamia tartunta- alueita (Timonen & Valkonen 2018) ja näiden lisäksi lehden pinnalla kasvavia epifyyttisieniä.
Lehden ravintoarvot voivat muuttua vesiekosysteemiin päätymisen jälkeen mikrobiston muuttuessa. Tärkein lehden ravintoarvoja lisäävä eliöryhmä on lehden pinnalla kasvava leväbiofilmi, mutta myös muiden mikrobien, kuten sienten, muodostama yhteisö voi muuttua vedessä. Mikrobiston muutos heijastunee suoraan lehden tarjoamiin rasvahappoihin ja muihin ravintoarvoihin. Ravintoarvojen kannalta mikrobiyhteisön muutos ei kuitenkaan välttämättä ole
5
kvantitatiivisesti yhtä merkitsevä kuin levien suhteen, sillä jotkin mikrobit voivat kuitenkin kyetä jatkamaan kasvuaan ja toimintaansa myös vedessä. Toisaalta mikrobiyhteisön rasvahappojen kvalitatiivinen muutos voi olla tärkeä eliöille, mikäli välttämättömiä rasvahappoja tuottavat mikrobit yleistyvät.
2 SIENET AKVAATTISESSA RAVINTOVERKOSSA
2.1 Kirkkaiden ja humuspitoisten järvien litoraalivyöhykkeet elinympäristönä
Humusjärvet ovat yleisiä boreaalisella vyöhykkeellä (Vesterinen 2017), ja ne ovat myös Suomessa yleisin järvityyppi (Kortelainen 1993, Rantakari ym. 2004). Humusjärvissä esiintyy ympäristöstä järveen valuneita humusaineita, jotka antavat järville niille tyypillisen värin ja happamoittavat vettä (Hessen & Tranvik 1998). Humusaineet jaetaan liukoisuutensa mukaan humushappoihin, fulvohappoihin ja humiineihin (Stevenson 1982, Timonen & Valkonen 2018). Vedessä ne ovat joko liuenneina, kolloideina tai kiinteänä aineksena. Humusaineet sitovat typpeä ja fosforia itseensä, ja suhteellisen korkeat fosforipitoisuudet ovatkin humusjärvissä tavallisia (Hessen & Tranvik 1998). Nämä eivät kuitenkaan ole välttämättä eliöille käyttökelpoisessa muodossa, ja fosfori onkin usein planktonin kasvua rajoittava tekijä.
Kirkkaissa järvissä fosforin kierto on nopeampaa, ja eliöt saavat näin ollen systeemiin saapuvan fosforin nopeammin käyttöönsä.
Humuspitoisissa järvissä tuottajien määrä on kirkkaita vähäisempi, johtuen vähäisemmästä systeemiin saapuvan valon määrästä (Seekell et al. 2015), ja heterotrofia onkin humusjärvissä yleisempää kuin kirkkaammissa järvissä (Jansson ym. 2007). Toisaalta kesällä pinnassa olevien typen ja fosforin sekä tuottajien määrän on havaittu olevan korkeampi humusjärvissä kuin kirkkaissa järvissä (Nürnberg & Shaw 1998, Bergström & Karlsson 2019). Tuottavuuden kannalta humusjärvet ovat kiinnostava ekosysteemi, sillä systeemiin sitoutuvan energian lähde voi olla joko auringon valoenergia tai alloktonisen aineksen hajotuksesta vapautuva energia (Hessen & Tranvik 1998). Näin ollen systeemiin voidaan saada energiaa myös muuten kuin tuottajien kautta, mikä puolestaan on pääasiallinen keino kirkasvetisissä järvissä. Eroja tuottavuudessa löytyy myös litoraalin ja pelagiaalin välillä vesikasvien ja pohjalevien ollessa tärkeimpiä tuottajia litoraalissa ja kasviplanktonin pelagiaalissa (Vesterinen 2017).
Benthos on vesisysteemin pohjalla elävien eliöiden muodostama yhteisö (Lampert &
Sommer 2007). Humusjärvien litoraalivyöhykkeillä benthoksen biomassa on alhainen verrattuna muihin järven osiin, mistä syystä litoraalin merkitystä järven toiminnalle ei ole
6
pidetty yhtä tärkeänä (Vesterinen 2017). Kuitenkin litoraalin levistä ja vesikasveista muodostuva tuottajayhteisö ja auto- ja alloktonisen aineksen päätyminen sinne tekevät siitä rikkaan elinympäristön. Alloktoninen aines lisää käytettävien substraattien määrää hajottajille, mikä lisännee järven heterotrofiaa. Tämä voikin olla huomattavan tärkeä tekijä tutkittaessa järvien tuottavuuden vuodenaikaisvaihteluita. Kesäisin lisääntyvä järven nettoautotrofia voisikin saada hyvin jyrkän kontrastin syksyn valtavan alloktonisen aineksen määrän vuoksi ja muuttaa hetkellisesti järven dynamiikkaa.
Alloktoninen aines tarjoaa hajottajille ja kuluttajille tärkeän energian ja ravinteiden lähteen.
Alloktonisen orgaanisen aineksen merkityksen on havaittu olevan vähäisempi suurissa kirkasvetisissä järvissä kuin pienissä humusjärvissä (Pace ym. 2007). Järven koko vaikuttaakin siihen, kuinka suuri merkitys alloktonisella aineksella on järven ravintoverkkoon. Pienissä järvissä alloktonisen aineksen merkitys on kasvaa, koska saatavan orgaanisen aineksen määrä järven tilavuutta kohti on suurempi. Toisaalta systeemiin saapuva orgaaninen aines voidaan käsitellä ja hyödyntää perusteellisemmin suurissa järvissä.
Happamissa vesissä sienten osuus mikrobistosta kasvaa (Wurzbacher ym. 2010, Taube ym.
2018). Etenkin soiden järvissä, joissa on runsaasti orgaanista ainetta ja pH alhainen, on havaittu monimuotoista sienilajistoa. Järvityypistä huolimatta eri mikrobit hyödyntävät energianlähteenään erilaisia orgaanisten ainesten partikkeleja (Danger ym. 2016, Taube ym.
2018). Orgaanisen aineksen laatu ja alkuperä määräävätkin paljolti, millainen mikrobisto järvessä on (Taube ym. 2018). Koska humusaineet happamoittavat järviä, on kuitenkin hankala arvioida, vaikuttaako sienten runsastumiseen humusaineiden korkeampi määrä itsessään, alhainen pH vai näiden yhteisvaikutus. Lisäksi arviointia hankaloittaa muidenkin ympäristötekijöiden vaikutus. Korkeissa lämpötiloissa esimerkiksi orgaanisen aineksen laadun merkitys on sienille vähäisempi kuin matalammissa lämpötiloissa (Fernandes ym. 2012).
2.2 ”Akvaattiset” sienet
Dick (1971) jakoi järviin päätyvät sienet aktiivisiin ja inaktiivisiin. Sekä aktiiviset että inaktiiviset sienet toimisivat ravintona sekasyöjille ja benthoksen kuluttajille kuten karikkeen syöjille. Aktiiviset sienet voisivat tämän lisäksi kyetä lisääntymään ja tuottamaan itiöitä vedessä. Termi ”akvaattiset sienet” vastaa pitkälti aktiivisten sienten käsitettä, ja tässä tutkimuksessa sitä käytetäänkin kuvaamaan sieniä, jotka kykenevät selviytymään ja elämään vedessä. Akvaattisiksi lajeiksi ei siis katsota lajeja, jotka kuolevat tai katoavat lyhyen ajan päästä veteen päädyttyään, mikä vastaa paljolti Dickin (1971) inaktiivisten sienten käsitettä.
7
Jako akvaattisiin ja terrestrisiin sieniin on häilyvä, sillä osa lajeista kykenee elämään kummassa tahansa habitaatissa (Wurzbacher ym. 2010). Esimerkiksi lehdellä endofyyttisenä eläviä sieniä on löydetty järvistä, ja vastaavasti akvaattisina pidettyjä lajeja terrestrisestä ympäristöstä (Chauvet ym. 2016). Tästä syystä termin ”amfibiset sienet” on esitetty olevan kuvaavampi (Michaelides & Kendrick 1978), mutta akvaattisten sienten käsite on kuitenkin laajemmassa käytössä, vaikkeivat kaikki akvaattisiksi kutsutut lajit olekaan niin sanotusti aidosti akvaattisia. On myös tärkeää tiedostaa, että akvaattiset sienet ovat ekologinen luokka, eivätkä ne kuulu tiettyyn fylogeneettiseen ryhmään. Pääosin akvaattiset sienet kuuluvat Ascomycota-kaareen, mutta myös Basidiomycota- ja Zygomycota -kaarien sieniä on havaittu esiintyvän seisovissa vesissä (Carvalho & Caramujo 2014).
Akvaattisten sienten tutkimuksissa keskitytään usein vain harvoihin ryhmiin, mikä on ongelmallista niiden monimuotoisuuden ja ekologisen roolin tuntemisen kannalta (Wurzbacher ym. 2010). Molekulaariset analyysit voivat lisätä monimuotoisuuden tuntemusta, mutta myös muita menetelmiä kuten rasvahappo- ja isotooppianalyyseja tarvitaan akvaattisten sienten roolien tunnistamiseksi.
2.2.1 Primäärit ja sekundääriset akvaattiset sienet
Akvaattiset sienet voidaan jakaa karkeasti kahteen luokkaan: primäärisesti ja sekundäärisesti vedessä elämiseen sopeutuneisiin (Wurzbacher ym. 2010). Ensimmäiseen luokkaan kuuluvat lähinnä piiskasiimasienet, kun jälkimmäiseen ryhmään lukeutuvat muun muassa Hyphomycetes-luokan sienet ja hiivat. Myös foliaariset sienet (ks. kohta 2.2.2), jotka selviytyvät vesiympäristössä, voidaan lukea sekundäärisiin akvattisiin sieniin. Hyphomycetes- luokan sienet käyttävät vesiympäristöä lähinnä levittäytymiseen ennemmin kuin elinympäristöksi, sillä ne tarvitsevat kiinteän kasvualustan kuten järven pohjalle painuvat kuolleet eliöt tai niiden osat eli detrituksen. Luokkaan kuuluu kuitenkin ekolokeroltaan hyvin erilaisesti sopeutuneita lajeja, joista osa tuottaa konidioita terrestrisessä ympäristössä, ja jotkin Hyphomycetes-luokan sienet voivat olla jopa endofyyttisiä (Chauvet ym. 2016). Hiivat sen sijaan eivät vaadi detritusta kasvualustakseen, vaan ne voivat elää vapaana vedessä, joskin niiden määrät ovat huomattavan alhaisia verrattuna bakteerien solumääriin (Wurzbacher ym.
2010).
Hyphomycetes-luokan sienet voivat olla hyvinkin runsaita detrituksella. Virtaavissa vesissä niiden on havaittu kattavan jopa 7-18 % kokonaisbiomassasta kuolleella lehdellä (Gessner &
Chauvet 1994). Sen sijaan Pyreneiden niemimaalla sijaitsevissa kuuden lammen sedimenteissä
8
ja vapaana vedessä esiintyvien sienten osuuden on havaittu olevan vain sen sijaan 1–5 % mikrobistosta (Carvalho & Caramujo 2014), mikä viittaisi detrituksen tarjoavan sienille vesisysteemissä otollisimmat kasvuolosuhteet, joissa ne kykenevät kilpailemaan nopeammin lisääntyvien bakteerien kanssa. Hyphomycetes-luokan sienten itiöitä on myös havaittu puiden lehdiltä lehtien ollessa vielä puussa, mikä antanee niille kilpailuetua hajotusprosessissa lehden pudottua (Bärlocher & Kendrick 1974).
Sienet ja bakteerit kilpailevat samoista resursseista, ja niiden on havaittu heikentävän voimakkaasti toistensa kasvua hajotettavalla järviruo´on (Phragmites australis) lehdellä (Mille- Lindblom & Tranvik 2003). Ravinne- ja elintilakilpailun lisäksi bakteerit voivat heikentää sienen kasvua erittämillään yhdisteillä. Bakteerien läsnäolon on havaittu myös vähentävän sienen omaa eksoentsyymituotantoa (Baschien ym. 2009). Antagonistisesta suhteesta huolimatta Mille-Lindblom & Tranvik (2003) havaitsivat, ettei vapautuvan hiilen määrä poikennut eri hajottajien ja näiden yhdistelmän välillä. Sienten biomassa kasvoi jopa 12- kertaiseksi bakteerittomalla lehdellä, mikä saattaa osoittaa sienten olevan tehokkaita kasvamaan, mutta heikkoja kilpailemaan.
Sienten osuus mikrobistosta on tavallisesti melko alhainen bakteerien osuuteen verrattuna.
Sopivat olosuhteet voivat kuitenkin suosia sieniä hajottajina, jolloin niiden osuus hajottajayhteisössä kasvaa. Sienet kykenevät esimerkiksi käyttämään hankalasti saatavilla olevia ravinteita hyväkseen bakteereja paremmin (Wurzbacher ym. 2010, Taube ym. 2018).
Sienten ja bakteerien suhde on myös paljolti riippuvainen substraatista, jota se käyttää ravinteiden lähteenään. Lehden hajotusaste ja C:N:P-suhde vaikuttaa vahvasti siihen, kumpi eliöryhmä dominoi missäkin hajotussukkession vaiheessa (Danger ym. 2016). Lisäksi akvaattiset sienet ovat suhteellisen runsaita muun muassa biofilmeillä, pinnoilla, leväsoluissa, ja liikkumattomassa vedessä. Näin ollen sienten merkitys järvissä saattaisi olla suhteessa korkeampi verrattuna virtaaviin vesiin. Virtaavissa vesissä sienten on havaittu olevan myös bakteereja yleisempiä karikkeen hajotuksen varhaisessa vaiheessa hiilen suhteellisen osuuden ollessa korkea typen ja fosforin osuuksiin nähden (Bärlocher & Kendrick 1974, Danger ym.
2016). Sienten on lisäksi havaittu dominoivan alhaisemmissa lämpötiloissa (Bärlocher &
Kendrick 1974) ja olevan erityisen tärkeässä roolissa happamassa ja humuspitoisessa vedessä (Grossart ym. 2016). Sen sijaan hapen vähenemisen on virtaavissa vesissä havaittu heikentävän Hyphomycetes-luokan sienten kasvua, joskin jotkin lajit onnistuivat kasvamaan jopa vain 4 % hapekkuudessa (Medeiros ym. 2009).
Piiskasiimasienet ovat yksi tutkituimmista akvaattisista sieniryhmistä. Piiskasiimasienet aiheuttavat tauteja paitsi kasviplanktonille myös monille selkärangattomille, jotka ovat edelleen
9
ravintoa korkeammille trofiatasoille (Gleason ym. 2008). Piiskasiimasienet toimivat myös hajottajina, ja lisäävät ravinteiden saatavuutta pohjaeläimille hajottamalla detritusta. Gleason ym. (2008) huomauttavat, että piiskasiimasienten tunnistamisen pitäisi olla tarkempaa tutkimuksissa tarkemman taksonikohtaisten roolien selvittämiseksi. Molekulaariset metodit voisivatkin lisätä piiskasiimasienten paitsi taksonomista myös ekologista tuntemusta.
2.2.2 Foliaariset sienet
Fyllosfääri tarkoittaa elävää lehteä mikrobistoineen (Osono 2014). Foliaariset sienet puolestaan on tässä tutkimuksessa käytetty yhteisnimitys sienille, jotka elävät osan elinkierrostaan lehden pinnalla epifyyttinä tai lehden solukossa endofyyttinä (mukaillen Timosen & Valkosen (2018) endofyyttisienen määritelmää). Kummankin ryhmän edustajat sisältävät pääasiassa Ascomycota-kaaren edustajia.
Lehden pudotessa foliaarisilla sienillä on etulyöntiasema hajotusprosessissa (Timonen &
Valkonen 2018). Suurin osa niistä korvautuu kuitenkin pian muiden nopeakasvuisten hajottajien kolonisoidessa lehden, joskin jotkin sienilajit voivat esiintyä edelleen myöhemmissä hajotuksen vaiheissa (Osono 2006). Helpoiten hajotettavista orgaanisista aineista otetaan ensimmäisenä energia talteen. Hankalasti käytettävien yhdisteiden, kuten ligniinin, jäädessä jäljelle yleistyvät vastaavasti muut sienet. Yleistettynä voidaan sanoa, että sienet pystyvät hyödyntämään hankalasti saatavia ravinteita bakteereja paremmin (Wurzbacher 2010, Taube ym. 2018).
2.2.2.1 Epifyyttisienet
Epifyyttiset sienet leviävät lehden pinnalle ympäristöstä leviävillä itiöillä (Timonen &
Valkonen 2018). Ympäristö vaikuttaakin suoraan lehden epifyyttilajistoon. Toisaalta epifyyttiset sienet eivät ole kuitenkaan yhtä usein isäntäspesifejä kuin endofyytit, kuten havaittiin mangrovepuilla tehdyssä tutkimuksessa (Yao ym. 2019).
Epifyyttisienillä on monenlaisia ekolokeroita - osa on loisia, osa mutualisteja ja osa kommensalisteja (Timonen & Valkonen 2018). Epifyyttien mutualistinen hyöty voi olla yksinkertaisesti se, että ne vievät elintilaa taudinaiheuttajilta kolonisoimalla lehden pinnan.
Patogeeniset epifyytit voivat tappaa kasvin solukkoa ja ryhtyä myöhemmin hajottamaan sitä.
Loisivat epifyytit voivat kasvattaa kasvisoluihin tunkeutuvia rihmoja, joiden avulla ne ottavat
10
kasvin orgaanisia yhdisteitä käyttöönsä. Muut kuin patogeeniset ja parasiittiset epifyyttisienet saavat kasvuunsa tarvitsemansa ravinteet puolestaan esimerkiksi sadeveden orgaanisista yhdisteistä, siitepölystä tai eliöiden eritteistä.
Pinnalla eläminen altistaa epifyytit endofyyttejä enemmän alttiiksi ympäristöstä tuleville bioottisille ja abioottisille tekijöille (Timonen & Valkonen 2018). Monilla epifyyteillä onkin keinoja suojautua esimerkiksi säteilyä vastaan. Toisaalta monet epifyyttisienet reagoivat herkästi ilmansaasteisiin. Voikin olla, että veteen joutuminen olisi useimmille epifyyteille liian radikaali muutos, ja ne korvautuisivat nopeasti muulla lajistolla. Maahan pudotessaan ne saattaisivat sen sijaan säilyttää elintilansa ja kyetä jatkamaan kasvua esimerkiksi mukautumalla hajottajan rooliin.
2.2.2.2 Endofyyttisienet
Endofyyttiset sienet ovat ekologialtaan monimuotoisia: ne voivat olla esimerkiksi parasiitteja, mutualisteja tai kommensalisteja (Timonen & Valkonen 2018). Endofyyttisyys voi myös olla joillakin lajeilla vain elinkierron vaihe, josta sieni leviää myöhemmin toisaalle. Tätä kutsutaan endofyyttiseksi jatkumoksi (Sieber 2007). Esimerkiksi ympäristöolosuhteiden muutos voi vaikuttaa endofyyttien rooliin: esimerkiksi kommensalistina elänyt sieni voi alkaa solukon kuollessa hajottajaksi tai mutualistinen sieni voi alkaa kuivuuden seurauksena loisia isäntäkasvissaan (Timonen & Valkonen 2018). Endofyyttien kasvia hyödyttävä vaikutus voi olla kasvin vastustuskykyä lisäävä vaikutus kuivuutta ja taudinaiheuttajia vastaan (Gao ym.
2010, Yao ym. 2019) ja kasvin kasvun kiihtyminen siinä osassa, jossa sieni esiintyy (Gao ym.
2010) ja puun fotosynteesitehokkuuden parantaminen (Arnold ym. 2003). Endofyytit voivat myös erittää mykotoksiineja, jotka vähentävät herbivoriaa (Timonen & Valkonen 2018).
Toisaalta endofyytit voinevat myös lisätä lehden ravintoarvoa tarjoamalla monipuolisemman ravintoaineiden lähteen. Eri sienillä voikin olla monenlaisia etuja ja haittoja ravintoarvojen kannalta, ja tällä voi olla vaikutusta siihen, miten järven pohjaeläimet käyttävät lehteä ravinnokseen.
Endofyyttisienet voivat olla isäntäspesifejä tai generalisteja (Saikkonen 2007).
Isäntäspesifisyys lienee yleisempää alueilla, joissa puulajien monimuotoisuus on riittävän matala sienen leviämisen onnistumiseksi. Endofyyttisienten arvellaan kehittyneen taudinaiheuttajasienistä (Timonen & Valkonen 2018). Isäntäkasvin ja endofyytin pitkän yhteisen evoluution takia patogeenisuuden on esitetty olevan kuitenkin harvinaista ja tapahtuvan lähinnä poikkeuksellisissa ympäristöoloissa, joissa kasvin puolustuskyky heikkenee
11
(Sieber 2007). Yleisimmät tauteja aiheuttavat endofyytit ovatkin usein opportunisteja. Vaikka monet endofyytit voivat olla isäntäspesifejä, niiden joustavuus elinympäristön suhteen voi olla suurta, sillä endofyyttisieniä on havaittu esiintyvän myös järvissä (Wurzbacher ym. 2010).
Jotkin Hyphomycetes-luokan sienet voivat esiintyä mutualistisina endofyytteinä (Chauvet ym.
2016), ja nämä voisivatkin olla sopeutuneet sekundäärisesti akvaattiseen ympäristöön. Niin sanottujen aidosti terrestristen endofyyttien mukautumisesta akvaattiseen ympäristöön ei kuitenkaan ole tietoa.
Endofyyttisten sienten lajisto voi loppukesästä olla erityisen runsasta (Timonen & Valkonen 2018). Endofyyttien lajiston määräytymiseen vaikuttavat muun muassa sienten leviämistapa (horisontaalinen vs. vertikaalinen). Vertikaalisesti leviävät endofyytit puolestaan leviävät muodostuvan siemenen mukana (Timonen & Valkonen 2018). Vertikaalisesti leviävillä endofyyteillä on usein pitkä yhteisevoluutio isäntäkasvinsa kanssa, mistä syystä ne ovat usein mutualistisessa suhteessa isäntäkasvinsa kanssa (Faeth & Fagan 2002). Horisontaalisesti leviävien lajien on sen sijaan levitettävä itiönsä kasvukauden aikana seuraavaan isäntäpuuhun, mikä altistaa ne ympäristön bioottisille ja abioottisille muutoksille (Helander ym. 2006).
Horisontaalisesti leviävien endofyyttien on tunnistettava isäntäkasvinsa ja läpäistävä sen puolustus. Tunnistus tapahtuu lektiinin kaltaisilla proteiineilla (Sieber 2007). Tunnistettuaan sopivan kasvuympäristön sienen itiöstä kasvaa lehden pinnalle iturihma, jonka kärkeen muodostuvan painerihman avulla se tunkeutuu lehden vahakerroksen läpi ja kiinnittyy lehteen (Timonen & Valkonen 2018). Painerihmasta kasvaa lehden solukkoon edelleen tartuntapiikki.
Tunkeuduttuaan kasvin solukkoon endofyytti aloittaa niin kutsutun hiljaisen vaiheen, jolloin se ei aiheuta kasville haittaa eikä ulkoisia oireita (Sieber 2007). Mahdollinen patogeeninen vaihe tulee myöhemmin, mikäli ympäristöolot luovat painetta siihen.
Toisin kuin epifyyttien, endofyyttien ravintoarvot eivät päädy lehden biofilmiä ravintonaan käyttäville kuluttajille, ellei endofyyttinen sieni ympäristöolojen seurauksena ala muodostaa lehden pinnalle ulottuvaa kasvustoa. Endofyyttiset sienet päätyvätkin akvaattisessa systeemissä oletettavasti ainoastaan niiden pohjaeläinten käyttöön, jotka hyödyntävät lehden koko kasvisolukkoa ravintonaan. Tämä vaatinee muun muassa sopivia suuosarakenteita pohjaeläimiltä, mikä rajoittanee endofyyttisten sienten ravintoarvojen hyödyntämismahdollisuuksia pohjaeläinten keskuudessa. Biofilmien syöjille epifyytit lienevätkin endofyyttejä merkittävämpi ravintolähde.
Endofyyttien runsaus ja monimuotoisuus, sekundäärimetaboliittien tuotanto ja kyky mukautua erilaisiin ympäristöihin muuttamalla ekolokeroaan tekee niistä huomionarvoisen kohteen akvaattisessa tutkimuksessa. Tästä huolimatta aihe on hyvin puutteellisesti tunnettu, ja
12
kaipaa kipeästi lisätietoa. Tämä tutkimus onkin yksi harvoista aiheeseen keskittyvistä julkaisuista, antaen osviittaa tuleville alan tutkimuksille.
2.3 Rasvahappojen merkitys ravintoverkossa
Rasvat ovat veteen huonosti liukenevia hiilivety-yhdisteitä (Gurr ym. 2002). Rasvat vaikuttavat solun fysiologiaan ja toimintaan, mikä selittää joidenkin mikrobien kykyä sopeutua ääriolosuhteisiin kuten kuumuuteen tai korkeaan suolaisuuteen (Ratledge 1994). Erilaisia rasvoja ovat muun muassa energiavarastoina toimivat triasyyliglyserolit ja rakenteellisina rasvoina toimivat fosfolipidit (Arts ym. 2009). Triasyyliglyserolissa esiintyy yhtä, kahta tai kolmea eri rasvahappoa, kun taas fosfolipideissa vain yhtä tai kahta. Rasvahapoilla on ekosysteemissä merkittävä rooli, sillä eliöt tarvitsevat rasvahappoja muun muassa energianlähteinä, solujen rakenneosina, biomolekyylien esiasteina ja viestinviejämolekyyleinä (Arts ym. 2009). Rasvahapoilla on myös olennainen rooli ravintoverkossa, jossa ne ovat tärkeä ravinnon laatua määrittävä tekijä. Tutkimuksissa rasvahappoja on hyödynnetty muun muassa mikrobitutkimuksessa biomassan arvioinnissa (mm. Frostegård & Bååth 1996) ja sienten ja bakteerien tunnistuksessa (mm. Stahl & Klug 1996).
Tyydyttyneiden rasvahappojen (SAFA) hiiliketjussa on ainoastaan yksinkertaisia sidoksia hiilten välillä, ja niitä käytetään pääasiassa energianlähteinä ja -varastoina (Goncalves ym.
2017). Kertatyydyttymättömillä rasvahapoilla (MUFA) puolestaan on hiiliketjussaan yksi kaksoissidos. Lähes kaikki eliöt pystyvät syntetisoimaan MUFA:a oman metaboliansa avulla yksinkertaisemmista molekyyleista. Monityydyttymättömillä rasvahapoilla (PUFA) on kaksi tai useampia kaksoissidoksia hiiliketjussaan. Eläimillä ne vaikuttavat solukalvon ominaisuuksiin ja toimivat hormonien esiasteina (Brett & Müller-Navarra 1997).
Ekosysteemitasolla monityydyttymättömien rasvahappojen, mukaan lukien välttämättömien rasvahappojen, synteesi tapahtuu pääosin kasveissa, ja eläinten onkin saatava PUFA:a ravinnosta
Välttämättömiä rasvahappoja ovat rasvahapot, joita tarkasteltava eliö ei kykene itse tuottamaan de novo (Goncalves ym. 2017). Useimmiten tärkeistä rasvahapoista puhuttaessa tarkoitetaan ihmiselle välttämättömiä rasvahappoja kuten linoleenihappoa (LIN), α- linoleenihappoa (ALA), eikosapentaeenihappoa (EPA) ja dokosaheksaeenihappoa (DHA).
Välttämättömien rasvahappojen lähteitä ovat esimerkiksi järven leväyhteisö, kasvit ja bakteerit.
Ihminen saa välttämättömiä rasvahappoja pääosin akvaattista alkuperää olevasta ruoasta (Gladyshev ym. 2013), mutta myös teollisesti tuotetuista valmisteista ja ravintolisistä (Arts ym.
13
2001). Erityisesti DHA:n ja EPA:n saanti on tärkeää, sillä normaalin metabolian lisäksi ne vaikuttavat aivojen toimintaan ja voivat ehkäistä sairauksia (Dyal & Narine 2005, Jiao ym.
2014). Edellä mainitut välttämättömät rasvahapot ovat välttämättömiä myös akvaattisen ekosysteemin kuluttajille (Goncalves ym. 2017). Esimerkiksi vesikirpun (Daphnia magna) kasvua on havaittu rajoittavan sen ravinnosta saaman EPA:n määrä (Müller-Navarra 1995).
Jotkin kuluttajat kykenevät muokkaamaan ravinnostaan saamiaan rasvahappoja pidentämällä ALA-hiiliketjun pituutta ja muokkaamalla kaksoissidosten määriä (Brett & Müller-Navarra 1997), mutta muokkaus on vähäistä eikä riitä yksin täyttämään muiden välttämättömien rasvahappojen vajetta (Goncalves ym. 2017). Pitoisuuksien ja ravinnon laadun vaihtelu eliöiden välillä on kuitenkin suurta, sillä esimerkiksi EPA:n ja DHA:n pitoisuudet voivat vaihdella jopa 128-kertaisesti kalalajien välillä (Gladyshev ym. 2013). Paitsi lajien, myös eri järvien ja järvityyppien välillä voi esiintyä eroja eliöiden rasvahappokoostumuksissa. Esimerkiksi kirkkaissa järvissä ahventen (Perca fluviatilis) ω3-rasvahappojen osuuden on havaittu olevan korkeampi kuin humuspitoisissa (Strandberg ym. 2016).
2.3.1 Akvaattisten sienten rasvahapot ja rooli ravintoverkossa
Hajottajayhteisö tuo sekä auto- että alloktonista alkuperää olevassa detrituksessa olevat ravinteet ja ravintoaineet uudelleen muiden eliöiden saataville (Gleason ym. 2008). Esimerkiksi piiskasiimasienet voivat paitsi hajottaa orgaanisen aineksen pienhiukkasia (POM) myös muuttaa epäorgaanisia yhdisteitä orgaaniseen muotoon. Benthoksen mikrobeilla onkin ratkaiseva rooli hiilen kierrossa hajotustoiminnan ansiosta (Taube ym. 2018). Akvaattiset sienet lisäävät eritysesti fosforin ja typen saatavuutta kuluttajille (Danger ym. 2016), millä voi olla merkittävä vaikutus järven ravinnetalouden kannalta, sillä fosfori rajoittaa esimerkiksi humusjärvissä planktonin kasvua (Hessen & Tranvik 1998). Rasvahappojen kannalta hajottajien toiminta on kiinnostavaa, sillä on epäselvää, missä määrin levien syntetisoimat ja kuluttajien käyttämät rasvahapot päätyvät näiden kuoltua uudelleen kuluttajien käyttöön, ja missä määrin mikrobit muokkaavat rasvahappoja omassa metaboliassaan. Autoktoninen aines tarjonnee mikrobeille enemmän välttämättömiä rasvahappoja, ja voi näin ollen olla parempaa ravintoa benthoksen kuluttajille. Alloktoninen aines sen sijaan tuo uusia ravinteita ja orgaanisia yhdisteitä systeemiin. Lisäksi alloktonisen orgaanisen aineksen laadun on havaittu säätelevän voimakkaasti sienten ja bakteerien suhteellisia osuuksia (Taube ym. 2018).
Funck ym. (2015) tutkivat kahdeksan Hyphomycetes-luokan sienten rasvahappoprofiileja virtaavissa vesissä. Kaikilla lajeilla esiintyi runsaimpina rasvahappoina 16:0, 18:0, 18:1ω9,
14
18:2ω6 (LIN) ja 18:3ω3 (ALA), jotka yhdessä kattoivat jopa yli 94 % sienten rasvahapoista.
Näistä viidestä LIN oli runsain. Lajien välinen vaihtelu ja tyydyttyneiden, kertatyydyttymättömien ja monityydyttymättömien rasvahappojen suhteellisten osuuksien vaihtelu on kuitenkin suurta. Tästä huolimatta tutkimuksen perusteella akvaattiset Hyphomycetes-luokan sienet voisivat tarjota tärkeän linoleenihapon ja α-linoleenihapon lähteen. Funck ym. (2015) havaitsivat myös veden fosforipitoisuuksien vaikuttavan sienten rasvahappokoostumuksiin. Alhainen fosforipitoisuus vähensi monityydyttymättömien rasvahappojen, mukaan lukien ALA:n ja LIN:n suhteellista osuutta sienissä Alatospora constricta -sientä (Helotiales) lukuun ottamatta, johon fosforipitoisuus ei vaikuttanut. Tulosten perusteella voisikin olettaa, että järven ravinteisuuden kasvaessa välttämättömien rasvahappojen osuus kasvaa mikrobiaalisen kierron kautta myös muilla trofiatasoilla.
Substraatilla on vaikutusta sienten rasvahappokoostumukseen, kuten havaittiin mm.
Shirasakan ym. (1995) tutkimuksessa. Näin ollen erilaiset kasvualustat voivat vaikuttaa sienten ravintoarvoihin, kun toiset kasvualustat voivat johtaa runsaampaan välttämättömien rasvahappojen synteesiin. Pohjaeläinten ravinnonsaannin kannalta hyvät rasvahappoarvot eivät kuitenkaan välttämättä yksinään riitä, jos ravinnonlähteen biomassa on alhainen. Hajottaessaan lehtiä sienet voivat kuitenkin tuottaa sekä rihmastoa että konidioita, joiden biomassa voi olla merkittävä pohjaeläinten ravinnonsaannin kannalta (Gessner & Chauvet 1994). Esimerkiksi kasviplanktonin parasiittisten piiskasiimasienten (Chytridiomycota) on havaittu parantavan ravinteiden ja ravintoaineiden saatavuutta eläinplanktonille zoosporien tuotannon kautta (Gerphagnon ym. 2018). Piiskasiimasienten rasvahapot vastasivat paljolti alkuperäisiä kasviplanktonin rasvahappoja, viitaten vähäiseen rasvahappojen muokkaukseen. Myös muut akvaattiset sienet voinevat toimia ratkaisevana linkkinä eri trofiatasojen välillä parantamalla rasvahappojen saatavuutta kuluttajille.
Tavanomaisten rasvahappojen lisäksi sienet voivat syntetisoida harvinaisia rasvahappoja metaboliassaan. Shirasaka ym. (1995) havaitsivat Saprolegnia-suvun 28YTF-1 -kannan kykenevän syntetisoimaan rihmastossaan harvinaisia monityydyttymättömiä 19:5ω2- ja 19:4ω5-rasvahappoja 15:0-rasvahaposta He esittivät rasvahapon muodostuksen olevan samankaltainen kuin EPA:n synteesin:
15:0→17:0→17:1→17:2ω5→17:3ω5→19:4ω5→19:5ω2.
Mielenkiintoista on, että 15:0-rasvahapon puuttuminen kasvualustasta lisäsi EPA:n tuotantoa.
Herääkin kysymys, onko 19:5ω2-rasvahapon tuotanto kyseisen sienikannan kannalta hyödyllisempää, ja jos on, niin miksi? Entä onko C17- ja C19-rasvahappojen kerryttäminen ja syntetisointi sienikunnassa yleistä? Esimerkiksi Mortierella-suvun sienten on havaittu
15
akkumuloivan monityydyttymättömiä C17- ja C19-rasvahappoja ja Candida-suvun sienten taas on havaittu akkumuloivan tyydyttymättömiä C17-rasvahappoja (Shirasaka ym. 1995).
2.3.2 Foliaaristen sienten rasvahapot
Virtaavissa vesissä pohjaeläinten on havaittu kuluttavan sientä sisältävät lehdet muita tehokkaammin ravinnokseeen (Bärlocher & Kendrick 1974). Sama ilmiö esiintynee myös järviekosysteemeissä. Toisaalta kaikki sienet eivät ole välttämättä sopivia pohjaeläinten ravinnoksi (Bärlocher & Kendrick 1973) Esimerkiksi endofyyttiset sienet voivat erittää mykotoksiineja, kuten alkaloideja, jotka ovat myrkyllisiä niitä syöville hyönteisille (Timonen
& Valkonen 2018).
Sienten ja muiden mikrobien kolonisoitua lehti sen päädyttyä järveen fyllosfäärin ravintoarvo paranee paitsi mikrobien itsensä lisäämän ravintoarvon myös niiden toiminnan seurauksena lehdistä käyttökelpoisempaan muotoon saatavien ravinteiden johdosta (Bärlocher 1985). Kaikki pohjaeläimet eivät kuitenkaan kykene hyödyntämään mikrobien lehdelle tuomaa ravintolisää. Kykyyn vaikuttavat muiden muassa pohjaeläinten liikkuvuus, pohjaeläimen käyttämien ravintolähteiden määrä ja kyky torjua mikrobien puolustusmekanismeja kuten mykotoksiinien eritystä.
Lehtien epifyyttisten sienten roolia järviekosysteemissä ei ole tutkittu paljoakaan. Aihetta sivuavia tutkimuksia kuitenkin löytyy. Esimerkiksi Ellis ym. (2002) tutkivat levän kuoressa epifyyttinä elävän Fusarium oxysporum -sienen rasvahappokoostumusta. He havaitsivat, että sienessä esiintyi pääasiassa 16:0-, 18:0- ja 18:1ω9-rasvahappoja, jotka käsittivät 47 % koko rasvahappokoostumuksesta. Tämä osuus on huomattavasti vähemmän kuin Funckin ym. (2015) kahdeksasta Hyphomycetes-luokan sienestä löytämä viiden yleisimmän rasvahapon osuus, jotka yhdessä kattoivat yli 94 % niiden koko rasvahappokoostumuksesta. Lisäksi F. oxysporum -sienen kvalitatiivinen rasvahappokoostumus on ravintoarvoiltaan köyhempi, sillä välttämättömiä rasvahappoja ei esiintynyt merkittävästi.
Myös epifyyttisillä hiivoilla 16:0- ja 18:0-rasvahapot dominoivat rasvahappokoostumuksessa (Zviagintseva ym. 1975). Mielenkiintoinen havainto on, että tyydyttymättömät rasvahapot ovat runsaampia epifyyttisillä hiivoilla kuin maaperässä esiintyvillä Lipomyces-suvun hiivoilla. Epifyyttien rasvahappokoostumus sisälsi lisäksi pitkäketjuisia rasvahappoja maaperän hiivoja enemmän. Mikäli ilmiö on yleinen epifyyteillä, lehtien pudotessa maahan epifyyttiset hiivat voisivat tarjota sekä terrestrisille että akvaattisille karikkeen kuluttajille tärkeän pitkäketjuisten ja tyydyttymättömien rasvahappojen lähteen.
16
Toinen aihetta sivuava tutkimus selvitti, että epifyyttisen Pseudozyma flocculosa -hiivan kykenee tuottavamaan solun ulkopuolelle eritettäviä 17:1-rasvahappoja, jotka haittaavat muiden sienten kasvua (Avis & Bélanger 2002). Havainto on mielenkiintoinen, sillä Candida- suvun sienten on havaittu akkumuloivan tyydyttymättömiä C17-rasvahappoja. Herääkin kysymys, voisiko tyydyttymättömillä C17-rasvahapoilla olla rooli yleisempänä sienten puolustusmekanismina. Joka tapauksessa tällainen C17-rasvahappojen kerryttäminen sekä mahdollinen de novo -synteesi toisi niitä pohjaeläinten käyttöön benthoksessa. Vaikka tyydyttymättömät C17-rasvat haittaisivatkin muiden sienten kasvua, ei niillä välttämättä olisi toksista vaikutusta korkeamman trofiatason eliöille.
Lehtien endofyyttisten sienten rasvahappokoostumuksia on tutkittu jopa vielä vähemmän kuin epifyyttien. Dey ym. (2011) eristivät endofyyttisiä Colletotrichum- ja Alternaria- sukujen kantoja kahdesta ruohovartisesta kasvista. He havaitsivat kertatyydyttymättömien rasvahappojen kattavan yli 60 % sienten neutraaleista rasvahapoista, kun taas tyydyttyneiden osuus oli noin 12–16 % ja monityydyttymättömien 24–28 %. Samankaltaiset suhteet ilmenivät myös sienten glykolipideillä, kun taas fosfolipideillä tyydyttyneiden osuudet olivat noin 41 ja 52 %, kertatyydyttymättömien 24–28 % ja monityydyttymättömien 21–23 %. Välttämättömistä rasvahapoista ALA ja LIN olivat runsaimmat. LIN kattoi jopa 23 % koko neutraalien rasvahappojen määrästä. Myös ALA esiintyi kaikissa luokissa, runsaimpana fosfolipideissä, joissa sen osuus koko fosfolipidikoostumuksesta oli jopa yli 7 %. Mikäli samankaltainen rasvahappokoostumus esiintyisi myös puiden lehtien endofyyttisillä sienillä, voisivat nämä tarjota välttämättömien rasvahappojen ”ravintolisän” lehteä ravintonaan hyödyntäville kuluttajille niin akvaattisessa kuin terrestrisessäkin ekosysteemissä.
Monilla mikrosienillä on useita eri rakenteita riippuen ympäristöolosuhteista. Esimerkiksi epifyyttisienet voivat muodostaa kestoitiöitä, jotka selviytyvät pitkiä aikoja lehden pinnalla (Timonen & Valkonen 2018). Olosuhteiden muuttuessa paremmiksi sieni aktivoituu ja alkaa kasvattaa rihmaa tunkeutuakseen lehden solukkoon. Laboratoriossa sieniä kasvatetaan useimmiten ravinnealustoilla, jolloin olosuhteet voivat alkaa suosia rihmastomaista kasvua lepoitiöiden ja hiivamaisen jakautumisen sijaan. Tällä on hyvin luultavasti vaikutusta myös sienen rasvahappometaboliaan ja näin ollen ravintoarvoihin. Eri sienillä on luonnossa erilaisia ympäristöolojen määräämiä kasvutapoja, ja nämä tulisikin tuntea taksonikohtaisesti mahdollisimman tarkan kuvan saamiseksi niiden roolista ravintoverkossa.
17 3 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET
Tutkimuksessa vertailtiin kolmen kirkasvetisen ja humuspitoisen järven sieniyhteisöjen rasvahappokoostumuksia. Tutkimuksessa kasvatettiin järvien litoraalivyöhykkeeltä kerättyjen koivun lehtien endofyyttisiä ja epifyyttisiä sieniä agar-maljoilla. Fyllosfäärin kokonaisrasvahappokoostumusta tarkasteltiin koivun lisäksi lepän lehdillä.
Tutkimuskysymyksiä oli neljä:
1) Mitä rasvahappoja akvaattisilla sienillä esiintyy?
2) Kumpi sieniryhmä tarjoaa parempia rasvahappoja, epifyyttiset vai endofyyttiset sienet?
3) Eroavatko lehden terrestrinen (ranta) ja akvaattinen (litoraali) rasvahappokoostumus toisistaan?
4) Eroavatko humusjärvien ja kirkasvetisten järvien rasvahappokoostumukset toisistaan?
4 MATERIAALIT JA MENETELMÄT 4.1 Näytteiden kerääminen
Näytteet kerättiin Pohjois-Karjalasta kuudesta järvestä (Kuorinka, Sompalampi, Ylinen, Onkilampi, Pyhäselkä, Mekrijärvi; kuva 1) ja niiden rannoilta 17. ja 18.10.2018. Kolme ensin mainittua olivat kirkasvetisiä ja jälkimmäiset kolme humuspitoisia.
Jokaisesta järvestä mitattiin veden lämpötila ja happipitoisuus (YSI Professional Plus (Pro Plus)) ja otettiin vesinäyte pH-mittauksia varten. Järvivesien pH mitattiin 25 °C:ssa (Consort P600, TEOPAL). Lisäksi kirjattiin järven pohjatyyppi, näytteenottoetäisyys. näytteiden keräämiseen käytetty aika ja havaintoja ympäristöstä. Näytteiksi kerättiin lehtiä litoraalivyöhykkeen pohjasta potkuhaavilla. Lisäksi järvien rannoilta poimittiin 3–6 koivun lehteä ja 1–4 lepän lehteä Falcon-putkiin fyllosfäärien kokonaisrasvahappokoostumusanalyyseja varten. Rasvahappoanalyysiin meneviä lehtinäytteitä säilytettiin matkan ajan jäillä kylmälaukussa, ennen kuin ne säilöttiin -80 °C:ssa 1,5–5 tunnissa (17.10.) tai 0,5–2 tunnissa (18.10). Viljelynäytteiksi päätyvät lehdet laitettiin kuljetuksen ja säilytyksen ajaksi lehdet 10 l ämpäreihin, joissa oli kyseisen järven vettä.
Näytteitä säilytettiin kaksi päivää 4 °C:ssa ennen kasvatusten aloittamista.
18
Kuva 1. Näytteenottopaikkojen sijainti. 1=Kuorinka, 2=Sompalampi, 3=Pyhäselkä, 4=Ylinen, 5=Onkilampi, 6=Mekrijärvi.
4.2 Sienten viljely
Sieniä kasvatettiin kiinteällä hiiva-mallas -agarilla (YM-agar, Sigma-Aldrich). Alustat valettiin valmistajan ohjeiden mukaan sekoittamalla 750 ml tislattua vettä 30,77 g YM-agarjauhetta, ja lämmittämällä seosta mikrossa, kunnes seos kiehui (n. 13 min, välillä lasisauvalla sekoittaen).
Lämmitettyä seosta kaadettiin kasvatuspurkkeihin 30 ± 1 ml. Purkkien kannet suljettiin ja alustat autoklavoitiin (1h, 121 °C). Alustojen jäähdyttyä purkit varastoitiin kylmähuoneeseen (4°C).
Sieniympit tehtiin kahdella eri tavalla menetelmien vertailemiseksi. Ensimmäisessä metodissa (lehtipalametodi) lehdistä puhdistettiin biofilmi ottamalla mallia Rakotorianan ym.
(2008) endofyyttisten sienten tutkimuksesta ja tavanomaisesta kasvisolukkoviljelmän steriloinnista. Lehtiä liotettiin noin viisi minuuttia ionivaihdetussa vedessä, johon oli lisätty 10
% Tween-liuosta (polyetyleeniglykonisorbitaanimonolauraatti). Tästä eteenpäin työskentely suoritettiin aseptisesti laminaarikaapissa. Lehtiä liotettiin minuutin ajan 70 % etanolissa, josta ne siirrettiin 3,5 % natriumhypokloriittiin kymmenen minuutin ajaksi. Seuraavaksi lehtiä liotettiin 30 sekuntia 70 % etanolissa. Lehdet siirrettiin likoamaan steriiliin veteen viideksi
19
minuutiksi, jonka jälkeen vesi vaihdettiin ja lehtiä liotettiin toiset viisi minuuttia. Tämä toistettiin vielä kerran. Biofilmin puhdistamisen jälkeen lehdistä leikattiin liekissä sterilisoidulla skalpellilla noin 3–6 mm2 palasia eri osista lehtiä, joista kuusi palaa siirrettiin kummallekin kasvualustalle.
Toisessa ymppimetodissa (itiömenetelmä) lehdet siirrettiin biofilmin poistamisen jälkeen steriileihin 500 ml:n erlenmayerpulloihin, joissa oli 200 ml steriiliä vettä. Pullojen suuaukot peitettiin ohuella, steriilillä pahvilla ilman vaihtumisen takaamiseksi ja kontaminaation estämiseksi. Näytteitä sekoitettiin huoneenlämmössä sekoittajalla noin 42–66 tuntia hapekkuuden parantamiseksi ja itiöiden tuottamisen aloittamiseksi. Tämän menetelmän tavoitteena oli saada lehden eri osien sienet kasvamaan maljoilla, ensimmäisen menetelmän jättäessä osan lehden sienilajistosta väkisinkin puuttumaan satunnaisesti leikattujen lehtipalojen edustaessa koko lehteä. Kummallakin tavalla tehtyihin kasvatuspurkkeihin lisättiin 10 ml steriiliä vettä muodostamaan ohuen vesifaasin. Viljelmät siirrettiin kasvamaan 13–15 °C:een noin kolmeksi viikoksi.
Epifyyttisieniä kasvatettiin YM-agarilla petrimaljoilla soveltaen Woodyn ym. (2003) käyttämää menetelmää. Neljä lehteä kustakin järvestä suspensoitiin 50 millilitraan 0,01 % Tween-liuosta saksilla ja leikkurilla (Sorvall Omni-Mixer, 8000 rpm 45 sekuntia). Saatua seosta pipetoitiin 1 millilitra petrimaljalle, ja bakteerikasvun estämiseksi lisättiin millilitra 50 μg/ml kloramfenikolia, niin että kokonaistilavuus 2 ml saatiin levitettyä koko maljan laajuudelle.
Replikaatteja tehtiin kaksi kappaletta kustakin näytteestä. Sieniä kasvatettiin 13–15 °C:ssa 19–
21 vuorokautta.
Sekä endofyytti- että epifyyttiviljelmistä poimittiin yhtä lajia sisältäviin jatkokasvatuksiin steriileillä pinseteillä silmin havaittavia kasvustoja (pesäkkeitä, hyhmää), jotka suspensoitiin 1,5 millilitraan steriiliä vettä. Seos pipetoitiin alustalle. Alustalle pipetoitu suspensio laimennettiin edelleen kymmeneen millilitraan asti steriilillä vedellä. Jatkokasvatuksia kasvatettiin edelleen 13–15 °C:ssa 32 tai 34 vrk.
Analyyseja varten sienet kerättiin maljoilta 15 ml:n Falcon-putkiin. Saman järven epifyyttisienet yhdistettiin omaan putkeensa (2 replikaattia), lehtipalametodilla kasvatetut endofyytit omaansa ja suspensiomenetelmällä kasvatetut omaansa. Tarvittaessa sekaan lisättiin hieman steriiliä vettä näytteen upottamiseksi putken pohjalle. Työskentely tehtiin jäähauteella.
Näytteet varastoitiin -80 °C:ssa.
20 4.3 Rasvahappoanalyysi
Falcon-putkissa olevat näytteet (sekä fyllosfääri- että kasvatusnäytteet) kylmäkuivattiin (Christ ALPHA 1-4 LD Plus, kuivatusaika 24 h, josta 22 h 0,34 mbar ja 2h 0,1 mbar) ja jauhettiin nestetypellä etanolilla ja kloroformi-metanolilla (2:1) puhdistetulla huhmareella. Tämän jälkeen näytteet siirrettiin takaisin -80 °C:een.
Rasvahappoanalyyseilla selvitettiin sienten ja lehtien rasvahappokoostumuksia. Jauhettuja näytteitä punnittiin 3,0–9,0 mg. Punnittu jauhe siirrettiin alumiinikuppeineen jäähauteelle uunissa lämpösteriloituun kloroformi-metanoli -seoksella huuhdeltuun Kimax-putkeen, ja näytteet uutettiin lasikärkisellä täyspipetillä 2 ml kloroformi-metanoli -seosta (2:1). Tämän jälkeen näytteet varastoitiin -20 °C odottamaan seuraavan päivän jatkouuttamista.
Jatkouuttamisessa putkiin lisättiin sisäiset standardit. Lehtinäytteille lisättiin standardiksi 4 μl 21:0 -rasvahappoa (Nu-Chek Prep Inc., 1,00 mg/ml 2:1 kloroformi-metanoli -seosta) ja viljelmille ja näiden kontrolleille 23:0 -rasvahappoa (Nu-Chek Prep Inc., 0,499 mg/ml 2:1 kloroformi-metanoli -seosta). Putkia huuhdeltiin typellä muutaman sekunnin ajan, jonka jälkeen näytteitä sonikoitiin 5 minuuttia solujen hajottamiseksi. Sonikoinnin jälkeen näytteisiin lisättiin 400 μl kaliumkloridia (0,88 % KCl MQ-vedessä). Näytteitä vorteksoitiin muutaman sekunnin ajan ja sentrifugoitiin 3 min 2000 rpm. Sentrifuugissa erottunut alempi faasi siirrettiin uuteen Kimax-putkeen. Ylempään faasiin lisättiin teoreettisen alemman faasin mukaisesti kloroformia, metanolia ja MQ-vettä suhteessa 86:14:1 ja 400 μl 0,88 % KCl-liuosta, jonka jälkeen näytteet vorteksoitiin ja sentrifugoitiin uudelleen loppujen rasvahappojen saamiseksi talteen. Saatu uusi alafaasi yhdistettiin ensimmäisen alafaasin kanssa. Tämän jälkeen näytteet pakastettiin -20 °C.
Seuraavaksi rasvahapot metyloitiin. Pakastetuista näytteistä haihdutettiin nesteet pois 30,0
°C jatkuvan typpivirran alla. Nesteiden haihduttua putket siirrettiin vetokaappiin, jossa niihin lisättiin 1 ml n-heksaania ja 2 ml 1 % H2SO4 (metanoliin sekoitettuna). Putket huuhdottiin typellä N2 ja näytteitä inkuboitiin 90 min ajan 90 °C. Tämän jälkeen putkien annettiin jäähtyä muutaman minuutin ajan ja niihin lisättiin 1,5 ml MQ-vettä ja 4 ml n-heksaania. Putkia vorteksoitiin muutaman sekunnin ajan ja sentrifugoitiin 2 min 2000 rpm. Saatu ylempi faasi siirrettiin uuteen kloroformi-metanoli -seoksella huuhdeltuun Kimax-putkeen. Alempaan faasiin lisättiin 4 ml n-heksaania ja putket vorteksoitiin ja sentrifugoitiin uudelleen aiemman mukaisesti. Muodostunut uusi yläfaasi yhdistettiin aiemmin saatuun yläfaasiin. Tämän jälkeen putkista haihdutettiin heksaani pois 30 °C jatkuvan typpivirran alla.
21
Heksaanin haihduttua putkiin lisättiin 0,5 tai 1 ml n-heksaania. Putkia vorteksoitiin muutaman sekunnin ajan rasvahappojen monoestereiden sekoittamiseksi, jonka jälkeen kaikki neste pipetoitiin kromatografipulloihin. Tämä toistettiin uudelleen loppujen estereiden saannin varmistamiseksi talteen. Näytteet varastoitiin -20 °C.
Rasvahapot analysoitiin yhdistetyllä kaasukromatografilla ja massaspektrometrilla (GC- MS). Kolonnin (DB-23) pituus oli 30 m ja halkaisija 250 μm. Kolonnin filmin paksuus puolestaan oli 0,25 μm. Massaspektrometrissa käytettiin splitless -moodia. Aloituslämpötila oli 250 °C, ja heliumin kokonaisvirtaus oli 43,8 ml/min. Kaasukromatografin aloituslämpötila oli 50 °C, josta lämpötilaa nostettiin 150 °C:een, ja edelleen 190 °C:een ja vielä 210 °C:een asti. Ajon jälkeen lämpötilaa nostettiin 230 °C:een 2 minuutin ajaksi. Yhden näytteen ajoaika oli 60,67 minuuttia, johon lisätään vielä 10 minuutin väliaika ennen kuin massaspektrometri käsitteli uutta näytettä. Standardinäytteenä käytettiin GLC Reference standard 538:a (Nu-chek Prep Inc.), joista tehtiin neljä eri vahvuista liuosta standardisuoran luomiseksi.
Kromatogrammeista määritettiin rasvahapot niiden retentioaikojen ja massaspektrometrin piikkien avulla. Piikkien pinta-ala laskettiin MSD ChemStation –ohjelmalla (Agilent). Saadut alat koottiin yhteen, ja jokaiselle näytteelle laskettiin sekä määrä mg/g kuivapainoyksikköä kohden että kunkin rasvahapon prosenttiosuus kokonaisrasvahappokoostumuksesta. Näytteistä vähennettiin blank-näytteiden perusteella määritetyn kontaminaation keskiarvo.
4.4 Tilastolliset analyysit
Tilastollisilla testeillä testattiin luokkamuuttujien (epifyytti vs. endofyytti, kirkasvetinen vs.
humuspitoinen, suspensiometodi vs. lehtipalametodi, leppä vs. koivu) ja jatkuvien ympäristömuuttujien (pH, veden lämpötila, veden happipitoisuus, järven koko) vaikutuksia fyllosfäärien ja sienten rasvahappokoostumuksiin. Monimuuttuja-analyysit (maintest ja pairwise PERMANOVA (permutational multivariate analysis of variance)) ja MDS (multidimensional scaling) -ordinaatiovisualisoinnit tehtiin Primer 6 & PERMANOVA+ - ohjelmalla. Analyyseihin sisällytettiin mukaan vain ne rasvahapot, joita esiintyi näytteessä vähintään 1 %. MDS-ordinaatioissa käytettiin euklidisia etäisyyksiä. PERMANOVA:a testattiin sekä rasvahappojen määrien että prosenttiosuuksien suhteen. Jatkuvia ympäristömuuttujia puolestaan testattiin DistLM-analyysilla (step-wise, permutaatioiden määrä 999), jolla selvitettiin myös eri muuttujien selitysastetta. Eri luokkamuuttujien eroja rasvahappokoostumuksessa testattiin myös epäparametrisella Mann-Whitneyn U-testillä (IBM SPSS Statistics 25).
22
PERMANOVA:ssa aineistoon kokeiltiin luonnollista logaritmin muunnosta ja neliöjuurimuunnosta, mutta nämä eivät muuttaneet ratkaisevasti tulosten merkitsevyyttä, joten aineisto jätettiin muuntamatta. Rasvahappojen prosenttiosuuksille kokeiltiin myös muunnosta, mutta tässäkään tapauksessa muutos ei ollut olennaisesti erilainen, joten se jätettiin tekemättä.
Muunnokset voivat myös olla yhdentekeviä tai jopa vääristää tuloksia (Happel ym. 2017), mikä puolsi aineiston jättämistä käsittelemättömäksi.
5 TULOKSET 5.1 Sieniviljelmät
Epifyyttisienillä havaittiin 15 eri rasvahappoa, joista 4 esiintyi ainoastaan kirkasvetisissä järvissä (kuva 2). Endofyyttisienillä havaittiin puolestaan jopa 27 eri rasvahappoa, joista 10 esiintyi ainoastaan kirkasvetisissä ja 4 vain humuspitoisissa järvissä (kuva 3). Epifyyttisienten ja endofyyttisienten rasvahappokoostumukset eivät eronneet toisistaan tilastollisesti merkitsevästi, mutta ero oli kuitenkin lähes merkitsevä (pairwise PERMANOVA p=0,051;
t=2,013). Foliaaristen sienten rasvoista runsaimpina ryhmänä olivat sekä humuspitoisissa että kirkasvetisissä järvissä kertatyydyttymättömät rasvahapot, toiseksi yleisimpänä tyydyttyneet ja erittäin vähäisinä esiintyivät monityydyttymättömät (taulukko 1). Endofyyttisienillä kokeilluilla itiöviljelyllä ja lehtipalaviljelyllä ei ollut merkitsevää eroa sienten rasvahappokoostumusten suhteen (pairwise PERMANOVA p=0,491; t=0,713).
Kirkasvetisten ja humuspitoisten järvien sienten rasvahappokoostumukset eivät eronneet toisistaan tilastollisesti merkitsevästi määrien (pairwise PERMANOVA p=0,73; t=0,515; kuva 4). Järvien kesken sienten rasvahappokoostumukset eivät eronneet tilastollisesti merkitsevästi (maintest PERMANOVA p=0,79; pseudo-F=0,579; df=5).
DistLM-testissä foliaarisia sieniä vertailtaessa selitysarvoksi saatiin 0,154.
Ympäristömuuttujat eivät vaikuttaneet tässäkään tapauksessa merkitsevästi, mutta sienen tyyppi selitti eroja tilastollisesti merkitsevästi tai lähes merkitsevästi (epifyyteille p=0,034 ja endofyyteille p=0,05).
Endofyyttien ω3/ω6-suhde oli hieman korkeampi kuin epifyyttisienten.
Ekotyyppikohtaisesti tarkasteltuna humusjärvissä epifyyttien ja endofyyttien ω3/ω6-suhteen keskiarvo oli kuitenkin sama, kun taas kirkasvetisissä järvissä endofyyttien suhde oli hieman korkeampi, joskin ero jäi keskihajonnan sisään.
23
Kuva 2. Epifyyttisienten rasvahappojen määrien (mg/g kuivapainoa) keskiarvot keskihajontoineen kirkkaissa ja humuspitoisissa järvissä.
Kuva 3. Endofyyttisienten rasvahappojen määrien (mg/g kuivapainoa) keskiarvot keskihajontoineen kirkasvetisissä ja humuspitoisissa järvissä.
24
Taulukko 1. Koivun lehden sienten rasvahappojen prosenttiosuuksien keskiarvot ja -hajonnat (SD) ryhmittäin (SAFA, MUFA ja PUFA) humuspitoisissa ja kirkasvetisissä järvissä.
Humusjärvi
Kirkas
järvi
Rasvahappo Epifyytti SD Endofyytti SD Epifyytti SD Endofyytti SD
14:0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,2 0,4 0,2 0,4
i15 3,5 3,6 1,5 1,3 2,4 3,1 0,7 1,1
a15 2,0 2,2 0,9 1,1 0,9 1,2 1,1 1,8
a16 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,2 0,6
16:0 25,3 2,3 28,1 2,5 26,0 2,1 28,0 6,0
a17 0,0 0,0 0,2 0,5 0,0 0,0 0,3 0,8
18:0 0,0 0,0 0,2 0,5 0,0 0,0 0,7 1,8
SAFA % 30,8 8,0 30,9 5,8 29,4 6,8 31,2 12,5
16:1 0,0 0,0 0,2 0,4 0,0 0,0 0,0 0,0
16:1 1,8 1,4 2,0 1,3 1,5 1,1 1,6 1,1
16:1 12,4 5,7 12,2 3,1 10,4 2,2 11,3 3,0
16:1 0,0 0,0 0,4 1,0 0,0 0,0 0,0 0,0
17:1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,2 0,6
17:1 26,4 4,5 24,8 5,0 26,1 3,0 24,5 5,3
17:1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,2 0,5 0,3 0,6
18:1 2,2 3,9 0,5 0,8 2,2 2,2 1,1 2,8
18:1 13,7 7,8 16,3 2,4 15,0 4,0 17,0 5,1
19:1 0,2 0,4 0,6 0,9 0,4 0,6 0,2 0,6
19:1 7,6 4,0 5,7 2,7 7,3 2,6 4,6 1,8
20:1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 1,4 3,4
MUFA % 64,3 27,7 62,9 17,6 63,2 16,2 62,3 24,3
14:2 0,0 0,0 0,0 0,0 0,2 0,6 0,0 0,0
16:2 0,0 0,0 0,3 0,7 0,0 0,0 0,0 0,0
18:2ω6 0,4 0,6 0,8 1,3 1,5 1,9 0,4 1,0 18:3ω6 0,0 0,0 0,5 1,1 0,8 1,3 0,0 0,0 20:4ω6 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,2 0,5
21:3 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,4 0,9
22:4 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,7 1,8
22:4ω6 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,5 1,3
22:6 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,3 0,8
PUFA % 0,4 0,6 1,5 3,1 2,6 3,8 2,5 6,2
YHTEENSÄ 95,5 36,3 95,3 26,5 95,2 26,7 96,0 43,0
25
Kuva 4. MDS-ordinaatio foliaaristen sienten jakautumisesta kirkasvetisissä ja humuspitoisissa järvissä. K=kirkasvetinen järvi, H=humusjärvi.
5.2 Fyllosfääri
Koivun lehdillä havaittiin 16 eri rasvahappoa, joista 2 esiintyi ainoastaan humusjärvissä (kuva 5). Koivun ja lepän lehtien rasvahappokoostumukset erosivat toisistaan määrien (kuva 6, pairwise PERMANOVA p=0,005; t=2,440) ja prosentuaalisten osuuksien suhteen (p=0,002;
t=2,821). Koivulla runsaimpana esiintyivät tyydyttyneet rasvahapot, kun taas lepällä SAFA:t olivat runsaimpina kirkkaissa järvissä ja PUFA:t olivat runsaimpana humusjärvissä (taulukko 2).
Lehtinäytteillä litoraaleista ja rannoilta kerättyjen lehtinäytteiden rasvahappokoostumukset eivät eronneet tilastollisesti merkitsevästi määrien (kuva 7; pairwise PERMANOVA p=0,44;
t=0,887) eivätkä prosenttiosuuksien suhteen (p=0,383; t=0,992).
Veden kirkkauden suhteen ei havaittu eroa lehtien rasvahappokoostumuksissa määrien (kuva 6; pairwise PERMANOVA p=0,766; t=0,627) eikä rasvahappojen prosenttiosuuksien suhteen (p=0,611; t=0,803). Järvien kesken ei myöskään havaittu merkitseviä eroja (maintest PERMANOVA p=0,742; pseudo-F=0,669; df=5).
Koivun lehtien rasvahappokoostumus erosi endofyyttisten (pairwise PERMANOVA p=0,001; t=5,729) ja epifyyttisten (p=0,001; t=6,219) sienten rasvahappokoostumuksista tilastollisesti merkitsevästi (kuva 8).
26
Taulukko 2. Litoraalista kerättyjen koivun (Betula sp.) ja lepän (Alnus sp.) fyllosfäärien rasvahappojen prosentuaalisten osuuksien keskiarvot ja -hajonnat ryhmittäin (SAFA, MUFA ja PUFA) humuspitoisissa ja kirkasvetisissä järvissä.
Humuspitoinen Kirkasvetinen
Betula
sp. SD
Alnus
sp. SD
Betula
sp. SD
Alnus
sp. SD
14:0 1,9 0,3 1,7 0,4 1,9 0,8 1,9 2,0
16:0 15,7 1,7 18,1 0,3 19,3 8,3 20,0 2,1
18:0 3,5 0,5 2,7 0,0 3,7 1,8 4,2 1,2
20:0 3,1 0,4 3,5 3,0 3,7 2,0 6,2 5,4
22:0 2,9 0,5 4,7 2,4 3,5 2,3 6,5 4,9
23:0 4,1 1,6 2,6 3,6 4,0 5,8 0,7 1,1
24:0 4,8 1,0 2,5 0,1 6,2 3,6 3,3 1,7
25:0 0,9 0,8 0,0 0,0 1,3 1,1 0,0 0,0
26:0 13,6 2,1 2,2 3,2 15,2 3,6 3,5 1,2
SAFA % 50,6 8,8 37,9 13,0 58,8 29,3 46,3 19,7
14:1 0,0 0,0 1,2 0,2 0,3 0,6 0,4 0,7
18:1 7,3 0,8 2,7 2,0 4,5 4,7 4,8 4,2
21:1 0,0 0,0 2,8 3,9 0,0 0,0 2,9 5,1
23:1 6,9 1,4 2,9 1,7 7,4 3,8 2,7 1,4
25:1 3,0 5,2 2,0 2,9 1,0 1,8 3,2 2,2
MUFA % 17,2 7,4 11,6 10,7 13,3 10,8 14,0 13,6
16:3ω3 0,4 0,6 0,0 0,0 0,4 0,7 0,0 0,0 18:2ω6 7,0 0,4 5,3 0,8 5,4 3,7 6,9 2,3 18:3ω3 20,8 4,5 39,7 11,7 18,7 14,1 28,5 16,6
PUFA % 28,1 5,5 45,0 12,4 24,5 18,5 35,4 18,9
YHTEENSÄ 95,9 21,6 94,6 36,1 96,5 58,6 95,6 52,2
27
Kuva 5. Koivun ja lepän lehtien rasvahappojen määrien (mg/g kuivapainoa) jakautuminen kirkkaiden ja humuspitoisten järvien litoraalissa. H=humusjärvi, K=kirkasvetinen järvi.
Kuva 6. Kaksiulotteinen MSDS-ordinaatio rasvahappojen ryhmittymisestä lajin ja järven kirkkauden mukaan. K=kirkasvetinen järvi, H=humusjärvi.
28
Kuva 7. Kaksiulotteinen MSDS-ordinaatio rasvahappojen ryhmittymisestä lajin ja habitaatin mukaan. A=Alnus sp., B=Betula sp., L=litoraali, R=ranta.
Kuva 8. Kaksiulotteinen MDS-ordinaatio rasvahappojen ryhmittymisestä kasvatusnäytteiden ja koivun fyllosfäärien mukaan.
29
DistLM-testillä testattiin ympäristömuuttujien (pH, veden lämpötila, veden happipitoisuus, järven pinta-ala) vaikutusta lehtien rasvahappokoostumuksiin ja eri tekijöiden selitysastetta eroille. Ympäristömuuttujat eivät vaikuttaneet tilastollisesti merkitsevästi sienten rasvahappokoostumuksiin. Lehtinäytteillä mallin selitysaste (R2) oli 0,286. Suurimman osan rasvahappokoostumusten vaihtelusta selitti lehden taksoni (Alnus sp. p=0,004 ja Betula sp.
p=0,003; pseudo-F=6,323), kun taas ympäristömuuttujat eivät vaikuttaneet tilastollisesti merkitsevästi. Prosentuaalisia osuuksia tarkastellessa mallin selitysaste oli 0,437, josta merkitsevänä tekijänä oli jälleen ainoastaan lehden taksoni (Alnus sp. p=0,001 ja Betula sp.
p=0,001; pseudo-F=8,458).
Koivun lehden rasvahappokoostumusta ja kasvatusnäytteitä vertailtaessa mallin selitysasteeksi saatiin 0,574. Merkitsevästi eroja selittivät endofyyttiset sienet (p=0,001;
pseudo-F=12,698) ja lehti (p=0,001; pseudo-F=35,194), kun taas epifyyttisienet eivät selittäneet merkitsevästi eroja (p=0,07; pseudo-F=2,977), kuten eivät myöskään ympäristömuuttujat. Vastaavia prosenttiosuuksia vertailtaessa mallin selitysasteeksi saatiin 0,814 (lehdelle p=0,001; pseudo-F=135,79; epifyytille p=0,002; pseudo-F=8,489 ja endofyytille p=0,004; pseudo-F=9,130). Ympäristömuuttujat eivät vaikuttaneet merkitsevästi rasvahappokoostumuksiin. Järven kirkkaus ei selittänyt missään tapauksessa eroja tilastollisesti merkitsevästi.
Koivun lehtien ω3/ω6 -suhde oli merkitsevästi korkeampi kuin kasvatettujen foliaaristen sienten (kuva 9; Mann-Whitneyn U-testi p<0,001). Vertailtaessa litoraalista ja järvien rannoilta kerättyjen koivun lehtien ω3/ω6-suhdetta havaittiin, että litoraalivyöhykkeiltä kerätyillä lehdillä suhde oli korkeampi, joskin tämäkin ero jäi keskihajonnan sisään eikä ollut merkitsevä (kuva 10; Mann-Whitneyn U-testi p=0,514).
Koivun lehdellä ainoastaan 18:1-rasvahapon määrä erosi merkitsevästi vertailtaessa litoraalista ja rannalta kerättyjen lehtien välillä (Mann-Whitneyn U-testi, p=0,015). Lepän lehdillä rasvahappojen määrät eivät eronneet litoraalin ja rannan välillä. Kirkkaiden ja humuspitoisten järvien välillä ainoastaan 22:0-rasvahapon määrä erosi merkitsevästi (Mann- Whitneyn U-testi, p=0,002). Lepän lehtien rasvahappojen määrät eivät eronneet merkitsevästi kirkkauden suhteen.
30
Kuva 9. Koivun fyllosfäärin ja foliaaristen sienten ω3- ja ω6-rasvahappojen määrien (mg/g kuivapainoa) suhteiden keskiarvot keskihajontoineen.
Kuva 10. Litoraalista ja rannalta kerättyjen koivun (Betula) ja lepän (Alnus) lehtien ω3- ja ω6 - rasvahappojen määrien (mg/g kuivapainoa kohden) suhteiden keskiarvot keskihajontoineen.
L=litoraali, R=ranta.
Alnus L Alnus R Betula L Betula R
31 6 TULOSTEN TARKASTELU
Tutkimus onnistui hyvin, joskin näytteiden väliset erot jäivät liian pieniksi, jotta ne olisivat olleet merkitseviä. Epifyyttisten ja endofyyttisten sienten tilastollisesti lähes merkitsevä ero oli yksi tutkimuksen kiinnostavimmista havainnoista. Samoin se, että kertatyydyttymättömät rasvahapot käsittivät neljä viidestä runsaimmasta rasvahaposta kummallakin foliaarisella sieniryhmällä. Järven kirkkaus ei selittänyt merkitsevästi eroja, mutta suuremmalla aineistolla erot voitaisiin mahdollisesti saada paremmin näkyviin, samoin kuin muiden tekijöiden vaikutus.
6.1 Sienten viljely
Sienten viljely oli onnistunutta, joskin kasvavien lajien osuutta lehden koko sieniyhteisöstä ei voida arvioida ilman molekulaarisia tutkimuksia. Endofyyttisienillä eri viljelynaloitusmenetelmillä (lehtipala- ja itiöviljely) ei ollut merkitsevää eroa, mikä oli toivottavaa tutkimuksen ja menetelmien kehittämisen kannalta. Ymppimetodeista lehtien itiöviljely on huomattavasti tehokkaampi työskentelyyn käytetyn ajan takia. Siinä pääsevät edustetuiksi myös kaikki sienet lehden eri osista. Toisaalta itiöviljely voi suosia nopeasti itiöitä tuottavia lajeja. Hitaammin reagoivat ja itiöitä tuottavat lajit voivatkin olla paremmin edustettuina lehtipalanäytteissä.
Viljely ei takaa luotettavaa tulosta näytteen koko sienikannasta. Mikrobiviljelmistä saadaan havaittua tällä menetelmällä vain pieni osa mikrobistosta (Kirchman 2012). Näytteen sisältämien lajien kasvuolosuhteet ja tarvittavat vuorovaikutukset muiden eliöiden kanssa voivat johtaa tulosharhaan, kun vain osa lajeista kykenee kasvamaan kasvualustalla. Näin ollen viljelyolosuhteet voivat vaikuttaa maljoille valikoituvaan lajistoon ja sienten ravintoarvoihin.
Esimerkiksi jo muutaman asteen lämpötilamuutokset voivat aiheuttaa toisistaan poikkeavia tuloksia rasvahappokoostumuksissa (Müller ym. 1994, Stahl & Klug 1996). Näin ollen kokeen tulokset eivät vastaa luonnollista tilannetta, vaan ovat suuntaa-antavia. Lisäksi lehteä hajottavat sienet voivat muodostaa ravinnollisesti runsaampia rakenteita, kuten rihmaa ja konidioita.
Rasvahappokoostumus vaihdellee paitsi eri sienilajien myös lajinsisäisten rakenteiden välillä.
Tämä tulisi huomioida aina, kun on kyseessä laboratorio-olosuhteissa kasvatettu sieninäyte.
Rasvahappokoostumus muuttuu myös nopeasti ympäristömuutosten seurauksena, ja näytteiden keruu olisikin suotavaa paitsi useampana ajankohtana myös useammasta paikasta.
