Sienten viljely - Koivun (Betula sp.) foliaaristen sienten rasvahapot kirkkaiden ja humuspitois

Sieniä kasvatettiin kiinteällä hiiva-mallas -agarilla (YM-agar, Sigma-Aldrich). Alustat valettiin valmistajan ohjeiden mukaan sekoittamalla 750 ml tislattua vettä 30,77 g YM-agarjauhetta, ja lämmittämällä seosta mikrossa, kunnes seos kiehui (n. 13 min, välillä lasisauvalla sekoittaen).

Lämmitettyä seosta kaadettiin kasvatuspurkkeihin 30 ± 1 ml. Purkkien kannet suljettiin ja alustat autoklavoitiin (1h, 121 °C). Alustojen jäähdyttyä purkit varastoitiin kylmähuoneeseen (4°C).

Sieniympit tehtiin kahdella eri tavalla menetelmien vertailemiseksi. Ensimmäisessä metodissa (lehtipalametodi) lehdistä puhdistettiin biofilmi ottamalla mallia Rakotorianan ym.

(2008) endofyyttisten sienten tutkimuksesta ja tavanomaisesta kasvisolukkoviljelmän steriloinnista. Lehtiä liotettiin noin viisi minuuttia ionivaihdetussa vedessä, johon oli lisätty 10

% Tween-liuosta (polyetyleeniglykonisorbitaanimonolauraatti). Tästä eteenpäin työskentely suoritettiin aseptisesti laminaarikaapissa. Lehtiä liotettiin minuutin ajan 70 % etanolissa, josta ne siirrettiin 3,5 % natriumhypokloriittiin kymmenen minuutin ajaksi. Seuraavaksi lehtiä liotettiin 30 sekuntia 70 % etanolissa. Lehdet siirrettiin likoamaan steriiliin veteen viideksi

minuutiksi, jonka jälkeen vesi vaihdettiin ja lehtiä liotettiin toiset viisi minuuttia. Tämä toistettiin vielä kerran. Biofilmin puhdistamisen jälkeen lehdistä leikattiin liekissä sterilisoidulla skalpellilla noin 3–6 mm²palasia eri osista lehtiä, joista kuusi palaa siirrettiin kummallekin kasvualustalle.

Toisessa ymppimetodissa (itiömenetelmä) lehdet siirrettiin biofilmin poistamisen jälkeen steriileihin 500 ml:n erlenmayerpulloihin, joissa oli 200 ml steriiliä vettä. Pullojen suuaukot peitettiin ohuella, steriilillä pahvilla ilman vaihtumisen takaamiseksi ja kontaminaation estämiseksi. Näytteitä sekoitettiin huoneenlämmössä sekoittajalla noin 42–66 tuntia hapekkuuden parantamiseksi ja itiöiden tuottamisen aloittamiseksi. Tämän menetelmän tavoitteena oli saada lehden eri osien sienet kasvamaan maljoilla, ensimmäisen menetelmän jättäessä osan lehden sienilajistosta väkisinkin puuttumaan satunnaisesti leikattujen lehtipalojen edustaessa koko lehteä. Kummallakin tavalla tehtyihin kasvatuspurkkeihin lisättiin 10 ml steriiliä vettä muodostamaan ohuen vesifaasin. Viljelmät siirrettiin kasvamaan 13–15 °C:een noin kolmeksi viikoksi.

Epifyyttisieniä kasvatettiin YM-agarilla petrimaljoilla soveltaen Woodyn ym. (2003) käyttämää menetelmää. Neljä lehteä kustakin järvestä suspensoitiin 50 millilitraan 0,01 % Tween-liuosta saksilla ja leikkurilla (Sorvall Omni-Mixer, 8000 rpm 45 sekuntia). Saatua seosta pipetoitiin 1 millilitra petrimaljalle, ja bakteerikasvun estämiseksi lisättiin millilitra 50 μg/ml kloramfenikolia, niin että kokonaistilavuus 2 ml saatiin levitettyä koko maljan laajuudelle.

Replikaatteja tehtiin kaksi kappaletta kustakin näytteestä. Sieniä kasvatettiin 13–15 °C:ssa 19–

21 vuorokautta.

Sekä endofyytti- että epifyyttiviljelmistä poimittiin yhtä lajia sisältäviin jatkokasvatuksiin steriileillä pinseteillä silmin havaittavia kasvustoja (pesäkkeitä, hyhmää), jotka suspensoitiin 1,5 millilitraan steriiliä vettä. Seos pipetoitiin alustalle. Alustalle pipetoitu suspensio laimennettiin edelleen kymmeneen millilitraan asti steriilillä vedellä. Jatkokasvatuksia kasvatettiin edelleen 13–15 °C:ssa 32 tai 34 vrk.

Analyyseja varten sienet kerättiin maljoilta 15 ml:n Falcon-putkiin. Saman järven epifyyttisienet yhdistettiin omaan putkeensa (2 replikaattia), lehtipalametodilla kasvatetut endofyytit omaansa ja suspensiomenetelmällä kasvatetut omaansa. Tarvittaessa sekaan lisättiin hieman steriiliä vettä näytteen upottamiseksi putken pohjalle. Työskentely tehtiin jäähauteella.

Näytteet varastoitiin -80 °C:ssa.

20 4.3 Rasvahappoanalyysi

Falcon-putkissa olevat näytteet (sekä fyllosfääri- että kasvatusnäytteet) kylmäkuivattiin (Christ ALPHA 1-4 LD Plus, kuivatusaika 24 h, josta 22 h 0,34 mbar ja 2h 0,1 mbar) ja jauhettiin nestetypellä etanolilla ja kloroformi-metanolilla (2:1) puhdistetulla huhmareella. Tämän jälkeen näytteet siirrettiin takaisin -80 °C:een.

Rasvahappoanalyyseilla selvitettiin sienten ja lehtien rasvahappokoostumuksia. Jauhettuja näytteitä punnittiin 3,0–9,0 mg. Punnittu jauhe siirrettiin alumiinikuppeineen jäähauteelle uunissa lämpösteriloituun kloroformi-metanoli -seoksella huuhdeltuun Kimax-putkeen, ja näytteet uutettiin lasikärkisellä täyspipetillä 2 ml kloroformi-metanoli -seosta (2:1). Tämän jälkeen näytteet varastoitiin -20 °C odottamaan seuraavan päivän jatkouuttamista.

Jatkouuttamisessa putkiin lisättiin sisäiset standardit. Lehtinäytteille lisättiin standardiksi 4 μl 21:0 -rasvahappoa (Nu-Chek Prep Inc., 1,00 mg/ml 2:1 kloroformi-metanoli -seosta) ja viljelmille ja näiden kontrolleille 23:0 -rasvahappoa (Nu-Chek Prep Inc., 0,499 mg/ml 2:1 kloroformi-metanoli -seosta). Putkia huuhdeltiin typellä muutaman sekunnin ajan, jonka jälkeen näytteitä sonikoitiin 5 minuuttia solujen hajottamiseksi. Sonikoinnin jälkeen näytteisiin lisättiin 400 μl kaliumkloridia (0,88 % KCl MQ-vedessä). Näytteitä vorteksoitiin muutaman sekunnin ajan ja sentrifugoitiin 3 min 2000 rpm. Sentrifuugissa erottunut alempi faasi siirrettiin uuteen Kimax-putkeen. Ylempään faasiin lisättiin teoreettisen alemman faasin mukaisesti kloroformia, metanolia ja MQ-vettä suhteessa 86:14:1 ja 400 μl 0,88 % KCl-liuosta, jonka jälkeen näytteet vorteksoitiin ja sentrifugoitiin uudelleen loppujen rasvahappojen saamiseksi talteen. Saatu uusi alafaasi yhdistettiin ensimmäisen alafaasin kanssa. Tämän jälkeen näytteet pakastettiin -20 °C.

Seuraavaksi rasvahapot metyloitiin. Pakastetuista näytteistä haihdutettiin nesteet pois 30,0

°C jatkuvan typpivirran alla. Nesteiden haihduttua putket siirrettiin vetokaappiin, jossa niihin lisättiin 1 ml n-heksaania ja 2 ml 1 % H2SO4 (metanoliin sekoitettuna). Putket huuhdottiin typellä N2 ja näytteitä inkuboitiin 90 min ajan 90 °C. Tämän jälkeen putkien annettiin jäähtyä muutaman minuutin ajan ja niihin lisättiin 1,5 ml MQ-vettä ja 4 ml n-heksaania. Putkia vorteksoitiin muutaman sekunnin ajan ja sentrifugoitiin 2 min 2000 rpm. Saatu ylempi faasi siirrettiin uuteen kloroformi-metanoli -seoksella huuhdeltuun Kimax-putkeen. Alempaan faasiin lisättiin 4 ml n-heksaania ja putket vorteksoitiin ja sentrifugoitiin uudelleen aiemman mukaisesti. Muodostunut uusi yläfaasi yhdistettiin aiemmin saatuun yläfaasiin. Tämän jälkeen putkista haihdutettiin heksaani pois 30 °C jatkuvan typpivirran alla.

Heksaanin haihduttua putkiin lisättiin 0,5 tai 1 ml n-heksaania. Putkia vorteksoitiin muutaman sekunnin ajan rasvahappojen monoestereiden sekoittamiseksi, jonka jälkeen kaikki neste pipetoitiin kromatografipulloihin. Tämä toistettiin uudelleen loppujen estereiden saannin varmistamiseksi talteen. Näytteet varastoitiin -20 °C.

Rasvahapot analysoitiin yhdistetyllä kaasukromatografilla ja massaspektrometrilla (GC-MS). Kolonnin (DB-23) pituus oli 30 m ja halkaisija 250 μm. Kolonnin filmin paksuus puolestaan oli 0,25 μm. Massaspektrometrissa käytettiin splitless -moodia. Aloituslämpötila oli 250 °C, ja heliumin kokonaisvirtaus oli 43,8 ml/min. Kaasukromatografin aloituslämpötila oli 50 °C, josta lämpötilaa nostettiin 150 °C:een, ja edelleen 190 °C:een ja vielä 210 °C:een asti. Ajon jälkeen lämpötilaa nostettiin 230 °C:een 2 minuutin ajaksi. Yhden näytteen ajoaika oli 60,67 minuuttia, johon lisätään vielä 10 minuutin väliaika ennen kuin massaspektrometri käsitteli uutta näytettä. Standardinäytteenä käytettiin GLC Reference standard 538:a (Nu-chek Prep Inc.), joista tehtiin neljä eri vahvuista liuosta standardisuoran luomiseksi.

Kromatogrammeista määritettiin rasvahapot niiden retentioaikojen ja massaspektrometrin piikkien avulla. Piikkien pinta-ala laskettiin MSD ChemStation –ohjelmalla (Agilent). Saadut alat koottiin yhteen, ja jokaiselle näytteelle laskettiin sekä määrä mg/g kuivapainoyksikköä kohden että kunkin rasvahapon prosenttiosuus kokonaisrasvahappokoostumuksesta. Näytteistä vähennettiin blank-näytteiden perusteella määritetyn kontaminaation keskiarvo.

4.4 Tilastolliset analyysit

Tilastollisilla testeillä testattiin luokkamuuttujien (epifyytti vs. endofyytti, kirkasvetinen vs.

humuspitoinen, suspensiometodi vs. lehtipalametodi, leppä vs. koivu) ja jatkuvien ympäristömuuttujien (pH, veden lämpötila, veden happipitoisuus, järven koko) vaikutuksia fyllosfäärien ja sienten rasvahappokoostumuksiin. Monimuuttuja-analyysit (maintest ja pairwise PERMANOVA (permutational multivariate analysis of variance)) ja MDS (multidimensional scaling) ordinaatiovisualisoinnit tehtiin Primer 6 & PERMANOVA+ -ohjelmalla. Analyyseihin sisällytettiin mukaan vain ne rasvahapot, joita esiintyi näytteessä vähintään 1 %. MDS-ordinaatioissa käytettiin euklidisia etäisyyksiä. PERMANOVA:a testattiin sekä rasvahappojen määrien että prosenttiosuuksien suhteen. Jatkuvia ympäristömuuttujia puolestaan testattiin DistLM-analyysilla (step-wise, permutaatioiden määrä 999), jolla selvitettiin myös eri muuttujien selitysastetta. Eri luokkamuuttujien eroja rasvahappokoostumuksessa testattiin myös epäparametrisella Mann-Whitneyn U-testillä (IBM SPSS Statistics 25).

PERMANOVA:ssa aineistoon kokeiltiin luonnollista logaritmin muunnosta ja neliöjuurimuunnosta, mutta nämä eivät muuttaneet ratkaisevasti tulosten merkitsevyyttä, joten aineisto jätettiin muuntamatta. Rasvahappojen prosenttiosuuksille kokeiltiin myös muunnosta, mutta tässäkään tapauksessa muutos ei ollut olennaisesti erilainen, joten se jätettiin tekemättä.

Muunnokset voivat myös olla yhdentekeviä tai jopa vääristää tuloksia (Happel ym. 2017), mikä puolsi aineiston jättämistä käsittelemättömäksi.

5 TULOKSET 5.1 Sieniviljelmät

Epifyyttisienillä havaittiin 15 eri rasvahappoa, joista 4 esiintyi ainoastaan kirkasvetisissä järvissä (kuva 2). Endofyyttisienillä havaittiin puolestaan jopa 27 eri rasvahappoa, joista 10 esiintyi ainoastaan kirkasvetisissä ja 4 vain humuspitoisissa järvissä (kuva 3). Epifyyttisienten ja endofyyttisienten rasvahappokoostumukset eivät eronneet toisistaan tilastollisesti merkitsevästi, mutta ero oli kuitenkin lähes merkitsevä (pairwise PERMANOVA p=0,051;

t=2,013). Foliaaristen sienten rasvoista runsaimpina ryhmänä olivat sekä humuspitoisissa että kirkasvetisissä järvissä kertatyydyttymättömät rasvahapot, toiseksi yleisimpänä tyydyttyneet ja erittäin vähäisinä esiintyivät monityydyttymättömät (taulukko 1). Endofyyttisienillä kokeilluilla itiöviljelyllä ja lehtipalaviljelyllä ei ollut merkitsevää eroa sienten rasvahappokoostumusten suhteen (pairwise PERMANOVA p=0,491; t=0,713).

Kirkasvetisten ja humuspitoisten järvien sienten rasvahappokoostumukset eivät eronneet toisistaan tilastollisesti merkitsevästi määrien (pairwise PERMANOVA p=0,73; t=0,515; kuva 4). Järvien kesken sienten rasvahappokoostumukset eivät eronneet tilastollisesti merkitsevästi (maintest PERMANOVA p=0,79; pseudo-F=0,579; df=5).

DistLM-testissä foliaarisia sieniä vertailtaessa selitysarvoksi saatiin 0,154.

Ympäristömuuttujat eivät vaikuttaneet tässäkään tapauksessa merkitsevästi, mutta sienen tyyppi selitti eroja tilastollisesti merkitsevästi tai lähes merkitsevästi (epifyyteille p=0,034 ja endofyyteille p=0,05).

Endofyyttien ω3/ω6-suhde oli hieman korkeampi kuin epifyyttisienten.

Ekotyyppikohtaisesti tarkasteltuna humusjärvissä epifyyttien ja endofyyttien ω3/ω6-suhteen keskiarvo oli kuitenkin sama, kun taas kirkasvetisissä järvissä endofyyttien suhde oli hieman korkeampi, joskin ero jäi keskihajonnan sisään.

Kuva 2. Epifyyttisienten rasvahappojen määrien (mg/g kuivapainoa) keskiarvot keskihajontoineen kirkkaissa ja humuspitoisissa järvissä.

Kuva 3. Endofyyttisienten rasvahappojen määrien (mg/g kuivapainoa) keskiarvot keskihajontoineen kirkasvetisissä ja humuspitoisissa järvissä.

Taulukko 1. Koivun lehden sienten rasvahappojen prosenttiosuuksien keskiarvot ja -hajonnat (SD) ryhmittäin (SAFA, MUFA ja PUFA) humuspitoisissa ja kirkasvetisissä järvissä.

Humusjärvi

Kirkas

järvi

Rasvahappo Epifyytti SD Endofyytti SD Epifyytti SD Endofyytti SD

14:0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,2 0,4 0,2 0,4

Kuva 4. MDS-ordinaatio foliaaristen sienten jakautumisesta kirkasvetisissä ja humuspitoisissa järvissä. K=kirkasvetinen järvi, H=humusjärvi.

5.2 Fyllosfääri

Koivun lehdillä havaittiin 16 eri rasvahappoa, joista 2 esiintyi ainoastaan humusjärvissä (kuva 5). Koivun ja lepän lehtien rasvahappokoostumukset erosivat toisistaan määrien (kuva 6, pairwise PERMANOVA p=0,005; t=2,440) ja prosentuaalisten osuuksien suhteen (p=0,002;

t=2,821). Koivulla runsaimpana esiintyivät tyydyttyneet rasvahapot, kun taas lepällä SAFA:t olivat runsaimpina kirkkaissa järvissä ja PUFA:t olivat runsaimpana humusjärvissä (taulukko 2).

Lehtinäytteillä litoraaleista ja rannoilta kerättyjen lehtinäytteiden rasvahappokoostumukset eivät eronneet tilastollisesti merkitsevästi määrien (kuva 7; pairwise PERMANOVA p=0,44;

t=0,887) eivätkä prosenttiosuuksien suhteen (p=0,383; t=0,992).

Veden kirkkauden suhteen ei havaittu eroa lehtien rasvahappokoostumuksissa määrien (kuva 6; pairwise PERMANOVA p=0,766; t=0,627) eikä rasvahappojen prosenttiosuuksien suhteen (p=0,611; t=0,803). Järvien kesken ei myöskään havaittu merkitseviä eroja (maintest PERMANOVA p=0,742; pseudo-F=0,669; df=5).

Koivun lehtien rasvahappokoostumus erosi endofyyttisten (pairwise PERMANOVA p=0,001; t=5,729) ja epifyyttisten (p=0,001; t=6,219) sienten rasvahappokoostumuksista tilastollisesti merkitsevästi (kuva 8).

Taulukko 2. Litoraalista kerättyjen koivun (Betula sp.) ja lepän (Alnus sp.) fyllosfäärien rasvahappojen prosentuaalisten osuuksien keskiarvot ja -hajonnat ryhmittäin (SAFA, MUFA ja PUFA) humuspitoisissa ja kirkasvetisissä järvissä.

Humuspitoinen Kirkasvetinen

Kuva 5. Koivun ja lepän lehtien rasvahappojen määrien (mg/g kuivapainoa) jakautuminen kirkkaiden ja humuspitoisten järvien litoraalissa. H=humusjärvi, K=kirkasvetinen järvi.

Kuva 6. Kaksiulotteinen MSDS-ordinaatio rasvahappojen ryhmittymisestä lajin ja järven kirkkauden mukaan. K=kirkasvetinen järvi, H=humusjärvi.

Kuva 7. Kaksiulotteinen MSDS-ordinaatio rasvahappojen ryhmittymisestä lajin ja habitaatin mukaan. A=Alnus sp., B=Betula sp., L=litoraali, R=ranta.

Kuva 8. Kaksiulotteinen MDS-ordinaatio rasvahappojen ryhmittymisestä kasvatusnäytteiden ja koivun fyllosfäärien mukaan.

DistLM-testillä testattiin ympäristömuuttujien (pH, veden lämpötila, veden happipitoisuus, järven pinta-ala) vaikutusta lehtien rasvahappokoostumuksiin ja eri tekijöiden selitysastetta eroille. Ympäristömuuttujat eivät vaikuttaneet tilastollisesti merkitsevästi sienten rasvahappokoostumuksiin. Lehtinäytteillä mallin selitysaste (R²) oli 0,286. Suurimman osan rasvahappokoostumusten vaihtelusta selitti lehden taksoni (Alnus sp. p=0,004 ja Betula sp.

p=0,003; pseudo-F=6,323), kun taas ympäristömuuttujat eivät vaikuttaneet tilastollisesti merkitsevästi. Prosentuaalisia osuuksia tarkastellessa mallin selitysaste oli 0,437, josta merkitsevänä tekijänä oli jälleen ainoastaan lehden taksoni (Alnus sp. p=0,001 ja Betula sp.

p=0,001; pseudo-F=8,458).

Koivun lehden rasvahappokoostumusta ja kasvatusnäytteitä vertailtaessa mallin selitysasteeksi saatiin 0,574. Merkitsevästi eroja selittivät endofyyttiset sienet (p=0,001;

pseudo-F=12,698) ja lehti (p=0,001; pseudo-F=35,194), kun taas epifyyttisienet eivät selittäneet merkitsevästi eroja (p=0,07; pseudo-F=2,977), kuten eivät myöskään ympäristömuuttujat. Vastaavia prosenttiosuuksia vertailtaessa mallin selitysasteeksi saatiin 0,814 (lehdelle p=0,001; pseudo-F=135,79; epifyytille p=0,002; pseudo-F=8,489 ja endofyytille p=0,004; pseudo-F=9,130). Ympäristömuuttujat eivät vaikuttaneet merkitsevästi rasvahappokoostumuksiin. Järven kirkkaus ei selittänyt missään tapauksessa eroja tilastollisesti merkitsevästi.

Koivun lehtien ω3/ω6 -suhde oli merkitsevästi korkeampi kuin kasvatettujen foliaaristen sienten (kuva 9; Mann-Whitneyn U-testi p<0,001). Vertailtaessa litoraalista ja järvien rannoilta kerättyjen koivun lehtien ω3/ω6-suhdetta havaittiin, että litoraalivyöhykkeiltä kerätyillä lehdillä suhde oli korkeampi, joskin tämäkin ero jäi keskihajonnan sisään eikä ollut merkitsevä (kuva 10; Mann-Whitneyn U-testi p=0,514).

Koivun lehdellä ainoastaan 18:1-rasvahapon määrä erosi merkitsevästi vertailtaessa litoraalista ja rannalta kerättyjen lehtien välillä (Mann-Whitneyn U-testi, p=0,015). Lepän lehdillä rasvahappojen määrät eivät eronneet litoraalin ja rannan välillä. Kirkkaiden ja humuspitoisten järvien välillä ainoastaan 22:0-rasvahapon määrä erosi merkitsevästi (Mann-Whitneyn U-testi, p=0,002). Lepän lehtien rasvahappojen määrät eivät eronneet merkitsevästi kirkkauden suhteen.

Kuva 9. Koivun fyllosfäärin ja foliaaristen sienten ω3- ja ω6-rasvahappojen määrien (mg/g kuivapainoa) suhteiden keskiarvot keskihajontoineen.

Kuva 10. Litoraalista ja rannalta kerättyjen koivun (Betula) ja lepän (Alnus) lehtien ω3 ja ω6 -rasvahappojen määrien (mg/g kuivapainoa kohden) suhteiden keskiarvot keskihajontoineen.

L=litoraali, R=ranta.

Alnus L Alnus R Betula L Betula R

31 6 TULOSTEN TARKASTELU

Tutkimus onnistui hyvin, joskin näytteiden väliset erot jäivät liian pieniksi, jotta ne olisivat olleet merkitseviä. Epifyyttisten ja endofyyttisten sienten tilastollisesti lähes merkitsevä ero oli yksi tutkimuksen kiinnostavimmista havainnoista. Samoin se, että kertatyydyttymättömät rasvahapot käsittivät neljä viidestä runsaimmasta rasvahaposta kummallakin foliaarisella sieniryhmällä. Järven kirkkaus ei selittänyt merkitsevästi eroja, mutta suuremmalla aineistolla erot voitaisiin mahdollisesti saada paremmin näkyviin, samoin kuin muiden tekijöiden vaikutus.

6.1 Sienten viljely

Sienten viljely oli onnistunutta, joskin kasvavien lajien osuutta lehden koko sieniyhteisöstä ei voida arvioida ilman molekulaarisia tutkimuksia. Endofyyttisienillä eri viljelynaloitusmenetelmillä (lehtipala- ja itiöviljely) ei ollut merkitsevää eroa, mikä oli toivottavaa tutkimuksen ja menetelmien kehittämisen kannalta. Ymppimetodeista lehtien itiöviljely on huomattavasti tehokkaampi työskentelyyn käytetyn ajan takia. Siinä pääsevät edustetuiksi myös kaikki sienet lehden eri osista. Toisaalta itiöviljely voi suosia nopeasti itiöitä tuottavia lajeja. Hitaammin reagoivat ja itiöitä tuottavat lajit voivatkin olla paremmin edustettuina lehtipalanäytteissä.

Viljely ei takaa luotettavaa tulosta näytteen koko sienikannasta. Mikrobiviljelmistä saadaan havaittua tällä menetelmällä vain pieni osa mikrobistosta (Kirchman 2012). Näytteen sisältämien lajien kasvuolosuhteet ja tarvittavat vuorovaikutukset muiden eliöiden kanssa voivat johtaa tulosharhaan, kun vain osa lajeista kykenee kasvamaan kasvualustalla. Näin ollen viljelyolosuhteet voivat vaikuttaa maljoille valikoituvaan lajistoon ja sienten ravintoarvoihin.

Esimerkiksi jo muutaman asteen lämpötilamuutokset voivat aiheuttaa toisistaan poikkeavia tuloksia rasvahappokoostumuksissa (Müller ym. 1994, Stahl & Klug 1996). Näin ollen kokeen tulokset eivät vastaa luonnollista tilannetta, vaan ovat suuntaa-antavia. Lisäksi lehteä hajottavat sienet voivat muodostaa ravinnollisesti runsaampia rakenteita, kuten rihmaa ja konidioita.

Rasvahappokoostumus vaihdellee paitsi eri sienilajien myös lajinsisäisten rakenteiden välillä.

Tämä tulisi huomioida aina, kun on kyseessä laboratorio-olosuhteissa kasvatettu sieninäyte.

Rasvahappokoostumus muuttuu myös nopeasti ympäristömuutosten seurauksena, ja näytteiden keruu olisikin suotavaa paitsi useampana ajankohtana myös useammasta paikasta.

Kasvusubstraatin suuren vaikutuksen takia tämän tutkimuksen tuloksia tulee tarkastella kriittisesti, sillä agar tarjoaa erilaiset ravintoarvot verrattuna puusta pudonneeseen lehteen, mikä voi näkyä rasvahappokoostumusten eroina luonnollisissa ja laboratorion olosuhteissa.

6.2 Foliaaristen sienten ravintoarvot

Koivun epifyyttisten ja endofyyttisten sienten rasvahappokoostumukset eivät eronneet toisistaan merkitsevästi, mutta ero on kuitenkin lähes merkitsevä. DistLM-testillä havaittiin, että sienen kuuluminen epifyytteihin ja endofyytteihin selitti 15,4 % näytteiden välisestä vaihtelusta rasvahappokoostumuksissa. Huomionarvoista on myös se, että analyyseihin sisällytetyistä rasvahapoista (>1% kokonaisrasvahappokoostumuksesta) endofyyttisienillä esiintyi 27 eri rasvahappoa, kun taas epifyyttisienillä vain 15. Pitkäketjuisin rasvahappo epifyyttisienillä oli C19, kun taas endofyyttisienillä se oli C22. Koska lehden endofyyttilajisto määräytyy kasvin eläessä, lienee endofyyttien rasvahappokoostumuskin pitkälti määräytynyt puun kehityshistorian mukaan, rasvahappokoostumuksen muunnellessa sienen metabolisten rajojen puitteissa. Näin ollen voisi myös olettaa, että lehden päätyminen järveen vähentää endofyyttisen lajiston runsautta muiden hajottajien kolonisoidessa lehden, minkä pitäisi näkyä myös rasvahappokoostumuksen yksinkertaistumisena. Näin ei kuitenkaan tutkimuksessa ollut, mikä voisi selittyä joko sillä, että A) endofyyttisienet pysyvät lehden kudoksessa pidempään kuin on luultu, B) endofyyttien rasvahappokoostumus on luonnostaan monipuolinen, eikä lajiston yksinkertaistuminen heijastu rasvahappoihin ja/tai C) lehdet ovat päätyneet järveen niin vähän aikaa ennen näytteiden keräämistä, ettei akvaattista lehden hajottajayhteisön sukkessiota ole vielä alkanut tapahtua.

Yleisin SAFA foliaarisilla sienillä oli 16:0. Yleisin MUFA oli 17:1, mutta myös 16:1 ja 18:1 esiintyivät sangen runsaina (yli 10 % rasvahappojen määrästä). Vähäisen esiintyvyyden ja suuren keskihajonnan takia monityydyttymättömistä rasvahapoista minkään niistä ei voida sanoa olevan yleisin.

Kasvatusnäytteissä havaituista rasvahapoista huomattavan suuri osa oli kertatyydyttymättömiä, runsaimpina C16–C19 -kertatyydyttymättömät rasvahapot. rasvahappoa esiintyi monissa sieniviljelmissä, kun taas fyllosfääreistä sitä ei havaittu. 19:1-rasvahappoa on havaittu esiintyvän ennenkin mikrobi- ja sieniyhteisöissä (Frostegård ym.

1993). Vastaava kertatyydyttymättömien rasvahappojen runsaus on havaittu myös endofyyttisillä Colletotrichum- ja Alternaria-sukujen sienillä (Dey ym. 2011), joskaan he eivät

havainneet 19:1 esiintymistä. Toisin kuin lehdillä, foliaarisilla sienillä esiintyi havaittavia määriä 14:0-17:0 -rasvahappojen anteiso- ja isomuotoja.

Epifyyteillä havaittiin pitkäketjuisina PUFA:ina 18:2ω6 ja 18:3ω6, kun taas endofyyttisienillä pitkäketjuisia monityydyttymättömiä rasvahappoja olivat 18:2ω6, 18:3ω6, 20:4ω6, 21:3 ja 22:4. Näytteissä esiintyi suhteellisen paljon 17:1-rasvahappoja. Havainto on mielenkiintoinen, sillä Pseudozyma floccuosa -hiivan on havaittu tuottavan näitä puolustautuakseen härmää vastaan (Avis & Bélanger 2002). Myös Candida-suvun sienet voivat kerryttää tyydyttymättömiä C17-rasvahapoja (Shirasaka ym. 1995). Herääkin kysymys, voisiko tyydyttymättömillä C17-rasvahapoilla olla erityinen tarkoitus sienten puolustusmekanismina.

Vaikka eritetyt 17:1-rasvahapot voivat olla toksisia muille sienille, ne eivät kuitenkaan välttämättä ole haitallisia korkeamman trofiatason eliöille, etenkään jos niiden pitoisuudet ovat alhaisia.

Epifyyttisillä hiivoilla on havaittu tyydyttymättömien rasvahappojen olevan tyydyttyneitä runsaampia, vaikkakin runsaimpina esiintyivät 16:0 ja 18:0 (Zviagintseva ym. 1975). Myös tässä tutkimuksessa 16:0 oli runsain foliaarisilla sienillä, kun taas 18:0 ei esiintynyt juurikaan.

Sekä epifyyttisillä että endofyyttisillä sienillä havaittiin, että valtaosa rasvahapoista oli kertatyydyttymättömiä ja vain pieni osa monityydyttymättömiä, mikä tukee Zviagintseva ym.

(1975) saamia tuloksia. He havaitsivat myös tyydyttymättömien rasvahappojen esiintyvän runsaampina epifyyttisillä hiivoilla kuin maaperän hiivoilla, mikä voisi viitata tyydyttymättömien rasvahappojen tärkeyteen epifyyttien metaboliassa. Tämä tutkimus ei kuitenkaan erotellut hiivoja ja homeita toisistaan, vaan käsitti koko sieniyhteisön rasvahappokoostumuksen, mikä onkin mielekkäämpää ravintoketjun tutkimisen kannalta.

Välttämättömistä rasvahapoista epifyyttisienillä havaittiin esiintyvän LIN:a.

Endofyyttisienillä havaittiin puolestaan sekä LIN:a, ARA:a että DHA:ta. LIN:a esiintyi foliaarisilla sienillä kaikissa järvissä paitsi Kuoringassa. Niiden osuus koko näytteen koostumuksesta vaihteli välillä 1,1–4,4 % (0,08-0,60 mg/g DW). Endofyyttisienillä LIN:n osuus oli yhtä suuri kirkasvetisissä ja humuspitoisissa järvissä, kun taas epifyyttisienillä osuus oli kirkasvetisissä järvissä hieman korkeampi. ARA:a ja DHA:ta havaittiin kuitenkin vain Sompalammelta kerätystä näytteestä, ja kummankin osuus näytteen rasvahappokoostumuksesta oli alle 2 %. Osuudet ovat huomattavasti alhaisempia kuin Funckin ym. (2015) Hyphomycetes-luokan sienillä havaitsevat LIN:n ja ALA:n osuudet, jotka kattoivat jopa 32-53% tutkittujen sienten rasvahappokoostumuksesta. Herääkin kysymys, konsentroituvatko ALA ja LIN akvaattisessa ravintoverkossa niin, että ne kattavat jo huomattavan osan ”aidosti akvaattisen”

mikrobiston rasvahappokoostumuksesta. Jos niin on, niin mikseivät siinä tapauksessa

pidemmät välttämättömät rasvat näy Funckin ym. (2015) tutkimien sienten rasvahappokoostumuksissa? On myös mahdollista, että akvaattiset sienet syntetisoivat lyhytketjuisempia ALA:a ja LIN:a de novo, kun taas pidempien monityydytymättömien rasvahappojen synteesi ei onnistuisi sopivan desaturaasientsyymin puuttuessa. Niin tai näin, foliaaristen sienet vaikuttaisivat olevan köyhiä ravinnonlähteitä välttämättömien rasvahappojen suhteen.

Endofyyttien ω3/ω6-suhde oli lievästi korkeampi kuin epifyyttisten sienten, mutta ero ei ollut merkitsevä. Havainto on kuitenkin mielenkiintoinen, ja voisi selittyä fysiologisilla ja metabolisilla eroilla liittyen sienityypin ekologiaan. Epifyyttiset sienet ovat endofyyttisiä sieniä alttiimpia ulkoisille stressitekijöille kuten säteilylle (Timonen & Valkonen 2018), ja epifyyttilajisto voisikin häiriintyä järveen päätymisestä niin paljon, että se korvautuu muilla lajeilla. Epifyyttisten sienten rasvahappojen vähäisyyttä ja heikompaa ravinnollista laatua endofyyttien rasvahappoihin verrattuna voisikin selittää levien kasvu lehdillä. Levät kilpailisivat joko suoraan tai epäsuorasti sienten kanssa, heikentäen sienten biodiversíteettiä.

Tätä selitystä tukee se, että koivun lehtien ω3/ω6-suhde oli hieman korkeampi litoraalin lehdillä kuin rannalta kerätyillä lehdillä. Tutkimuksessa käytetty aineisto on kuitenkin sangen suppea, ja tarkemmissa lisätutkimuksissa voitaisiin kenties löytää luotettavammin eroja eri muuttujien välille. Näin pienellä näytekoolla erot ja niiden puuttuminen voivat selittyä helposti yhden tai muutaman näytteen poikkeavuudella.

Sekä epifyyttisillä että endofyyttisillä sienillä on havaittu kyky alkaa hajottajaa lehden solukkoa sen kuoltua (Timonen & Valkonen 2018). Tällöin on sangen mahdollista, että sienen fysiologinen tila muuttuu suurestikin, ja homemaisia pesäkkeitä tai jopa hyyfirakenteita saattaisi ilmaantua lehdelle. Tällaiset rakenteet lisäisivät huomattavasti sienen biomassaa lehdellä, ja parantaisivat lehden ravintoarvoa benthoksen kuluttajille. Pohjaeläinten on havaittu suosivan sientä sisältäviä lehtiä ravintonaan (mm. Bärlocher & Kendrick 1974), mutta tällaisissa kokeissa sieni on usein saatavilla juurikin pohjaeläimille arvokkaampana hyyfinä, mikä ei simuloi välttämättä luonnollisinta tilannetta kaikilla lajeilla, etenkään kun olosuhteista riippuen sienet joutuvat kilpailemaan bakteerien kanssa lehden ravinteista (Mille-Lindblom &

Tranvik 2003). Tällöin lienee todennäköistä, että sienet esiintyvät usein myös joko pieninä pesäkkeinä tai hiivamaisina soluina. Koivun lehden rasvahappokoostumuksen ω3/ω6-suhde oli huomattavasti korkeampi kuin viljeltyjen sienten, ja pohjaeläinten kannalta koko lehden käyttäminen ravinnoksi voisikin olla tehokkaampaa leväbiofilmin ollessa vähäinen.

6.3 Terrestrisen ja akvaattisen rasvahappokoostumuksen erot

Kuten aiemmin todettiin, jako akvaattisiin ja terrestrisiin sieniin on kiistanalainen, koska osa sienilajeista voi esiintyä kummassakin habitaatissa tai elää vain osan elinkierrostaan vedessä (Wurzbacher ym. 2010), Esimerkiksi vahvasti akvaattisiksi luetun Hyphomycetes-luokan sienten itiöitä on löydetty virtaavia vesiä ympäröiviltä alueilta ja puiden lehdiltä endofyytteinä (Chauvet ym. 2016). Tämä vähentää sekä sieniyhteisö- että rasvahappokoostumuksen eroamisen todennäköisyyttä. Toisaalta lehden hajotusprosessin edetessä foliaariset sienet korvautuvat nopeasti tehokkaammilla pioneerihajottajilla (Timonen & Valkonen 2018), mikä voi luoda suhteellisen nopeasti eroja terrestrisen ja akvaattisen habitaatin välille.

Kuten odotettiin, eroja löytyi koivun ja lepän lehden välillä, mutta rannan ja litoraalin lehtien rasvahappokoostumusten erot eivät olleet merkitseviä kummallakaan taksonilla, Tämä selittyy pienellä aineistolla, vaikkakin rannan ja litoraalien lehtien rasvahappokoostumusten ero oli siitä huolimatta huomattavan vähäinen. Koivun lehdellä ainoastaan 18:1-rasvahapon määrä erosi merkitsevästi vertailtaessa litoraalista ja rannalta kerättyjen lehtien välillä, kun taas lepän lehdillä mikään rasvahappo ei eronnut eri habitaattien välillä. Tätä voi selittää se, että tutkimuksessa käytetty aineisto on satunnaisesti kerätty eikä lehtien päätymisestä järveen ole tietoa. Jatkotutkimuksissa lehtien inkubointiaika järvivedessä tulisikin standardoida eron

In document Koivun (Betula sp.) foliaaristen sienten rasvahapot kirkkaiden ja humuspitoisten järvien litoraalissa (sivua 19-0)