Foliaaristen sienten rasvahapot - Rasvahappojen merkitys ravintoverkossa

2.3 Rasvahappojen merkitys ravintoverkossa

2.3.2 Foliaaristen sienten rasvahapot

Virtaavissa vesissä pohjaeläinten on havaittu kuluttavan sientä sisältävät lehdet muita tehokkaammin ravinnokseeen (Bärlocher & Kendrick 1974). Sama ilmiö esiintynee myös järviekosysteemeissä. Toisaalta kaikki sienet eivät ole välttämättä sopivia pohjaeläinten ravinnoksi (Bärlocher & Kendrick 1973) Esimerkiksi endofyyttiset sienet voivat erittää mykotoksiineja, kuten alkaloideja, jotka ovat myrkyllisiä niitä syöville hyönteisille (Timonen

& Valkonen 2018).

Sienten ja muiden mikrobien kolonisoitua lehti sen päädyttyä järveen fyllosfäärin ravintoarvo paranee paitsi mikrobien itsensä lisäämän ravintoarvon myös niiden toiminnan seurauksena lehdistä käyttökelpoisempaan muotoon saatavien ravinteiden johdosta (Bärlocher 1985). Kaikki pohjaeläimet eivät kuitenkaan kykene hyödyntämään mikrobien lehdelle tuomaa ravintolisää. Kykyyn vaikuttavat muiden muassa pohjaeläinten liikkuvuus, pohjaeläimen käyttämien ravintolähteiden määrä ja kyky torjua mikrobien puolustusmekanismeja kuten mykotoksiinien eritystä.

Lehtien epifyyttisten sienten roolia järviekosysteemissä ei ole tutkittu paljoakaan. Aihetta sivuavia tutkimuksia kuitenkin löytyy. Esimerkiksi Ellis ym. (2002) tutkivat levän kuoressa epifyyttinä elävän Fusarium oxysporum -sienen rasvahappokoostumusta. He havaitsivat, että sienessä esiintyi pääasiassa 16:0-, 18:0- ja 18:1ω9-rasvahappoja, jotka käsittivät 47 % koko rasvahappokoostumuksesta. Tämä osuus on huomattavasti vähemmän kuin Funckin ym. (2015) kahdeksasta Hyphomycetes-luokan sienestä löytämä viiden yleisimmän rasvahapon osuus, jotka yhdessä kattoivat yli 94 % niiden koko rasvahappokoostumuksesta. Lisäksi F. oxysporum -sienen kvalitatiivinen rasvahappokoostumus on ravintoarvoiltaan köyhempi, sillä välttämättömiä rasvahappoja ei esiintynyt merkittävästi.

Myös epifyyttisillä hiivoilla 16:0- ja 18:0-rasvahapot dominoivat rasvahappokoostumuksessa (Zviagintseva ym. 1975). Mielenkiintoinen havainto on, että tyydyttymättömät rasvahapot ovat runsaampia epifyyttisillä hiivoilla kuin maaperässä esiintyvillä Lipomyces-suvun hiivoilla. Epifyyttien rasvahappokoostumus sisälsi lisäksi pitkäketjuisia rasvahappoja maaperän hiivoja enemmän. Mikäli ilmiö on yleinen epifyyteillä, lehtien pudotessa maahan epifyyttiset hiivat voisivat tarjota sekä terrestrisille että akvaattisille karikkeen kuluttajille tärkeän pitkäketjuisten ja tyydyttymättömien rasvahappojen lähteen.

Toinen aihetta sivuava tutkimus selvitti, että epifyyttisen Pseudozyma flocculosa -hiivan kykenee tuottavamaan solun ulkopuolelle eritettäviä 17:1-rasvahappoja, jotka haittaavat muiden sienten kasvua (Avis & Bélanger 2002). Havainto on mielenkiintoinen, sillä Candida-suvun sienten on havaittu akkumuloivan tyydyttymättömiä C17-rasvahappoja. Herääkin kysymys, voisiko tyydyttymättömillä C17-rasvahapoilla olla rooli yleisempänä sienten puolustusmekanismina. Joka tapauksessa tällainen C17-rasvahappojen kerryttäminen sekä mahdollinen de novo -synteesi toisi niitä pohjaeläinten käyttöön benthoksessa. Vaikka tyydyttymättömät C17-rasvat haittaisivatkin muiden sienten kasvua, ei niillä välttämättä olisi toksista vaikutusta korkeamman trofiatason eliöille.

Lehtien endofyyttisten sienten rasvahappokoostumuksia on tutkittu jopa vielä vähemmän kuin epifyyttien. Dey ym. (2011) eristivät endofyyttisiä Colletotrichum- ja Alternaria- sukujen kantoja kahdesta ruohovartisesta kasvista. He havaitsivat kertatyydyttymättömien rasvahappojen kattavan yli 60 % sienten neutraaleista rasvahapoista, kun taas tyydyttyneiden osuus oli noin 12–16 % ja monityydyttymättömien 24–28 %. Samankaltaiset suhteet ilmenivät myös sienten glykolipideillä, kun taas fosfolipideillä tyydyttyneiden osuudet olivat noin 41 ja 52 %, kertatyydyttymättömien 24–28 % ja monityydyttymättömien 21–23 %. Välttämättömistä rasvahapoista ALA ja LIN olivat runsaimmat. LIN kattoi jopa 23 % koko neutraalien rasvahappojen määrästä. Myös ALA esiintyi kaikissa luokissa, runsaimpana fosfolipideissä, joissa sen osuus koko fosfolipidikoostumuksesta oli jopa yli 7 %. Mikäli samankaltainen rasvahappokoostumus esiintyisi myös puiden lehtien endofyyttisillä sienillä, voisivat nämä tarjota välttämättömien rasvahappojen ”ravintolisän” lehteä ravintonaan hyödyntäville kuluttajille niin akvaattisessa kuin terrestrisessäkin ekosysteemissä.

Monilla mikrosienillä on useita eri rakenteita riippuen ympäristöolosuhteista. Esimerkiksi epifyyttisienet voivat muodostaa kestoitiöitä, jotka selviytyvät pitkiä aikoja lehden pinnalla (Timonen & Valkonen 2018). Olosuhteiden muuttuessa paremmiksi sieni aktivoituu ja alkaa kasvattaa rihmaa tunkeutuakseen lehden solukkoon. Laboratoriossa sieniä kasvatetaan useimmiten ravinnealustoilla, jolloin olosuhteet voivat alkaa suosia rihmastomaista kasvua lepoitiöiden ja hiivamaisen jakautumisen sijaan. Tällä on hyvin luultavasti vaikutusta myös sienen rasvahappometaboliaan ja näin ollen ravintoarvoihin. Eri sienillä on luonnossa erilaisia ympäristöolojen määräämiä kasvutapoja, ja nämä tulisikin tuntea taksonikohtaisesti mahdollisimman tarkan kuvan saamiseksi niiden roolista ravintoverkossa.

17 3 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET

Tutkimuksessa vertailtiin kolmen kirkasvetisen ja humuspitoisen järven sieniyhteisöjen rasvahappokoostumuksia. Tutkimuksessa kasvatettiin järvien litoraalivyöhykkeeltä kerättyjen koivun lehtien endofyyttisiä ja epifyyttisiä sieniä agar-maljoilla. Fyllosfäärin kokonaisrasvahappokoostumusta tarkasteltiin koivun lisäksi lepän lehdillä.

Tutkimuskysymyksiä oli neljä:

1) Mitä rasvahappoja akvaattisilla sienillä esiintyy?

2) Kumpi sieniryhmä tarjoaa parempia rasvahappoja, epifyyttiset vai endofyyttiset sienet?

3) Eroavatko lehden terrestrinen (ranta) ja akvaattinen (litoraali) rasvahappokoostumus toisistaan?

4) Eroavatko humusjärvien ja kirkasvetisten järvien rasvahappokoostumukset toisistaan?

4 MATERIAALIT JA MENETELMÄT 4.1 Näytteiden kerääminen

Näytteet kerättiin Pohjois-Karjalasta kuudesta järvestä (Kuorinka, Sompalampi, Ylinen, Onkilampi, Pyhäselkä, Mekrijärvi; kuva 1) ja niiden rannoilta 17. ja 18.10.2018. Kolme ensin mainittua olivat kirkasvetisiä ja jälkimmäiset kolme humuspitoisia.

Jokaisesta järvestä mitattiin veden lämpötila ja happipitoisuus (YSI Professional Plus (Pro Plus)) ja otettiin vesinäyte pH-mittauksia varten. Järvivesien pH mitattiin 25 °C:ssa (Consort P600, TEOPAL). Lisäksi kirjattiin järven pohjatyyppi, näytteenottoetäisyys. näytteiden keräämiseen käytetty aika ja havaintoja ympäristöstä. Näytteiksi kerättiin lehtiä litoraalivyöhykkeen pohjasta potkuhaavilla. Lisäksi järvien rannoilta poimittiin 3–6 koivun lehteä ja 1–4 lepän lehteä Falcon-putkiin fyllosfäärien kokonaisrasvahappokoostumusanalyyseja varten. Rasvahappoanalyysiin meneviä lehtinäytteitä säilytettiin matkan ajan jäillä kylmälaukussa, ennen kuin ne säilöttiin -80 °C:ssa 1,5–5 tunnissa (17.10.) tai 0,5–2 tunnissa (18.10). Viljelynäytteiksi päätyvät lehdet laitettiin kuljetuksen ja säilytyksen ajaksi lehdet 10 l ämpäreihin, joissa oli kyseisen järven vettä.

Näytteitä säilytettiin kaksi päivää 4 °C:ssa ennen kasvatusten aloittamista.

Kuva 1. Näytteenottopaikkojen sijainti. 1=Kuorinka, 2=Sompalampi, 3=Pyhäselkä, 4=Ylinen, 5=Onkilampi, 6=Mekrijärvi.

4.2 Sienten viljely

Sieniä kasvatettiin kiinteällä hiiva-mallas -agarilla (YM-agar, Sigma-Aldrich). Alustat valettiin valmistajan ohjeiden mukaan sekoittamalla 750 ml tislattua vettä 30,77 g YM-agarjauhetta, ja lämmittämällä seosta mikrossa, kunnes seos kiehui (n. 13 min, välillä lasisauvalla sekoittaen).

Lämmitettyä seosta kaadettiin kasvatuspurkkeihin 30 ± 1 ml. Purkkien kannet suljettiin ja alustat autoklavoitiin (1h, 121 °C). Alustojen jäähdyttyä purkit varastoitiin kylmähuoneeseen (4°C).

Sieniympit tehtiin kahdella eri tavalla menetelmien vertailemiseksi. Ensimmäisessä metodissa (lehtipalametodi) lehdistä puhdistettiin biofilmi ottamalla mallia Rakotorianan ym.

(2008) endofyyttisten sienten tutkimuksesta ja tavanomaisesta kasvisolukkoviljelmän steriloinnista. Lehtiä liotettiin noin viisi minuuttia ionivaihdetussa vedessä, johon oli lisätty 10

% Tween-liuosta (polyetyleeniglykonisorbitaanimonolauraatti). Tästä eteenpäin työskentely suoritettiin aseptisesti laminaarikaapissa. Lehtiä liotettiin minuutin ajan 70 % etanolissa, josta ne siirrettiin 3,5 % natriumhypokloriittiin kymmenen minuutin ajaksi. Seuraavaksi lehtiä liotettiin 30 sekuntia 70 % etanolissa. Lehdet siirrettiin likoamaan steriiliin veteen viideksi

minuutiksi, jonka jälkeen vesi vaihdettiin ja lehtiä liotettiin toiset viisi minuuttia. Tämä toistettiin vielä kerran. Biofilmin puhdistamisen jälkeen lehdistä leikattiin liekissä sterilisoidulla skalpellilla noin 3–6 mm²palasia eri osista lehtiä, joista kuusi palaa siirrettiin kummallekin kasvualustalle.

Toisessa ymppimetodissa (itiömenetelmä) lehdet siirrettiin biofilmin poistamisen jälkeen steriileihin 500 ml:n erlenmayerpulloihin, joissa oli 200 ml steriiliä vettä. Pullojen suuaukot peitettiin ohuella, steriilillä pahvilla ilman vaihtumisen takaamiseksi ja kontaminaation estämiseksi. Näytteitä sekoitettiin huoneenlämmössä sekoittajalla noin 42–66 tuntia hapekkuuden parantamiseksi ja itiöiden tuottamisen aloittamiseksi. Tämän menetelmän tavoitteena oli saada lehden eri osien sienet kasvamaan maljoilla, ensimmäisen menetelmän jättäessä osan lehden sienilajistosta väkisinkin puuttumaan satunnaisesti leikattujen lehtipalojen edustaessa koko lehteä. Kummallakin tavalla tehtyihin kasvatuspurkkeihin lisättiin 10 ml steriiliä vettä muodostamaan ohuen vesifaasin. Viljelmät siirrettiin kasvamaan 13–15 °C:een noin kolmeksi viikoksi.

Epifyyttisieniä kasvatettiin YM-agarilla petrimaljoilla soveltaen Woodyn ym. (2003) käyttämää menetelmää. Neljä lehteä kustakin järvestä suspensoitiin 50 millilitraan 0,01 % Tween-liuosta saksilla ja leikkurilla (Sorvall Omni-Mixer, 8000 rpm 45 sekuntia). Saatua seosta pipetoitiin 1 millilitra petrimaljalle, ja bakteerikasvun estämiseksi lisättiin millilitra 50 μg/ml kloramfenikolia, niin että kokonaistilavuus 2 ml saatiin levitettyä koko maljan laajuudelle.

Replikaatteja tehtiin kaksi kappaletta kustakin näytteestä. Sieniä kasvatettiin 13–15 °C:ssa 19–

21 vuorokautta.

Sekä endofyytti- että epifyyttiviljelmistä poimittiin yhtä lajia sisältäviin jatkokasvatuksiin steriileillä pinseteillä silmin havaittavia kasvustoja (pesäkkeitä, hyhmää), jotka suspensoitiin 1,5 millilitraan steriiliä vettä. Seos pipetoitiin alustalle. Alustalle pipetoitu suspensio laimennettiin edelleen kymmeneen millilitraan asti steriilillä vedellä. Jatkokasvatuksia kasvatettiin edelleen 13–15 °C:ssa 32 tai 34 vrk.

Analyyseja varten sienet kerättiin maljoilta 15 ml:n Falcon-putkiin. Saman järven epifyyttisienet yhdistettiin omaan putkeensa (2 replikaattia), lehtipalametodilla kasvatetut endofyytit omaansa ja suspensiomenetelmällä kasvatetut omaansa. Tarvittaessa sekaan lisättiin hieman steriiliä vettä näytteen upottamiseksi putken pohjalle. Työskentely tehtiin jäähauteella.

Näytteet varastoitiin -80 °C:ssa.

20 4.3 Rasvahappoanalyysi

Falcon-putkissa olevat näytteet (sekä fyllosfääri- että kasvatusnäytteet) kylmäkuivattiin (Christ ALPHA 1-4 LD Plus, kuivatusaika 24 h, josta 22 h 0,34 mbar ja 2h 0,1 mbar) ja jauhettiin nestetypellä etanolilla ja kloroformi-metanolilla (2:1) puhdistetulla huhmareella. Tämän jälkeen näytteet siirrettiin takaisin -80 °C:een.

Rasvahappoanalyyseilla selvitettiin sienten ja lehtien rasvahappokoostumuksia. Jauhettuja näytteitä punnittiin 3,0–9,0 mg. Punnittu jauhe siirrettiin alumiinikuppeineen jäähauteelle uunissa lämpösteriloituun kloroformi-metanoli -seoksella huuhdeltuun Kimax-putkeen, ja näytteet uutettiin lasikärkisellä täyspipetillä 2 ml kloroformi-metanoli -seosta (2:1). Tämän jälkeen näytteet varastoitiin -20 °C odottamaan seuraavan päivän jatkouuttamista.

Jatkouuttamisessa putkiin lisättiin sisäiset standardit. Lehtinäytteille lisättiin standardiksi 4 μl 21:0 -rasvahappoa (Nu-Chek Prep Inc., 1,00 mg/ml 2:1 kloroformi-metanoli -seosta) ja viljelmille ja näiden kontrolleille 23:0 -rasvahappoa (Nu-Chek Prep Inc., 0,499 mg/ml 2:1 kloroformi-metanoli -seosta). Putkia huuhdeltiin typellä muutaman sekunnin ajan, jonka jälkeen näytteitä sonikoitiin 5 minuuttia solujen hajottamiseksi. Sonikoinnin jälkeen näytteisiin lisättiin 400 μl kaliumkloridia (0,88 % KCl MQ-vedessä). Näytteitä vorteksoitiin muutaman sekunnin ajan ja sentrifugoitiin 3 min 2000 rpm. Sentrifuugissa erottunut alempi faasi siirrettiin uuteen Kimax-putkeen. Ylempään faasiin lisättiin teoreettisen alemman faasin mukaisesti kloroformia, metanolia ja MQ-vettä suhteessa 86:14:1 ja 400 μl 0,88 % KCl-liuosta, jonka jälkeen näytteet vorteksoitiin ja sentrifugoitiin uudelleen loppujen rasvahappojen saamiseksi talteen. Saatu uusi alafaasi yhdistettiin ensimmäisen alafaasin kanssa. Tämän jälkeen näytteet pakastettiin -20 °C.

Seuraavaksi rasvahapot metyloitiin. Pakastetuista näytteistä haihdutettiin nesteet pois 30,0

°C jatkuvan typpivirran alla. Nesteiden haihduttua putket siirrettiin vetokaappiin, jossa niihin lisättiin 1 ml n-heksaania ja 2 ml 1 % H2SO4 (metanoliin sekoitettuna). Putket huuhdottiin typellä N2 ja näytteitä inkuboitiin 90 min ajan 90 °C. Tämän jälkeen putkien annettiin jäähtyä muutaman minuutin ajan ja niihin lisättiin 1,5 ml MQ-vettä ja 4 ml n-heksaania. Putkia vorteksoitiin muutaman sekunnin ajan ja sentrifugoitiin 2 min 2000 rpm. Saatu ylempi faasi siirrettiin uuteen kloroformi-metanoli -seoksella huuhdeltuun Kimax-putkeen. Alempaan faasiin lisättiin 4 ml n-heksaania ja putket vorteksoitiin ja sentrifugoitiin uudelleen aiemman mukaisesti. Muodostunut uusi yläfaasi yhdistettiin aiemmin saatuun yläfaasiin. Tämän jälkeen putkista haihdutettiin heksaani pois 30 °C jatkuvan typpivirran alla.

Heksaanin haihduttua putkiin lisättiin 0,5 tai 1 ml n-heksaania. Putkia vorteksoitiin muutaman sekunnin ajan rasvahappojen monoestereiden sekoittamiseksi, jonka jälkeen kaikki neste pipetoitiin kromatografipulloihin. Tämä toistettiin uudelleen loppujen estereiden saannin varmistamiseksi talteen. Näytteet varastoitiin -20 °C.

Rasvahapot analysoitiin yhdistetyllä kaasukromatografilla ja massaspektrometrilla (GC-MS). Kolonnin (DB-23) pituus oli 30 m ja halkaisija 250 μm. Kolonnin filmin paksuus puolestaan oli 0,25 μm. Massaspektrometrissa käytettiin splitless -moodia. Aloituslämpötila oli 250 °C, ja heliumin kokonaisvirtaus oli 43,8 ml/min. Kaasukromatografin aloituslämpötila oli 50 °C, josta lämpötilaa nostettiin 150 °C:een, ja edelleen 190 °C:een ja vielä 210 °C:een asti. Ajon jälkeen lämpötilaa nostettiin 230 °C:een 2 minuutin ajaksi. Yhden näytteen ajoaika oli 60,67 minuuttia, johon lisätään vielä 10 minuutin väliaika ennen kuin massaspektrometri käsitteli uutta näytettä. Standardinäytteenä käytettiin GLC Reference standard 538:a (Nu-chek Prep Inc.), joista tehtiin neljä eri vahvuista liuosta standardisuoran luomiseksi.

Kromatogrammeista määritettiin rasvahapot niiden retentioaikojen ja massaspektrometrin piikkien avulla. Piikkien pinta-ala laskettiin MSD ChemStation –ohjelmalla (Agilent). Saadut alat koottiin yhteen, ja jokaiselle näytteelle laskettiin sekä määrä mg/g kuivapainoyksikköä kohden että kunkin rasvahapon prosenttiosuus kokonaisrasvahappokoostumuksesta. Näytteistä vähennettiin blank-näytteiden perusteella määritetyn kontaminaation keskiarvo.

4.4 Tilastolliset analyysit

Tilastollisilla testeillä testattiin luokkamuuttujien (epifyytti vs. endofyytti, kirkasvetinen vs.

humuspitoinen, suspensiometodi vs. lehtipalametodi, leppä vs. koivu) ja jatkuvien ympäristömuuttujien (pH, veden lämpötila, veden happipitoisuus, järven koko) vaikutuksia fyllosfäärien ja sienten rasvahappokoostumuksiin. Monimuuttuja-analyysit (maintest ja pairwise PERMANOVA (permutational multivariate analysis of variance)) ja MDS (multidimensional scaling) ordinaatiovisualisoinnit tehtiin Primer 6 & PERMANOVA+ -ohjelmalla. Analyyseihin sisällytettiin mukaan vain ne rasvahapot, joita esiintyi näytteessä vähintään 1 %. MDS-ordinaatioissa käytettiin euklidisia etäisyyksiä. PERMANOVA:a testattiin sekä rasvahappojen määrien että prosenttiosuuksien suhteen. Jatkuvia ympäristömuuttujia puolestaan testattiin DistLM-analyysilla (step-wise, permutaatioiden määrä 999), jolla selvitettiin myös eri muuttujien selitysastetta. Eri luokkamuuttujien eroja rasvahappokoostumuksessa testattiin myös epäparametrisella Mann-Whitneyn U-testillä (IBM SPSS Statistics 25).

PERMANOVA:ssa aineistoon kokeiltiin luonnollista logaritmin muunnosta ja neliöjuurimuunnosta, mutta nämä eivät muuttaneet ratkaisevasti tulosten merkitsevyyttä, joten aineisto jätettiin muuntamatta. Rasvahappojen prosenttiosuuksille kokeiltiin myös muunnosta, mutta tässäkään tapauksessa muutos ei ollut olennaisesti erilainen, joten se jätettiin tekemättä.

Muunnokset voivat myös olla yhdentekeviä tai jopa vääristää tuloksia (Happel ym. 2017), mikä puolsi aineiston jättämistä käsittelemättömäksi.

5 TULOKSET 5.1 Sieniviljelmät

Epifyyttisienillä havaittiin 15 eri rasvahappoa, joista 4 esiintyi ainoastaan kirkasvetisissä järvissä (kuva 2). Endofyyttisienillä havaittiin puolestaan jopa 27 eri rasvahappoa, joista 10 esiintyi ainoastaan kirkasvetisissä ja 4 vain humuspitoisissa järvissä (kuva 3). Epifyyttisienten ja endofyyttisienten rasvahappokoostumukset eivät eronneet toisistaan tilastollisesti merkitsevästi, mutta ero oli kuitenkin lähes merkitsevä (pairwise PERMANOVA p=0,051;

t=2,013). Foliaaristen sienten rasvoista runsaimpina ryhmänä olivat sekä humuspitoisissa että kirkasvetisissä järvissä kertatyydyttymättömät rasvahapot, toiseksi yleisimpänä tyydyttyneet ja erittäin vähäisinä esiintyivät monityydyttymättömät (taulukko 1). Endofyyttisienillä kokeilluilla itiöviljelyllä ja lehtipalaviljelyllä ei ollut merkitsevää eroa sienten rasvahappokoostumusten suhteen (pairwise PERMANOVA p=0,491; t=0,713).

Kirkasvetisten ja humuspitoisten järvien sienten rasvahappokoostumukset eivät eronneet toisistaan tilastollisesti merkitsevästi määrien (pairwise PERMANOVA p=0,73; t=0,515; kuva 4). Järvien kesken sienten rasvahappokoostumukset eivät eronneet tilastollisesti merkitsevästi (maintest PERMANOVA p=0,79; pseudo-F=0,579; df=5).

DistLM-testissä foliaarisia sieniä vertailtaessa selitysarvoksi saatiin 0,154.

Ympäristömuuttujat eivät vaikuttaneet tässäkään tapauksessa merkitsevästi, mutta sienen tyyppi selitti eroja tilastollisesti merkitsevästi tai lähes merkitsevästi (epifyyteille p=0,034 ja endofyyteille p=0,05).

Endofyyttien ω3/ω6-suhde oli hieman korkeampi kuin epifyyttisienten.

Ekotyyppikohtaisesti tarkasteltuna humusjärvissä epifyyttien ja endofyyttien ω3/ω6-suhteen keskiarvo oli kuitenkin sama, kun taas kirkasvetisissä järvissä endofyyttien suhde oli hieman korkeampi, joskin ero jäi keskihajonnan sisään.

Kuva 2. Epifyyttisienten rasvahappojen määrien (mg/g kuivapainoa) keskiarvot keskihajontoineen kirkkaissa ja humuspitoisissa järvissä.

Kuva 3. Endofyyttisienten rasvahappojen määrien (mg/g kuivapainoa) keskiarvot keskihajontoineen kirkasvetisissä ja humuspitoisissa järvissä.

Taulukko 1. Koivun lehden sienten rasvahappojen prosenttiosuuksien keskiarvot ja -hajonnat (SD) ryhmittäin (SAFA, MUFA ja PUFA) humuspitoisissa ja kirkasvetisissä järvissä.

Humusjärvi

Kirkas

järvi

Rasvahappo Epifyytti SD Endofyytti SD Epifyytti SD Endofyytti SD

14:0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,2 0,4 0,2 0,4

Kuva 4. MDS-ordinaatio foliaaristen sienten jakautumisesta kirkasvetisissä ja humuspitoisissa järvissä. K=kirkasvetinen järvi, H=humusjärvi.

5.2 Fyllosfääri

Koivun lehdillä havaittiin 16 eri rasvahappoa, joista 2 esiintyi ainoastaan humusjärvissä (kuva 5). Koivun ja lepän lehtien rasvahappokoostumukset erosivat toisistaan määrien (kuva 6, pairwise PERMANOVA p=0,005; t=2,440) ja prosentuaalisten osuuksien suhteen (p=0,002;

t=2,821). Koivulla runsaimpana esiintyivät tyydyttyneet rasvahapot, kun taas lepällä SAFA:t olivat runsaimpina kirkkaissa järvissä ja PUFA:t olivat runsaimpana humusjärvissä (taulukko 2).

Lehtinäytteillä litoraaleista ja rannoilta kerättyjen lehtinäytteiden rasvahappokoostumukset eivät eronneet tilastollisesti merkitsevästi määrien (kuva 7; pairwise PERMANOVA p=0,44;

t=0,887) eivätkä prosenttiosuuksien suhteen (p=0,383; t=0,992).

Veden kirkkauden suhteen ei havaittu eroa lehtien rasvahappokoostumuksissa määrien (kuva 6; pairwise PERMANOVA p=0,766; t=0,627) eikä rasvahappojen prosenttiosuuksien suhteen (p=0,611; t=0,803). Järvien kesken ei myöskään havaittu merkitseviä eroja (maintest PERMANOVA p=0,742; pseudo-F=0,669; df=5).

Koivun lehtien rasvahappokoostumus erosi endofyyttisten (pairwise PERMANOVA p=0,001; t=5,729) ja epifyyttisten (p=0,001; t=6,219) sienten rasvahappokoostumuksista tilastollisesti merkitsevästi (kuva 8).

Taulukko 2. Litoraalista kerättyjen koivun (Betula sp.) ja lepän (Alnus sp.) fyllosfäärien rasvahappojen prosentuaalisten osuuksien keskiarvot ja -hajonnat ryhmittäin (SAFA, MUFA ja PUFA) humuspitoisissa ja kirkasvetisissä järvissä.

Humuspitoinen Kirkasvetinen

Kuva 5. Koivun ja lepän lehtien rasvahappojen määrien (mg/g kuivapainoa) jakautuminen kirkkaiden ja humuspitoisten järvien litoraalissa. H=humusjärvi, K=kirkasvetinen järvi.

Kuva 6. Kaksiulotteinen MSDS-ordinaatio rasvahappojen ryhmittymisestä lajin ja järven kirkkauden mukaan. K=kirkasvetinen järvi, H=humusjärvi.

Kuva 7. Kaksiulotteinen MSDS-ordinaatio rasvahappojen ryhmittymisestä lajin ja habitaatin mukaan. A=Alnus sp., B=Betula sp., L=litoraali, R=ranta.

Kuva 8. Kaksiulotteinen MDS-ordinaatio rasvahappojen ryhmittymisestä kasvatusnäytteiden ja koivun fyllosfäärien mukaan.

DistLM-testillä testattiin ympäristömuuttujien (pH, veden lämpötila, veden happipitoisuus, järven pinta-ala) vaikutusta lehtien rasvahappokoostumuksiin ja eri tekijöiden selitysastetta eroille. Ympäristömuuttujat eivät vaikuttaneet tilastollisesti merkitsevästi sienten rasvahappokoostumuksiin. Lehtinäytteillä mallin selitysaste (R²) oli 0,286. Suurimman osan rasvahappokoostumusten vaihtelusta selitti lehden taksoni (Alnus sp. p=0,004 ja Betula sp.

p=0,003; pseudo-F=6,323), kun taas ympäristömuuttujat eivät vaikuttaneet tilastollisesti merkitsevästi. Prosentuaalisia osuuksia tarkastellessa mallin selitysaste oli 0,437, josta merkitsevänä tekijänä oli jälleen ainoastaan lehden taksoni (Alnus sp. p=0,001 ja Betula sp.

p=0,001; pseudo-F=8,458).

Koivun lehden rasvahappokoostumusta ja kasvatusnäytteitä vertailtaessa mallin selitysasteeksi saatiin 0,574. Merkitsevästi eroja selittivät endofyyttiset sienet (p=0,001;

pseudo-F=12,698) ja lehti (p=0,001; pseudo-F=35,194), kun taas epifyyttisienet eivät selittäneet merkitsevästi eroja (p=0,07; pseudo-F=2,977), kuten eivät myöskään ympäristömuuttujat. Vastaavia prosenttiosuuksia vertailtaessa mallin selitysasteeksi saatiin 0,814 (lehdelle p=0,001; pseudo-F=135,79; epifyytille p=0,002; pseudo-F=8,489 ja endofyytille p=0,004; pseudo-F=9,130). Ympäristömuuttujat eivät vaikuttaneet merkitsevästi rasvahappokoostumuksiin. Järven kirkkaus ei selittänyt missään tapauksessa eroja tilastollisesti merkitsevästi.

Koivun lehtien ω3/ω6 -suhde oli merkitsevästi korkeampi kuin kasvatettujen foliaaristen sienten (kuva 9; Mann-Whitneyn U-testi p<0,001). Vertailtaessa litoraalista ja järvien rannoilta kerättyjen koivun lehtien ω3/ω6-suhdetta havaittiin, että litoraalivyöhykkeiltä kerätyillä lehdillä suhde oli korkeampi, joskin tämäkin ero jäi keskihajonnan sisään eikä ollut merkitsevä (kuva 10; Mann-Whitneyn U-testi p=0,514).

Koivun lehdellä ainoastaan 18:1-rasvahapon määrä erosi merkitsevästi vertailtaessa litoraalista ja rannalta kerättyjen lehtien välillä (Mann-Whitneyn U-testi, p=0,015). Lepän lehdillä rasvahappojen määrät eivät eronneet litoraalin ja rannan välillä. Kirkkaiden ja humuspitoisten järvien välillä ainoastaan 22:0-rasvahapon määrä erosi merkitsevästi (Mann-Whitneyn U-testi, p=0,002). Lepän lehtien rasvahappojen määrät eivät eronneet merkitsevästi kirkkauden suhteen.

Kuva 9. Koivun fyllosfäärin ja foliaaristen sienten ω3- ja ω6-rasvahappojen määrien (mg/g kuivapainoa) suhteiden keskiarvot keskihajontoineen.

Kuva 10. Litoraalista ja rannalta kerättyjen koivun (Betula) ja lepän (Alnus) lehtien ω3 ja ω6 -rasvahappojen määrien (mg/g kuivapainoa kohden) suhteiden keskiarvot keskihajontoineen.

L=litoraali, R=ranta.

Alnus L Alnus R Betula L Betula R

31 6 TULOSTEN TARKASTELU

Tutkimus onnistui hyvin, joskin näytteiden väliset erot jäivät liian pieniksi, jotta ne olisivat olleet merkitseviä. Epifyyttisten ja endofyyttisten sienten tilastollisesti lähes merkitsevä ero oli yksi tutkimuksen kiinnostavimmista havainnoista. Samoin se, että kertatyydyttymättömät rasvahapot käsittivät neljä viidestä runsaimmasta rasvahaposta kummallakin foliaarisella sieniryhmällä. Järven kirkkaus ei selittänyt merkitsevästi eroja, mutta suuremmalla aineistolla erot voitaisiin mahdollisesti saada paremmin näkyviin, samoin kuin muiden tekijöiden vaikutus.

6.1 Sienten viljely

Sienten viljely oli onnistunutta, joskin kasvavien lajien osuutta lehden koko sieniyhteisöstä ei voida arvioida ilman molekulaarisia tutkimuksia. Endofyyttisienillä eri viljelynaloitusmenetelmillä (lehtipala- ja itiöviljely) ei ollut merkitsevää eroa, mikä oli toivottavaa tutkimuksen ja menetelmien kehittämisen kannalta. Ymppimetodeista lehtien itiöviljely on huomattavasti tehokkaampi työskentelyyn käytetyn ajan takia. Siinä pääsevät edustetuiksi myös kaikki sienet lehden eri osista. Toisaalta itiöviljely voi suosia nopeasti itiöitä tuottavia lajeja. Hitaammin reagoivat ja itiöitä tuottavat lajit voivatkin olla paremmin edustettuina lehtipalanäytteissä.

Viljely ei takaa luotettavaa tulosta näytteen koko sienikannasta. Mikrobiviljelmistä saadaan havaittua tällä menetelmällä vain pieni osa mikrobistosta (Kirchman 2012). Näytteen sisältämien lajien kasvuolosuhteet ja tarvittavat vuorovaikutukset muiden eliöiden kanssa voivat johtaa tulosharhaan, kun vain osa lajeista kykenee kasvamaan kasvualustalla. Näin ollen viljelyolosuhteet voivat vaikuttaa maljoille valikoituvaan lajistoon ja sienten ravintoarvoihin.

Esimerkiksi jo muutaman asteen lämpötilamuutokset voivat aiheuttaa toisistaan poikkeavia tuloksia rasvahappokoostumuksissa (Müller ym. 1994, Stahl & Klug 1996). Näin ollen kokeen tulokset eivät vastaa luonnollista tilannetta, vaan ovat suuntaa-antavia. Lisäksi lehteä hajottavat sienet voivat muodostaa ravinnollisesti runsaampia rakenteita, kuten rihmaa ja konidioita.

Rasvahappokoostumus vaihdellee paitsi eri sienilajien myös lajinsisäisten rakenteiden välillä.

Tämä tulisi huomioida aina, kun on kyseessä laboratorio-olosuhteissa kasvatettu sieninäyte.

Rasvahappokoostumus muuttuu myös nopeasti ympäristömuutosten seurauksena, ja näytteiden keruu olisikin suotavaa paitsi useampana ajankohtana myös useammasta paikasta.

Kasvusubstraatin suuren vaikutuksen takia tämän tutkimuksen tuloksia tulee tarkastella kriittisesti, sillä agar tarjoaa erilaiset ravintoarvot verrattuna puusta pudonneeseen lehteen, mikä voi näkyä rasvahappokoostumusten eroina luonnollisissa ja laboratorion olosuhteissa.

6.2 Foliaaristen sienten ravintoarvot

Koivun epifyyttisten ja endofyyttisten sienten rasvahappokoostumukset eivät eronneet toisistaan merkitsevästi, mutta ero on kuitenkin lähes merkitsevä. DistLM-testillä havaittiin, että sienen kuuluminen epifyytteihin ja endofyytteihin selitti 15,4 % näytteiden välisestä vaihtelusta rasvahappokoostumuksissa. Huomionarvoista on myös se, että analyyseihin sisällytetyistä rasvahapoista (>1% kokonaisrasvahappokoostumuksesta) endofyyttisienillä esiintyi 27 eri rasvahappoa, kun taas epifyyttisienillä vain 15. Pitkäketjuisin rasvahappo epifyyttisienillä oli C19, kun taas endofyyttisienillä se oli C22. Koska lehden endofyyttilajisto määräytyy kasvin eläessä, lienee endofyyttien rasvahappokoostumuskin pitkälti määräytynyt puun kehityshistorian mukaan, rasvahappokoostumuksen muunnellessa sienen metabolisten rajojen puitteissa. Näin ollen voisi myös olettaa, että lehden päätyminen järveen vähentää endofyyttisen lajiston runsautta muiden hajottajien kolonisoidessa lehden, minkä pitäisi näkyä myös rasvahappokoostumuksen yksinkertaistumisena. Näin ei kuitenkaan tutkimuksessa ollut, mikä voisi selittyä joko sillä, että A) endofyyttisienet pysyvät lehden kudoksessa pidempään kuin on luultu, B) endofyyttien rasvahappokoostumus on luonnostaan monipuolinen, eikä lajiston yksinkertaistuminen heijastu rasvahappoihin ja/tai C) lehdet ovat päätyneet järveen niin vähän aikaa ennen näytteiden keräämistä, ettei akvaattista lehden hajottajayhteisön sukkessiota ole vielä alkanut tapahtua.

Yleisin SAFA foliaarisilla sienillä oli 16:0. Yleisin MUFA oli 17:1, mutta myös 16:1 ja 18:1 esiintyivät sangen runsaina (yli 10 % rasvahappojen määrästä). Vähäisen esiintyvyyden ja suuren keskihajonnan takia monityydyttymättömistä rasvahapoista minkään niistä ei voida sanoa olevan yleisin.

Kasvatusnäytteissä havaituista rasvahapoista huomattavan suuri osa oli kertatyydyttymättömiä, runsaimpina C16–C19 -kertatyydyttymättömät rasvahapot. rasvahappoa esiintyi monissa sieniviljelmissä, kun taas fyllosfääreistä sitä ei havaittu. 19:1-rasvahappoa on havaittu esiintyvän ennenkin mikrobi- ja sieniyhteisöissä (Frostegård ym.

1993). Vastaava kertatyydyttymättömien rasvahappojen runsaus on havaittu myös endofyyttisillä Colletotrichum- ja Alternaria-sukujen sienillä (Dey ym. 2011), joskaan he eivät

havainneet 19:1 esiintymistä. Toisin kuin lehdillä, foliaarisilla sienillä esiintyi havaittavia määriä 14:0-17:0 -rasvahappojen anteiso- ja isomuotoja.

Epifyyteillä havaittiin pitkäketjuisina PUFA:ina 18:2ω6 ja 18:3ω6, kun taas

In document Koivun (Betula sp.) foliaaristen sienten rasvahapot kirkkaiden ja humuspitoisten järvien litoraalissa (sivua 16-0)