Huokoisten piinanopartikkelien valmistus vähämetallisella metalliavusteisella kemiallisella syövytyksellä suonensisäiseen annosteluun

Huokoisten piinanopartikkelien valmistus vähämetallisella metalliavusteisella kemiallisella syövytyksellä

suonensisäiseen annosteluun

Jiri Jäntti Luonnontieteiden pro gradu -tutkielma Sovelletun fysiikan koulutusohjelma Itä-Suomen Yliopisto, Sovelletun Fysiikan laitos 1. huhtikuuta 2021

ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, Luonnontieteiden ja metsätieteiden tiedekunta Sovelletun fysiikan koulutusohjelma, lääketieteellinen fysiikka

Jiri Jäntti: Huokoisten piinanopartikkelien valmistus vähämetallisella metalliavustei- sella kemiallisella syövytyksellä suonensisäiseen annosteluun

Luonnontieteiden pro gradu -tutkielma, 48 sivua

Tutkielman ohjaajat: FT Joakim Riikonen ja FT professori Vesa-Pekka Lehto Maaliskuu 2021

Tiivistelmä

Huokoinen pii (PSi) on bioyhteensopiva sekä biohajoava materiaali, jolla on suuri pinta-ala ja muokattava pinta, joiden ansiosta sillä on potentiaalia muun muassa lääkkeen kanta- jaksi. Sitä voidaan valmistaa vähämetallisella metalliavusteisella kemiallisella syövytyksellä (MACE), joka soveltuu piikiekkojen lisäksi myös piijauheen syövytykseen parantaen mene- telmän kustannustehokkuutta. Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää suonensisäiseen annos- teluun sopivien PSi-nanopartikkelien valmistusta MACE-menetelmällä. Tutkimuksessa selvi- tettiin menetelmässä käytettävän etikkahapon määrän, piin massan kaksinkertaistamisen ja piin tyypin vaikutuksia PSi:n ominaisuuksiin. Lisäksi tutkittiin, kuinka PSi-mikropartikke- leista voidaan valmistaa nanopartikkeleita sekä saavutetaanko niiden kaksoisPEGyloinnilla eli pintakäsittelyllä riittävä kolloidinen stabiilius suonensisäisen annostelun kannalta.

Etikkahapon vaikutusta MACE:ssa tutkittiin syövyttäen PSi:tä käyttämällä 0-40 ml etikkahappoa. Pinta-ala ja huokostilavuus kasvoivat ja huokoskoko pieneni kaasusorptio- mittausten mukaan, kun etikkahapon määrää kasvoi. Etikkahappo pienensi pintajännitys- tä, jolloin syövytysliuos pääsi täyttämään syöpyneet huokoset tehostaen etäistä syöpymistä, mikä kasvatti erityisesti pienten huokosten huokostilavuutta. Piijauheen massan vaikutusta tutkittiin 1 g ja 2 g erillä havaiten pinta-alan ja huokostilavuuden pienenevän sekä huokos- koon kasvavan massan kaksinkertaistuessa, mikä saattoi johtua riittämättömästä etikkaha- pon määrästä suurempaa massaa syövytettäessä. Eri piin tyyppejä tutkittaessa havaittiin, että runsaammin seostettujen piin tyyppien pinta-ala ja huokostilavuus olivat suurempia ja huokoskoko pienempi, mikä johtui muun muassa matalammasta potentiaaliesteestä run- saasti seostetun piin ja metallin rajapinnan välillä.

Jauhaminen oli tehokkaampi nanopartikkelien valmistusmenetelmä kuin sonikoiminen, koska sillä voitiin valmistaa kaikista mikropartikkeleista nanopartikkeleita kokojakauman perusteella, joka määritettiin dynaamisella valonsironnalla, mutta sonikoidessa osa partikke- leista jäi mikropartikkeleiksi. Mahdollisesti sonikoinnin teho oli riittämätön rikkomaan pak- suimpia PSi:n seinämiä tai partikkelien keskelle mahdollisesti jäänyttä ei-huokoista ydintä.

Seostetun N++-tyypin ja seostamattoman UW-tyypin nanopartikkeleita kaksoisPEGyloi- tiin ja niiden PEG-pitoisuus määritettiin termogravimetrialla. N++-tyypin PEG-pitoisuus oli 8,1 % ja UW-tyypin 5,8 %, joiden välinen ero johtui ainakin N++-tyypin yli kaksi kertaa suuremmasta pinta-alasta. Kolloidista stabiiliutta tutkittiin mittaamalla zeta-potentiaalia, joka kasvoi lähemmäs nollaa molemmille tyypeille kaksoisPEGyloinnin seurauksena, mikä viittasi niiden hyvään kolloidiseen stabiiliuteen steeriseen stabiiliuteen perustuen. Kuitenkin N++-tyypin zeta-potentiaali kasvoi enemmän suuremman PEG-pitoisuuden vuoksi. Kolloi- dista stabiiliutta tutkittiin myös mittaamalla partikkelikokoa 23 h aikana ja havaittiin, että koko pysyi lähes samana ensimmäisen 4 h ajan molemmille tyypeille eli partikkelit olivat kolloidisesti stabiileja 4 h ajan, mikä on riittävä suonensisäisen annostelun kannalta. Lisäk- si suuremman PEG-pitoisuuden omaavien N++-partikkelien havaittiin olevan kolloidisesti stabiilimpia myös 23 h kuluttua kuin UW-partikkelien. Kaiken kaikkiaan tutkimus lisäsi ymmärrystä MACE:n valmistusparametrien vaikutuksista PSi:n valmistuksessa ja osoitti, että menetelmällä valmistetuista PSi-mikropartikkeleista voidaan valmistaa suonensisäiseen annosteluun soveltuvia pintakäsiteltyjä PSi-nanopartikkeleita.

Abstract

Porous silicon (PSi) is a biocompatible and biodegradable material with a high surface area and its surface can be modified, thus it has potential e.g as a drug carrier. PSi can be produced by low-load metal-assisted chemical etching (MACE) that can be applied for wafers but also powders improving the cost-effectiveness of the method. The aim of the study was to investigate production of PSi nanoparticles for intravenous administration using MACE. The effects of the amount of acetic acid used in the method, doubling of the mass of silicon, and the different doping of silicon on the properties of PSi were studied. In addition, it was explored how nanoparticles can be produced from PSi microparticles and whether their dualPEGylation achieves sufficient colloidal stability for intravenous administration.

The effect of acetic acid in MACE was studied by etching PSi using 0-40 ml acetic acid. The surface area and pore volume increased and pore size decreased according to gas sorption measurements as the amount of acetic acid was increased. Acetic acid reduced surface tension, thus etchant was able to fill better the formed pores improving remote etching which increased especially volume of the small pores. The effect of silicon powder mass was studied with 1 g and 2 g batches. Surface area and pore volume decreased, as well as pore size increased when the mass was doubled. A possible reason was an insufficient amount of acetic acid when etching the bigger batch. When the effect of doping of silicon on the etched PSi was studied, it was observed that surface area and pore volume of highly doped silicon were higher and pore size smaller because highly doped silicon has lower potential barrier between silicon-metal interface compared to less doped silicon.

Milling was a more efficient manufacturing method to produce nanoparticles than sonication because all of the microparticles were able to be milled to nanoparticles based on the size distribution determined by dynamic light scattering. However, sonication of microparticles left part of them as microparticles. Possibly, the power of sonication was insufficient to break the thickest pore walls or a non-porous core could remain after etching.

Douped N++ type and undoped UW type nanoparticles were dualPEGylated and their PEG content was determined by thermogravimetric analysis. The PEG content of N++ type and UW type were 8.1 % and 5.8 %, respectively. The difference was probably result of twice higher surface area of N++ type PSi. Colloidal stability was studied by measuring the zeta- potential which was increased closer to zero for both types as a result of dualPEGylation suggesting their good colloidal stability based on steric stabilization. However, the zeta- potential of the N++ type increased more due to higher PEG content than on the UW type. Colloidal stability was also studied by measuring particle size over 23 h and it was found that the size remained almost constant for the first 4 h for the both types, thus they were colloidally stable for 4 h. This is sufficient for intravenous administration applications.

Additionally, the N++ particles with higher PEG content were more stable colloidally even after 23 h than the UW particles. Overall, the study increased understanding of the effect of MACE manufacturing parameters in the production of PSi and demonstrated that produced PSi microparticles by MACE can be used to prepare dualPEGylated PSi nanoparticles for intravenous administration.

Sanasto

CT Tietokonetomografia (Computed tomography) DLS Dynaaminen valonsironta (Dynamic light scattering)

DPEG-PSi KaksoisPEGyloitu huokoinen pii (Dual PEGylated porous silicon)

HF Vetyfluoridihappo

HNO₃ Typpihappo

H2O2 Vetyperoksidi

IUPAC Kansainvälinen teoreettisen ja sovelletun kemian liitto (International union of pure and applied chemistry)

LDE Laseri-Doppler-elektroforeesi

MACE Metalliavusteinen kemiallinen syövytys (metal-assisted chemical etching) MRI Magneettikuvannus (Magnetic resonance imaging)

NA Avogadron vakio

PBS Fosfaattipuskuriliuos (Phosfate buffered saline) PEG Polyetyleeniglykoli (Polyethylene glycol)

PET Positroniemissiotomografia (Positron emission tomography) PSi Huokoinen pii (Porous silicon)

RES Retikuloendoteliaalijärjestelmä (Reticuloendothelial system)

rtPA Rekombinantti kudoksen plasminogeeniaktivaattori (recombinant tissue plasminogen activator)

SK Streptokinaasi (streptokinase)

SPECT Yksifotoniemissiotomografia (Single-photon emission computed tomography) TG Termogravitometri (Thermogravimetry)

TGA Termogravitometria (Thermogravimetric analysis)

TOPSi Termisesti oksidoitu huokoinen pii (Thermally oxidized porous silicon) tPA Kudoksen plasminogeeniaktivaattori (Tissue plasminogen activator)

Sisällys

1 Johdanto 6

2 PSi:n valmistusmenetelmät 9

2.1 Metalliavusteinen kemiallinen syövytys (MACE) . . . 10

2.2 PSi:n pintakäsittely . . . 14

3 Nanopartikkelit verihyytymien teranostiikassa 16 4 Nanopartikkelien karakterisointimenetelmät 18 4.1 Kaasuadsorptio ja -desorptio . . . 18

4.2 Termogravimetria . . . 19

4.3 Dynaaminen valonsironta . . . 19

4.4 Zeta-potentiaali . . . 20

5 Menetelmät 22 5.1 PSi-partikkelien valmistaminen MACE-menetelmällä ja niiden pinnan muokkaaminen . . . 22

5.1.1 Piimikropartikkelien valmistaminen . . . 22

5.1.2 Etikkahapon määrän ja syövytettävän piijauheen massan vai- kutus PSi:n ominaisuuksiin MACE-menetelmässä . . . 22

5.1.3 Metalliavusteinen kemiallinen syövytys (MACE) . . . 23

5.1.4 Terminen oksidoiminen . . . 23

5.1.5 PSi-nanopartikkelien valmistaminen . . . 24

5.1.6 Kemiallinen oksidoiminen . . . 25

5.1.7 PEGyloiminen . . . 25

5.2 Karakterisoinnit . . . 26

5.2.1 Kaasuadsorptio ja -desorptio . . . 26

5.2.2 Termogravimetria . . . 26

5.2.3 Kolloidinen stabiilius ja zeta-potentiaali . . . 27

6 Tulokset ja pohdinta 28 6.1 Etikkahapon vaikutus PSi:n ominaisuuksiin MACE- menetelmässä . . . 28

6.2 Syövytettävän piijauheen massan vaikutus . . . 31

6.3 Piin seostuksen vaikutus PSi:n ominaisuuksiin MACE-menetelmässä . 32 6.4 Nanopartikkelien valmistaminen . . . 34

6.5 KaksoisPEGyloidut PSi-nanopartikkelit . . . 37

7 Yhteenveto 42

Viitteet 44

Liitteet 48

1 Johdanto

Huokoinen pii (PSi) havaittiin ensimmäisen kerran 1950-luvun puolivälissä, kun Art- hur ja Ingeborg Uhlir yrittivät kehittää sähkökemiallista menetelmää, jolla voitaisiin kiillottaa piikiekkoja mikroelektronisia virtapiirejä varten. Tietyissä olosuhteissa pii- kiekko ei kuitenkaan liuennut tasaisesti muodostaen kiiltävää pintaa, kuten oli oletet- tu, vaan pinnalle havaittiin muodostuneen kalvo, jonka ymmärrettiin olevan PSi:tä vasta myöhemmin. He raportoivat poikkeavuudesta laboratorion tekniseen muistioon, mutta havaintoon ei kiinnitetty suurempaa huomiota. [1]

Kiinnostus PSi:tä kohtaan kasvoi merkittävästi vasta 1990-luvulla, jolloin sen hyö- dylliset ominaisuudet, kuten fotoluminesenssi, korkea pinta-ala ja kontrolloitava huo- kosten koko havaittiin. [1] PSi:n havaittiin olevan bioyhteensopiva ja biologisesti ha- joava materiaali, mikä käynnisti PSi:n biolääketieteellisten sovellusten kehitystyön.

Nykyisin PSi:tä tutkitaan monissa biolääketieteellisissä sovelluskohteissa, kuten lääk- keen kantajana, kudosteknologiassa, immunoterapiassa ja kuvantamisessa [2].

Jo mainittujen ominaisuuksien lisäksi PSi soveltuu erityisen hyvin biolääketieteel- lisiin käyttötarkoituksiin, koska PSi-partikkelien kokoon, huokoisuuteen ja huokosten tilavuuteen voidaan vaikuttaa käyttämällä eri valmistusparametrejä. PSi:llä on suuri pinta-ala ja monikäyttöinen pinta, joka voidaan funktionalisoida esimerkiksi kontrol- loimaan lääkkeen vapautumista ja pidentämään partikkelien säilymistä verenkierrossa välttämällä biologisia esteitä, kuten epäspesifistä sitoutumista ja retikuloendoteliaali- järjestelmän (RES,reticuloendothelial system) aktivoitumista. [2] RES:n aktivoitu- mista edistää opsonisaatio, jossa elimistön vierasaineelle erikoistuneet vasta-aineet eli opsoniinit kiinnittyvät vierasaineiden pinnalle. Tällöin fagosytoivat solut tunnistavat vierasaineiden pinnalle kiinnittyneet opsoniinit ja kuljettavat vierasaineet maksaan tai pernaan. Opsonisaatio on nopeampaa hydrofobisille ja varauksellisille partikke- leille, joten sitä voi ehkäistä esimerkiksi PEGyloinnilla eli pinnoittamalla partikkelit varauksettomalla polyetyleeniglykolilla (PEG), jonka vapaa ketju on pitkä ja hydro- fiilinen. [3, 4]

Kansainvälinen teoreettisen ja sovelletun kemian liiton (IUPAC, International union of pure and applied chemistry) määritelmän mukaan mikrohuokosien materi- aalien huokosten halkaisija on alle 2 nm, mesohuokosten 2-50 nm ja makrohuokoisten yli 50 nm. [5] Huokoisista materiaaleista erityisesti mesohuokoiset materiaalit ovat sopivia lääkeaineiden kantajiksi, koska huokoskoko on riittävän suuri, jotta lääke voi- daan ladata tehokkaasti sen rakenteeseen ja se voi vapautua nopeasti. Lisäksi PSi:n huokoisuusaste voi olla jopa yli 50 %, minkä ansiosta siihen voidaan ladata runsaasti lääkettä. [2]

Yksi tapa valmistaa mesohuokoista PSi:tä on metalliavusteinen kemiallinen syö- vytys (metal-assisted chemical etching, MACE), joka soveltuu PSi:n valmistami- seen niin piikiekoista kuin -jauheestakin. Toisinaan MACE-menetelmästä käytetään myös nimitystä metalliavusteinen katalyyttinen syövytys (metal-assisted catalytic etching). Erityisesti MACE:n soveltaminen PSi:n valmistamiseen piijauheista on kan- nattavaa, koska valmistaminen jauheesta on edullisempaa kuin piikiekosta. PSi:n omi- naisuuksiin voidaan vaikuttaa myös MACE:ssa perinteisempien menetelmien, kuten elektrokemiallisen syövytyksen tapauksessa, mutta haasteena on ymmärtää eri valmis- tusparametrien kokonaisvaikutus PSi:n ominaisuuksiin. Tamarov ym. tutkivat katta- vasti muun muassa lämpötilan, oksidantin määrän ja syövytyksen keston sekä eri

seostusten vaikutusta sen ominaisuuksiin, kuten pinta-alaan, huokostilavuuteen, huo- koskokoon ja tuottoon [6, 7].

Joitain kantajapartikkeleita voidaan myös kuvata esimerkiksi magneettikuvauk- sella (MRI), yksifotoniemissiotomografialla (SPECT), positroniemissiotomografialla (PET) tai tietokonetomografialla (CT). Nanolääkkeiden kehityksessä onkin alettu keskittyä kantajiin, joilla on sekä terapeuttista että diagnostista potentiaalia. Näiden kahden ominaisuuden yhdistävää menetelmää kutsutaan terasnostiseksi menetelmäk- si. PSi:llä onkin paljon potentiaalia teranostisiin sovelluksiin jo edellä mainittujen ominaisuuksien, kuten lääkkeen kantokyvyn ja muokattavan pinnan ansiosta. Lisäk- si on havaittu, että pii on hyperpolarisoituva materiaali [8] eli sen ytimen spinien polarisaatiota voidaan hetkellisesti kasvattaa merkittävästi suuremmaksi verrattu- na sen termiseen tasapainotilaan. Tällaiset materiaalit soveltuvat hyperpolarisoituun MRI:hin ja niillä on mahdollista saavuttaa jopa monikymmenkertaisesti voimakkaam- pi polarisaatio verrattuna perinteisessä MRI:ssä käytettäviin kontrastiaineisiin, minkä ansiosta kontrasti paranee [9].

PSi:tä on kehitetty esimerkiksi syövän teranostiikkaan. Näkki ym. valmistivat kak- soisPEGyloituja (DPEG, dual P EGylated), doxorubisiinilla ladattuja PSi-nanopar- tikkeleita, jotka olivat pH-herkkiä ja niiden ydin oli päällystetty MRI:hin soveltu- villa superparamagneettisilla rautaoksidinanopartikkeleilla. Partikkelien kolloidinen stabiilius oli erinomainen, ne soveltuivat MRI:hin, minkä lisäksi niiden magnetisaatio oli yksi suurimmista, mitä PSi-partikkeleilla on raportoitu. Partikkeleilla saavutettiin erinomainen hoitovaste eivätkä ne olleet myrkyllisiä eivätkä ne aiheuttaneet haital- lisia sivuvaikutuksia toisin kuin vapaa doxorubisiini. [10] Wang ym. puolestaan tut- kivat kaksoisleimattuja (radio- ja fluoresenssileima) ja syöpään iRDG-peptidillä koh- dennettuja sorafenibi ladattuja PSi-nanopartikkeleita kemoterapeuttisiin sovelluksiin, joiden biologista leviämistä voitiin monitoroida SPECT/CT:llä (in vivo) ja pitkäai- kaista biologista leviämistä kudostasolla fluoresenssimikroskoopilla (ex vivo). PSi- iRGD-nanopartikkeleita annosteltiin suonensisäisesti sekä niitä injektoitiin suoraan kasvaimeen, jolloin niiden havaittiin kertyvän tehokkaammin kuin suonensisäises- ti annosteltuna. PSi-iRGD-nanopartikkelien todettiin olevan myrkyttömiä ja niiden havaittiin kertyvän kasvaimeen tehokkaammin sekä pysyen siellä paremmin verrat- tuna PSi-nanopartikkeleihin. Kuitenkin molemmilla tavoilla annostellut PSi-iRGD- nanopartikkelit poistuivat kasvaimesta (PC3-MM2) suhteellisen nopeasti, minkä pa- rantamiseksi he ehdottavat partikkelien pinnan muokkaamista siten, ettei RES:in vaikutus olisi niin voimakas. Sorafenibia sisältävät PSi-iRGD-nanopartikkelit esti- vät tehokkaammin kasvaimen kasvua 24 h jälkeen verrattuna vapaaseen sorafenibiin, mikä johtui sen tasaisesti jatkuvasta vapautumisesta kasvaimen alueella. [11] PSi- nanopartikkeleita on tutkittu myös sydäniskemiassa vaurioituneiden sydänlihasolu- jen kuvantamiseen SPECT/CT:llä ja hoitoon. Ferreira ym. tutkivat PEGyloituja

111In-leimattuja PSi-nanopartikkeleita, jotka kohdennettiin A-tyypin natriureettinen peptidin avulla (ANP, atrial natriuretic peptide) sydämen vaurioituneelle alueelle.

Partikkelit saavuttivat riittävän kolloidisen stabiiliuden, niihin voitiin ladata sydäntä suojaavaa molekyyliä ja SPECT/CT:llä havaittiin, että¹¹¹In-leimatut ANP- PSi-nanopartikkelit kertyivät vain vaurioituneeseen sydämeen merkittävästi enemmän kuin kohdentamattomat ¹¹¹In-leimatut PSi-nanopartikkelit. [12]

Yksi potentiaalinen käyttökohde terasnostiikalle olisi verihyytymien havaitsemi- nen, sillä ne voivat aiheuttaa hengenvaarallisia aivo- ja sydäninfarkteja. Verihyytymät syntyvät yleensä verisuonien seinämiin niiden vaurioitumisen seurauksena ja irrotes-

saan verihiutaleista ja fibriinistä koostuvat verihyytymät voivat kulkeutua pienempiin verisuoniin muodostaen veritulppia. Tavallisesti veritulpat havaitaan vasta akuutis- sa tilassa, jonka vuoksi uusien, varhaisemmassa vaiheessa diagnosoivien menetelmien tutkiminen olisi kannattavaa. Veritulppien hoidossa käytettävät nykyiset hoidot, ku- ten verenohennuslääkitys sekä akuuteissa tilanteissa liuotushoidot lisäävät merkittä- västi verenvuotokomplikaatioiden riskiä. Uusien terasnostisten keinojen avulla voitai- siin havaita verihyytymiä ennen kuin ne aiheuttavat veritulppia sekä pyrkiä hoidon aikana välttymään verenvuotokomplikaatioilta esimerkiksi tehokkaamman lääkkeen kohdennuksen avulla, jolloin ohennuslääkkeen annosta voitaisiin pienentää saavutta- malla silti sama hoitovaste.

Verihyytymien kuvantamiseen on kehitetty kohdennettuja kultananopartikkeleita [13], rautaoksidinanopartikkeleita [14] ja radioaktiivisia merkkiaineita [15] sekä ve- rihyytymien kohdennettuun hoitoon polymeerinanopartikkeleita [16] ja magneettisia kuparinanopartikkeleita [17]. Vaikka verihyytymien diagnosointiin sekä kohdennet- tuun hoitoon on nanopartikkeleita hyödyntäviä sovelluksia, on molemmat ominaisuu- det yhdistäviä teranostisia sovelluksia varsin vähän. Kuitenkin McCarthy ym. ovat kehittäneet veritulppien terasnostiikkaan fibriolyyttisiä rautaoksidinanopartikkelei- ta, jotka voidaan kohdentaa verihyytymiin kohdentavan peptidin avulla. Ne voitiin havaita MRI:llä ja ne soveltuivat fibrinolyyttisen kudoksen plasminogeenin aktivaat- torin (tissue plasminogen activator, tPA) kantajaksi, joka on yleinen verihyytymien liuottamiseen käytettävä lääke. [18, 19]

Tässä tutkielmassa pyrittiin kehittämään pintakäsiteltyjä PSi-nanopartikkeleita kohti suonensisäisen annostelun sovelluksia. PSi-mikropartikkeleita valmistettiin pii- jauheesta kustannustehokkaalla MACE-menetelmällä ja pyrittiin selvittämään, kuin- ka syövytyksen aikana pinta-aktiivisena aineena eli surfaktanttina käytettävän etikka- hapon määrä, syövytettävän piin massan kaksinkertaistaminen ja piin erilaiset seos- tukset vaikuttavat PSi:n ominaisuuksiin, kuten huokoisuuteen ja pinta-alaan. Lisäksi tavoitteena oli selvittää, kuinka mikropartikkeleista voidaan valmistaa noin 200 nm kokoisia nanopartikkeleita sekä pintakäsitellä ne PEGyloimalla ja tutkia niiden kol- loidista stabiiliutta.

2 PSi:n valmistusmenetelmät

Perinteinen ja yleinen PSi:n valmistusmetodi on elektrokemiallinen syövytys. Elektro- kemiallisesti syövyttämällä PSi:n huokosten kokoa ja huokoisuusastetta voidaan muo- kata muuttamalla valmistusparametrejä [20]. Siinä muodostetaan suljettu virtapiiri anodin ja katodin välille elektrolyytin, yleensä vetyfluoridihapon (HF), läpi. Virran- tiheyttä ja potentiaalia muuttamalla voidaan vaikuttaa syöpymiseen ja huokosten muodostumiseen, mutta myös useat muut valmistusparametrit, kuten elektrolyytin koostumus ja konsentraatio, piin seostus (doping) ja sähkönjohtavuus sekä lämpöti- la vaikuttavat piin syöpymiseen. [1] Tässä tutkielmassa piin seostuksista käytetään taulukossa 1 esitettyjä lyhenteitä.

Muita PSi:n valmistusmenetelmiä ovat muun muassa stainetsaus, MACE [20] ja regeneratiivinen syövytys (regenerative electroless etching) [21]. Stainetsauksessa HF-liuokseen lisätään oksidanttia, kuten typpihappoa (HNO₃), jonka lisääminen ai- heuttaa hapettumis-pelkistymisreaktion, jolloin piihin syöpyy koloja. Menetelmä on yksinkertainen, mutta sillä saadaan muodostettua vai ohut kerros PSi:tä piikiekon- tai partikkelin pinnalle, joten se ei ole kovin kustannustehokas menetelmä. [22]

Regeneratiivisessä syövytyksessä piin syövytykseen käytetään kahta oksidanttia, joita merkitään Ox₁ ja Ox₂. Ox₁ toimii katalyyttinä piin ja Ox₂:n välillä. Ox₂ ei osallistu itse pääreaktioon, mutta se regeneroi Ox₁:stä, joka käynnistää syöpymisreak- tion injektoimalla elektroniaukkoja piin valenssivyölle. Täten Ox₂:n määrällä voidaan kontrolloida reaktiota. Regeneratiivinen syövytys on uusi menetelmä, jonka toivotaan lisäävän PSi:n tuottamisen kustannustehokkuutta, sillä reaktiota rajoittavana Ox₂:n voidaan käyttää vetyperoksidia (H₂O₂), joka on suhteellisen edullista. [21]

Tässä tutkielmassa PSi:n valmistamiseen käytetään MACE-menetelmää, joka on edullinen ja yksinkertainen metodi valmistaa piinanorakenteita. Menetelmä esitellään yksityiskohtaisemmin seuraavassa luvussa (2.1).

Taulukko 1: Taulukossa on esitetty tutkielmassa käytettävien piin seostuksien lyhen- teet, kuvaus, resistiivisyys ja seostus.

Lyhenne Kuvaus Koko (µm) Resistiivisyys (Ω·cm) Seostus (cm⁻³)

P Jauhettu piikiekosta 11-25 25 Boori 5·10¹⁴

P+ Jauhettu piikiekosta 11-25 0,105 Boori 3·10¹⁷

P++ Jauhettu piikiekosta 11-25 0,0186 Boori 4·10¹⁸

UW Jauhettu piikiekosta 11-25 +5000 Boori 1·10¹²

N+ Jauhettu piikiekosta 11-25 1,15 Fosfori 3·10¹⁵

N++ Jauhettu piikiekosta 11-25 0,0144 Fosfori 3·10¹⁸

ESMC10 Metallurginen jauhe, puhtaus 99,997 % 2-10 Epäpuhtaudet: Al, Fe, Ca, Ti

2.1 Metalliavusteinen kemiallinen syövytys (MACE)

Ensimmäisen kerran metalliavusteisesta kemiallisesta syövytyksestä raportoitiin vuon- na 1997, kun alumiinipinnoitteista piitä syövytettiin liuoksessa, joka sisälsi HF, HNO₃ ja H₂O. Alumiinin avulla syövytysaika lyheni merkittävästi ja myöhemmin havait- tiin, että piin pinnan syöpymistä voitiin katalysoida myös muiden jalometallien avul- la HF:a, H₂O₂:a ja etanolia sisältävässä liuoksessa. Havaintona oli, että jalometalli uppoaa piihin muodostaen huokosia tai nanolankoja (nanowire). Tietyissä olosuh- teissa mikrohuokoisia rakenteita muodostui jalometallipartikkelien ympärille tai niitä saattoi muodostua jopa ilman metallikatalyyttiä. [23, 24]

Metallipartikkelin syöpymistä nopeuttavaa vaikutusta on pyritty selittämään pai- kallisen galvaanisen kennon avulla, joka muodostuu, kun metallipartikkeli upotetaan liuokseen, joka sisältää syövyttävää HF-vesiliuosta ja oksidantin, kuten H2O2:n. Tässä ympäristössä katodireaktio tapahtuu metallin pinnalla ja anodireaktio piin pinnalla.

Katodireaktiossa metalli-liuos-rajapinnalla tapahtuu reaktio

H₂O₂+ 2 H⁺→2 H₂O + 2 h⁺, (1) missä oksidantin määrä vähentyy ja muodostuu vettä sekä syntyy kaksi aukkoa eli elektronivajausta piiatomin valenssivyölle, mitä merkitään symbolilla h⁺. [25]

Anodireaktiossa pii liukenee joko suoraan divalentisti tai välituotteen (SiO₂) kaut- ta tetravalentisti riippuen oksidantin vahvuudesta ja konsentraatiosta. Divalentissa liukenemisessa reaktioon osallistuu kaksi ja tetravalentissa reaktiossa neljä aukkoa.

Kun käytetään joko heikkoa oksidanttia kuten O₂ tai oksidantin konsentraatio on pieni ([H₂O₂] < 0,1 mol/l), tapahtuu divalentti reaktio, jossa kaksi elektroniaukkoa muuttaa pinnan Si-Si-sidoksen välituotteeksi Si²⁺. Välituote reagoi kahden protonin kanssa, jolloin vapautuu vetykaasua ja muodostuu Si⁴⁺-kationi seuraavan reaktioyh- tälön mukaisesti:

Si + 2H⁺+ 2 h⁺→Si⁴⁺+ H₂ ↑. (2) Muodostunut Si⁴⁺-kationi reagoi edelleen HF:n kanssa, jolloin pii liukenee seuraavasti:

Si⁴⁺+ 6HF→SiF²⁻₆ + 6H⁺. (3)

Yhtälöt 2 ja 3 voidaan esittää myös yhdistetyssä muodossa:

Si + 6 F⁻+ 2H⁺+ 2 h⁺ →SiF²⁻₆ + H₂ ↑. (4) Kun käytetään vahvaa oksidanttia, kuten H₂O₂:a, on havaittu tapahtuvan elektro- lyyttinen kiillottuminen (electropolishing ef f ect), jossa pii syöpyy tasaisesti tasoit- taen syöpyvää pintaa ja poistaen jo pinnalle mahdollisesti muodostuneita huokosia.

Elektrolyyttisessä kiillottumisessa reaktioon osallistuu neljä aukkoa ja syntyy SiO₂- molekyyli, joka puolestaan liukenee HF-liuokseen. Tetravalenttia, SiO₂-välituotteen kautta tapahtuvaa reaktioita kuvaavat reaktioyhtälöt:

Si + 2H₂O + 4 h⁺→SiO₂ + 4H⁺ SiO₂+ 6HF→SiF²⁻₆ + 2H⁺+ 2H₂O.

(5) Anodi- ja katodireaktioita on havainnollistettu kuvassa 1. Sekä divalentti että tet- ravalentti hajoamisreaktio voidaan esittää myös yhden anodireaktion avulla, missä

rektiomekanismi riippuu muodostuneiden elektroniaukkojen määrästä valenssivyöllä.

Molemmat reaktiomekaniikat yhdistävä reaktioyhtälö voidaan esittää muodossa, Si + 6HF + nh⁺→H₂SiF₆ + nH⁺+

4−n 2

H₂↑, (6)

missä n on keskimääräinen elektroniaukkojen lukumäärä valenssivyöllä yhtä piiato- mia kohden. [25] Kun puolestaan anodi- ja katodireaktiot yhdistetään, kokonaisreak- tioyhtälö voidaan kirjoittaa muotoon

Si + n

2H₂O₂+ 6HF→nH₂O + H₂SiF₆+

4−n 2

H₂ ↑. (7)

Chartier ym. esittivät, että H₂O₂- ja HF-konsentraatioiden avulla esitetty suhde- lukuρ, olisi tärkeä valmistusparametri, joka on verrattavissa virrantiheyteen elektro- kemiallisessa syövytyksessä [26]. He määrittelivät ρ:n seuraavasti:

ρ= [HF]

[HF] + [H₂O₂]. (8)

He havaitsivat, että suhteen ollessa likimain 0,85 metallikatalyytin tunkeutumisky- ky piihin oli parhaimmillaan ja ilman metallia syöpyminen oli tehokkainta, kun ρoli likimain 0,45. Lisäksi he havaitsivat, että suurella HF-konsentraatiolla eli, kun 0,7

< ρ < 1,0, muodostui sylinterimäisiä metallipartikkelin halkaisijan kokoisia huoko- sia. Kun 0,2 < ρ < 0,7 muodostui kartiomaisia huokosia, jotka olivat pohjalla me- tallipartikkelin halkaisijan kokoisia, mutta lähempänä pintaa huomattavasti isompia.

Laskettaessa HF-konsentraatiota (0,09 < ρ < 0,2), muodostui useiden mikrometrien kokoisia onkaloita ja H₂O₂-konsentraatiota kasvatettaessa onkaloiden halkaisija kas- voi piin pinnalla. Kunρ< 0,09 huokoisia ei juurikaan muodostunut, mutta piin pinta kiillottui. [26]

MACE-menetelmällä voidaan valmistaa PSi:tä syövyttämällä joko piikiekkoja tai -jauhetta, mutta piijauheen syövytys on kustannustehokkaampaa kuin piikiekko- jen syövyttäminen. Kun PSi:tä valmistetaan piijauheesta, valmistaminen toteutetaan yleensä kaksivaiheisesti. Ensin metalli injektoidaan liuokseen, jossa on vetyfluoridia, vettä, etikkahappoa ja piijauhetta. Metalli leviää tasaisesti liuokseen ja metalli-ionit nukleoituvat esiintyen aivan kuin partikkeleina piin pinnalla. Toisessa vaiheessa ok- sidantti injektoidaan sekaan, mikä käynnistää syöpymisreaktion piipartikkelien pin- nalla metallipartikkelien katalysoimana ja metallipartikkelit alkavat syöpymisen seu- rauksena uppoamaan piihin. Syöpymisessä metallipartikkelit edistävät aukkojen muo- dostumista piin valenssivyölle edellä mainitun katodireaktion (1) mukaisesti ja aukot puolestaan määrittävät syöpymisnopeuden niin kauan kuin liuoksen HF-konsentraatio on riittävän suuri ja siten anodireaktio voi jatkua. [7] Syöpyminen on voimakkainta lähellä metallin ja piin rajapintaa, koska siellä sen aukkojen tiheys on suurin. Syöpy- mistä tapahtuu myös kauempana rajapinnasta aukkojen diffuusion seurauksena, joka on todennäköisempää runsaasti seostetulle piille [6], koska runsaasti seostetun piin ja metallin rajapinnan välinen potentiaalieste (Schottky barrier) on matalampi, mikä edistää aukkojen tunneloitumista potentiaaliesteen ohi. [27]

Piijauheen syövytyksessä voidaan käyttää myös surfaktanttia, kuten etikkahap- poa, joka alentaa pintajännitystä ja vähentää partikkelien aggregoitumista eli kiin- nittymistä toisiinsa. Lisäksi metalli voidaan injektoida vakionopeudella esimerkiksi

Kuva 1: Kuvassa havainnollistetaan MACE-menetelmän katodi- ja anodireaktioita, missä jalometallipartikkeli reagoi tasaisella piin pinnalla HF-H₂O₂-liuoksessa. Koh- dassa (a) on esitetty katodireaktio, jossa piin valenssielektroni siirtyy ensin elektro- negatiivisemmalle metallille jättäen aukon piin valenssivyölle. Tämän jälkeen metallin pinnalla tapahtuu katodireaktio 1, jolloin oksidantin (H₂O₂) määrä vähentyy ja aukko siirtyy metallin kautta piihin. (b) Anodireaktio matalassa H₂O₂-konsentraatiossa: di- valentissa reaktiossa pii liukenee suoraan HF-liuokseen ja muodostuu H₂SiF₆ja vapau- tuu H₂-kaasua. (c) Anodireaktio korkeassa H₂O₂-konsentraatiossa: tapahtuu tetrava- lentti reaktio, jossa ensin muodostuu piidioksidia (SiO₂), joka liukenee HF-liuokseen muodostamatta H₂-kaasua. Kuva on lähteestä [25].

15 min ajan, jotta nukleaatio on homogeenistä HF-liuoksessa piipartikkelien seassa.

Yksi piijauheen syövytyksen haaste on syövytysliuoksen kuumeneminen, koska syö- pymisreaktio on eksoterminen ja reaktionopeus suuri johtuen jauheen suuresta pinta- alasta. [6]

Sen lisäksi kuinka metalli injektoidaan myös injektoitavan metallin määrä vaikut- taa siihen miten syöpyminen tapahtuu. Tamarov ym. syövyttivät piitä käyttäen eri määriä hopeaa katalyyttinä. Esimerkiksi, kun he syövyttivät 1 g piitä ja käyttivät yli

2 mmol hopeaa, piihin syöpyi selkeitä yhdensuuntaisia polkuja ja muodostui piina- nolankoja. Tämä johtui isojen ja tiheiden hopeananopartikkelien yhdensuuntaisesta syöpymisestä piihin. Osa hopeasta jäi kuitenkin piin pinnalle, minkä seurauksena syn- tyi sivureaktioita ja tuotto pieneni. Kun hopeaa käytettiin 1-2 mmol, osa pinnasta jäi syöpymättä, mutta muutoin syöpyminen oli vastaavaa kuin yli 2 mmol tapauksessa.

Kun hopeaa käytettiin 0,1-0,5 mmol, piinanolangat olivat epätasaisia eikä syviä huo- kosia muodostunut. Lisäksi pinta-ala ja huokostilavuus pienenivät merkittävästi sekä havaittiin, ettei mesohuokosia muodostunut. Kuitenkin, kun hopeaa käytettiin alle 0,1 mmol syöpymisen luonne muuttui ja muodostui lähes ainoastaan mesohuokosia, jotka olivat rakenteeltaan satunnaisia. Niiden huokoskokojakaumasta voitiin havaita kaksi piikkiä, joista toinen oli alle 10 nm ja toinen 20-50 nm. Tamarov ym. esittivät, että isommat huokoset muodostuivat aggregoimattomien hopeananopartikkelien sa- tunnaisesta liikkeestä ja pienemmät huokoset regeneratiivisen syöpymisen kaltaisesta syöpymisestä, jonka aiheuttaa piihin muodostuneet elektroniaukot. Heidän mukaansa elektroniaukot voivat muodostua Ag⁺-ionien pelkistymisen seurauksena piin ja syö- vytysliuoksen rajapinnalla tai ne ovat voineet siirtyä kauemmaksi piihin diffuusiolla muodostuttuaan ensin metalli-pii-rajapinnalla H₂O₂:n vähenemisen tai metallipartik- kelien pinnan Ag⁺-ionien pelkistymisen seurauksena. Lisäksi he havaitsivat, että täl- löin pinta-ala kasvoi takaisin lähes samalle tasolle ja huokostilavuus jopa suuremmaksi kuin käytettäessä 1-2 mmol hopeaa. [6]

Oksidanttina käytettävän H₂O₂:n määrä vaikuttaa niin ikään syöpymiseen ja myös se on syytä injektoida vakionopeudella etenkin, kun syövytetään piijauhetta piikiek- kojen sijaan, koska jauheessa on enemmän pinta-alaa. Injektoimalla H₂O₂ vakiono- peudella voidaan kontrolloida sen konsentraatiota syövytysliuoksessa ja välttyä ek- sotermisen reaktion aiheuttamalta kuumenemiselta [21]. Injektoimalla H₂O₂ hitaalla vakionopeudella esimerkiksi 90 min ajan syöpyminen on jatkuvaa koko injektion ajan ja vältytään elektrolyyttiseltä kiillottumiselta, joka estäisi huokosten muodostumisen.

Kun käytetään yli 2 mmol hopeaa, H₂O₂:n määrä korreloi lineaarisesti PSi:n tuot- toon, koska H₂O₂ kuluu piin syövytykseen metallipartikkelien alla. Siispä lisättäessä H₂O₂:a PSi:n tuotto pienenee. Lisäksi on havaittu, että kun H₂O₂/Si-molaarisuhdetta kasvatetaan 0,9 saakka huokosten tilavuus ja pinta-ala kasvavat hitaasti. Kun molaari- suhde kasvatetaan arvosta 0,9 arvoon 1,0 sekä huokostilavuus, että pinta-ala kasvavat merkittävästi enemmän kuin 0,1 yksikön kasvatus molaarisuhteessa vaikutti alle 0,9 molaarisuhteilla. Tämä voi johtua hopeananopartikkelien tehokkaammasta liukene- misesta korkeammassa H₂O₂-konsentraatiossa ja liuenneiden hopeaionien käynnistä- mästä syöpymisestä. Kun hopeaa käytettiin alle 0,05 mmol, H₂O₂/Si-molaarisuhteen kasvu korreloi lineaarisesti sekä pinta-alaan että huokostilavuuteen kasvattaen mo- lempia arvoja. Lisäksi tuotto läheni lineaarisesti kohti 100 %:a, kun H₂O₂:n määrää vähennettiin, mikä oli osoitus siitä, että käytettäessä matalaa hopeapitoisuutta si- vureaktioiden määrä oli alhainen ja siten H₂O₂ kului lähes täysin mesohuokosten syövyttämiseen. [6]

Syövytyslämpötila vaikutta myös PSi:n ominaisuuksiin. Tamarov ym. tutkivat sen vaikutusta jäillä viilennetyssä, huoneenlämpöisessä ja lämmitetyssä vesihauteessa, jol- loin syövytysliuoksen lämpötilat olivat 16, 30 ja 52,5^◦C. Keskiarvoinen huokostilavuus ei juurikaan muuttunut 16 ja 30^◦C välillä, mutta 52,5^◦C:ssa keskiarvoinen huokosti- lavuus kasvoi merkittävästi. Se, ettei keskiarvoinen huokostilavuus kasvanut 16 ja 30

◦C välillä, johtui pienten hopeananopartikkelien satunnaisen liikkeen muodostamien 8-50 nm huokosten tilavuuden merkittävästä pienemisestä, vaikka samanaikaisesti

regeneratiivista syövytystä muistuttavalla tavalla muodostuvien 2-7 nm huokosten ti- lavuus ja koko kasvoivat. 52,5 ^◦C:ssa keskiarvoisen huokostilavuuden kasvun ohella myös 2-7 nm huokosten koko ja tilavuus kasvoivat, kuten myös 8-50 nm huokosten, mikä laski tuottoa, koska piitä syöpyi enemmän siirryttäessä lähemmäksi elektrolyyt- tisen kiillottumisen vaikutusaluetta. [6]

Tamarov ym. tutkivat myös eri metallien ja piin seostusten vaikutusta MACE- menetelmässä. Kulta ja platina olivat ainoat metallit, jotka soveltuivat syövyttämään UW- ja ESMC10-tyypin piitä, siten että myös 4-6 nm huokosia muodostui. He esit- tivät, että 4-6 nm huokosten muodostuminen oli seurausta siitä, että valenssivyön aukkojen konsentraatio on suurempi metallin puolella, jolloin niitä siirtyy diffuusiolla piin puolelle. Osa siirtyneistä aukoista ilmaantuu lähelle piin ja elektrolyytin raja- pintaa, jolloin etäsyöpyminen (remote etching) voi tapahtua. Eri metalleja vertail- lessa suurimmat pinta-alat saavutettiin käyttämällä katalyyttinä kultaa. Kun kultaa käytettiin syövyttämään eri piiseostuksia, N++-PSi:n pinta-ala oli suurin 310 m²/g, P++-PSi:n pinta-ala oli 190 m²/g ja UW-PSi:n 100 m²/g. He havaitsivat myös, että 4-6 nm huokosten tilavuus oli suurin N++-seostukselle ja lähes samaa luokkaa P++- seostukselle. UW, N+, N, P+, P ja ESMC10-PSi:n seostusten huokostilavuudet olivat matalampia, mutta muistuttivat toisiaan. ESMC10 pinta-ala ja huokostilavuus olivat kuitenkin edellä mainittuja hieman suurempia, koska sen partikkelikoko oli pienempi ja siten sen pinta-ala suurempi ennen syövytystä. [7]

2.2 PSi:n pintakäsittely

PSi:n pinnalla on valtava merkitys sen stabiilisuuteen ja reaktiivisuuteen. Välittömäs- ti syövytyksen jälkeen PSi on erityisen reaktiivisia, koska PSi-partikkelien pinnalla oleva pii on sitoutunut vetyyn muodostaen Si-H, Si-H₂ tai Si-H₃ -sidoksia ja siksi pinnan passivointi on tärkeää. [20] Pii muodostaa edellä mainittuja hydridejä helpos- ti veden kanssa, koska pii on alkuaineena riittävän elektropositiivinen irrottaakseen vedyn vedestä. [1]

PSi-partikkelit reagoivat veden lisäksi helposti myös ilman hapen kanssa, muut- taen partikkelien pinnan morfologiaa ja huokoisuutta. Yksi tapa ehkäistä ei-toivottua hapettumista on oksidoida PSi-partikkelien pinta termisesti oksidoimalla. Termisen oksidoinnin passivoimiskyky riippuu lämpötilasta ja lämmityksen kestosta. Kun oksidointi suoritetaan happea sisältävässä kaasussa ja matalassa lämpötilassa (250- 440 ^◦C), Si-Si-sidokset oksidoituvat SiO_y-Si-H_x-pintarakenteiksi. Kun lämpötila on yli 440 ^◦C:tta, pinnan hydridit alkavat oksidoitua hydroksyyliryhmiksi ja lämpöti- lan ollessa yli 600 ^◦C, myös loput hydridit oksidoituvat joko O_ySi-OH tai Si-O-Si -oksideiksi. [20, 28]

Oksidointi voidaan toteuttaa myös kemiallisesti käyttäen voimakkaasti oksidoi- vaa H₂O₂:a tai HNO₃:a. Kemiallisessa oksidoinnissa muodostuu enemmän Si-OH- pintaryhmiä kuin termisessä oksidoinnissa ja ne mahdollistavat pinnan paremman muokkaamisen. Kemiallisen oksidoinnin on havaittu olevan tehokkaampaa, kun käy- tetään jo ennakkoon passivoitua PSi:tä. Siksi oksidointi voidaan suorittaa ensin ter- misesti, jotta oksidointi on mahdollisimman tehokasta. [28]

Etenkin lääketieteellisissä sovelluksissa käytettävien partikkelien täytyy olla mah- dollisimman myrkyttömiä ja kolloidisesti stabiileja, jotta partikkelit voivat kiertää mahdollisimman pitkään verenkierrossa. Muun muassa näitä ominaisuuksia voidaan parantaa PEGyloimalla PSi-partikkelien pinta. PEGyloinnin stabiloiva vaikutus pe-

rustuu steeriseen stabiiliuteen, jossa varauksettomia polymeerejä liitetään partikke- lien pinnalle polymeerien adsorptiolla tai kemiallisesti liittämällä siten, että ne ympä- röivät partikkelien pinnan tasaisesti. PEG-molekyylien kiinnityttyä PSi-partikkelien pinnalle opsoniinien ja muiden partikkelien kiinnittyminen PSi:n pinnalle estyy PEG- molekyylien varauksettomuuden sekä niiden pitkän hydrofiilisen ketjun ansiosta. [4, 29] Tällöin fagosytoosilta voidaan välttyä, koska makrofagit ja muut syöjäsolut eivät tunnista partikkeleita niihin kiinnittyneen opsoniinin avulla, jolloin verenkiertoaikaa voidaan kasvattaa. Lisäksi PEGylointi passivoi partikkelien pintaa, jonka ansiosta niiden aggregoitumista voidaan välttää [3]. PEGyloinnin kolloidista stabiiliutta pa- rantava vaikutus on suotuisaa suonensisäisille sovelluksille, jotta partikkelit ehtivät saavuttaa halutun kohteen passiivisella kertymisellä, spesifillä sitoutumisella tai ul- koisen kohdennuksen avulla (esim. magneettikenttä [30]) ja niitä kertyisi mahdollisim- man vähän maksaan tai pernaan. Lisäksi preliminääriset mittaukset ovat osoittaneet, ettei PEGylointi lyhennä piinanopartikkelien relaksaatioaikaa, eikä siten vaikuta hy- perpolarisoitujen piinanopartikkelien soveltuvuuteen MRI:ssa [8].

Näkki ym. osoittivat, että 0,5 kDa ja 2,0 kDa PEG-molekyyleillä, partikkelien pin- ta voitiin PEGyloida mahdollisimman tiheästi ja estää proteiinien adsorptio tehok- kaasti. Esimerkiksi PEGylointi 2,0 kDa:n PEG:lla ei ollut yksinään riittävä torjumaan pienten makromolekyylien sitoutumista. Eri kokoisten PEG-molekyylien käytöllä voi- tiin PEGyloida partikkelien pinta tiheämmin. [29, 31] PEGyloinnin tiheyden kasvat- tamisella voidaan puolestaan parantaa partikkelien bioyhteensopivuutta ja välttää entistä tehokkaammin esimerkiksi fagosytoosia, mutta toisaalta joissain sovelluksis- sa se voi vaikeuttaa lääkkeen pääsyä tiettyihin soluihin, jolloin lääkkeen teho laskee.

Tätä ilmiötä onkin kutsuttu PEG dilemmaksi. Dilemman ratkaisemiseksi on esitetty PEG-ketjujen poistamista kohdennetulla alueella entsymaattisesti tai hydrolyyttises- ti. [32]

3 Nanopartikkelit verihyytymien teranostiikassa

Verihyytymät koostuvat enimmäkseen verihiutaleista ja fibriineistä. Verihyytymät muodostuvat yleensä vahingoittuneiden verisuonien seinämiin seurauksena verisuo- nien mekaanisesta vauriosta tai plakin repeytymisestä. Veren hyytyminen on moni- vaiheinen ketjureaktio, johon osallistuu myös useita eri proteiineja. Useat hyytymis- reaktioon osallistuvat proteiinit kiertävät verenkierron mukana epäaktiivisessa muo- dossa ja muuttuvat aktiiviseen muotoon verenvuodon ilmentyessä. [15, 33]

Veritulppa on puolestaan paikallisesti kehittynyt verihyytymä eli trombi, joka voi tukkia verenkierron erityisesti laskimoissa, joissa veren virtaus on hitaampaa. Veri- hyytymän irrotessa verisuonien seinämistä se voi kulkeutua kapeisiin verisuoniin ja tukkia ne. Kulkeutunutta tukosta kutsutaan emboliaksi. Veritulpat aiheuttavat vaa- rallisia sairauksia, kuten sydän- tai aivoinfarkteja ja keuhkoveritulppia. [18] Toisin kuin useat muut sairaudet, verihyytymät havaitaan tavallisesti vasta pitkälle eden- neenä, jolloin tukos verisuonessa on edennyt jo vakavaksi. Tästä syystä hoito on suo- ritettava pikaisesti tukkeuman havaitsemisen jälkeen.[30] Akuuteissa tukkeumien hoi- doissa, joissa verihyytymä on lähtenyt liikkeelle ja tukkinut esimerkiksi aivovaltimon, käytetään yleensä liuotushoitoa. Mikäli potilaalla on jatkuva veritulpan muodostumi- sen riski, joka voi olla muun muassa perinnöllistä, käytetään verenohennushoitoa eli antikoagulaatiohoitoa, mikä estää veren hyytymistä. Tyypillisiä verenohennuslääkkei- tä ovat hepariini ja varfariini (Marevan). Edellä mainittuihin hoitomuotoihin liittyy aina verenvuotokomplikaation riski, koska hoidot vaikuttavat koko verenkierron alu- eella [30].

Veritulppien hoidossa käytettävät lääkkeet on jaoteltu verihiutaleita ja veren hyy- tymistä aiheuttavia proteiineja estäviin lääkkeisiin, jotka estävät veritulppien muo- dostumisen ja verihyytymiä liuottaviin lääkkeisiin. Liuottavista lääkkeistä tärkeimpiä ovat plasminogeeni aktivaattorit, kuten streptokinaasi (SK, streptokinase) ja tPA.

Ne eivät kuitenkaan ole spesifisiä, joten ne aiheuttavat verenvuotokomplikaatioita ja joissain tapauksissa allergisia reaktioita. [30]

Kohdennettu lääkintä olisi ratkaisu tehokkaampaan hoitoon ja sivuvaikutusten välttämiseksi. Kokeellisissa veritulppien hoitomuodoissa kantajapartikkeleita pyritään joko ohjaamaan verihyytymän alueelle ulkoisen magneettikentän avulla tai aktivoi- maan lääkkeen vapautuminen verihyytymän alueella ultraäänellä. Lisäksi lääke voi- daan myös pyrkiä kohentamaan verihyytymiin hyytymisprosessissa keskeisessä roolis- sa olevien verihiutaleiden pintaproteiineihin spesifisesti sitoutuvien ligandien avulla.

Kehityksessä on myös teranostisia lähestymistapoja, joilla voitaisiin samanaikaisesti hoitaa veritulppa ja monitoroida hoidon tehokkuutta. [30]

Verihyytymien kuvantamiseen on kehitetty muun muassa rautaoksidinanopartik- keleita [18, 19], kultananopartikkeleita [13] ja radionuklideja ^99mTc ja¹²⁵I [15]. Useat tutkimukset keskittyvät nimenomaan kohdennettuun verihyytymien tai valtimokovet- tumien kuvantamiseen tai niiden hoitoon, mutta teranostisia sovelluksia ei juurikaan ole. McCarthy ym. ovat kuitenkin kehittäneet myös teranostista sovellusta, jossa he kohdensivat rautaoksidinanopartikkeleita peptidien avulla verihyytymien muodostu- misprosessissa esiintyviin proteiineihin. He osoittivat partikkelien sitoutuvan verihyy- tymiin hiirikokeissa jopa 2,7-kertaisella tehokkuudella verrattuna referenssinäyttei- siin, joissa kohdentavaa peptidiä ei käytetty. Lisäksi partikkelit soveltuivat MRI:hin sekä verihyytymiä liuottavan tPA:n kantajaksi. [18, 19]

Verihyytymien kuvantamiseen ilman terapeuttista ominaisuutta on kehitetty na- nopartikkeleita, jotka soveltuvat kuvantamiseen joko CT:llä tai MRI:llä. Esimerkiksi CT:llä kuvattavia kultananopartikkeleita on kehitetty verihyytymien akuuttiin ku- vantamiseen. Kim ym. tutkivat fibriinikohdennettuja klykoli-kitosaani-pinnoitettuja kultananopartikkeleita, joiden avulla veritulppa voidaan havaita ja sen vakavuus ar- vioida reaaliajassa sekä seurata fibrinolyyttisen hoidon tehokkuutta. [13] Suzuki ym.

kohdensivat superparamagneettisia rautaoksidinanopartikkeleita aktiivisten verihiu- taleiden pinnalla esiintyvään P-selektiiniin sulfidoidulla polysakkaridilla (f ucoidan) ja he osoittivat, että verihyytymiä voidaan kuvata näiden nanopartikkelien avulla MRI:llä. [14] Myös gadoniumpohjaisia MRI:llä kuvattavia kontrastiaineita on tutkit- tu ja myös ne kohdennettiin hyytymissä esiintyvään P-selektiiniin. [34]

Verihyytymien kohdennetun hoidon sovelluksia ovat kehittäneet muun muassa Xu ym. [16] He kehittivät verihiutaleilla pinnoitettuja polymeerisiä nanopartikkelei- ta, jotka oli konjugoitu liuotushoidoissa käytettävällä rtPA:lla (recombinant tissue plasminogen activator) ja he osoittivat, että nanopartikkelit kohdentuivat aktivoitu- neisiin verihiutaleisiin verihyytymän muodostuessa sekä vähensivät verenvuotoriskiä verrattuna vapaaseen rtPA:han. [16] Myös magneettisesti kohdennettuja tPA:lla ja SK:lla ladattuja silika-kuparinanopartikkeleita (SiO₂-CuNP) on tutkittu verihyyty- mien kohdennettuun hoitoon. Tadayon ym. onnistuivat kohdentamaan magneettisia SiO₂-CuNP-nanopartikkeleita 15 % tehokkaammin vapaaseen tPA-SK verrattuna rottamallissaan sekä saavuttivat 15-25 min nopeamman verihyytymien hajoami- sajan. [17]

4 Nanopartikkelien karakterisointimenetelmät

4.1 Kaasuadsorptio ja -desorptio

Kaasusorptiolla voidaan karakterisoida huokoisten materiaalien pinta-alaa ja huo- koisten kokojakaumaa sekä tilavuutta. Kaasusorptiossa mitataan adsorpoituneen ja desorptoituneen kaasun määrää sen suhteellisen paineen funktiona. Tästä datasta muodostuvaa kuvaajaa kutsutaan adsorptio- tai desorptioisotermiksi. Mesohuokoisil- la nanopartikkeleilla adsorptio-desorptioisotermiin muodostuu hysteresissilmukka eli suljettu silmukka, jossa adsorptio- ja desorptiokäyrät poikkeavat toisistaan, mutta pienin ja suurin arvo on sama molemmilla käyrillä.

Kaasuadsorptiossa kaasumolekyylit, kuten typpi tai argon, adsorpoituvat mata- lassa paineessa olevan näytteen pinnalle. Kun painetta kasvatetaan, kaasumolekyylit muodostavat ensin yhden molekyylikerroksen paksuisen kerroksen näytteen pinnalle Langmuirin teorian mukaisesti. Langmuirin teoria sopii hyvin kemisorptioon, koska sen mukaan adsorptiopinnalla on vain yhdenlaisia perustiloja, joihin vain yksi mole- kyyli voi adsorpoitua. Teoria ei kuitenkaan suoraan sovellu huokoisille materiaaleille, jos myös fysisorptio huomioidaan. Fysisorptiossa painetta kasvatettaessa muodostuu useamman molekyylikerroksen paksuisia kerroksia heikkojen vuorovaikutusten, kuten van der waals -voimien seurauksena. Emmett ja Brunauer päättelivät kokeellisesti, että matalilla paineilla isotermin juuri muuttuessa lineaariseksi adsorpoitunut kerros olisi todennäköisesti yhden molekyylikerroksen paksuinen. Brunauer-Emmett-Teller (BET) -teoriassa Langmuirin teoriaa laajennettiin siten, että edellinen adsorptiokerros voi toimia adsorptiopintana seuraavalle kerroksella aina saturaatiopisteeseen saakka, mikä tarkoittaa äärellistä adsorptiokerrosten määrää ja siten äärellistä adsorptioker- roksen paksuutta. [35] BET-teoriassa oletetaan myös, että adsorboituvat molekyylit ovat pallon muotoisia ja ne järjestyvät pintaan heksagonaalisesti. Adsorpoituneiden kaasumolekyylien määrä n_m voidaan ratkaista lineaarisen BET-yhtälön (9) avulla, sovittamalla suora isotermin lineaariseen osaan. Lineaarinen BET-yhtälö on muotoa

p/p⁰

n_ad(1−p/p⁰) = 1

n_mC + C−1 n_mC

p

p⁰, (9)

missä n_ad adsorboituneen kaasun ainemäärä suhteellisessa paineessap/p⁰,n_m ensim- mäiseen molekyylikerrokseen adsorpoituneen kaasun ainemäärä ja C BET-vakio. [5]

C on likimäärin

C =e^q1RT−q2, (10)

missä q₁ on ensimmäisen molekyylikerroksen adsorpoima lämpö ja q₂ nesteytymises- sä adsorpoitunut lämpö [36]. Sovittamalla suora lähes lineaariseen dataan pienimmän neliösumman menetelmällä, voidaann_m jaC ratkaista sovitetun suoran kulmakertoi- men, vakiotermin ja lineaarisen BET-yhtälön (9) avulla. Tällöin pinta-alaA_svoidaan ratkaista yhtälön (11) mukaisesti, missä N_Aon Avogadron vakio ja akeskimääräinen kaasumolekyylien poikkipinta-ala

A_s =n_mN_Aa. (11)

Huokosten kokojakauman ja tilavuuden selvittämiseksi voidaan puolestaan käyt- tää BJH-teoriaa. BJH-teoriassa oletetaan, että huokoset ovat sylinterin muotoisia ja

kaasumolekyylit fysisorboituvat huokosten seinämiin tai nesteytyvät kapillaareihin.

[37]

Kun painetta kasvatetaan, kaasu adsorpoituu huokosten seinämille. Painetta yhä kasvatettaessa adsorpoitunut kaasu alkaa kondensoitua seinämille, jolloin neste alkaa täyttämään huokosia. Kondensoituminen riippuu huokosten koosta Kelvinin yhtälön

log P P₀

!

= −2γ_glV_m

r_kRT (12)

mukaisesti, missä γ_gl on adsorpoituvan nesteen pintajännitys, V_m nesteen molaarinen tilavuus ja rk on Kelvinin säde eli kondensoituneen nesteen säde. Todellisessa huo- kosten sädettärlaskettaessa on otettava huomioon myös adsorptiokerroksen paksuus t, jolloin huokosten säde voidaan ratkaista yhtälöllä r = r_k+t. [37] Säteen määrit- tämisessä tarvittava Kelvinin säde voidaan ratkaista Kelvinin yhtälöstä (12) ja typ- pikaasua käytettäessä adsorptiokerroksen paksuus t voidaan määrittää esimerkiksi Harkins-Jura yhtälöllä

t =

"

0,1399 0,034−logp/p₀

#1/2

(13) [38].

4.2 Termogravimetria

Termogravimetri (TG) eli lämpövaaka lämmittää näytettä ja punnitsee sen massaa lämmityksen aikana eri ajanhetkillä. Termogravimetria (TGA) on termoanalyyttinen menetelmä, jolla tutkitaan, kuinka lämpöenergia vaikuttaa materiaalin koostumuk- seen. TGA:lla voidaan karakterisoida esimerkiksi epäorgaanisen kantajaan ladatun lääkemolekyylin tai sen pinnalle konjugoidun orgaanisen yhdisteen määrä, sillä epä- orgaaniset materiaalit ovat termisesti stabiilimpia kuin lääkemolekyylit tai orgaa- niset yhdisteet. Täten, kun lämmitetään esimerkiksi PEGyloituja PSi-partikkeleita, PEG-molekyylit hajoavat PSi-partikkelien pinnalta lämpötiloissa, joissa PSi:n massa ei merkittävästi muutu. Tällöin massan häviöstä voidaan ratkaista PEG-molekyylien massa, kun verrataan massahäviötä PEGyloimattoman referenssinäytteen kanssa.

4.3 Dynaaminen valonsironta

Dynaamisella valonsironnalla (DLS, dynamic light scattering) voidaan määrittää nanopartikkelien ja pienten mikropartikkelien hydrodynaaminen kokojakauma sus- pensiossa sekä tutkia niiden kolloidista stabiilisuutta. Menetelmä perustuu Brownin liikkeeseen, jonka mukaan mikro- tai nanopartikkelit liikkuvat satunnaisesti suspen- siossa, mutta Brownin liikkeen nopeus on sitä suurempi mitä pienempi partikkeli on. Kun partikkelit liikkuvat suspensiossa ja niihin kohdistetaan monokromaattis- ta laservaloa, sirottavien nanopartikkelien ja detektorin väliset etäisyydet vaihtelevat eri ajanhetkillä. Tällöin nanopartikkeleista sironneet fotonit interferoivat keskenään.

Tällöin siis sironneen valon kokonaisintensiteetti vaihtelee satunnaisesti ajan suhteen.

Koska pienet partikkelit liikkuvat nopeammin kuin suuret partikkelit, on myös ko- konaisintensiteetin vaihtelu nopeampaa pienille nanopartikkeleille kuin suurille nano- partikkeleille. Intensiteetin vaihtelua ja sen riippuvuutta ajasta voidaan tarkastella

autokorrelaatiofunktion avulla, jota edelleen analysoimalla voidaan määrittää pyö- reiden nanopartikkelien hydrodynaamisen säteen kokojakauma. [39] Yleensä nano- partikkelien koolla tarkoitetaan kyseisen kokojakauman keskiarvoa. Koska Brownin liikkeen nopeuteen vaikuttavat myös suspension viskositeetti sekä lämpötila, tulee ky- seiset mittausparametrit tuntea tarkasti, jotta mittauksen tulokset ovat luotettavia.

Vesisuspensio on yleinen vaihtoehto, jonka viskositeetti ja sen lämpötilariippuvuus ovat hyvin tunnettuja.

4.4 Zeta-potentiaali

Nanopartikkelien pinnan läheisyydessä on diffuusiokerros, jossa on partikkelien pin- tavaraukseen verrattuna vastakkaisesti varautuneita ioneja. Ioneja sitoutuu varauk- sellisen nanopartikkelin pinnalle sähköisen vetovoiman takia, jolloin nanopartikkelin pinnalle muodostuu tiukasti sitoutuneiden ionien kerros, jota kutsutaan Sternin ker- rokseksi. Tiukasti sitoutuneen Sternin kerroksen ulkopuolella sijaitsee jo edellä mai- nittu diffuusiokerros, jossa on sekä positiivisesti että negatiivisesti varautuneita ione- ja, mutta ne ovat sitoutuneet heikommin. Liukupinnaksi (slipping plane) kutsutaan sitä etäisyyttä ytimestä, jonka sisäpuolella ionit liikkuvat partikkelin liikkeen muka- na. Tähän etäisyyteen päättyy myös diffuusiokerros ja sen ulkopuolella ionit liikku- vat vapaasti partikkelien liikkeestä riippumatta. Sähköistä potentiaalia, joka vallitsee liukupinnalla, kutsutaan zeta-potentiaaliksi. [32, 40] Edellä kuvailtuja kerroksia ja zeta-potentiaalia havainnollistetaan kuvassa 2.

Kuva 2: Kuvassa on esitetty negatiivisesti varautuneen partikkelin Sternin kerros, diffuusiokerros ja liukupinta. Liukupinnalla vallitsevaa potentiaalia kutsutaan zeta- potentiaaliksi. Kuva on lähteestä [40].

Zeta-potentiaalin avulla voidaan arvioida nanopartikkelien stabiiliutta suspensios- sa, sillä sen avulla saadaan tietoa onko nanopartikkeleilla taipumusta kiinnittyä toi- siinsa joko aggregoituen tai flokkuloituen. Aggregoitumiseen ja flokkuloitumiseen vai- kuttavat muun muassa nanopartikkelien pinnan ominaisuudet, nesteen pH ja ionivah- vuus. [41] Jotta nanopartikkelit eivät aggregoidu tai flokkuloidu on zeta-potentiaalin poikettava nollasta niin paljon, että sähköinen hylkimisvoima kumoaa molekulaaris- ten voimien, kuten van der waals voiman, aiheuttaman vetovoiman. Tällöin nanopar- tikkelit pysyvät toisistaan erillään paremmin ja ovat stabiileja kyseisessä nesteessä.

Toisaalta nanopartikkelit voivat olla kolloidisesti stabiileja, vaikka sähköinen hylki- misvoima ei pitäisikään niitä erillään, koska partikkelit voivat olla stabiileja steerisen stabiloinnin avulla, kuten luvussa 2.2 kerrottiin. Esimerkiksi nanopartikkelien PEG- yloinnin on osoitettu laskevan zeta-potentiaalia, vaikka se parantaa partikkelien kol- loidista stabiiliutta [32].

Laseri-Doppler-elektroforeesi (LDE) on menetelmä, jolla mitataan pientä siron- neen valon taajuussiirtymää, joka on seurausta partikkelien liikkeestä sähkökentässä.

Taajuuden muutos ∆f on muotoa

∆f = 2vsin(θ/2)

λ , (14)

missävon varautuneiden partikkelien nopeus kohti vastakkaisesti varautunutta elekt- rodia, λ laserin aallonpituus jaθ sironneen valonsäteen sirontakulma suhteessa tulo- kulmaan. [42] Sähkökentänvahvuuden E huomioimiseksi voidaan nopeuden sijasta käyttää elektroforeettista liikkuvuutta U_E, joka on nopeuden ja sähkökentänvahvuu- den osamäärä. Tällöin U_E voidaan ratkaista mitatun vaihesiirtymän avulla. Henryn yhtälön mukaan UE on puolestaan

U_E = 2ζF(κa)

3η , (15)

missä on dielektrinen vakio,F(κa) on Henryn funktio,κ on debye etäisyyden kään- teisluku,a on partikkelin säde,η on viskositeetti jaζ on zeta-potentiaali. Täten zeta- potentiaali voidaan ratkaista yhtälöiden (14) ja (15) avulla, kun nopeuden sijasta käytetään elektroforeettista liikkuvuutta. [42, 43]

5 Menetelmät

Tutkielman tavoitteena oli valmistaa ja kehittää sellaisia PSi-nanopartikkeleita, jot- ka soveltuisivat suonensisäisen annostelun sovelluksiin. Täten PSi-partikkelien tulisi saavuttaa riittävä kolloidinen stabiilius PBS-liuoksessa ja huokoskoon sekä tilavuuden tulisi olla sopivia mahdollista lääkeaineen lataamista varten. Tässä luvussa kerrotaan, kuinka PSi-nanopartikkelita valmistettiin ja pintakäsiteltiin (tiivistetysti kuvassa 3) sekä kuinka nanopartikkelien ominaisuuksia karakterisoitiin.

5.1 PSi-partikkelien valmistaminen MACE-menetelmällä ja niiden pinnan muokkaaminen

5.1.1 Piimikropartikkelien valmistaminen

Tässä tutkielmassa PSi-partikkeleita valmistettiin piijauheesta MACE-menetelmällä, joten valmistamisen ensimmäinen vaihe oli piikiekkojen murskaaminen ja jauhami- nen piijauheeksi kaikilla muilla piin tyypeillä paitsi ESMC10-tyypillä, joka oli val- mista jauhetta. Piikiekko murskattiin ensin noin 5 mm kokoisiksi paloiksi, jonka jäl- keen piikiekon palasia jauhettiin Fritsch:in pulverisette 7 planetaarisella kuulamyl- lyllä. Piikiekon palat laitettiin zirkonia jauhamiskulhoihin ja niihin lisättiin halkaisijaltaan 1 cm kokoisia zirkonia kuulia. Jauhamiseen käytettiin nopeutta 300 RPM ja jauhaminen kesti yhtäjaksoisesti 15 minuuttia, jonka jälkeen zirkonia kuu- lat poistettiin ja jauhetut partikkelit siivilöitiin ultraäänivärisyttäjää apuna käyttäen 53 µm ja 25 µm siivilöillä. Alle 25 µm partikkelit kerättiin talteen ja suuremmat partikkelit jauhettiin ja siivilöitiin uudelleen, kunnes niiden koko oli alle 25 µm.

Seuraavaksi mikropartikkelit pestiin 20 g erissä siten, että partikkelien sekaan lisättiin 220 ml vettä ja 20 ml H₂O₂ (37 %) ja niitä sonikoitiin ultraäänialtaassa tunnin ajan sekoittaen niitä lusikalla 15 min välein, jotta partikkelit eivät muodostaisi sedimenttiä keitinlasin pohjalle. Sen jälkeen mikropartikkelit huuhdeltiin vedellä 11 µm suodattimen päällä ja partikkelien annettiin kuivua uunissa 67 ^◦C:ssa yön yli.

Suodatuksen seurauksena piipartikkelien koko oli siis 11 - 25µm. Pesun tavoitteena oli poistaa mahdolliset orgaaniset kontaminaatiot piin pinnalta partikkelikokojakauman muokkaamisen lisäksi.

5.1.2 Etikkahapon määrän ja syövytettävän piijauheen massan vaikutus PSi:n ominaisuuksiin MACE-menetelmässä

Sekä etikkahapon määrän vaikutusta että syövytettävän piijauheen massan vaiku- tusta PSi-partikkelien ominaisuuksiin MACE-menetelmässä tutkittiin valmistamal- la PSi-partikkeleita pitäen muita valmistusparametrejä vakioina. Etikkahapon mää- rän testaamisessa käytettiin N+-piijauhetta ja piijauheen massan testaamisessa P+- piijauhetta.

Etikkahapon määrän vaikutusta tutkittiin valmistamalla PSi:tä käyttäen piijau- heen kostuttamiseen 0-40 ml etikkahappoa. Syövytettävän piijauheen massan vaiku- tusta tutkittiin puolestaan valmistamalla PSi-partikkeleita käyttäen n. 1 g ja 2 g valmistuseriä pitäen H₂O₂/Si molaarisuhde vakiona ja kaksinkertaistamalla myös in- jektoitavan metallin määrä. Molemmissa mittauksissa valmistettujen PSi-partikkelien BET-pinta-ala ja BJH-tilavuus määritettiin kaasusorptiolla (TriStar II 3020), min-

kä lisäksi määritettiin PSi-partikkelien tuottoprosentti mittaamalla näytteen massa ennen syövytystä ja sen jälkeen.

5.1.3 Metalliavusteinen kemiallinen syövytys (MACE)

Tutkielmassa käytettävä PSi-mikropartikkelien valmistusmenetelmä mukailee Tama- rovin ym. valmistusmenetelmää [7]. MACE-menetelmässä metallina käytettiin kultaa, koska sen avulla voitiin syövyttää 4-6 nm huokosia, piin saostuksesta riippumatta, se- kä sillä saavutetaan suuret pinta-alat.

Ensin 1,005 g ±0,005 g mikropartikkeleita punnittiin 100 ml polytetrafluorietee- niastiaan. Mikropartikkelien sekaan lisättiin 20 ml etikkahappoa ja niitä sonikoitiin 10 min. Mahdollisesti aggregoituneiden partikkelien liukenemista pyrittiin helpotta- maan sekoittamalla niitä lusikalla muutaman minuutin välein. Seuraavaksi partikke- lien sekaan lisättiin 20 ml HF:a (40 %) ja seosta sekoitettiin magneettisekoittajan avulla, jonka jälkeen lämpötilan annettiin tasautua 10 min ajan, mikäli syövytykses- sä käytettiin lämpö- tai kylähaudetta. Kylmähaudetta käytettiin N++-tyypin piijau- heen syövytyksessä, P++-tyypin piijauheen syövytettiin huoneen lämmössä ja N+, N, P+, P, UW, ESMC10 -tyyppien piijauheet syövytettiin 50 ^◦C:n lämpöhauteessa.

Lämpötilan tasauduttua aloitettiin metallin (HAuCl₄) injektoiminen. 4,167 ml 0,006 M HAuCl₄·3 H₂O liuosta injisoitiin ruiskun avulla nopeudella 0,278 ml/min eli 15 minuutin ajan, jonka jälkeen liuoksen annettiin sekoittua vielä 5 minuutin ajan, jotta kulta leviäisi tasaisesti piimikropartikkelien pinnalle ja kullan konsentraatio olisi tasainen.

Oksidanttina käytettiin H₂O₂:a, jota injisoitiin siten, että sen molaarisuhde piihin oli likimain yksi. Kun piin massa oli likimain 1,005 g eli 0,0357 mol ja H₂O₂:n vah- vuus oli 35 wt% (11,52 M) tarvittiin sitä noin 3,2 ml, joka vastaa 0,0368 mol. Tällöin molaarisuhde oli 1,0. Jotta H₂O₂:a voitiin injisoida hitaammin syöpymisliuokseen ja välttää syövytysliuoksen lämpeneminen ja reaktion siirtyminen kohti elektrolyyttis- tä kiillottumista, sitä laimennettiin lisäämällä 2,8 ml tislattua vettä. Tällöin H₂O₂- liuoksen tilavuus oli 6 ml, joka injisoitiin nopeudella 66,67µl/min partikkelien (1,005 g) sekaan, mikä tarkoitti likimain 90 min injektioaikaa. Injisoinnin jälkeen reaktion annettiin kulkea loppuun 10 min ajan. Lopuksi partikkelit huudeltiin vedellä 9 µm suodattimen päällä, kun partikkelien koko oli 11-25 µm ja 1-2 µm suodattimen pääl- lä, kun partikkelien koko oli 2-10µm kaupallisten ESMC10-partikkelien tapauksessa.

Tutkimuksessa käytettyjen partikkelien koot on esitetty taulukossa 1 piin eri seostuk- sille. Suodatuksen jälkeen partikkelit kasteltiin nopeasti haihtuvalla pentaanilla, jotta veden kuivuessa sen pintajännitys ei rikkoisi huokosia. Partikkelien annettiin kuivua uunissa 67 ^◦C:ssa yön yli.

5.1.4 Terminen oksidoiminen

PSi-mikropartikkeleita oksidoitiin termisesti kuumentamalla niitä 2 tunnin ajan 300

◦C:ssa huoneilmassa. Mikropartikkelit asetettiin lasisessa näytepullossa vaaka-asen- nossa isoon kvartsiputkeen, joka asetettiin putkiuuniin. Lämmityksen jälkeen partik- kelien annettiin jäähtyä huoneenlämmössä ja ne kerättiin talteen. Termisesti oksidoi- duista huokoisista piipartikkeleista käytetään lyhennettä TOPSi.

5.1.5 PSi-nanopartikkelien valmistaminen

TOPSi-mikropartikkeleista valmistettiin nanopartikkeleita sekä sonikoimalla niitä ve- sisuspensioissa että jauhamalla niitä planetaarisella kuulamyllyllä.

Sonikointimenetelmässä 200 mg TOPSi-mikropartikkelita suspendoitiin noin 20- 30 ml vettä. 50 ml putkissa olevat suspendoidut TOPSi-partikkelit asetettiin vesihau- teeseen, jonne lisättiin jäitä suspension jäähdyttämiseksi. Hielcher:in UP200S soni- kaattorin sauva asetettiin suspensioon ja sonikointi suoritettiin suurimmalla teholla (200 W) 1 tunnin jaksoissa. Jaksojen välillä suspensiosta poistettiin likimain 50 µl näyte TOPSi-partikkeleita, joiden koko mitattiin ennen seuraavan sonikointijakson aloittamista. Sonikoinnin jälkeen partikkelit erotettiin vedestä sentrifugoimalla ja ne pestiin etanolilla kahdesti. Pesulla tarkoitetaan partikkelien suspendoimista ja sentri- fugointia, jonka jälkeen partikkelit poistetaan nesteestä ja ne suspendoidaan uudelleen (tässä tapauksessa etanoliin). Pesun jälkeen partikkelit varastoitiin etanoliliuoksessa.

Jauhamismenetelmässä TOPSi-mikropartikkeleita jauhettiin Fritsch:in pulveriset- te 7 planetaarisella kuulamyllyllä. Jauhaminen suoritettiin 2 ml lasisissa näyteputkis- sa ja jauhamiseen käytettiin 1 mm kokoisia zirkonia jauhamiskuulia. Likimain 200 mg TOPSi-mikropartikkeleita laitettiin koeputkeen ja täytettiin jauhamiskuulilla, jonka jälkeen partikkelit sekoitettiin kuulien joukkoon pyörivällä liikkeellä. Kuvassa 4 on esitetty asetelma ennen sekoittamista. Lopuksi joukkoon lisättiin etanolia, jonka va- lumista näyteputken pohjalle helpotettiin sonikoimalla niitä ultraäänialtaassa. Näy- teputket asetettiin tiiviisti jauhamisastiaan, jottei niiden korkit pääse avautumaan.

Partikkeleita jauhettiin 5 min jaksoissa, jotta lasiputkiin kertyvä paine voitiin vapaut- taa jaksojen välillä, millä ehkäistiin putkien haitallinen lämpeneminen sekä paineen kasvaminen ja täten ehkäistiin näyteputkien rikkoutuminen sekä näytteen vuotami- nen näyteputkesta. Ensimmäisessä jauhamisperiodissa pyörimisnopeutena käytettiin 500 RPM, jonka jälkeisissä periodeissa käytettiin nopeutta 700 RMP. Partikkeleita jauhettiin noin 1 h ajan tai kunnes partikkeleiden koko oli halutun suuruinen. Jauha- misen jälkeen jauhamiskuulat ja niiden seassa olevat partikkelit kaadettiin keitinlasiin ja lisättiin noin 5 ml etanolia, jonka jälkeen partikkelit eroteltiin kuulista pipetoimal- la. Kuulien huuhtelemiseen käytettiin noin 5 ml etanolia ja ne huuhdeltiin kolmesti, jotta mahdollisimman paljon partikkeleita saatiin kerättyä talteen. PSi-partikkelit varastoitiin etanoliin.

Kuva 4: Kuvassa on P, P+, P++, N+, N++, UW ja ESMC10 -tyyppien huokoisia piimikropartikkeleita sekä zirkoniakuulia asetettuna näyteputkiin jauhamista varten.