PSi:n pinnalla on valtava merkitys sen stabiilisuuteen ja reaktiivisuuteen. Välittömäs-ti syövytyksen jälkeen PSi on erityisen reakVälittömäs-tiivisia, koska PSi-parVälittömäs-tikkelien pinnalla oleva pii on sitoutunut vetyyn muodostaen Si-H, Si-H2 tai Si-H3 -sidoksia ja siksi pinnan passivointi on tärkeää. [20] Pii muodostaa edellä mainittuja hydridejä helpos-ti veden kanssa, koska pii on alkuaineena riittävän elektroposihelpos-tiivinen irrottaakseen vedyn vedestä. [1]
PSi-partikkelit reagoivat veden lisäksi helposti myös ilman hapen kanssa, muut-taen partikkelien pinnan morfologiaa ja huokoisuutta. Yksi tapa ehkäistä ei-toivottua hapettumista on oksidoida PSi-partikkelien pinta termisesti oksidoimalla. Termisen oksidoinnin passivoimiskyky riippuu lämpötilasta ja lämmityksen kestosta. Kun oksidointi suoritetaan happea sisältävässä kaasussa ja matalassa lämpötilassa (250-440 ◦C), Si-Si-sidokset oksidoituvat SiOy-Si-Hx-pintarakenteiksi. Kun lämpötila on yli 440 ◦C:tta, pinnan hydridit alkavat oksidoitua hydroksyyliryhmiksi ja lämpöti-lan ollessa yli 600 ◦C, myös loput hydridit oksidoituvat joko OySi-OH tai Si-O-Si -oksideiksi. [20, 28]
Oksidointi voidaan toteuttaa myös kemiallisesti käyttäen voimakkaasti oksidoi-vaa H2O2:a tai HNO3:a. Kemiallisessa oksidoinnissa muodostuu enemmän Si-OH-pintaryhmiä kuin termisessä oksidoinnissa ja ne mahdollistavat pinnan paremman muokkaamisen. Kemiallisen oksidoinnin on havaittu olevan tehokkaampaa, kun käy-tetään jo ennakkoon passivoitua PSi:tä. Siksi oksidointi voidaan suorittaa ensin ter-misesti, jotta oksidointi on mahdollisimman tehokasta. [28]
Etenkin lääketieteellisissä sovelluksissa käytettävien partikkelien täytyy olla mah-dollisimman myrkyttömiä ja kolloidisesti stabiileja, jotta partikkelit voivat kiertää mahdollisimman pitkään verenkierrossa. Muun muassa näitä ominaisuuksia voidaan parantaa PEGyloimalla PSi-partikkelien pinta. PEGyloinnin stabiloiva vaikutus
pe-rustuu steeriseen stabiiliuteen, jossa varauksettomia polymeerejä liitetään partikke-lien pinnalle polymeerien adsorptiolla tai kemiallisesti liittämällä siten, että ne ympä-röivät partikkelien pinnan tasaisesti. PEG-molekyylien kiinnityttyä PSi-partikkelien pinnalle opsoniinien ja muiden partikkelien kiinnittyminen PSi:n pinnalle estyy PEG-molekyylien varauksettomuuden sekä niiden pitkän hydrofiilisen ketjun ansiosta. [4, 29] Tällöin fagosytoosilta voidaan välttyä, koska makrofagit ja muut syöjäsolut eivät tunnista partikkeleita niihin kiinnittyneen opsoniinin avulla, jolloin verenkiertoaikaa voidaan kasvattaa. Lisäksi PEGylointi passivoi partikkelien pintaa, jonka ansiosta niiden aggregoitumista voidaan välttää [3]. PEGyloinnin kolloidista stabiiliutta pa-rantava vaikutus on suotuisaa suonensisäisille sovelluksille, jotta partikkelit ehtivät saavuttaa halutun kohteen passiivisella kertymisellä, spesifillä sitoutumisella tai ul-koisen kohdennuksen avulla (esim. magneettikenttä [30]) ja niitä kertyisi mahdollisim-man vähän maksaan tai pernaan. Lisäksi preliminääriset mittaukset ovat osoittaneet, ettei PEGylointi lyhennä piinanopartikkelien relaksaatioaikaa, eikä siten vaikuta hy-perpolarisoitujen piinanopartikkelien soveltuvuuteen MRI:ssa [8].
Näkki ym. osoittivat, että 0,5 kDa ja 2,0 kDa PEG-molekyyleillä, partikkelien pin-ta voitiin PEGyloida mahdollisimman tiheästi ja estää proteiinien adsorptio tehok-kaasti. Esimerkiksi PEGylointi 2,0 kDa:n PEG:lla ei ollut yksinään riittävä torjumaan pienten makromolekyylien sitoutumista. Eri kokoisten PEG-molekyylien käytöllä voi-tiin PEGyloida partikkelien pinta tiheämmin. [29, 31] PEGyloinnin tiheyden kasvat-tamisella voidaan puolestaan parantaa partikkelien bioyhteensopivuutta ja välttää entistä tehokkaammin esimerkiksi fagosytoosia, mutta toisaalta joissain sovelluksis-sa se voi vaikeuttaa lääkkeen pääsyä tiettyihin soluihin, jolloin lääkkeen teho laskee.
Tätä ilmiötä onkin kutsuttu PEG dilemmaksi. Dilemman ratkaisemiseksi on esitetty PEG-ketjujen poistamista kohdennetulla alueella entsymaattisesti tai hydrolyyttises-ti. [32]
3 Nanopartikkelit verihyytymien teranostiikassa
Verihyytymät koostuvat enimmäkseen verihiutaleista ja fibriineistä. Verihyytymät muodostuvat yleensä vahingoittuneiden verisuonien seinämiin seurauksena verisuo-nien mekaanisesta vauriosta tai plakin repeytymisestä. Veren hyytyminen on moni-vaiheinen ketjureaktio, johon osallistuu myös useita eri proteiineja. Useat hyytymis-reaktioon osallistuvat proteiinit kiertävät verenkierron mukana epäaktiivisessa muo-dossa ja muuttuvat aktiiviseen muotoon verenvuodon ilmentyessä. [15, 33]
Veritulppa on puolestaan paikallisesti kehittynyt verihyytymä eli trombi, joka voi tukkia verenkierron erityisesti laskimoissa, joissa veren virtaus on hitaampaa. Veri-hyytymän irrotessa verisuonien seinämistä se voi kulkeutua kapeisiin verisuoniin ja tukkia ne. Kulkeutunutta tukosta kutsutaan emboliaksi. Veritulpat aiheuttavat vaa-rallisia sairauksia, kuten sydän- tai aivoinfarkteja ja keuhkoveritulppia. [18] Toisin kuin useat muut sairaudet, verihyytymät havaitaan tavallisesti vasta pitkälle eden-neenä, jolloin tukos verisuonessa on edennyt jo vakavaksi. Tästä syystä hoito on suo-ritettava pikaisesti tukkeuman havaitsemisen jälkeen.[30] Akuuteissa tukkeumien hoi-doissa, joissa verihyytymä on lähtenyt liikkeelle ja tukkinut esimerkiksi aivovaltimon, käytetään yleensä liuotushoitoa. Mikäli potilaalla on jatkuva veritulpan muodostumi-sen riski, joka voi olla muun muassa perinnöllistä, käytetään verenohennushoitoa eli antikoagulaatiohoitoa, mikä estää veren hyytymistä. Tyypillisiä verenohennuslääkkei-tä ovat hepariini ja varfariini (Marevan). Edellä mainittuihin hoitomuotoihin liittyy aina verenvuotokomplikaation riski, koska hoidot vaikuttavat koko verenkierron alu-eella [30].
Veritulppien hoidossa käytettävät lääkkeet on jaoteltu verihiutaleita ja veren hyy-tymistä aiheuttavia proteiineja estäviin lääkkeisiin, jotka estävät veritulppien muo-dostumisen ja verihyytymiä liuottaviin lääkkeisiin. Liuottavista lääkkeistä tärkeimpiä ovat plasminogeeni aktivaattorit, kuten streptokinaasi (SK, streptokinase) ja tPA.
Ne eivät kuitenkaan ole spesifisiä, joten ne aiheuttavat verenvuotokomplikaatioita ja joissain tapauksissa allergisia reaktioita. [30]
Kohdennettu lääkintä olisi ratkaisu tehokkaampaan hoitoon ja sivuvaikutusten välttämiseksi. Kokeellisissa veritulppien hoitomuodoissa kantajapartikkeleita pyritään joko ohjaamaan verihyytymän alueelle ulkoisen magneettikentän avulla tai aktimaan lääkkeen vapautuminen verihyytymän alueella ultraäänellä. Lisäksi lääke voi-daan myös pyrkiä kohentamaan verihyytymiin hyytymisprosessissa keskeisessä roolis-sa olevien verihiutaleiden pintaproteiineihin spesifisesti sitoutuvien ligandien avulla.
Kehityksessä on myös teranostisia lähestymistapoja, joilla voitaisiin samanaikaisesti hoitaa veritulppa ja monitoroida hoidon tehokkuutta. [30]
Verihyytymien kuvantamiseen on kehitetty muun muassa rautaoksidinanopartik-keleita [18, 19], kultananopartikrautaoksidinanopartik-keleita [13] ja radionuklideja 99mTc ja125I [15]. Useat tutkimukset keskittyvät nimenomaan kohdennettuun verihyytymien tai valtimokovet-tumien kuvantamiseen tai niiden hoitoon, mutta teranostisia sovelluksia ei juurikaan ole. McCarthy ym. ovat kuitenkin kehittäneet myös teranostista sovellusta, jossa he kohdensivat rautaoksidinanopartikkeleita peptidien avulla verihyytymien muodostu-misprosessissa esiintyviin proteiineihin. He osoittivat partikkelien sitoutuvan verihyy-tymiin hiirikokeissa jopa 2,7-kertaisella tehokkuudella verrattuna referenssinäyttei-siin, joissa kohdentavaa peptidiä ei käytetty. Lisäksi partikkelit soveltuivat MRI:hin sekä verihyytymiä liuottavan tPA:n kantajaksi. [18, 19]
Verihyytymien kuvantamiseen ilman terapeuttista ominaisuutta on kehitetty na-nopartikkeleita, jotka soveltuvat kuvantamiseen joko CT:llä tai MRI:llä. Esimerkiksi CT:llä kuvattavia kultananopartikkeleita on kehitetty verihyytymien akuuttiin ku-vantamiseen. Kim ym. tutkivat fibriinikohdennettuja klykoli-kitosaani-pinnoitettuja kultananopartikkeleita, joiden avulla veritulppa voidaan havaita ja sen vakavuus ar-vioida reaaliajassa sekä seurata fibrinolyyttisen hoidon tehokkuutta. [13] Suzuki ym.
kohdensivat superparamagneettisia rautaoksidinanopartikkeleita aktiivisten verihiu-taleiden pinnalla esiintyvään P-selektiiniin sulfidoidulla polysakkaridilla (f ucoidan) ja he osoittivat, että verihyytymiä voidaan kuvata näiden nanopartikkelien avulla MRI:llä. [14] Myös gadoniumpohjaisia MRI:llä kuvattavia kontrastiaineita on tutkit-tu ja myös ne kohdennettiin hyytymissä esiintyvään P-selektiiniin. [34]
Verihyytymien kohdennetun hoidon sovelluksia ovat kehittäneet muun muassa Xu ym. [16] He kehittivät verihiutaleilla pinnoitettuja polymeerisiä nanopartikkelei-ta, jotka oli konjugoitu liuotushoidoissa käytettävällä rtPA:lla (recombinant tissue plasminogen activator) ja he osoittivat, että nanopartikkelit kohdentuivat aktivoitu-neisiin verihiutaleisiin verihyytymän muodostuessa sekä vähensivät verenvuotoriskiä verrattuna vapaaseen rtPA:han. [16] Myös magneettisesti kohdennettuja tPA:lla ja SK:lla ladattuja silika-kuparinanopartikkeleita (SiO2-CuNP) on tutkittu verihyyty-mien kohdennettuun hoitoon. Tadayon ym. onnistuivat kohdentamaan magneettisia SiO2-CuNP-nanopartikkeleita 15 % tehokkaammin vapaaseen tPA-SK verrattuna rottamallissaan sekä saavuttivat 15-25 min nopeamman verihyytymien hajoami-sajan. [17]
4 Nanopartikkelien karakterisointimenetelmät
4.1 Kaasuadsorptio ja -desorptio
Kaasusorptiolla voidaan karakterisoida huokoisten materiaalien pinta-alaa ja huo-koisten kokojakaumaa sekä tilavuutta. Kaasusorptiossa mitataan adsorpoituneen ja desorptoituneen kaasun määrää sen suhteellisen paineen funktiona. Tästä datasta muodostuvaa kuvaajaa kutsutaan adsorptio- tai desorptioisotermiksi. Mesohuokoisil-la nanopartikkeleilMesohuokoisil-la adsorptio-desorptioisotermiin muodostuu hysteresissilmukka eli suljettu silmukka, jossa adsorptio- ja desorptiokäyrät poikkeavat toisistaan, mutta pienin ja suurin arvo on sama molemmilla käyrillä.
Kaasuadsorptiossa kaasumolekyylit, kuten typpi tai argon, adsorpoituvat mata-lassa paineessa olevan näytteen pinnalle. Kun painetta kasvatetaan, kaasumolekyylit muodostavat ensin yhden molekyylikerroksen paksuisen kerroksen näytteen pinnalle Langmuirin teorian mukaisesti. Langmuirin teoria sopii hyvin kemisorptioon, koska sen mukaan adsorptiopinnalla on vain yhdenlaisia perustiloja, joihin vain yksi mole-kyyli voi adsorpoitua. Teoria ei kuitenkaan suoraan sovellu huokoisille materiaaleille, jos myös fysisorptio huomioidaan. Fysisorptiossa painetta kasvatettaessa muodostuu useamman molekyylikerroksen paksuisia kerroksia heikkojen vuorovaikutusten, kuten van der waals -voimien seurauksena. Emmett ja Brunauer päättelivät kokeellisesti, että matalilla paineilla isotermin juuri muuttuessa lineaariseksi adsorpoitunut kerros olisi todennäköisesti yhden molekyylikerroksen paksuinen. Brunauer-Emmett-Teller (BET) -teoriassa Langmuirin teoriaa laajennettiin siten, että edellinen adsorptiokerros voi toimia adsorptiopintana seuraavalle kerroksella aina saturaatiopisteeseen saakka, mikä tarkoittaa äärellistä adsorptiokerrosten määrää ja siten äärellistä adsorptioker-roksen paksuutta. [35] BET-teoriassa oletetaan myös, että adsorboituvat molekyylit ovat pallon muotoisia ja ne järjestyvät pintaan heksagonaalisesti. Adsorpoituneiden kaasumolekyylien määrä nm voidaan ratkaista lineaarisen BET-yhtälön (9) avulla, sovittamalla suora isotermin lineaariseen osaan. Lineaarinen BET-yhtälö on muotoa
p/p0
missä nad adsorboituneen kaasun ainemäärä suhteellisessa paineessap/p0,nm ensim-mäiseen molekyylikerrokseen adsorpoituneen kaasun ainemäärä ja C BET-vakio. [5]
C on likimäärin
C =eq1RT−q2, (10)
missä q1 on ensimmäisen molekyylikerroksen adsorpoima lämpö ja q2 nesteytymises-sä adsorpoitunut lämpö [36]. Sovittamalla suora lähes lineaariseen dataan pienimmän neliösumman menetelmällä, voidaannm jaC ratkaista sovitetun suoran kulmakertoi-men, vakiotermin ja lineaarisen BET-yhtälön (9) avulla. Tällöin pinta-alaAsvoidaan ratkaista yhtälön (11) mukaisesti, missä NAon Avogadron vakio ja akeskimääräinen kaasumolekyylien poikkipinta-ala
As =nmNAa. (11)
Huokosten kokojakauman ja tilavuuden selvittämiseksi voidaan puolestaan käyt-tää BJH-teoriaa. BJH-teoriassa oletetaan, että huokoset ovat sylinterin muotoisia ja
kaasumolekyylit fysisorboituvat huokosten seinämiin tai nesteytyvät kapillaareihin.
[37]
Kun painetta kasvatetaan, kaasu adsorpoituu huokosten seinämille. Painetta yhä kasvatettaessa adsorpoitunut kaasu alkaa kondensoitua seinämille, jolloin neste alkaa täyttämään huokosia. Kondensoituminen riippuu huokosten koosta Kelvinin yhtälön
log P P0
!
= −2γglVm
rkRT (12)
mukaisesti, missä γgl on adsorpoituvan nesteen pintajännitys, Vm nesteen molaarinen tilavuus ja rk on Kelvinin säde eli kondensoituneen nesteen säde. Todellisessa huo-kosten sädettärlaskettaessa on otettava huomioon myös adsorptiokerroksen paksuus t, jolloin huokosten säde voidaan ratkaista yhtälöllä r = rk+t. [37] Säteen määrit-tämisessä tarvittava Kelvinin säde voidaan ratkaista Kelvinin yhtälöstä (12) ja typ-pikaasua käytettäessä adsorptiokerroksen paksuus t voidaan määrittää esimerkiksi Harkins-Jura yhtälöllä
Termogravimetri (TG) eli lämpövaaka lämmittää näytettä ja punnitsee sen massaa lämmityksen aikana eri ajanhetkillä. Termogravimetria (TGA) on termoanalyyttinen menetelmä, jolla tutkitaan, kuinka lämpöenergia vaikuttaa materiaalin koostumuk-seen. TGA:lla voidaan karakterisoida esimerkiksi epäorgaanisen kantajaan ladatun lääkemolekyylin tai sen pinnalle konjugoidun orgaanisen yhdisteen määrä, sillä epä-orgaaniset materiaalit ovat termisesti stabiilimpia kuin lääkemolekyylit tai orgaa-niset yhdisteet. Täten, kun lämmitetään esimerkiksi PEGyloituja PSi-partikkeleita, PEG-molekyylit hajoavat PSi-partikkelien pinnalta lämpötiloissa, joissa PSi:n massa ei merkittävästi muutu. Tällöin massan häviöstä voidaan ratkaista PEG-molekyylien massa, kun verrataan massahäviötä PEGyloimattoman referenssinäytteen kanssa.
4.3 Dynaaminen valonsironta
Dynaamisella valonsironnalla (DLS, dynamic light scattering) voidaan määrittää nanopartikkelien ja pienten mikropartikkelien hydrodynaaminen kokojakauma sus-pensiossa sekä tutkia niiden kolloidista stabiilisuutta. Menetelmä perustuu Brownin liikkeeseen, jonka mukaan mikro- tai nanopartikkelit liikkuvat satunnaisesti suspen-siossa, mutta Brownin liikkeen nopeus on sitä suurempi mitä pienempi partikkeli on. Kun partikkelit liikkuvat suspensiossa ja niihin kohdistetaan monokromaattis-ta laservaloa, sirotmonokromaattis-tavien nanopartikkelien ja detektorin väliset etäisyydet vaihtelevat eri ajanhetkillä. Tällöin nanopartikkeleista sironneet fotonit interferoivat keskenään.
Tällöin siis sironneen valon kokonaisintensiteetti vaihtelee satunnaisesti ajan suhteen.
Koska pienet partikkelit liikkuvat nopeammin kuin suuret partikkelit, on myös ko-konaisintensiteetin vaihtelu nopeampaa pienille nanopartikkeleille kuin suurille nano-partikkeleille. Intensiteetin vaihtelua ja sen riippuvuutta ajasta voidaan tarkastella