Nanopartikkelien pinnan läheisyydessä on diffuusiokerros, jossa on partikkelien pin-tavaraukseen verrattuna vastakkaisesti varautuneita ioneja. Ioneja sitoutuu varauk-sellisen nanopartikkelin pinnalle sähköisen vetovoiman takia, jolloin nanopartikkelin pinnalle muodostuu tiukasti sitoutuneiden ionien kerros, jota kutsutaan Sternin ker-rokseksi. Tiukasti sitoutuneen Sternin kerroksen ulkopuolella sijaitsee jo edellä mai-nittu diffuusiokerros, jossa on sekä positiivisesti että negatiivisesti varautuneita ione-ja, mutta ne ovat sitoutuneet heikommin. Liukupinnaksi (slipping plane) kutsutaan sitä etäisyyttä ytimestä, jonka sisäpuolella ionit liikkuvat partikkelin liikkeen muka-na. Tähän etäisyyteen päättyy myös diffuusiokerros ja sen ulkopuolella ionit liikku-vat vapaasti partikkelien liikkeestä riippumatta. Sähköistä potentiaalia, joka vallitsee liukupinnalla, kutsutaan zeta-potentiaaliksi. [32, 40] Edellä kuvailtuja kerroksia ja zeta-potentiaalia havainnollistetaan kuvassa 2.
Kuva 2: Kuvassa on esitetty negatiivisesti varautuneen partikkelin Sternin kerros, diffuusiokerros ja liukupinta. Liukupinnalla vallitsevaa potentiaalia kutsutaan zeta-potentiaaliksi. Kuva on lähteestä [40].
Zeta-potentiaalin avulla voidaan arvioida nanopartikkelien stabiiliutta suspensios-sa, sillä sen avulla saadaan tietoa onko nanopartikkeleilla taipumusta kiinnittyä toi-siinsa joko aggregoituen tai flokkuloituen. Aggregoitumiseen ja flokkuloitumiseen vai-kuttavat muun muassa nanopartikkelien pinnan ominaisuudet, nesteen pH ja ionivah-vuus. [41] Jotta nanopartikkelit eivät aggregoidu tai flokkuloidu on zeta-potentiaalin poikettava nollasta niin paljon, että sähköinen hylkimisvoima kumoaa molekulaaris-ten voimien, kumolekulaaris-ten van der waals voiman, aiheuttaman vetovoiman. Tällöin nanopar-tikkelit pysyvät toisistaan erillään paremmin ja ovat stabiileja kyseisessä nesteessä.
Toisaalta nanopartikkelit voivat olla kolloidisesti stabiileja, vaikka sähköinen hylki-misvoima ei pitäisikään niitä erillään, koska partikkelit voivat olla stabiileja steerisen stabiloinnin avulla, kuten luvussa 2.2 kerrottiin. Esimerkiksi nanopartikkelien PEG-yloinnin on osoitettu laskevan zeta-potentiaalia, vaikka se parantaa partikkelien kol-loidista stabiiliutta [32].
Laseri-Doppler-elektroforeesi (LDE) on menetelmä, jolla mitataan pientä siron-neen valon taajuussiirtymää, joka on seurausta partikkelien liikkeestä sähkökentässä.
Taajuuden muutos ∆f on muotoa
∆f = 2vsin(θ/2)
λ , (14)
missävon varautuneiden partikkelien nopeus kohti vastakkaisesti varautunutta elekt-rodia, λ laserin aallonpituus jaθ sironneen valonsäteen sirontakulma suhteessa tulo-kulmaan. [42] Sähkökentänvahvuuden E huomioimiseksi voidaan nopeuden sijasta käyttää elektroforeettista liikkuvuutta UE, joka on nopeuden ja sähkökentänvahvuu-den osamäärä. Tällöin UE voidaan ratkaista mitatun vaihesiirtymän avulla. Henryn yhtälön mukaan UE on puolestaan
UE = 2ζF(κa)
3η , (15)
missä on dielektrinen vakio,F(κa) on Henryn funktio,κ on debye etäisyyden kään-teisluku,a on partikkelin säde,η on viskositeetti jaζ on potentiaali. Täten zeta-potentiaali voidaan ratkaista yhtälöiden (14) ja (15) avulla, kun nopeuden sijasta käytetään elektroforeettista liikkuvuutta. [42, 43]
5 Menetelmät
Tutkielman tavoitteena oli valmistaa ja kehittää sellaisia PSi-nanopartikkeleita, jot-ka soveltuisivat suonensisäisen annostelun sovelluksiin. Täten PSi-partikkelien tulisi saavuttaa riittävä kolloidinen stabiilius PBS-liuoksessa ja huokoskoon sekä tilavuuden tulisi olla sopivia mahdollista lääkeaineen lataamista varten. Tässä luvussa kerrotaan, kuinka PSi-nanopartikkelita valmistettiin ja pintakäsiteltiin (tiivistetysti kuvassa 3) sekä kuinka nanopartikkelien ominaisuuksia karakterisoitiin.
5.1 PSi-partikkelien valmistaminen MACE-menetelmällä ja niiden pinnan muokkaaminen
5.1.1 Piimikropartikkelien valmistaminen
Tässä tutkielmassa PSi-partikkeleita valmistettiin piijauheesta MACE-menetelmällä, joten valmistamisen ensimmäinen vaihe oli piikiekkojen murskaaminen ja jauhami-nen piijauheeksi kaikilla muilla piin tyypeillä paitsi ESMC10-tyypillä, joka oli val-mista jauhetta. Piikiekko murskattiin ensin noin 5 mm kokoisiksi paloiksi, jonka jäl-keen piikiekon palasia jauhettiin Fritsch:in pulverisette 7 planetaarisella kuulamyl-lyllä. Piikiekon palat laitettiin zirkonia jauhamiskulhoihin ja niihin lisättiin halkaisijaltaan 1 cm kokoisia zirkonia kuulia. Jauhamiseen käytettiin nopeutta 300 RPM ja jauhaminen kesti yhtäjaksoisesti 15 minuuttia, jonka jälkeen zirkonia kuu-lat poistettiin ja jauhetut partikkelit siivilöitiin ultraäänivärisyttäjää apuna käyttäen 53 µm ja 25 µm siivilöillä. Alle 25 µm partikkelit kerättiin talteen ja suuremmat partikkelit jauhettiin ja siivilöitiin uudelleen, kunnes niiden koko oli alle 25 µm.
Seuraavaksi mikropartikkelit pestiin 20 g erissä siten, että partikkelien sekaan lisättiin 220 ml vettä ja 20 ml H2O2 (37 %) ja niitä sonikoitiin ultraäänialtaassa tunnin ajan sekoittaen niitä lusikalla 15 min välein, jotta partikkelit eivät muodostaisi sedimenttiä keitinlasin pohjalle. Sen jälkeen mikropartikkelit huuhdeltiin vedellä 11 µm suodattimen päällä ja partikkelien annettiin kuivua uunissa 67 ◦C:ssa yön yli.
Suodatuksen seurauksena piipartikkelien koko oli siis 11 - 25µm. Pesun tavoitteena oli poistaa mahdolliset orgaaniset kontaminaatiot piin pinnalta partikkelikokojakauman muokkaamisen lisäksi.
5.1.2 Etikkahapon määrän ja syövytettävän piijauheen massan vaikutus PSi:n ominaisuuksiin MACE-menetelmässä
Sekä etikkahapon määrän vaikutusta että syövytettävän piijauheen massan vaiku-tusta PSi-partikkelien ominaisuuksiin MACE-menetelmässä tutkittiin valmistamal-la PSi-partikkeleita pitäen muita valmistusparametrejä vakioina. Etikkahapon mää-rän testaamisessa käytettiin N+-piijauhetta ja piijauheen massan testaamisessa P+-piijauhetta.
Etikkahapon määrän vaikutusta tutkittiin valmistamalla PSi:tä käyttäen piijau-heen kostuttamiseen 0-40 ml etikkahappoa. Syövytettävän piijaupiijau-heen massan vaiku-tusta tutkittiin puolestaan valmistamalla PSi-partikkeleita käyttäen n. 1 g ja 2 g valmistuseriä pitäen H2O2/Si molaarisuhde vakiona ja kaksinkertaistamalla myös in-jektoitavan metallin määrä. Molemmissa mittauksissa valmistettujen PSi-partikkelien BET-pinta-ala ja BJH-tilavuus määritettiin kaasusorptiolla (TriStar II 3020),
min-kä lisäksi määritettiin PSi-partikkelien tuottoprosentti mittaamalla näytteen massa ennen syövytystä ja sen jälkeen.
5.1.3 Metalliavusteinen kemiallinen syövytys (MACE)
Tutkielmassa käytettävä PSi-mikropartikkelien valmistusmenetelmä mukailee Tama-rovin ym. valmistusmenetelmää [7]. MACE-menetelmässä metallina käytettiin kultaa, koska sen avulla voitiin syövyttää 4-6 nm huokosia, piin saostuksesta riippumatta, se-kä sillä saavutetaan suuret pinta-alat.
Ensin 1,005 g ±0,005 g mikropartikkeleita punnittiin 100 ml polytetrafluorietee-niastiaan. Mikropartikkelien sekaan lisättiin 20 ml etikkahappoa ja niitä sonikoitiin 10 min. Mahdollisesti aggregoituneiden partikkelien liukenemista pyrittiin helpotta-maan sekoittamalla niitä lusikalla muutaman minuutin välein. Seuraavaksi partikke-lien sekaan lisättiin 20 ml HF:a (40 %) ja seosta sekoitettiin magneettisekoittajan avulla, jonka jälkeen lämpötilan annettiin tasautua 10 min ajan, mikäli syövytykses-sä käytettiin lämpö- tai kylähaudetta. Kylmähaudetta käytettiin N++-tyypin piijau-heen syövytyksessä, P++-tyypin piijaupiijau-heen syövytettiin huoneen lämmössä ja N+, N, P+, P, UW, ESMC10 -tyyppien piijauheet syövytettiin 50 ◦C:n lämpöhauteessa.
Lämpötilan tasauduttua aloitettiin metallin (HAuCl4) injektoiminen. 4,167 ml 0,006 M HAuCl4·3 H2O liuosta injisoitiin ruiskun avulla nopeudella 0,278 ml/min eli 15 minuutin ajan, jonka jälkeen liuoksen annettiin sekoittua vielä 5 minuutin ajan, jotta kulta leviäisi tasaisesti piimikropartikkelien pinnalle ja kullan konsentraatio olisi tasainen.
Oksidanttina käytettiin H2O2:a, jota injisoitiin siten, että sen molaarisuhde piihin oli likimain yksi. Kun piin massa oli likimain 1,005 g eli 0,0357 mol ja H2O2:n vah-vuus oli 35 wt% (11,52 M) tarvittiin sitä noin 3,2 ml, joka vastaa 0,0368 mol. Tällöin molaarisuhde oli 1,0. Jotta H2O2:a voitiin injisoida hitaammin syöpymisliuokseen ja välttää syövytysliuoksen lämpeneminen ja reaktion siirtyminen kohti elektrolyyttis-tä kiillottumista, sielektrolyyttis-tä laimennettiin lisäämällä 2,8 ml tislattua vetelektrolyyttis-tä. Tällöin H2O2 -liuoksen tilavuus oli 6 ml, joka injisoitiin nopeudella 66,67µl/min partikkelien (1,005 g) sekaan, mikä tarkoitti likimain 90 min injektioaikaa. Injisoinnin jälkeen reaktion annettiin kulkea loppuun 10 min ajan. Lopuksi partikkelit huudeltiin vedellä 9 µm suodattimen päällä, kun partikkelien koko oli 11-25 µm ja 1-2 µm suodattimen pääl-lä, kun partikkelien koko oli 2-10µm kaupallisten ESMC10-partikkelien tapauksessa.
Tutkimuksessa käytettyjen partikkelien koot on esitetty taulukossa 1 piin eri seostuk-sille. Suodatuksen jälkeen partikkelit kasteltiin nopeasti haihtuvalla pentaanilla, jotta veden kuivuessa sen pintajännitys ei rikkoisi huokosia. Partikkelien annettiin kuivua uunissa 67 ◦C:ssa yön yli.
5.1.4 Terminen oksidoiminen
PSi-mikropartikkeleita oksidoitiin termisesti kuumentamalla niitä 2 tunnin ajan 300
◦C:ssa huoneilmassa. Mikropartikkelit asetettiin lasisessa näytepullossa vaaka-asen-nossa isoon kvartsiputkeen, joka asetettiin putkiuuniin. Lämmityksen jälkeen partik-kelien annettiin jäähtyä huoneenlämmössä ja ne kerättiin talteen. Termisesti oksidoi-duista huokoisista piipartikkeleista käytetään lyhennettä TOPSi.
5.1.5 PSi-nanopartikkelien valmistaminen
TOPSi-mikropartikkeleista valmistettiin nanopartikkeleita sekä sonikoimalla niitä ve-sisuspensioissa että jauhamalla niitä planetaarisella kuulamyllyllä.
Sonikointimenetelmässä 200 mg TOPSi-mikropartikkelita suspendoitiin noin 20-30 ml vettä. 50 ml putkissa olevat suspendoidut TOPSi-partikkelit asetettiin vesihau-teeseen, jonne lisättiin jäitä suspension jäähdyttämiseksi. Hielcher:in UP200S soni-kaattorin sauva asetettiin suspensioon ja sonikointi suoritettiin suurimmalla teholla (200 W) 1 tunnin jaksoissa. Jaksojen välillä suspensiosta poistettiin likimain 50 µl näyte TOPSi-partikkeleita, joiden koko mitattiin ennen seuraavan sonikointijakson aloittamista. Sonikoinnin jälkeen partikkelit erotettiin vedestä sentrifugoimalla ja ne pestiin etanolilla kahdesti. Pesulla tarkoitetaan partikkelien suspendoimista ja sentri-fugointia, jonka jälkeen partikkelit poistetaan nesteestä ja ne suspendoidaan uudelleen (tässä tapauksessa etanoliin). Pesun jälkeen partikkelit varastoitiin etanoliliuoksessa.
Jauhamismenetelmässä TOPSi-mikropartikkeleita jauhettiin Fritsch:in pulveriset-te 7 planetaarisella kuulamyllyllä. Jauhaminen suoripulveriset-tettiin 2 ml lasisissa näypulveriset-teputkis- näyteputkis-sa ja jauhamiseen käytettiin 1 mm kokoisia zirkonia jauhamiskuulia. Likimain 200 mg TOPSi-mikropartikkeleita laitettiin koeputkeen ja täytettiin jauhamiskuulilla, jonka jälkeen partikkelit sekoitettiin kuulien joukkoon pyörivällä liikkeellä. Kuvassa 4 on esitetty asetelma ennen sekoittamista. Lopuksi joukkoon lisättiin etanolia, jonka va-lumista näyteputken pohjalle helpotettiin sonikoimalla niitä ultraäänialtaassa. Näy-teputket asetettiin tiiviisti jauhamisastiaan, jottei niiden korkit pääse avautumaan.
Partikkeleita jauhettiin 5 min jaksoissa, jotta lasiputkiin kertyvä paine voitiin vapaut-taa jaksojen välillä, millä ehkäistiin putkien haitallinen lämpeneminen sekä paineen kasvaminen ja täten ehkäistiin näyteputkien rikkoutuminen sekä näytteen vuotami-nen näyteputkesta. Ensimmäisessä jauhamisperiodissa pyörimisnopeutena käytettiin 500 RPM, jonka jälkeisissä periodeissa käytettiin nopeutta 700 RMP. Partikkeleita jauhettiin noin 1 h ajan tai kunnes partikkeleiden koko oli halutun suuruinen. Jauha-misen jälkeen jauhamiskuulat ja niiden seassa olevat partikkelit kaadettiin keitinlasiin ja lisättiin noin 5 ml etanolia, jonka jälkeen partikkelit eroteltiin kuulista pipetoimal-la. Kuulien huuhtelemiseen käytettiin noin 5 ml etanolia ja ne huuhdeltiin kolmesti, jotta mahdollisimman paljon partikkeleita saatiin kerättyä talteen. PSi-partikkelit varastoitiin etanoliin.
Kuva 4: Kuvassa on P, P+, P++, N+, N++, UW ja ESMC10 -tyyppien huokoisia piimikropartikkeleita sekä zirkoniakuulia asetettuna näyteputkiin jauhamista varten.
5.1.6 Kemiallinen oksidoiminen
nanopartikkelien kemiallinen oksidointi suoritettiin suspendoimalla TOPSi-nanopartikkelit 2 ml vettä ja lisäämällä joukkoon 10 ml NH4OH(28 %)/H2O (1:6, v/v) -liuosta. Nanopartikkeleita sonikoitiin ultraäänialtaassa noin 2 min ajan, jot-ta aggregoituneet nanopartikkelit irtoavat toisisjot-taan. Tämän jälkeen joukkoon lisättiin 2 ml PSi:n pintaa oksidoivaa H2O2:a ja nanopartikkelit siirrettiin keitinle-vylle. Keitinlasissa olevat nanopartikkelit suojattiin foliolla, jotta lämpötila pysyisi mahdollisimman tasaisena reaktion ajan. Keitinlevyn lämpötila asetettiin 90 ◦C:een ja reaktion annettiin jatkua 15 min ajan. Reaktion aikana näytettä sekoitettiin mag-neettisekoittajalla. Reaktion jälkeen liuoksen annettiin jäähtyä ja partikkelit erotet-tiin reagoimatta jääneistä kemikaaleista sentrifugoimalla. Partikkelit peserotet-tiin kolmesti vedellä ja kahdesti etanolilla luvussa 5.1.5 kuvaillulla tavalla sekä varastoitiin lopuksi etanoliin.
TOPSi-partikkelit oksidoitiin kemiallisesti toistamiseen käyttäen HCl(37 %)/H2O (1:6, v/v) -liuosta. Oksidointi tapahtui vastaavasti kuin NH4OH/H2O-liuoksen ta-pauksessa. Kemiallisesti oksidoiduista TOPSi-partikkeleista käytetään lyhennettä TOPSi-OH.
5.1.7 PEGyloiminen
Oksidoinnin jälkeen TOPSi-OH-nanopartikkelit PEGyloitiin käyttäen PEG-silaania (0,5 kDa) ja PEG-silaania (2,0 kDa). Ensin 150 mg PEG-silaania (2,0 kDa) liuo-tettiin 1,5 ml tolueenia sonikoimalla sitä ultraäänialtaassa, jonka jälkeen se pipetoi-tiin keittopulloon. Keittopulloon lisätpipetoi-tiin 15 mg etanolisuspensiossa olevia TOPSi-OH-nanopartikkeleita ja 300 µl PEG-silaania (0,5 kDa), jonka jälkeen ne sekoitet-tiin keskenään sonikoimalla niitä minuutin ajan. Seuraavaksi liuoksesta poistetsekoitet-tiin etanoli lämmittämällä nanopartikkeleita 70 ◦C:lla keitinlevyllä 15 min ajan. Keitto-pulloon laitettiin magneettinen sekoitussauva ja typpikaasuvirtaus ohjattiin lähelle pullon pohjaa nopeuttamaan etanolin haihtumista. 15 min jälkeen typpikaasuvirtaus poistettiin ja keittopulloon lisättiin 2 ml tolueenia, sillä etanolia haihdutettaessa myös tolueenia haihtui pois. Tämän jälkeen keittopullo suljettiin parafilmillä eristäen ja keitinpullon ympärille asetettiin foliota, jotta lämpötila pysyisi tasaisena. Keitinlevyn lämpötila pidettiin edelleen 70◦C:ssa ja TOPSi-OH-nanopartikkelien ja PEG-silaanin annettiin reagoida vähintään 16 tunnin ajan. Reaktion jälkeen tolueenia haihdutet-tiin keittopullosta pois typpikaasun avulla ja samaan aikaan reaktio jatkui vielä 15 min ajan. Seuraavaksi näyte jäähdytettiin, kerättiin ja sentrifugoitiin, jonka jälkeen partikkelit erotettiin reagoimatta jääneistä yhdisteistä. Lopuksi kaksoisPEGyloidut TOPSi-OH-nanopartikkelit (DPEG-PSi) pestiin kolmesti etanolilla luvussa 5.1.5 ker-rotulla tavalla sekä ja varastoitiin etanoliin. Partikkelien keräämisessä vältettiin kei-tinpullon laidalle jääneiden partikkelien keräämistä, sillä PEGylointi niiden osalta ei ole välttämättä onnistunut.
Kuva 3: Kuvassa on esitetty tiivistetysti, kuinka DPEG-PSi-nanopartikkeleita val-mistettiin ja pintakäsiteltiin luvun 5.1 mukaisesti.