DNA2-NUKLEAASI-HELIKAASIN VAIKUTUS MITOKONDRIO-DNA:N TOIMINNASSA JA KORJAUKSESSA
MARKO YLÖNEN
Pro gradu- tutkielma Itä-Suomen yliopisto Ympäristö- ja biotieteiden laitos
Biologia 2019
ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO Ympäristö- ja biotieteiden laitos
YLÖNEN, MARKO: DNA2-nukleaasi-helikaasin vaikutus mitokondrio-DNA:n toiminnassa ja korjauksessa Pro gradu -tutkielma 63 s.
Joulukuu 2019 Mitokondriot ovat tärkeitä soluissa sijaitsevia energiametaboliaan, sekä moniin muihin metaboliareitteihin kuuluvia soluelimiä, joita esiintyy lähes kaikissa tunnetuissa aitotumallisissa soluissa. Jokainen mitokondrio pitää sisällään myös oman rengasmaisen perimäaineksen, mitokondrio-DNA:n (mtDNA), jonka korjaus ja ylläpito vaatii monia erilaisia proteiineja, joista monet ovat kuitenkin vähän tunnettuja. Yksi tällainen proteiini on DNA2-nukleaasi-helikaasi.
Tämän pro gradu -tutkielman tarkoituksena oli selvittää ihmisen DNA2:n merkittävyyttä mtDNA:n ylläpidossa ja täten tuottaa uutta tietoa tämän vähän tutkitun proteiinin toiminnasta ja tarpeellisuudesta. Erityishuomiota tutkimuksessa kiinnitettiin hDNA2:n tarpeellisuuteen mtDNA:n vaurionkorjauksessa, replikaation uudelleenkäynnistymisessä ja replikaatiossa.
Alun perin HEK 293-solujen DNA2 oli tarkoitus yliekspressoida mahdollisten vaikutusten tutkimiseksi. Mahdollinen yliekspressio selvitettiin Western blot-menetelmällä useita eri ekspressiokonstrukteista (pcDNA5/TO DNA2-1xflag, pcDNA5/TO MTS-DNA2- 1xflag ja pcDNA5/TO MTS-DNA2-3xflag), mutta yliekspression tuottaminen soluviljelmissä osoittautui haastavaksi, jolloin yleinen tutkimussuunnitelma vaihdettiin DNA2:n hiljentämiseksi soluissa lyhyiden, häiritsevien RNA-palasten avulla (siRNA). DNA2:n hiljentämisen vaikutus mtDNA:han selvitettiin tutkimalla mahdollisia muutoksia sen kopionumerossa (kvantitatiivinen PCR), topologiassa ja 7S-DNA:n määrässä (Southern blot).
Pelkkä DNA2:n hiljentäminen ei tuottanut muutoksia edellä mainituissa mtDNA:n ominaisuuksissa.
DNA2:n mahdollista merkittävyyttä mtDNA:n ylläpidossa stressi- ja vahingonkorjaustilanteissa selvitettiin vaurioittamalla soluviljelmiä 2’-3’-dideoksysytidiinillä (ddC) tai UV-valolla. Vaurioituksen jälkeen tutkimuskohteina toimivat ddC-vaurioitetuissa soluissa mtDNA:n kopionumero, topologia, sekä muutokset replikaatiossa (2D- elektroforeesi), kun taas UV-vaurioitetuissa soluissa ne olivat mtDNA:n topologia, 7S-DNA:n määrä ja muutokset replikaatiossa. Yhtä poikkeusta lukuun ottamatta, DNA2:n hiljentämisellä ei vaikuttaisi olevan merkitystä mtDNA:n vaurionkorjauksessa. Tämä tulos on kuitenkin arveluttava, koska myöhemmät kokeet paljastivat aiemmin suoritettujen DNA2-hiljennysten toimineen vain vähäisesti tai ei lainkaan. Solujen käsittely ddC:llä aiheutti huomattavan pudotuksen mtDNA:n kopionumerossa, lisäsi sen relaksoituneita topologisia muotoja runsaasti ja aiheutti replikaation pysähtymistä ja RITOLS-välituotteiden määrän kasvua. UV- käsittely aiheutti myös runsasta replikaation pysähtymistä, mutta ei juurikaan vaikuttanut mtDNA topologiaan tai 7S-DNA:n määrään.
Huomioitavaa on kuitenkin yhden ddC-kokeen aikana siRNA-käsittelyn aikaansaama ilmiö mtDNA:n replikaatiossa. DNA2-hiljennetty näyte, jota ei ollut käsitelty ddC:llä, tuotti kasvaneen määrän RITOLS-välituotteita, joita ei ollut havaittavissa kontrollinäytteessä.
Mikäli kyseisen näytteen DNA2:n hiljentäminen oli onnistunut muiden epäonnistumisesta huolimatta, tämä saattaisi viitata siihen, että DNA2:lla olisi yhteinen rooli mtDNA:n RITOLS-välituotteiden muokkauksessa kaksijuosteiseksi DNA:ksi polymeraasi γ:n kanssa, jota ddC-käsittely muissa näytteissä inhiboi. Hiljenemisen epävarmuuden vuoksi kyseiset kokeet on kuitenkin syytä toistaa, jotta havaitun ilmiön todenperäisyydestä voidaan varmistua ja jotta voidaan selvittää DNA2:n mahdolliset muut vaikutukset mtDNA:n ylläpidossa.
UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND
Department of Environmental and Biological Sciences
YLÖNEN, MARKO: The Effect of DNA2 Nuclease-Helicase on Mitochondrial DNA Function and Repair
MSc. Thesis 63 pp.
December 2019 Mitochondria are important cell organelles, that participate in energy metabolism and many other metabolic routes, and they can be found in almost all known eukaryotic cells. Each mitochondrion contains its own genome, called mitochondrial DNA (mtDNA), which is repaired and maintained by multiple different proteins, of which many have been studied very little. One such protein is the nuclease-helicase DNA2.
The aim of this pro gradu -project was to study the significance of human DNA2 in the maintenance of mtDNA and provide new information on the function and necessity of this little-studied protein. Special focus was placed on the importance of hDNA2 for repair, restarting of replication and replication of mtDNA itself.
The original plan was to overexpress DNA2 in HEK 293 cell cultures and to study its possible effects. Possible overexpression was measured using the Western blot -method on multiple expression constructs (pcDNA5/TO DNA2-1xflag, pcDNA5/TO MTS-DNA2-1xflag ja pcDNA5/TO MTS-DNA2-3xflag), but the overexpression proved challenging, so the overall aim of the study was changed to silencing the expression of DNA2 using small, interfering RNA (siRNA). The effects of DNA2 knockdown on mtDNA were studied by measuring changes in its the copy number (quantitative PCR), topology and the amount of 7S-DNA (Southern blot). It was discovered that the knockdown of DNA2 had little to no effect on the aforementioned features.
To study the possible effects DNA2 has in repair and stress conditions, cultured cells were damaged using either 2’-3’- dideoxycytidine (ddC) or UV light. After damaging the cells, the studied features of mtDNA were copy number, topology and changes in replication (2D electrophoresis) in the ddC-damaged cells, and topology, amount of 7S-DNA and changes in replication in UV-damaged cells. With one exception, knockdown of DNA2 by siRNA seemed to have no effect on the repair and maintenance of mtDNA. However, this result is somewhat inconclusive, considering later studies revealed that the knockdown of the cell lines which were used for previous experiments was found to be either lacking or non- existent. The ddC-treatment caused major reduction in the copy number of mtDNA, it increased the amount of relaxed topological forms, and also caused replication stalling as well as increase in RITOLS replication intermediates. UV-treatment also caused large amount of replication stalling but did not affect the topology of mtDNA or the amount of 7S-DNA.
However, it is worth noting that siRNA-treatment did cause a change in mtDNA replication in one of the samples during ddC-experiments. In this sample that had not been treated with ddC, the DNA2 knockdown caused an increase in the amount of RITOLS during replication. If the knockdown of that sample had succeeded, it could indicate that DNA2 has some role alongside polymerase γ in the process that turns RITOLS into double stranded DNA, which was inhibited by ddC in other treated samples. However, due to the uncertainty of the knockdown, these experiments need to be repeated in order to find out the validity of this finding as well as any other roles DNA2 might have in the maintenance of mtDNA.
SISÄLLYSLUETTELO
LYHTENTEET………...2
1 JOHDANTO………....3
2 MITOKONDRIOT………..4
2.1 Mitokondrio-DNA………..6
2.2 Mitokondrio-DNA:n replikaatio……….9
2.3 Mitokondrio-DNA:n korjaus……….11
2.3.1 DNA nukleaasi-helikaasi 2………...14
3 TUTKIMUSTAVOITTEET……...………....16
4 AINEISTO JA MENETELMÄT...17
4.1 Soluviljely...17
4.1.1 HEK 293-solujen väliaikainen transfektio DNA2:n yliekspressoimiseksi...17
4.1.2 293TREx-solujen transfektio...18
4.2 DNA2:n hiljennys siRNA-transfektiolla...18
4.3 Proteiinien eristys...19
4.3.1 Western blot...20
4.4 DNA-analyysit...21
4.4.1 Totaali-DNA:n eristys...21
4.4.2 Southern blot……….22
4.4.3 Topologia………..23
4.4.4 7S-DNA………....24
4.4.5 2D-geeli elektroforeesi……….24
4.5 RNA:n eristys...25
4.5.1 Northern blot………26
4.5.2 Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi...26
4.6 Mitokondrio-DNA:n kopionumeroanalyysi...28
4.7 Mitokondrio-DNA:n vaurioittaminen...29
4.7.1 ddC-käsittely...30
4.7.2 UV-valo...30
5 TULOKSET...31
5.1 DNA2:n väliaikainen yliekspressio...31
5.2 293TREx-solujen DNA2-ekspressio...33
5.3 DNA2:n hiljentäminen siRNA-transfektiolla...34
5.4 DNA2-hiljennettyjen solujen ddC-käsittely...39
5.4.1 mtDNA:n kopionumero-määrät...39
5.4.2 Topologia...41
5.4.3 2D-elektroforeesi...43
5.5 DNA2-hiljennettyjen solujen UV-käsittely...47
5.5.1 Topologia...47
5.5.2 7S-DNA...49
5.5.3 2D-elektroforeesi...51
5.6 DNA2:n hiljenemisen tarkistus...52
6 TULOSTEN TARKASTELU...54
7 JOHTOPÄÄTÖKSET...56
KIITOKSET...58
LÄHDELUETTELO...58
2 LYHENTEET
7S-DNA D-loop rakenteeseen hybridisoitunut yksijuosteinen DNA ADP Adenosiinidifosfaatti
APE1 Apuriininen/-pyrimidiininen endonukleaasi, korjaa virheellisiä nukleotidejä BER:in aikana
ATP Adenosiinitrifosfaatti
BER Base excision repair, vahingoittuneiden nukleotidien poisto DNA:sta COSCOFA Okazaki-fragmentteja hyödyntävä mtDNA:n replikaatiomekanismi
CSB mtDNA:n ei-koodaavalla alueella sijaitsevia konservoituneita sekvenssiblokkeja ddC 2’-3’-Dideoksysytidiini, kaupalliselta nimeltään Zalcitabine. Nukleosidianalogi,
joka estää käänteiskopioijaentsyymien toimintaa
D-loop mtDNA:n ei koodaava alue, johon 7S-DNA on liittyneenä DNA2 DNA nukleaasi-helikaasi 2
DSBR Double strand break repair, DNA:n kaksoisjuosteen korjaus
EtBr Etidiumbromidi, käytetään nukleiinihappojen värjäyksessä reagenssina FADH2 Flaviini-adeniinidinukleotidi
FEN1 Flap-endonukleaasi 1, poistaa ylimääräisä flap-rakenteita DNA:n korjauksen aikana ja käsittelee 5’-päät Okazaki-fragmenteissa
FBS Fetal bovine serum, naudan sikiöstä eristettyä seerumia
HEK 293 Ihmisen sikiön haimasta eristettyjä, helposti kasvatettavia soluja
HRR Homologous recombination repair, vaurioituneen DNA:n kaksoisjuosteen korjausmenetelmä
HSP Raskaan juosteen promoottorialue
LIG3 DNA ligaasi 3, entsyymi, joka korvaa poistetut nukleotidit uusilla DNA:n korjauksen aikana
LSP Kevyen juosteen promoottorialue mtDNA Mitokondrio-DNA
MMR Mismatch repair, väärien nukleotidiparien korjaus replikaation jälkeen mTERF Mitochondrial transcription termination factor, mitokondrion ribosomaalisen
RNA:n säätelijä
NADH Nikotiiniamidi-adeniinidinukleotidi
NCR mtDNA:n säätelyalueet sisältävä ei-koodaava alue
NEIL1 Endonukleaasi VIII-tyylinen proteiini 1, DNA-glykosylaasi, joka osallistuu BER:iin
3
NHEJ Non-homologous end-joining, vaurioituneen DNA:n kaksoisjuosteen korjausmenetelmä
NTH1 Endonukleaasi III-tyylinen proteiini 1, entsyymi, joka osallistuu BER:iin OGG1 8-Oksoguaniiniglykosylaasi, entsyymi, joka osallistuu BER:iin
OriH Raskaan juosteen replikaation aloituskohta OriL Kevyen juosteen replikaation aloituskohta Ori-Z RITOLS-replikaation aloituskohta
POLRMT Mitokondrion RNA-polymeraasi
RITOLS mtDNA:n replikaatiomekanismi, jonka aikana DNA suojataan RNA-palasilla ROS Reactive oxygen species, happiradikaali, joka sisältää parittoman elektronin siRNA Small interfering RNA, yksijuosteinen RNA, joka kykenee hiljentämään
komplementaarisen geenin
TAS Termination associated sequence, replikaation pysäyttämiseen liittyvä sekvenssi TFAM Mitokondrion transkriptiotekijä, jolla on monia tehtäviä
TFB1M Dimetyyliadenosiinitransferaasi 1, mitokondrion transkriptiotekijä TFB2M Dimetyyliadenosiinitransferaasi 2, mitokondrion transkriptiotekijä
tRNA Siirtäjä-RNA, pieni RNA-molekyyli, joka siirtää aminohapon proteiinin osaksi
1 JOHDANTO
Mitokondriot ovat lähes kaikissa tunnetuissa aitotumallisissa soluissa havaittavia soluelimiä, joilla on tärkeä merkitys aitotumallisten organismien energiametaboliassa, koska ne toimivat tapahtumapaikkana sekä sitruunahappokierrolle, että oksidatiiviselle fosforylaatiolla.
Mitokondriot osallistuvat myös muihin tärkeisiin tehtäviin soluissa, kuten erilaisten aminohappojen ja hormonien synteesiin (Lehninger ym. 2017). Samoin kuin solujen tumat, myös jokainen mitokondrio sisältää sen oman genomin, mitokondrio-DNA:n (mtDNA), jonka sisältämä geneettinen koodi koodaa elektroninsiirtoketjun kannalta tärkeitä proteiineja.
Valtaosa mitokondrioiden toimintaan liittyvistä proteiineista koodataan tumassa, josta ne myöhemmin siirretään mitokondrioihin (Gray ym. 1999). Näihin proteiineihin kuuluvat myös mtDNA:n ylläpidosta ja korjauksesta vastaavat proteiinit. Tällä hetkellä nämä mtDNA:n ylläpidosta vastaavat proteiinit ovat kuitenkin hyvin vähän tutkittuja ja niiden tarkat toimintaperiaatteet mitokondrioissa ovat yhä mysteeri. Yksi tällainen proteiini on ihmisen
4
DNA nukleaasi-helikaasi 2, hDNA2. DNA2 havaittiin ensimmäisen kerran leivinhiivassa (Saccharomyces cerevisiae) 1980-luvulla, ja ihmisen vastaavan geenin homologi vuonna (Dumas ym. 1982, Eki ym. 1996). Hiivan DNA2:n on havaittu toimivan yhdessä FEN1:n ja monen muun samankaltaisen proteiinin kanssa DNA:n replikaatioon ja vahingonkorjaukseen, sekä mitokondrioiden ja telomeerien ylläpitoon (Markiewicz-Potoczny ym. 2018). Ihmisen DNA2:n toimintaperiaatteita mitokondrioiden ylläpidossa ja mtDNA:n korjauksessa ei tunneta hyvin, mutta sen lokalisoituminen mitokondrioissa polymeraasi γ:n ja TWINKLE:n kanssa viittaisi samanlaiseen rooliin kuin hiivasoluissa (Zheng ym. 2008, Duxin ym. 2009).
Ihmisen DNA2:lla vaikuttaisi kuitenkin olevan tärkeä rooli ihmisen terveyden kannalta, koska mutaatiot sitä koodaavassa geenissä, tai sen yliekspression on havaittu aiheuttavan muun muassa mtDNA:n mutaatioita ja sen määrän vähenemistä, mtDNA:n replikaatio- ja korjaushäiriöitä, sekä lisääntynyttä syöpäriskiä esimerkiksi haiman soluissa (Ronchi ym.
2013, Kumar ym. 2017). Uusia tietoja hDNA2:n tarkasta toiminnasta voisi mahdollisesti hyödyntää tulevaisuuden syöpähoidoissa.
Tämän pro gradu -tutkielman tarkoitus on selvittää ihmisen DNA2:n yliekspression tai hiljentämisen mahdollisia vaikutuksia mitokondrioiden DNA:n ylläpitoon, korjaukseen ja replikaatioon, sekä mahdollisia vaurio- ja stressitilanteiden aikaisia lisävaikutuksia.
2 MITOKONDRIOT
Mitokondriot ovat yksiä tärkeimmistä eukaryoottisolujen sytosolissa sijaitsevista soluorganelleista, koska ne toimivat tapahtumapaikkana soluhengitykselle, jonka aikana mitokondriot tuottavat energiarikasta ATP:ta erinäisistä polttoaineina toimivista yhdisteistä, kuten rasvoista ja sokereista. Sytologit havaitsivat mitokondrioiden olemassaolon ensimmäisen kerran 1840-luvulla, mutta niiden yhteys soluhengitykseen paljastui vasta vuonna 1939, kun tutkijat Eugene Kennedy ja Albert Lehninger todistivat mitokondrioiden toimivan oksidatiivisen fosforylaation tapahtumapaikkana (Nadege ym. 2009).
Mitokondrioiden määrä vaihtelee solujen välillä, runsaasti energiaa kuluttavissa soluissa;
sydän- ja luustolihaksissa, niitä on runsaasti, kun taas täysikasvuisissa punasoluissa niitä ei ole lainkaan. Se missä kudostyypissä mitokondrio sijaitsee ei kuitenkaan vaikuta sen toimintatehokkuuteen (Park ym. 2014). Mitokondriot ovat noin 1-10 mikrometriä pitkiä, ja
5
koostuvat sileästä ulkokalvosta ja poimuttuneesta sisäkalvosta, jotka kumpikin rakentuvat kaksinkertaisesta fosfolipidi-kalvosta. Näiden kalvojen väliin ja sisäpuolelle jäävät tilat voidaan vielä luokitella kolmeen eri luokkaan niiden toimintojen perusteella: Sisä- ja ulkokalvon välinen tila, sisäkalvon poimut (kristat) ja sisäkalvon sisäpuoli (matriisi) (Campbell ym. 2015: 184).
Tällä hetkellä vallitseva teoria mitokondrioiden alkuperästä on niin sanottu endosymbioositeoria. Tämän teorian mukaan mitokondriot olisivat alun perin olleet alfa- proteobakteereja, jotka fagosytoosin seurauksena päätyivät muinaisten protoeukaryoottien sisälle tuhoutumatta, täten muodostaen symbioottisen suhteen kyseisen protoeukaryootin kanssa (Sagan, 1967, Schwartz & Dayhoff, 1978). Toisen endosymbioositeorian mukaan muinaiset alfa-proteobakteerit olisivat muodostaneet metabolisen symbioosin metaania tuottavien arkeonien kanssa (Martin & Müller, 1998). Aikojen saatossa nämä prokaryootit olisivat yhdistyneet, täten muodostaen muinaisen eukaryoottisen solun. Kumpikin näistä teoreettisista tapahtumista olisi tapahtunut noin 1-3 miljardia vuotta sitten. Näistä teorioista ensimmäinen on yleisimmin hyväksytty tutkijoiden keskuudessa (Archibald, 2015).
Mitokondrioiden päätehtävä on toimia solujen energiantuotantolaitoksina. Tämä tapahtuu monivaiheisen tapahtumaketjun seurauksena, jota kutsutaan oksidatiiviseksi fosforylaatioksi. Tämän tapahtumaketjun aikana mitokondrion sisäkalvolla tapahtuva elektroninsiirtoketju siirtää useiden entsyymien, proteiinikompleksien ja hapetus- pelkistysreaktioiden tuottamia elektroneja happimolekyyleille, ja tästä reaktiosta vapautunut energia käytetään muuttamaan matalaenergisempi ADP runsasenergiseksi ATP:ksi.
Mitokondrion matriisissa tapahtuva trikarboksyylihappokierto (sitruunahappokierto) tuottaa entsymaattisesti NADH:ta ja FADH2:ta, jotka toimivat elektronien siirtäjinä elektroninsiirtoketjun soluhengitysproteiinikomplekseille I-IV. Nämä kompleksit voivat myös vastaanottaa elektroneja käsitellyistä ravintoaineista, kuten rasva- ja aminohappojen hapetuksesta. Näiden proteiinikompleksien toiminnasta vapautuva energia käytetään luomaan protonigradientti mitokondrion kalvojen välitilaan, ja tämä gradientin energia puolestaan käytetään ATP-molekyylien muodostamiseen. Tämä tapahtuu proteiinikompleksissa V (Lehninger ym. 2017:729-734).
Energiantuotannon lisäksi mitokondriot ovat vastuussa monista muista solun homeostaasiaan ja metaboliaan liittyvien yhdisteiden tuotannosta. Ne osallistuvat muun muassa aminohappojen, lipidien ja kolesterolin synteesiin (Nadege ym. 2009), toimivat
6
lämmöntuottajina ruskeassa rasvakudoksessa (Campbell ym. 2015:252), sekä ylläpitävät kalsium (Paupe & Prudent, 2017) ja rauta-rikki homeostaasia (Alfadhel ym. 2017). Tämän lisäksi mitokondriot ylläpitävät solujen hapetus-pelkistys-tasapainoa (Chinnery & Schon 2003). Mitokondrioilla on myös tärkeä osa ohjattuun solukuolemaan, eli apoptoosiin johtavassa tapahtumaketjussa. Mitokondrion sisäkalvolla sijaitseva hemiproteiini sytokromi c osallistuu normaaleissa olosuhteissa soluhengitykseen, mutta siirtyessään solulimaan se käynnistää solun apoptoosin (Newmeyer ym. 2003).
2.1 Mitokondrio-DNA
Mitokondriot, ja täten myös mitokondriossa sijaitseva DNA, periytyy munasolun kautta maternaalisesti jälkeläisille (Chinnery ym. 2003). Valtaosa eukaryoottisolun perimäaineksesta sijaitsee sen tumassa, mutta pieni osa sitä sijaitsee solun mitokondrioiden sisällä. Historian saatossa mitokondriot ovat menettäneet valtaosan perimäaineksestaan tumalle, jossa koodataan yli 98 % mitokondrioiden toimintaan liittyvistä proteiineista ja vain 13 proteiinia koodataan mitokondrioissa (Gray ym. 1999). Sen yleisimmin tavattu muoto on kaksijuosteinen, ympyrämäinen genomi, joka voi olla avoin tai superkiertynyt (Kuva 1).
Näiden lisäksi mtDNA:n topologiassa on havaittu esimerkiksi seuraavia muotoja: kahden mtDNA-molekyylin muodostama dimeeri, kahden tai useamman yhteen liittyneen mtDNA- renkaan muodostama katenaani, sekä lineaarisena DNA-molekyylinä (Kolesar ym. 2013, Pohjoismäki ym. 2009) (Kuva 2). Kaikista monimutkaisimpia mtDNA:n muotoja on havaittu ihmisen sydänlihaskudoksessa, jossa suuret määrät mtDNA-molekyylejä voivat muodostaa laajoja verkostoja (Pohjoismäki ym. 2010). Ihmisen mtDNA on kooltaan noin 17 kb ja se rakentuu 16 569 emäsparista, jotka yhdessä koodaavat 37 erilaista geeniä, joita tarvitaan solun energiantuotannossa. Näistä geeneistä 13 koodaavat proteiineja, joita tarvitaan joko elektroninsiirtoketjussa tai oksidatiivisen fosforylaation aikana. Lopuista 24:stä geenistä 22 koodaavat siirtäjä-RNA:ta ja kaksi ribosomaalista RNA, joita tarvitaan 13:sta erilaisen mitokondriaalisen polypeptidin synteesissä. Yhdessä solussa saattaa olla tuhansia kopioita mtDNA:ta jakautuneina satoihin mitokondrioihin, riippuen solun koosta ja energiantarpeesta (Young ym. 2016).
Mitokondrion genomi on erittäin kompakti. Se ei sisällä lainkaan introneja ja vain hyvin vähän ei-koodaavaa DNA:ta. Siinä sijaitsevat geenit on eritelty toisistaan yhdestä muutamaan
7
tRNA-geenillä tai pienellä määrällä ei-koodaavaa DNA:ta (Uhler ym. 2015) (Kuva 1).
Mitokondrion genomin kaksi juostetta voidaan luokitella kevyeksi ja raskaaksi juosteeksi ja valtaosa genomin koodattavista geeneistä sijaitsee raskaalla juosteella. Tästä huolimatta mtDNA:n geenien transkriptio voi tapahtua sekä kevyellä että raskaalla juosteella (Aloni &
Attardi. 1971). Noin yhden kb:n (kilobase) mittaisella ei-koodaavalla alueella (non-coding region, NCR) sijaitsevat promoottorialueet molemmille juosteille (LSP ja HSP), raskaan juosteen replikaation aloituspaikka (OriH), kolme konservoitunutta sekvenssiblokkia (conserved sequence blocks, CSB 1-3) joiden uskotaan vaikuttavan replikaation säätelyyn, sekä replikaation pysäyttämiseen liittyvä sekvenssi TAS (termination-associated sequence) (Jemt ym. 2015) (Kuva 3). Kevyen juosteen replikaation aloituspaikka sijaitsee tämän ei- koodaavan alueen ulkopuolella (Holt & Reyes, 2012). Lisäksi joissakin mtDNA- molekyyleissä on havaittavissa noin 650:n emäsparin mittainen yksijuosteinen DNA- molekyyli (7S-DNA), joka on hybridisoitunut raskaaseen juosteeseen, täten muodostaen kolmijuosteisen rakenteen ei-koodaavalle alueelle (Kuva 3). Tästä kolmijuosteisesta rakenteesta käytetään nimitystä D-loop (displacement-loop), ja sen on arveltu syntyneen ennenaikaisesti pysäytetystä raskaan juosteen replikaatiosta (Nicholls & Minczuk, 2014).
Tämän kolmoisjuosteisen rakenteen merkitys on yhä epäselvä, mutta sen on arveltu auttavan DNA:n vauriota korjaavien proteiinien pääsyä vaurioituneille alueille (Blasiak ym. 2013) tai osallistuvan mtDNA:n replikaation säätelyyn (Holt ym. 2007).
8
Kuva 1: Ihmisen mtDNA. Kuvassa on havaittavissa noin 1000 emäsparin suuruinen ei- koodaava alue, joka sisältää noin 600 emäsparin suuruisen D loop -rakenteen. Tällä ei- koodaavalla alueella sijaitsevat promoottorialueet raskaalle ja kevyelle juosteelle (HSP ja LSP), sekä raskaan juosteen replikaation aloitusalue (OH). Kevyen juosteen aloitusalue (OL) sijaitsee tämän alueen ulkopuolella. Kuvattuna on lisäksi sitoutumisalue mitokondriaalisen transkription pysäyttäjälle (TER). Kuvassa on myös nähtävissä mtDNA:n RNA- ja polypeptidituotteiden koodausalueet (Nadege ym. 2009).
9
Kuva 2: Ihmisen mitokondrio-DNA:n erilaiset topologiset muodot ja niiden sijainnit ajetussa Southern blot -geelissä. Tunnetut topologiset muodot ovat rengasmaiset dimeerit, superkiertyneet katenaanit ja dimeerit, monomeeriset suorat juosteet, erilaiset replikaation välituotteet, katenaanit, monomeeriset avoimet renkaat ja superkiertyneet monomeerit juosteet. Sininen ja punainen väri kuvaavat yksittäisiä molekyylejä, ja dimeerien kohdalla myös keskimääräistä mtDNA:n genomin pituutta (Goffart ym. 2019).
Kuva 3: Lähikuva mitokondrio-DNA:n ei-koodaavasta alueesta (NCR). Alueella on havaittavissa raskaan ja kevyen juosteen promoottorialueet (HSP, LSP), raskaan ketjun replikaation aloituskohta (OriH), konservoituneita sekvenssiblokkeja (CSB 1-3), sekä replikaation päättämiseen liittyvä sekvenssi (TAS). Lisäksi kuvassa on havaittavissa esimerkki raskaaseen juosteeseen liittyneestä yksijuosteisesta 7S-DNA:sta, joka muodostaa kolmijuosteisen D-loop rakenteen (Uhler ym. 2015).
2.2 Mitokondrio-DNA:n replikaatio
Koska mtDNA on eristäytynyt mitokondrioiden sisälle, se tarvitsee toimiakseen oman replikaatio-, transkriptio- ja translaatiokoneistonsa. Tämä mahdollistaa mtDNA:n jatkuvan
10
kierrätyksen ja uudelleenkopioinnin jopa jakautumattomissa kudoksissa kuten aivossa, koska mtDNA:n replikaatio ei ole kytkeytynyt solusykliin, toisin kuin tumassa sijaitseva DNA (Chinnery ym. 2003). Omasta replikaatiokoneistostaan huolimatta, kaikki mitokondrioiden replikaatiossaan käyttämät proteiinit koodataan tuman DNA:sta (Ruhanen ym. 2011). Tällä hetkellä tunnetuimpia mtDNA:n replikaatioon osallistuvia tekijöitä ovat DNA-helikaasi Twinkle, joka kykenee avaamaan kaksijuosteista DNA-molekyyliä 5'-3' -suunnassa, DNA polymeraasi γ, joka on ainoa mtDNA:n polymeraasi ja täten osallistuu sen replikaatioon, korjaukseen ja oikolukuun, sekä yksijuosteiseen DNA:han sitoutuva ja sen stabiloiva mtSSB (mitochondrial single-stranded DNA-binding protein) (Kuva 4) (Stumpf ym. 2011, Uhler ym.
2015). Näiden lisäksi transkriptioon ja replikaatioon osallistuvat RNA-polymeraasi POLRMT, mitokondrion transkriptiotekijät TFAM, TFB1M ja TFB2M, sekä transkription pituutta säätelevä mTERF (mitochondrial termination factor) (Falkenberg ym. 2007).
Aikaisemmin luultiin, että mitokondrioiden DNA monistuisi syntetisoimalla komplementaarista juostetta eri aikaan kummallekin juosteelle, toisin kuin tumassa.
Myöhemmät tutkimukset ovat kuitenkin osoittaneet, että mtDNA:n replikaatiolle on olemassa useita erilaisia malleja, joista tunnetuimmat kaksi ovat yhtäaikaisen DNA-synteesin malli sekä eriaikaisen DNA-synteesin malli (Pohjoismäki & Goffart, 2011). Näistä ensimmäinen tunnetaan myös nimellä COSCOFA (conventional, strand coupled, Okazaki fragment associating). COSCOFA-mallissa mtDNA:n replikaatio alkaa laajalta alueelta nimeltä Ori-Z, joka sijaitsee ei-koodaavasta alueesta (NCR) alavirtaan. Tämä replikaatiomalli muistuttaa eniten tuman DNA:n replikaatiota. Replikaatio etenee molempiin suuntiin, jonka aikana toista juostetta rakennetaan Okazaki-fragmenttien avulla. Kun toinen kahdesta replikaatiohaarukasta saavuttaa ei-koodaavan alueen, replikaatio muuttuu yksisuuntaiseksi, kunnes kumpikin replikaatiohaarukka kohtaa toisensa NCR-alueella ja muodostaa uuden ristikkäisen rakenteen (Holt ym. 2012). Toisessa mallissa (juostesiirtymä, strand displacement) mtDNA:n replikaatio alkaa sille tyypillisestä kohdasta (OriH), edeten siitä noin kaksi kolmasosaa mtDNA:n pituudesta ennen kuin toisen juosteen synteesi alkaa sille tyypillisestä kohdasta (OriL). Tätä teoriaa tukee myös tieto, että raskaan ja kevyen juosteen replikaation aloituskohdat sijaitsevat noin 11 kb:n päässä erillään toisistaan vastakkaisilla juosteilla (Uhler ym. 2015). Tämän replikaatiomallin raskaan juosteen synteesi pysähtyy usein 700 bp:n jälkeen, muodostaen 7S- DNA:ta, joka puolestaan saa aikaan kolmijuosteisen D-loop rakenteen (Falkenberg ym. 2007).
11
Kuva 4: Mitokondrio-DNA:n replikaatiohaarukka. Kuvassa on havaittavissa TWINKLE- helikaasi, joka avaa kaksijuosteista DNA:ta, replikaatiota ja oikolukua suorittava DNA polymeraasi γ, joka koostuu yhdestä A ja kahdesta B alayksiköstä (POLγA ja POLγB), sekä RNA aluketta syntetisoiva RNA polymeraasi POLRMT. Näiden lisäksi kuvassa on useita yksijuosteista DNA:ta stabilisoivia mtSSB proteiineja (Uhler ym. 2015).
Edellä mainittujen replikaatiomallien lisäksi on jälkimmäisestä mallista olemassa vaihtoehtoinen, mutta ei kokonaan erilainen malli. Tästä vaihtoehtoisesta mallista käytetään termiä RITOLS (RNA introduced throughout the lagging strand). Tässä mallissa johtava juoste rakentuu kokonaan DNA:sta, mutta laahaavaan juosteeseen lisätään sen suojaamiseksi mtSSB proteiinien sijasta RNA:n palasia, jotka vasta jonkin ajan kuluttua korvataan DNA:lla (Uhler ym. 2015). Tämän mallin ehdotti ensimmäisenä tutkija Ian Holt vuonna 2006.
Nykytiedon pohjalta tutkijat pitävät sekä RITOLS- että COSCOFA-malleja todennäköisimpinä toimintamalleina mitokondrio-DNA:n replikaatiossa. Kummankin replikaatiomallin välituotteita on havaittu useissa eri nisäkäskudoksissa vaihtelevissa määrin.
RITOLS välituotteita on havaittu esimerkiksi jyrsijöiden ja kanojen maksasoluissa, sekä ihmisen viljellyissä soluissa, kun taas COSCOFA-mallin välituotteita on havaittu esimerkiksi luusto- ja sydänlihaskudoksissa (Ruhanen ym. 2011, Pohjoismäki ym. 2009, Herbers ym.
2019).
2.3 Mitokondrio-DNA:n korjaus
Aivan kuten replikaatiossa, mitokondriot tarvitsevat useita tuman DNA:n koodaamia proteiineja myös oman perimäaineksensa korjauksen aikana. Näiden mtDNA:n korjaukseen liittyvien proteiinien puuttuminen tai virheellinen toiminta voi johtaa vakaviin mitokondrioiden tai mtDNA:n vaurioiden aiheuttamiin sairauksiin. Esimerkkejä
12
mitokondrioiden vaurioiden aiheuttamista oireista ovat lihasten koordinaatio kyvyn heikkeneminen/menetys (ataksia), tahattomat lihaskouristukset (dystonia), verisolujen vähenemistä (pansytopenia), sekä vauvoilla luuytimen ja haiman toiminnallisia häiriöitä (Pearsonin syndrooma) (Taylor ym. 2005). Mitokondrioiden DNA-vaurioilla on myös havaittu olevan yhteys Parkinsonin, Huntingtonin ja Alzheimerin tautien puhkeamisessa (Caston ym. 2017). Yleisimmät syyt mtDNA:n vaurioihin ovat reaktiiviset happiradikaalit (reactive oxygen species, ROS) ja virheet mtDNA:n replikaation ja korjauksen aikana, jotka yleistyvät eliön ikääntyessä (Gredilla ym. 2010). Mitokondriot ja niiden DNA ovat soluhengitykseen osallistumisensa takia hyvin läheisessä kontaktissa oksidatiivisessa fosforylaatiossa syntyvien happiradikaalien, kuten superoksidianioniradikaalien (O2-), vetyperoksidin (H2O2), sekä hyvin hapettavien hydroksyyliradikaalien (OH) kanssa (Cadet ym. 2017). Nämä soluhengitysreaktioiden aikana syntyneet ja soluhengityssignaloinnissa käytetyt happiradikaalit voivat myös vaurioittaa soluhengityskoneistoa, mikä puolestaan voi johtaa ylimääräisten happiradikaalien syntyyn, täten aiheuttaen vahingollisen ketjureaktion mitokondrioiden sisällä (Caston ym. 2017). Vahinkoriskiä kasvattaa myös mtDNA:n läheinen assosiaatio mitokondrion sisäkalvon kanssa (Zinovkina, 2018).
Koska mitokondriot lainaavat valtaosan myös tuman DNA:n korjauksessa käytettävistä proteiineista, niiden vahingonkorjausmenetelmät ovat myös hyvin samankaltaisia (Kazak ym.
2012) (Kuva 5). Tärkeimmät mtDNA:n korjausmenetelmät ovat suora korjaus, vahingoittuneiden nukleotidien poisto lyhyeltä tai pidemmältä matkalta (base excision repair, BER), sekä vahingoittuneet kaksoisjuosteen korjaus (double strand break repair, DSBR) (Kazak ym. 2012, Sykora ym. 2012). Näiden lisäksi mitokondrioissa on osittain dokumentoituina havaittu myös väärien nukleotidiparien korjaus replikaation jälkeen (mismatch repair, MMR) (Mason ym. 2003), kaksoiskierteen poistoon liittyvät ei- homologisten kierteen päiden liitokset (non-homologous end joining, NHEJ) (Lakshmipathy
& Campbell, 1999) ja homologinen rekombinaatiokorjaus (homologous recombination repair, HRR) (Sage ym. 2010), sekä osittaista vahingonsietoa mtDNA:n replikaation aikana ohittamalla kaksoiskierteen vahingoittuneet kohdat (translesion repair), mutta tälle ominaisuudelle on vasta vähän näyttöä (Liu & Demple, 2010). Näistä suoraa DNA:n korjausta dealkylaation ja fotoreversaalin avulla käytetään vain harvoin, koska se on hyvin energiatehoton tapa korjata mtDNA:n vaurioita (Blasiak ym. 2013). Koska oksidatiiviset vahingot ovat yksi yleisimmistä mtDNA:n vaurioittajista, on vahingoittuneiden nukleotidien poisto yleisimmin käytetty korjausmetodi mitokondrioissa. BER käynnistyy, kun spesifinen
13
DNA glykosylaasi, kuten OGG1, NEIL1 tai NTH1 (Hu ym. 2005), tunnistaa vaurioituneen tai väärän nukleotidin juosteessa ja katkaisee tämän N-glykosidisen liitoksen, poistaen kyseisen puriinin tai pyrimidiinin ja luoden AP-alueen (abasic site, AP site). Tämän jälkeen kyseisen AP-alueen prosessoi AP endonukleaasi, kuten APE1, jolloin avoimen juosteen 3’-päähän muodostuu OH-alue ja 5’-päähän korjausjäännealue (repair patch, RP). Polymeraasi γ poistaa syntyneen jäännealueen (Muftuogly ym. 2014). Tämän jälkeen korjausprosessi voi edetä kahdella tavalla riippuen onko kyseessä yhden vai useamman nukleotidin mittainen vahingoittunut alue. Yhden nukleotidin mittaisessa vahingossa DNA ligaasi 3 (LIG3) (Ruhanen ym. 2011, Akbari ym. 2014) täyttää poistetun nukleotidin paikan uudella nukleotidillä. Useamman nukleotidin mittaisessa vahingossa polymeraasi γ lisää poistettujen nukleotidien tilalle uusia nukleotidejä, luoden samalla 3’-juosteisen flap-rakenteen, jonka jälkeen flap-endonukleaasi-1 (FEN1) ja DNA nukleaasi-helikaasi 2 (DNA2) poistavat 5’- jäännealueen (Kalifa ym. 2009, Duxin ym. 2009). Tämän jälkeen LIG3 täyttää tyhjiksi jääneet kohdat samaan tapaan kuin yksittäisen vahingon korjauksessa (Lakshmipathy & Campbell, 1999, McNally & O’Brien, 2017). Mikäli BER-prosessi keskeytyy tai suoritetaan puutteellisesti, voi sen seurauksena syntyä yksittäisen juosteen katkeaminen (single strand break, SSB), joka voi aiheuttaa replikaation ja translaation pysähtymisen ja myöhemmin pahentua erittäin sytotoksiseksi, molemmat juosteet kattavaksi kaksoisjuosteen katkeamiseksi (double strand break, DSB) (Muftuogly ym. 2014).
Mitokondrioissa on havaittu tapahtuvan korjaustoimenpiteitä kaksoisjuosteen katkeamisen korjaamiseksi, mutta niiden tarkemmat mekaniikat vaikuttavat poikkeavan jossain määrin tuman vastaavista mekanismeista (Kuva 5). Nämä korjausmekanismit kykenevät palauttamaan mtDNA:n eheyden, mutta eivät välttämättä sen alkuperäistä sekvenssiä ja ovat täten viimeinen mahdollisuus korjata vaurioitunut mtDNA (Garcia-Lepe ym. 2019). DSBR mitokondriossa vaikuttaisi pohjautuvan kahteen erilaiseen metodiin:
homologinen rekombinaatiokorjaus (HRR) (Thyagarajan ym. 1996) ja ei-homologinen kaksoisjuosteen päiden yhdistäminen (NHEJ) (Coffey ym. 1999, Tadi ym. 2016). HRR:n aikana DNA:n katkoskohdan juosteiden päät siirretään Rad51 ja Rad52 -proteiinien toimesta homologiseen, mutta ehjään DNA:n kaksoisjuosteeseen avattuun kuplaan, jossa DNA polymeraasit ja muut tällä hetkellä vähän tunnetut geenituotteet rakentavat uuden identtisen juostealueen vahingoittuneelle kaksoisjuosteelle. Tämän jälkeen korjatut juosteet irtoavat homologistaan ja DNA ligaasi 1 liittää leikkauskohdat uudelleen yhtenäiseksi juosteeksi (Chen, 2013, Featherstone ym. 1999). Tämän tumassa havaitun mekanismin olemassaoloa
14
mitokondrioissa ei kuitenkaan vielä ole pystytty kokonaan varmistamaan. Mitokondrion DNA:ssa sijaitsevan ei-koodaavaan D-loop alueen on arveltu auttavan tähän prosessiin vaadittavien proteiinien pääsyä korjausalueelle (Blasiak ym. 2013). NHEJ puolestaan pyrkii yhdistämään katkenneet kaksoisjuosteiden päät suoraan toisiinsa monimutkaisten proteiinikompleksien avulla, jonka tärkein toimija on DNA:n päitä sitova proteiini Ku.
Mitokondrioilla on havaittu kyky suorittaa NHEJ myös ilman Ku-proteiinia, mutta sen lopputulokset ovat usein epätarkkoja ja niistä usein puuttuu yksi tai useampi nukleotidi (Garcia-Lepe ym. 2019).
Kuva 5: Tuman ja mitokondrio-DNA:n erilaiset vahingonkorjausmenetelmät. Vihreällä merkityt menetelmät on tavattu sekä tumassa, että mitokondrioissa, kun taas oranssilla merkityt menetelmät on tällä hetkellä vain osittain kyetty tunnistamaan mitokondrioissa.
Punaiset korjausmenetelmät on tavattu vain tuman DNA:n korjauksen yhteydessä. MMR = mismatch repair, NER = nucleotide excision repair, BER = base excision repair, NHEJ = non- homologous end joining ja HRR = homologous recombination repair (Blasiak ym. 2013).
2.3.1 DNA nukleaasi-helikaasi 2
DNA nukleaasi-helikaasi 2 (DNA2) on DNA2/NAM7 (nuclear accomodation of mitochondria 7) helikaasi-perheeseen kuuluva proteiini, joka tunnistettiin ensimmäisen kerran leivinhiivassa (Saccharomyces cerevisiae) 1980-luvulla, jossa sillä havaittiin olevan aktiivinen rooli replikaation aikana niin hiivan tumassa kuin mitokondrioissa sen nukleaasi- ja helikaasiaktiivisuuden takia (Dumas ym. 1982, Budd & Campbell, 1997). Ihmisen homologinen DNA2:ta koodaava geeni löydettiin vuonna 1996 (Eki ym. 1996). DNA2
15
osallistuu pääsääntöisesti FEN1:n ja monen muun samankaltaisen proteiinin kanssa DNA:n replikaatioon ja vaurionkorjaukseen BER:in aikana, mutta sillä on havaittu myös olevan osa DNA:n vaurionkorjauksen aktivoimisessa ja mitokondrioiden toiminnan ylläpitämisessä, sekä telomeerien ylläpidossa (Markiewicz-Potoczny ym. 2018). Hiivasolujen analyysi on osoittanut DNA2:n lokalisoituvan solun eri osiin solusyklin eri vaiheissa. G1-vaiheessa sitä havaitaan telomeereissä, josta se siirtyy koko genomin alueelle S-vaiheessa ja takaisin telomeereihin myöhäisessä S/G2-vaiheessa (Choe ym. 2002). Se poistuu telomeereistä myös DNA:n vahingoittuessa, esimerkiksi kaksoisjuosteen rikkoutumisen aikana.
Tuman DNA:n replikaation aikana DNA2 ja FEN1 poistavat replikaatiossa laahaavaan juosteeseen Okazakin fragmenttien käsittelystä syntyvät, yksijuosteisesta DNA:sta rakentuvat noin 20 nukleotidin mittaiset flap-juosteet. Näihin flap-rakenteisiin suurella affiniteetillä liittyvä replikaatioproteiini A (RPA) inhiboi FEN1:n leikkaustoimintaa, mutta DNA2 voi syrjäyttää RPA:n jolloin FEN1 voi leikata syntyneet flap-rakenteet pois syntyvän DNA- juosteen tieltä (Bae ym. 2001). Samanlainen toimenpide on havaittavissa mtDNA:n replikaatiossa ja BER:ssä, jolloin DNA2 ja FEN1 (hiivoissa homologinen Rad27) poistavat polymeraasi γ:n mtDNA:n korjauksen aikana luomat flap-juosteet (Copeland ym. 2008, Duxin ym. 2009). Biokemialliset analyysit ovat osoittaneet DNA2-proteiinin nukleaasi- ja helikaasiaktiivisuuden olevan riippuvaisia ATP:n saatavuudesta (Masuda-Sasa ym. 2006).
DNA2-hiljennetyillä hiivasoluilla tehdyt tutkimukset ovat osoittaneet, että DNA2:n vajaus niiden tumissa johtaa epätavallisiin telomeereihin ja vähäiseen yksijuosteisen DNA:n määrään soluissa, mikä puolestaan vaikuttaa solujen ikääntymiseen (Markiewicz-Potoczny ym. 2018).
Lisäksi in vivo-tutkimuksissa on todettu, että vaikka FEN1 ja DNA2 toimivat hiivasoluissa läheisessä yhteistyössä toistensa kanssa, on DNA2 näistä kahdesta välttämätön, kun taas hiivasolut voivat kompensoida FEN1:n puuttumisen (Budd ym. 2000).
Toisin kuin hiivasoluilla, ihmisen DNA2 (hDNA2) on todettu lokalisoituvan tuman ja sytosolin sijasta pääsääntöisesti (mutta ei kokonaan) mitokondrioissa, mutta tällä hetkellä on epäselvää, kuinka solut säätelevät hDNA2:en määrää mitokondrioissa. Ihmisen DNA2 on noin 120 kilodaltonin suuruinen polypeptidi, jolla on kaksi toisistaan erillään toimivaa domeenia: N-terminaali nukleaasi- ja C-terminaali helikaasidomeeni (Ding ym. 2015). Se kuuluu PD-(D/E) XK nukleaasien superperheeseen (Uhler ym. 2015) ja se vaikuttaisi stimuloivan sekä tekevän yhteistyötä polymeraasi γ:n kanssa, täten ottaen osaa mtDNA:n replikaatioon ja korjaukseen (Zheng ym. 2008). Sen tarkkaa toimintaperiaatetta ihmisen mitokondrioissa ja niiden DNA:n replikaatiossa ja korjauksessa ei kuitenkaan tänä päivänä
16
vielä tunneta, mutta sen lokalisoituminen sekä polymeraasi γ:n, että TWINKLE:n kanssa antaa käsityksen sen toimimisesta samankaltaisesti kuin hiivasoluissa (Zheng ym. 2008, Duxin ym. 2009). DNA2-geenin mutaatioiden ja sen toimintahäiriöiden on todettu ihmissoluissa aiheuttavan mtDNA:n mutaatioita ja sen määrän vähenemistä, mtDNA:n replikaatio- ja korjaushäiriöitä sekä mitokondriaalista myopatiaa (Ronchi ym. 2013), kun taas sen yliekspression on havaittu lisäävän syöpäriskiä, esimerkiksi haimassa (Kumar ym. 2017).
DNA2:n puuttuminen alkionkehityksen aikana on todettu johtavan alkiokuolemiin (Lee ym.
2014).
3 TUTKIMUSTAVOITTEET
Koska ihmisen DNA2-proteiinin toiminnasta ja tärkeydestä mitokondrioiden DNA:n ylläpidossa tiedetään tällä hetkellä vain vähän, on tämän tutkimuksen tarkoituksena saada lisää tietoa sen tarpeellisuudesta solujen mtDNA:n ylläpidossa. Erityistä huomiota kiinnitämme hDNA2:n tarpeellisuuteen vaurionkorjauksessa, replikaation uudelleenkäynnistymisessä ja replikaatiossa. Nykytiedon mukaan hDNA2:lla on normaaliolosuhteissa vähäinen vaikutus mtDNA:n ylläpidossa, mutta tämä saattaa muuttua sen ollessa vaimennettu tai yliekspressoitu soluissa, sekä korjausta vaativien stressitilanteiden aikana.
Tutkimuksen ensimmäisenä tavoitteena on tuottaa solulinja, joka onnistuneesti yliekspressoi DNA2:n tuotantoa. Tämän jälkeen soluja on tarkoitus vaurioittaa tai niiden replikaatiota inhiboida ulkoisilla tekijöillä, kuten kemikaaleilla tai UV-valolla, ja tutkia yliekspression vaikutusta solujen korjauksessa. DNA2 on tunnetusti ollut vaikeasti yliekspressoitavissa soluviljelmissä. Mikäli DNA2:n yliekspressio soluviljelmissä ei onnistu, on tarkoitus tutkia DNA2:n hiljentämisen vaikutuksia vaurioitetuissa soluissa sen sijaan.
Vaurioittaminen suoritetaan samoja menetelmiä käyttäen kuin yliekspressoivilla soluilla.
17 4 AINEISTO JA MENETELMÄT
4.1 Soluviljely
Tämän tutkimuksen tarkoituksiin viljeltiin HEK 293 ja 293 TREx-solulinjoja. HEK-soluja kasvatettiin soluviljelymaljoilla, joissa kasvatusliuoksena toimi Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, L0103-500, Biowest), joka sisälsi 4,5 grammaa glukoosia per litra liuosta.
Tähän liuokseen on myös lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja 1% antibioottia (Penicillin-Streptomycin, 15070063, Thermo Fisher Scientific). TREx-solujen kasvatuksessa käytettävään mediumiin lisättiin 10% tetrasykliinistä vapaaksi todettua naudan sikiön seerumia (Tet approved FBS), sekä 1% antibioottia (Penicillin-Streptomycin). Kasvavia soluja säilytettiin inkubaattorissa 37 °C ja 10% hiilidioksidipitoisuudessa, ja solumaljoja jaettiin tarvittaessa 2-3 päivän välein.
4.1.1 HEK 293-solujen väliaikainen transfektio DNA2:n yliekspressoimiseksi
HEK 293-solujen transfektiossa käytettiin erilaisia plasmideja, jotka olivat pcDNA5/TO DNA2-1xflag, pcDNA5/TO MTS-DNA2-1xflag, pcDNA5/TO MTS-DNA2-3xflag, pcDNA5 FRT/TO MTS-DNA2-1xflag, pcDNA5 FRT/TO MTS-DNA2-myc ja pcDNA5 FRT/TO MTS- DNA2-3xflag. Plasmidinäytteiden lisäksi oli kaksi transfektoimatonta kontrollia.
Transfektiota varten HEK-solut oli aiemmin jaettu 9 cm2 pinta-alan omaaville soluviljelymaljoille. Transfektionesteet valmistettiin sekoittamalla 4 µg haluttua plasmidia 400 µl Optimem-mediumia. Sekoituksen jälkeen liuokseen sekoitettiin 6 µl transfektio- reagenssia (Turbofect, 13778-150, Thermo Fisher Scientific), jonka jälkeen liuoksen annettiin inkuboitua huoneenlämmössä 15 min. Inkubaation jälkeen transfektioliuos jaettiin tasaisesti kahdelle solumaljalle per plasmidinäyte, jonka jälkeen transfektoidut solumaljat siirrettiin takaisin inkubaattoriin odottamaan jatkotutkimuksia.
18 4.1.2 293TREx-solujen transfektio
Ennen transfektiota, 293TREx Flpln-solut oli jaettu kahdelle 6 cm halkaisijaltaan oleville soluviljelymaljoille. Kukin malja tarvitsi suhteessa 9:1 pcDNA5 FRT/TO MTS-DNA2-myc - plasmideja ja bakteeriviljelmästä kaupallisen E.Z.N.A Plasmid DNA Kit:in (D6942-01, Omega Bio-tek) ohjeiden mukaisesti eristettyjä, Flp-rekombinaasigeenin sisältäviä pOG44- plasmideja. Tämän transfektion tarkoituksena on integroida DNA2 -geeni TREx-solujen genomin haluttuun lokukseen, jotta se voidaan indusoida käyttäen doksisykliiniä. Sekä TREx- solut että aiemmin mainitut plasmidivektorit omaavat Flp:n tunnistavan alueen genomissaan, joka mahdollistaa tarkan, samaan lokukseen kohdistuvan genomialueen integraation Flp- rekombinaasin avulla. Tämän vuoksi uuden genomin integraatio on erittäin tehokas ja se kohdistuu aina haluttuun lokukseen solujen genomissa. Transfektio integroi soluihin myös antibioottiresistenttiysgeeni hygromysiini B:tä vastaan. Tämä plasmidiliuos sekoitettiin 600 µl TREx-soluille sopivaa Optimem-mediumia, jonka jälkeen liuokseen sekoitettiin 12 µl transfektio-reagenssia (Turbofect, Thermo Fisher Scientific) ja annettiin inkuboitua 15 min huoneenlämmössä. Tämän jälkeen liuos jaettiin tasaisesti kahdelle TREx-soluviljelymaljalle ja ne siirrettiin takaisin inkubaattoriin. Kahden päivän jälkeen TREx-solumaljoille lisättiin 15 µl hygromysiini B:tä ja 15 µl blastisidiiniä (ant-hg, ant-bl, Invivogen), joiden tarkoitus on tappaa ne solut, jotka eivät kanna sisällään 293TREx Flpln -vektoreita. Kaksi päivää antibioottikäsittelyn jälkeen solumaljoista poistettiin antibioottikäsittelyn seurauksena kuolleet solut.
4.2 DNA2:n hiljentäminen siRNA-transfektiolla
Soluviljelmille suoritettiin siRNA-transfektio, jonka tarkoituksena oli aiheuttaa RNA- interferenssiä sitoutumalla DNA2:n synteesiin johtavaan lähetti-RNA:han, täten hiljentäen sitä koodaavan geenin toiminnan. siRNA-transfektiot suoritettiin HEK 293-soluille, jotka oli aikaisemmin jaettu kahteentoista soluviljelylevyn kuoppaan, jonka halkaisija on 35 mm ja pinta-ala 9 cm2. Transfektionesteen valmistus aloitettiin sekoittamalla yhdessä mikroputkessa 225 µl Optimem-mediumia (31985-070 500 mL, Thermo Fisher Scientific) ja 12 µl lipofektamiini-transfektioreagenttia (Lipofectamine RNAiMAX, 13779-150, Thermo Fisher
19
Scientific). Toisessa mikroputkessa sekoitettiin 225 µl Optimem-mediumia ja 6,25 pM DNA2 siRNA 1 (4427037, siRNA ID s4173, locus ID 1763, Ambion Life Technologies) ja 6,25 pM DNA2 siRNA 2 (4427037, siRNA ID s4174, locus ID 1763, Ambion Life Technologies) (siRNA:n konsentraatio 10 pmol/µl). Tämän jälkeen kumpikin neste sekoitettiin keskenään ja annettiin inkuboitua huoneenlämmössä 5 min. Soluille, jotka transfektoitiin vain siRNA 1:llä tai siRNA 2:lla, valmistettiin transfektionesteet samoilla pitoisuuksilla, paitsi tällä kertaa yhtä siRNA:ta sekoitettiin nesteeseen 12,5 pM. Sama prosessi samoilla pitoisuuksilla toistettiin myös siRNA-negatiivikontrollin transfektionesteen valmistamiseksi. Inkubaation jälkeen yhden putken sisältö pipetoitiin tasaisesti kolmeen kahdestatoista soluviljelylevyn kuopasta tipoittain, jonka jälkeen solut siirrettiin inkubaattoriin odottamaan jatkotutkimuksia.
4.3 Proteiinien eristys
Proteiinien eristys viljellyistä soluista aloitettiin imemällä medium pois soluviljelymaljasta, jonka jälkeen solut irrotettiin maljan pohjasta lisäämällä soluviljelymaljaan 1 ml PBS ja tämän jälkeen pipetoimalla nestettä sisään ja ulos, kunnes kaikki solut olivat irronneet nesteeseen. Mikäli solut olivat tiukasti kiinni soluviljelymaljan pohjassa, irrotettiin ne huuhtomalla ne ensin kevyesti PBS:llä ja imemällä se pois, jonka jälkeen maljalle lisättiin 1 ml trypsiiniä irrottamaan solut. Kun solut olivat irronneet, siirrettiin solususpensio mikroputkeen, ja tämä putki 4 °C sentrifugiin 3 min, 1000 g. Tämän jälkeen putkesta poistettiin pipetoimalla neste ja syntynyt solupelletti resuspensoitiin 80-100 µl TOTEX- puskuria (20 mM Hepes pH 7,9, 400 mM NaCl, 20 % glyseroli, 1 % NP40, 1 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, 0,2 mM EGTA, 10 mM β-glyserofosfaatti, 10 mM NaF, 5 mM DTT, Complete proteinaasi-inhibiittoriseos), riippuen solupelletin koosta. Resuspensoitua solupellettiä pidettiin jäähauteessa 20 min, jonka jälkeen se siirrettiin noin 30 min -20 °C pakastimeen.
Pakastuksen jälkeen solususpensio sulatettiin jäähauteessa, välillä sekoittaen vortexilla. Kun solususpensio oli sulanut, siirrettiin se jälleen neljän celsiusasteen sentrifugiin viideksi minuutiksi, 16000 g. Fuugauksen jälkeen jäljellä oleva supernatantti siirrettiin uuteen mikroputkeen, ja täten valmis proteiininäyte säilytettiin -20 °C.
Eristettyjen proteiininäytteiden konsentraatioiden mittaukseen käytettiin Bradfordin menetelmää. 1 µl näytettä (tarvittaessa laimennettu) pipetoitiin 1 ml Bradford-liuosta (0,1 mg/ml Coomassie Brilliant Blue G250, 10 % EtOH, 8,5 % fosforihappo). Standardisuora
20
mittausta varten valmistettiin sekoittamalla 1 ml Bradford-liuosta 0, 2, 4, 6, 8, 10 ja 12 µg BSA:ta. Saatuja näytteitä inkuboitiin 15-20 minuuttia jäähauteessa, jonka jälkeen niiden absorbanssi mitattiin 595 nm aallonpituudessa käyttäen FluoStar Omega flourometriä (BMG Labtech). Näytteiden proteiinikonsentraatiot saatiin vertaamalla mitattuja absorbanssilukemia standardin vastaaviin.
4.3.1 Western blot
Eristetyt proteiininäytteet analysoitiin Western blot-menetelmää käyttäen. Geeliajossa käytettiin kaksiosaista akryyliamidigeeliä, joka koostui kasausgeelistä (4% akryyliamidi, 0,1% SDS, 125 mM Tris pH 6,8, 0,1% APS, 0,1% TEMED) ja ajogeelistä (8% akryyliamidi, 0,1% SDS, 375 Mm Tris pH 8,8, 0,1% APS, 0,1% TEMED). Ajokammio täytettiin 1x SDS- puskurilla (0,025 M Tris, 0,192 M glysiini, 0,1% SDS, pH 8,5). Proteiininäytteistä pipetoitiin 100 µg proteiinia, jonka jälkeen niihin lisättiin ¼ niiden tilavuudesta 5x Lämmli- latauspuskuria (250 nM Tris, pH 6,8, 10% SDS, 30% glyseroli, 0,5 M DTT, 0,02%
bromofenolisininen). Saatua sekoitusta keitettiin 5 min 95 °C, jonka jälkeen näytteet sekä proteiinimarkkeri (PageRuler Plus prestained protein ladder, Thermo Fisher Scientific) pipetoitiin geelin kuoppiin. Geeliä ajettiin noin 1,5 tuntia 100V. Ajon päätyttyä proteiinit siirrettiin geeliltä nitroselluloosa-kalvolle käyttäen electroblot-menetelmää siirtopuskurissa (1x SDS-puskuri + 20% metanoli), 1,5 t, 100V, 4 °C. Siirtoprosessin jälkeen membraanin huuhdottiin MilliQ-vedellä, värjättiin 1-2 min ajan Ponceau S-liuoksella (0,1% Ponceau S, 5% etikkahappo) ja ylimääräinen Ponceau S huuhdottiin uudestaan MilliQ-vedellä.
Kalvo siirrettiin huuhdottavaksi blokkausliuokseen (3% maitojauhetta TBST-puskurissa (20 nM Tris pH 7,6, 150 mM NaCl, 0,1% Tween-20)) noin tunniksi, jonka jälkeen se pestiin kaksi kertaa nopeasti 1x TBST:llä. TBST-pesun jälkeen kalvoa käsiteltiin yön yli primäärisessä vasta-aineessa, jonka jälkeen se pestiin 3x 5 min TBST:llä ja tämän jälkeen noin tunti sekundäärisessä vasta-aineessa. Tässä tutkimuksessa käytetyt primääriset vasta- aineet ja niiden konsentraatiot olivat rabbit anti-actin (A2066, Sigma, 1:2000), rabbit anti-flag (ABIN871107/20543, Antibodies-online/Proteintech, 1:2000 tai 1:4000), mouse anti-flag (ABIN1715174/Ebi T006, Antibodies-online, 1:1000 tai 1:2000), mouse anti-myc (SAB4700447, Sigma, 1:15000) ja rabbit anti-DNA2 (ABIN6388783, Antibodies-online, 1:1000 tai 1:500). Käytetyt sekundääriset vasta-aineet ja niiden konsentraatiot olivat goat-
21
anti-rabbit IgG HRP (A16104, NOVEX/Lifetech, 1:15000 tai 1:7500) ja goat-anti-mouse IgG (GTX77315, Genetex, 1:5000 tai 1:8000). Vasta-ainekäsittelyjen jälkeen kalvo huuhdottiin vielä 4x 10 min TBST:llä. Kalvon kuvantamiseksi suoritettiin noin minuutin kestävä Luminol-käsittely (10 ml 100 mM Tris-HCl pH 8,5, 22 µl 90 mM p-kumariinihappo DMSO:ssa, 50 µl 250 mM natrium-luminol DMSO:ssa, 3 µl 30% H202), jotta kalvo voitiin kuvantaa pimiössä filmille.
4.4 DNA-analyysit
4.4.1 Totaali-DNA:n eristys
Totaali-DNA:n eristys soluviljelmistä suoritettiin käyttäen proteinaasi K-digestiota ja fenoli:kloroformi-ekstraktiota. Totaali-DNA:n eristäminen soluviljelmistä aloitettiin irrottamalla ne soluviljelymaljan pohjasta käyttäen 1x PBS tai trypsiiniä, riippuen siitä kuinka tiukasti solut olivat kiinni maljan pohjassa. Irrottamisen jälkeen solut siirrettiin mikroputkiin 1x PBS-nesteessä ja sentrifugoitiin pelletiksi 4 °C, 5 min 1000 g, jonka jälkeen PBS imettiin pois. Saatu solupelletti liuotettiin 500 µl lyysispuskuriin (10 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,4% SDS). Seuraavaksi lysaattiin lisättiin 20 µl proteinaasi K:ta (10 mg/ml), jonka jälkeen lysaattia inkuboitiin 37 °C lämpöhauteessa vähintään 2 t, välillä hieman sekoittaen. Inkubaation jälkeen lysaattiin lisättiin 50 µl 5M NaCl.
Fenoli:kloroformi-ekstraktio aloitettiin lisäämällä lysaattiin 500 µl fenoli:kloroformi:isoamyylialkoholiliuosta (25:24:1, pH 6,9), jonka jälkeen saatua seosta sekoitettiin noin 2 min ja sentrifugoitiin noin 5 min, 16000 g. mikroputkeen muodostunut ylempi vesifaasi pipetoitiin uuteen mikroputkeen ja samat toimenpiteet toistettiin uudelle putkelle, kunnes kahden faasin välissä ei enää havaittu valkoista interfaasia. Fenolijäänteiden poistamiseksi DNA:sta, sekoitettiin viimeiseksi saatuun vesifaasiin 500 µl kloroformia, jonka jälkeen se sentrifugoitiin uudestaan 16000 g:ssä 5 min, ja saatu vesifaasi pipetoitiin jälleen uuteen putkeen. Saatuun nesteeseen sekoitettiin kaksi kertaa sen tilavuuden verran (noin 1000 µl) kylmää 100% etanolia ja 1/10 sen tilavuudesta (50 µl) 3M natriumasetaattia, pH 5,3.
Mikäli DNA saostui näkyviin, siirryttiin seuraavaan vaiheeseen, mutta mikäli ei, inkuboitiin liuosta 30 min -80 °C. Saostunut DNA pelletoitiin sentrifugissa, 4 °C, 16000 g, noin 30 min,
22
jonka jälkeen neste pipetoitiin pois. Ylimääräisten suolojen poistamiseksi DNA:sta lisättiin pelletin päälle 1 ml 70% EtOH, ja sentrifugoitiin se uudestaan 4 °C, 5 min 16000 g. Tämän jälkeen kaikki neste poistettiin putkesta mahdollisimman tarkoin ja pelletti jätettiin kuivumaan noin 30 min. Kuivunut pelletti joko resuspensoitiin 100 µl TE-puskuriin (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA), tai digestoitiin yön yli 37 °C lämpöhauteessa digestionesteellä (1 µl Thermo Scientific Fast Digest Bgl II, 100 µl 1x Fast Digest Buffer (FD0084, Thermo Fisher Scientific). Digestion jälkeen saadun näytteen DNA-pitoisuus mitattiin Nanodrop ND- 1000-spektrofotometrillä (NanoDrop Technologies, Inc, Yhdysvallat). Eristetyt DNA-näytteet säilytettiin -20 °C:ssä.
4.4.2 Southern blot
DNA-näytteiden Southern blottausta varten näytteitä ajettiin agaroosigeelissä yön yli matalalla, noin 32 V, virralla. Ajon jälkeen agaroosigeeliä inkuboitiin 2x 15 min depurinaatio- liuoksessa (0,25M HCl), jonka jälkeen ylimääräinen HCl huuhdottiin nopeasti pois MilliQ- vedellä. Tämän jälkeen geeliä inkuboitiin 2x 20 minuuttia denaturaatio-puskurissa (0,5M NaOH, 1,5M NaCl). Inkubointien jälkeen geelissä ollut DNA siirrettiin Hybond-XL nylonmembraanille (GE Healthcare) kapillaariblottauksen avulla. Blottaus suoritettiin asettamalla geelin päälle nylonmembraani, 2 suodatinpaperia, käsipaperia ja paino. DNA:n annettiin siirtyä geeliltä membraanille joko yön yli tai kunnes geeli oli kokonaan kuivunut.
Saatu nylonmembraani neutralisoitiin ja pidettiin kosteana 6x SSC-puskuriliuoksessa kiinnittämisen (cross-linking) aloittamiseen asti. Kiinnittäminen suoritettiin geelikuivurissa, 2 t 80 °C.
Kiinnitetty membraani esihybridisoitiin lämpökaapissa (65 °C) esilämmitetyllä Church:in hybridisaatiopuskurilla (0,25M NaPO4 pH 7,2, 7% SDS, 1 mM EDTA) noin 30 min ajan. Hybridisaatio suoritettiin yön yli lisäämällä lämpökaapissa olevalle membraanille noin 10 ml Church:in puskuria, johon oli lisätty radioaktiiviseksi leimattu denaturoitu koetin. Tämä koetin valmistettiin käyttäen kaupallista random prime leimausmenetelmää (Amersham Rediprime II DNA Labeling System, GE Healthcare), sekä G50-puhdistuspylvästä (Mini Quick Spin Columns, Roche). Radioaktiivisessa leimauksessa käytetyt koettimet olivat 7S (mtDNA 16177-40), 12S ja OH (mtDNA 37-611). 7S-koetinta käytettiin niin topologisissa, 7S- ja kopionumerotutkimuksissa, kun taas 12S- ja OH-koettimia käytettiin vain topologisissa
23
tutkimuksissa. Hybridisaation jälkeen membraani huuhdottiin lämpökaapissa (65 °C) 5 min + 3x 20 min 1x SSC (20x stock 3 M NaCl, 0,3 M natriumsitraatti pH 7,0), 0,1% SDS-liuoksella.
Liuos vaihdettiin uuteen jokaisen käyttökerran jälkeen. Pesujen jälkeen membraani käärittiin ohueen muovikalvoon ja siirrettiin kuvannuskasettiin fosforilevyn kanssa 1-3 päiväksi riippuen radioaktiivisen signaalin voimakkuudesta. Fosforilevyn signaali analysoitiin ja kuvattiin fosforikuvantimella (Molecular Imager FX, Bio-Rad). Vaihtoehtoisesti membraani voitiin kuvantaa röntgenfilmille (Kodak BioMax with BioMax MS Intensifying Screen).
Kuvauskasetti asetettiin -80 °C pakastimeen 1-5 päiväksi, jonka jälkeen filmi kehitettiin.
4.4.3 Topologia
Yhtenä tämän tutkimuksen kohteena oli selvittää, oliko DNA2:n ylikspressoinnilla tai hiljentämisellä vaikutusta mitokondrio-DNA:n topologiaan, esimerkiksi sen kierteisyyteen tai katenaaneihin. Eri käsittelyjen vaikutuksia soluviljelmien mtDNA:n topologiaan selvitettiin ajamalla eristettyjä DNA-näytteitä topologiageelillä, joka valmistettiin 0,4% agaroosista (ultrapure, Invitrogen) 1x TBE:ssä ilman etidiumbromidia. Geeli ajettiin TBE-puskurissa yön yli 32 V.
Geelin mtDNA:n topologiaa analysoitiin ennakkotiedolla, että superkiertyneet molekyylit liikkuivat geelissä ajon aikana pisimmän matkan. Lineaariset ja relaksoituneet molekyylit olisivat kulkeneet hieman lyhyemmän matkan ja näitä ylempänä geelissä arvioitiin olevan katenaaneja ja dimeerejä. DNA siirrettiin nylonmembraanille Southern blot- menetelmällä, hybridisoitiin radioaktiivisella koettimella (OH) ja valotettiin fosforilevylle.
Tämä levy skannattiin fosfokuvaajan avulla ja eri topologisten muotojen suhteet määriteltiin Quantity One-ohjelmalla (Bio-Rad). Vertailun kohteena toimivat fosfokuvaajasta saadut kontrolli- ja siRNA-käsiteltyjen näytteiden tummuusarvot katenaaneille, superkiertyneille ja rentoutuneille juosteille. Vertailemalla eri juosteiden suhteita kontrolli- ja siRNA-käsiteltyjen näytteiden välillä, ja suorittamalla näille arvoille Studentin kaksisuuntainen ja heteroskedastinen t-testi, voitiin selvittää siRNA-käsittelyn ja mtDNA:n vaurioittamisen vaikutusta mtDNA:n topologiaan.
24 4.4.4 7S-DNA
Topologisten tutkimusten lisäksi eristetyistä DNA-näytteistä haluttiin selvittää DNA2:n yliekspression ja hiljentämisen vaikutuksia mitokondrio-DNA:n 7S-DNA:han. 2 µg DNA- näytettä digestoitiin käyttäen 1 µl PvuII-restriktioentsyymiä (Thermo Fisher Scientific, ER0631) ja 2 µl 10x FastDigest Green buffer-digestiopuskuria (Thermo Fisher Scientific, B72). Näytteiden lopputilavuus oli 20 µl. Näytteitä digestoitiin 30 min 37 °C lämpöhauteessa, jonka jälkeen ne siirrettiin 10 min 75 °C lämpölevylle. Näytteet ajettiin 0,8%
agaroosigeelissä, joka oli valmistettu lisäämällä agaroosijauhetta ja 0,3 µl/ml EtBr:ää 1x TAE- puskuriin. Geelit ajettiin yön yli 20 V jännitteellä. Saadut geelit siirrettiin nylonmembraanille Southern blot-menetelmällä ja hybridisoitiin 7S-koettimella samaan tapaan kuin topologiageelit.
Hyödyntäen samaa fosfokuvaajaa ja laskennallisia metodeja kuin topologisissa tutkimuksissa, pystyttiin 7S-DNA:n suhde mtDNA:han vertailemaan kontrollien ja käsiteltyjen mtDNA-näytteiden välillä vertaamalla membraanien radioaktiivisten alueiden intensiivisyyttä. Intensiivisyyden avulla pystyttiin myös ottamaan huomioon mahdolliset epätasaiset lataukset, ja täten poikkeavat näytteiden pitoisuudet. Intensiteettianalyysistä saadut arvot, sekä neutraali tausta-arvo siirrettiin Excel -taulukkolaskentaohjelmaan, jossa jokaisesta mitatusta arvosta ensin vähennettiin tausta-arvo. Tämän jälkeen 7S-DNA:n intensiteettiarvot jaettiin ylemmän mtDNA:n intensiteettiarvoilla per näyte ja saaduista tuloksista laskettiin niin kontrolleille kuin siRNA-käsitellyille näytteille keskiarvot ja keskihajonnat.
4.4.5 2D-geeli elektroforeesi
Tutkimuksessa haluttiin selvittää myös DNA2:n hiljentämisen ja solujen vaurioittamisen vaikutusta mtDNA:n replikaatioon ja sen välituotteiden määriin. Tätä varten DNA-näytteille suoritettiin 2D neutraali/neutraali geelielektroforeesi. 10 µg DNA:ta digestoitiin 3 µl FastDigest HincII-restriktioentsyymiä (Thermo Fisher Scientific, FD0494) 1x FastDigest Green Buffer-puskurissa. Digestio tapahtui lämpökaapissa, 4 h 37 °C. Digestion jälkeen näytteille suoritettiin fenoli-kloroformiekstraktio sekoittamalla näytteisiin niiden tilavuuden verran fenoli:kloroformi:isoamyylialkoholia ja sentrifugoimalla niitä 5 min, 16000 g. Ylempi
25
vesifaasi siirrettiin uuteen putkeen ja siihen lisättiin 5 µl 10x DNA-latauspuskuria (50%
glycerol, 2 mM EDTA, 180 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,06% xyleenisyanoli ja bromofenolisininen). Geeliajon aikana DNA:n kulkeman matkan pituuden mittaamiseen käytettiin GeneRuler 1kb Plus DNA Ladder-markkeria (Thermo Fisher Scientific, SM1331).
Ensimmäisen ulottuvuuden geeli oli 0,4% agaroosigeeli (ultrapure) 1xTBE:ssä ilman EtBr:ää. Geeli ajettiin huoneenlämmössä yön yli 35 V jännitteellä. Ensimmäisen geeliajon jälkeen DNA:ta värjättiin 1x TBE:ssä, johon oli lisätty 20 µl 10 µg/µl EtBr 20 min ajan. Tämä suoritettiin, että voitiin varmistua DNA:n sijainneista UV-valon avulla, ja niiden irti leikkaamisen helpottamiseksi. Toisen ulottuvuuden geeli oli 0,95% agaroosigeeli, johon oli sekoitettu 1 µg/ml EtBr:ää. Tämä geeli valettiin ensimmäisen ulottuvuuden geelistä irti leikattujen geelijuosteiden ympärille ja geeli ajettiin 4 °C:ssä yön yli 100 V jännitteellä.
Ajopuskurina toimi 1x TBE, johon oli lisätty 0,1 µg/ml EtBr:ää. Geelin ylikuumenemisen ja sulamisen välttämiseksi ajopuskuria kierrätettiin koko ajon ajan pumpulla. Tämän ajon päätyttyä geelille suoritettiin Southern blot ja membraani hybridisoitiin OH-koettimella.
4.5 RNA:n eristys
Soluviljelmien RNA eristettiin analysointia varten Trizol-ekstraktiolla. Ekstraktio aloitettiin imemällä kasvatusmaljoista kasvatusmedium pois, jonka jälkeen jokaiselle soluviljelymaljalle lisättiin 0,5 ml Trizol-reagenssia (Thermo Fisher Scientific, 15596026). Solujen annettiin hajota noin 1 min, jonka jälkeen syntynyt lyysaatti kerättiin soluviljelymaljasta käyttäen pientä lastaa ja se pipetoitiin mikroputkeen. Lyysaattiputkiin sekoitettiin 100 µl kloroformia ja niitä fuugattiin 5 min 16000 g, jonka jälkeen syntyneistä faaseista ylempi siirrettiin uuteen putkeen. Uuteen putkeen sekoitettiin 250 µl isopropanolia ja seosta inkuboitiin 10 min huoneenlämmössä. Inkubaation jälkeen näytettä fuugattiin 10 min 12000 g, 4 °C. Syntyneen pelletin ympäriltä poistettiin neste ja se pestiin 1 ml 70% EtOH:ia ja fuugattiin 5 minuuttia 12000 g, 4 °C. Pesun jälkeen EtOH poistettiin ja pelletin annettiin kuivua 10-15 min, jonka jälkeen pelletti liuotettiin noin 30 µl:aan RNAaasi-vapaata vettä. Saatujen näytteiden RNA- pitoisuus mitattiin Nanodrop ND-1000-spektrofotometrillä ja näytteet säilytettiin -80 °C.
26 4.5.1 Northern blot
DNA2:en geeniekspression tutkimiseksi soluista eristetyille RNA-näytteille suoritettiin agaroosi-elektroforeesi ja Northern-blottaus. Ennen geelin ajoa kaikki RNA-näytteiden kanssa kontaktissa olevat ajokammion osat puhdistettiin vetyperoksidiliuoksella. Geeliajossa käytettävä agaroosigeeli oli 0,8% agaroosia 1x MOPS-puskurissa (40 mM MOPS, 10 mM natriumasetaatti, 1 mM EDTA, pH 7,2), johon oli lisätty 5,5% formaldehydi. Agaroosigeelin valmistus ja kovettaminen tapahtui vetokaapissa.
Geeliajossa käytettävät RNA-näytteet valmistettiin pipetoimalla 2 µg eristettyä RNA- näytettä ja lisäämällä siihen RNAaasi-vapaata vettä, kunnes näytteen kokonaistilavuus oli 5,5 µl. 5,5 µl näytteeseen lisättiin 1 µl 10x MOPS, 3,5 µl formaldehydiä ja 10 µl formamidiä.
Näytettä kuumennettiin 65 °C 15 min, jonka jälkeen se jäähdytettiin nopeasti jäähauteessa.
Ennen geelille pipetoimista näytteisiin lisättiin 2 µl latausväriä (0,05% Bromofenolisininen 100% formamidissä). Markkerina käytettiin 2 µl RiboRuler High Range RNA ladder (Thermo Fisher Scientific, SM1821).
Ennen oikean ajon aloittamista kovettunut geeli oli esiajettu 15 min 60 V 1x MOPS- puskurissa (5.5% formaldehydi). Näytteiden ajo suoritettiin yön yli 30 V. Ajon jälkeen geeli huuhdottiin RNAaasi-vapaassa vedessä ja inkuboitiin sekoittajalla 20x SSC:ssä 20 min ajan.
Geeli blotattiin vetokaapissa Hybond-XL nylonmembraanille (GE Healthcare) kapillaariblottauksen avulla samoin kuin Southern blotissa. RNA:n kiinnittämiseksi saatu membraani kuivatettiin geelikuivaajassa 2 t, 80 °C. Hybridisaatioprosessi oli myös sama kuin Southern blotissa. Radioaktiivisessa leimauksessa käytetty koetin oli 2678 emäsparin mittainen sekvenssi DNA2:n koodaavan alueen loppupuolelta. Hybridisaation jälkeen membraani käärittiin ohueen muovikalvoon ja siirrettiin kuvannuskasettiin fosforilevyn kanssa 1-3 päiväksi riippuen radioaktiivisen signaalin voimakkuudesta. Fosforilevyn signaali analysoitiin ja kuvattiin fosforikuvantimella (Molecular Imager FX, Bio-Rad).
4.5.2 Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi
DNA2:en hiljentämisen onnistumisen selvittämiseksi eristetyille RNA-näytteille suoritettiin kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi (qPCR) SybrGreen:in kanssa käyttäen joko
27
Accustart II tai JumpStart PCR-mastermixejä. Kumpikin qPCR-menetelmä aloitettiin identtisellä käänteistranskriptiolla. Käänteistranskriptiota varten sekoitettiin 2 µl 5x qScript cDNA Supermix (Quantabio, 95048), 0,5 µg siRNA-käsiteltyä RNA-näytettä ja MilliQ-vettä, kunnes näytteen kokonaistilavuus oli 10 µl. RNA-näytteistä, joita ei ollut käsitelty siRNA:lla, valmistettiin kontrollinäytteet samalla metodilla. Suurimman RNA-pitoisuuden omaavasta kontrollinäytteestä valmistettiin myös standardisuora laimennossarjana (1-0,5-0,25-0,125- 0,0625-0). Latauskontrollina käytettiin beeta-aktiinia. Näytteiden käänteistranskriptio suoritettiin PCR-laiteella (5 min 20 °C, 30 min 42 °C, 5 min 85 °C, 4 °C).
JumpStart-menetelmää käytettäessä qPCR näytteet valmistettiin sekoittamalla 10 µl JumpStart 2x Mastermix (Sigma, P2893), 250 nM ensimmäistä alukeseosta (DNA2 2678- forward + DNA2 myc Xho-reverse tai DNA2 2678-forward + human DNA2 3164-reverse), 250 nM toista alukeseosta (human 28S 1259-forward + human 28S 2388-reverse tai human 18S 1259-forward + human 18S 2388-reverse), 1 µl SybrGreen (1:1000) ja 7 µl käänteiskopioinnista saatua näytettä + MilliQ-vettä per näytekaivo (20 µl kokonaistilavuus).
Jokaisesta näytteestä ja kontrollista tehtiin kolme kopiota ja standardisuorasta kaksi kopiota qPCR-levylle. Levy asetettiin qPCR-laitteeseen, jossa reaktio tapahtui (3 min 94 °C, 40 sykliä 20 s 94 °C, 20 s 58 °C, 30 s 72 °C).
Ajon päätyttyä laite tuotti reaktiokuvaajan, jota analysoimalla voitiin päätellä sekä qPCR-amplifikaation, että DNA2:en hiljentämisen onnistuminen. Jokaisen qPCR- reaktion syklin aikana levyn kaivoissa olevan DNA:n määrä kasvaa eksponentiaalisesti, samalla kasvattaen myös kaivoista mitattavan fluoresenssin määrää eksponentiaalisesti.
Koska qPCR-näytteet oli valmistettu solujen RNA:sta käänteiskopioinnin avulla, pystyttiin tämän avulla arvioimaan soluissa olleen lähetti-RNA:n määrää, ja täten DNA2:n hiljentymistä. siRNA-käsittely häiritsee DNA2:n koodauksesta vastaavan lähetti-RNA:n toimintaa, ja täten myös siRNA-käsiteltyjen solujen amplifikaatiokäyrän (fluoresenssin määrä) pitäisi nousta hitaammin kuin kontrollinäytteiden, joita ei ole käsitelty siRNA:lla.
Beeta-aktiini toimi vertailukohteena, koska aiemmin soluille suoritetuilla käsittelyillä ei ollut vaikutusta sen ilmenemiseen, ja täten vertaamalla RNA-näytteiden käänteiskopioinnissa syntyneen DNA:n määrää beeta-aktiinin käänteiskopioidun DNA:n määrään, voitiin selvittää, oliko DNA2 onnistuneesti hiljennetty. Tilastollinen merkittävyys selvitettiin Studentin kaksisuuntaisella ja heteroskedastisella t-testillä.
