mtDNA:n kopionumero-määrät - DNA2-hiljennettyjen solujen ddC-käsittely

5.4 DNA2-hiljennettyjen solujen ddC-käsittely

5.4.1 mtDNA:n kopionumero-määrät

Aiemmin ddC-käsiteltyjen solujen mitokondrio-DNA:n mahdolliset kopionumeromuutokset selvitettiin käyttäen samanlaisia metodeja kuin siRNA-käsittelyn vaikutusten tutkimisen yhteydessä. AriaMX-laitteesta saadut arvot analysoitiin Excelillä samaan tapaan kuin siRNA-vaikutusten tutkimisen aikana, ja tuloksista muodostettiin kuvaaja (Kuva 14). T-testin ja tulosten tarkastelun perusteella siRNA-käsittelyllä ei vaikuttaisi olevan tilastollisesti merkittävää vaikutusta solujen mtDNA:n kopionumeroon (Taulukko 4). Tutkimus kuitenkin osoitti ddC-käsittelyn aiheuttavan mtDNA:n määrän huomattavaa laskua, joka alkaa palautumaan hitaasti altistuksen loputtua. Tämä oli nähtävissä pudonneissa mtDNA-määrissä ddC:lle altistetuissa soluissa verrattuna käsittelemättömiin soluihin, sekä mtDNA:n määrien nousussa 24 ja 48 tunnin palautumisen jälkeen.

Kuva 14: Kuvaaja ddC-käsittelyn vaikutuksista mitokondrio-DNA:n kopionumeroon. Vaikka siRNA-käsittely ei vaikuttaisi suoraan vaikuttavan mtDNA:n kopionumeroon, on kuvaajassa huomattavissa selkeä pudotus mtDNA:n määrässä ddC-käsitellyissä soluissa verrattuna käsittelemättömiin soluihin. Kun solujen annettiin palautua 24 ja 28 tuntia ddC-käsittelystä, myös mtDNA:n määrä alkoi hitaasti palautua.

Taulukko 4: qPCR-analyysin arvoista muodostetut lopulliset keskiarvot ja keskihajonnat ddC+siRNA-käsittelyjen vaikutuksista solujen mtDNA:n kopionumeroihin.

Käsittelemättömien ja ddC-käsiteltyjen näytteiden välillä on havaittavissa suuri ja tilastollisesti merkittävä pudotus kopionumerossa (p-arvo 0,00534), mutta siRNA ei vaikuttaisi tuottavan tilastollisesti merkittävää eroa kopionumerossa. Käsittelemätön 2,20001 2,02947 0,21852 0,03492 0,30812 0,00534 ddC-käsitelty 0,64821 0,74550 0,03910 0,07527 0,14095

24t

palautuminen

0,98745 0,83294 0,02104 0,02697 0,00182 48t

palautuminen 1,16295 1,36394 0,04337 0,09921 0,05541

41 5.4.2 Topologia

DNA2:n hiljentämisen ja ddC:llä aiheutettujen vahinkojen vaikutuksia solujen mitokondrio-DNA:n topologiaan tutkittiin käyttäen samoja menetelmiä kuin aiemmissa siRNA-hiljennyksen vaikutuksia tutkivissa tutkimuksissa. Fosforilevyn intensiteettiarvot mitattiin, jonka jälkeen saatuja arvoja analysoitiin Excelillä (Kuva 15). Vertailukohtina toimivat jälleen katenaanien ja superkiertyneiden juosteiden määrien keskiarvot suhteessa relaksoituneiden renkaiden keskiarvoon niin kontrolli- kuin siRNA-käsitellyissä näytteissä (Taulukko 5).

Saaduista tuloksista muodostettiin kaksi kuvaajaa; katenaanien määrä vastaan relaksoituneiden renkaiden määrä (Kuva 16) ja superkiertyneiden juosteiden määrä vastaan relaksoituneiden renkaiden määrä (Kuva 17). Saaduissa kuvaajissa on havaittavissa ddC:n aiheuttama mtDNA:n relaksoituneiden juosteiden suhteellisen määrän lisääntyminen soluissa verrattuna sen muihin topologisiin muotoihin, ja tämä muutos jatkuu myös pitkään käsittelyn lopettamisen jälkeen. Tämä johtuu siitä, että ddC-käsittely pysäyttää suuren osan mtDNA:sta replikaatiovaiheeseen, jolloin se on avonainen ja relaksoitunut. DNA2:n hiljentämisellä ei puolestaan vaikuttaisi olevan vaikutusta topologisten muotojen ilmenemissuhteissa.

Kuva 15: Molecular Imager FX-kuvantajalla fosforilevystä tuotettu ddC-tutkimusten topologiamembraanin kuva. Kuvassa on nähtävissä selkeästi mtDNA:n erilaisia topologia muotoja, jotka ovat jakautuneet geeliajon aikana niiden koon perusteella. Nämä ovat katenaanit (A), relaksoituneet renkaat (B) ja superkiertyneet juosteet (C). Blotin tummuus kuvaa tietyssä kohdassa kuvaa siinä olevan DNA:n määrää.

Kuva 16: DNA2:n hiljentämisen ja ddC-käsittelyn vaikutus mtDNA:n katenaanien ja relaksoituineiden renkaiden topologisiin suhteisiin. Kuvaajassa on nähtävissä ddC:n aiheuttama katenaani-mtDNA:n määrän putoaminen käsittelemättömiin soluihin verrattuna.

Kuvaajassa on myös havaittavissa lievä muutos katenaanien ja relaksoituneiden renkaiden topologisissa suhteissa.

Kuva 17: DNA2:n hiljentämisen ja ddC-käsittelyn vaikutus mtDNA:n superkiertyneiden juosteiden ja relaksoituneiden renkaiden topologisiin suhteisiin. Kuten katenaanien ja relaksoituneiden renkaiden suhteiden tutkimuksessa, kuvaajassa on nähtävissä ddC:n aiheuttama superkiertyneiden mtDNA-juosteiden määrän lasku ddC-käsitellyissä soluissa.

Myös sen hidas palautuminen 48 tunnin aikana on havaittavissa. ddC aiheuttaa muutoksia myös superkiertyneiden juosteiden ja relaksoituneiden renkaiden topologisissa suhteissa.

Taulukko 5: Fosforilevyn mitatuista intensiteettiarvoista lasketut lopulliset keskiarvot, keskihajonnat ja Studentin t-testien tulokset ddC-tutkimusten eri näytteille. Taulukon ylemmät arvot saatiin vertailemalla katenaanien suhteita relaksoituneisiin renkaisiin, kun taas alemmat on laskettu superkiertyneiden juosteiden suhteista relaksoituneisiin renkaisiin. T-testien p-arvot on laskettu erikseen jokaiselle kontrolli/siRNA -parille jokaisen erilaisen käsittelyn/palautumisen osalta. T-testien tulokset molemmissa vertailuissa osoittavat, ettei siRNA-käsittely aiheuta tilastollisesti merkittävää pudotusta käsittelemättömiin soluihin verrattuna katenaanien ja superkiertyneiden juosteiden määrissä, pois lukien 24t palautumisen jälkeen katenaanien ja relaksoituneiden juosteiden suhteissa, sekä käsittelemättömissä soluissa superkiertyneiden ja relaksoituneiden juosteiden suhteissa.

5.4.3 2D-elektroforeesi

DNA2:n hiljentämisen ja mtDNA:n ddC:llä vaurioittamisen yhteisvaikutuksia mtDNA:n replikaatioon ja sen välituotteiden määriin selvitettiin käyttäen 2D-geelielektroforeesia.

Ihmisen OH-koettimella hybridisoitu 2D-geelimembraani kuvannettiin Biomax-filmille (Kuvat 18 ja 19). 2D-membraanin 1n-pisteiden intensiteettiarvot mitattiin fosforilevystä AriaMX-kuvantimella, jotta voitiin varmistua eri näytteiden tasaisista latausarvoista, tai selvittää mahdolliset epätasaiset lataukset. Saaduista filmeistä tutkittiin mahdolliset muutokset mitokondrio-DNA:n replikaatiossa. Saatujen kuvien perusteella pelkkä ddC-käsittely aiheuttaa replikaation laajaa pysähtymistä, kuten oli havaittavissa myös topologisissa tutkimuksissa.

Jos solujen DNA2 oli hiljennetty siRNA:lla, vaikuttaisi solujen altistaminen ddC:lle pysäyttävän suuren osan mitokondrion DNA:sta replikaatiovaiheeseen. Tämä on havaittavissa kasvaneena määränä RITOLS-välituotteita niissä 2D-filmien osissa, joiden solut oli käsitelty sekä ddC:llä, että siRNA:lla, sekä selkeämpänä y-kaarena. Niitä oli myös havaittavissa kasvaneissa määrin myös siRNA:lla käsitellyssä kontrollinäytteessä. Näitä

RNA-palasia lisätään mitokondrio-DNA:n replikaation aikana laahaavaan juosteeseen sen suojelemiseksi, ennen kuin ne korvautuvat pysyvästi uudella DNA-juosteella. Koska RITOLS-välituotteita oli havaittavissa selkeästi myös näytteissä, joita ei ollut ddC-käsitelty, mutta joiden DNA2 oli hiljennetty, tämä saattaa merkitä sitä, että DNA2:lla voisi olla rooli mtDNA:n replikaation aikana. Tämä mahdollinen tehtävä voi liittyä siihen mtDNA:n replikaation vaiheeseen, jolloin RITOLS-välituotteita sisältävä DNA:RNA muunnetaan todelliseksi kaksijuosteiseksi mtDNA:ksi. Niissä soluissa, jotka oli käsitelty ddC:llä, kasvanut RITOLS-määrä on selitettävissä DNA-polymeraasi γ:n estyneenä toimintana, jolloin se ei kykene muuntamaan RITOLS:ia kaksijuosteiseksi DNA:ksi. Tällöin myös DNA2:n mahdollinen hiljentäminen ei vaikuta RITOLS-välituotteiden esiintymiseen yhtä selkeästi, kuin soluissa, joita ei ollut käsitelty ddC:llä.

Kuva 18: 2D-geelielektroforeesifilmi dideoksysytidiinikäsittelyn (100 µM) vaikutuksista mitokondrio-DNA:n replikaatioon ja sen välituotteiden määriin. Filmi sisältää kontrollinäytteen, siRNA-käsitellyn kontrollinäytteen, ddC-käsitellyn näytteen, sekä ddC+siRNA-käsitellyn näytteen. Näytteissä, jotka oli käsitelty joko siRNA:lla, tai ddC:llä on havaittavissa hieman enemmän RITOLS-välituotteita (punaiset ympyrät) verrattuna soluihin, joiden DNA2:ta ei ollut hiljennetty siRNA:lla. Nämä viittaavat siihen, että iso osa mtDNA:sta on pysähtynyt replikaatiovaiheeseen. ddC-käsitellyissä näytteissä myös y-kaari vaikuttaisi olevan voimakkaampi, mikä myös viittaa mtDNA:n replikaation pysähtymiseen soluissa 1n-pisteiden alla olevat numerot ovat kyseisten 1n-pisteiden intensiteettiarvoja, joita käytettiin näytteiden latausmäärien arvioimiseksi.

Kuva 19: Toinen ddC-tutkimuksissa tuotetuista 2D-geelin filmeistä. Filmi sisältää 24 ja 48 tuntia ddC-käsittelystä palautuneet näytteet siRNA-käsiteltyinä ja ilman käsittelyä. Kuten toisessa filmissä, näytteissä, jotka oli käsitelty sekä siRNA:lla, että ddC:llä on havaittavissa hieman enemmän RITOLS-välituotteita (punaiset ympyrät). 48 tuntia palautuneessa näytteessä vaikuttaisi olevan puolet vähemmän ladattua DNA:ta verrattuna 48t + siRNA-näytteeseen, mikä selittäisi sen verrattaisen heikkouden filmillä. Tämä on nähtävissä 1n-pisteiden alla olevia latausarvoja vertaamalla.

47 5.5 DNA2-hiljennettyjen solujen UV-käsittely

Erilaisten stressi- ja vauriotilanteiden vaikutusten tutkimiseksi, DN2-hiljennettyjä soluja vaurioitettiin myös UV-valolla. UV-valon on todistettu altistavan solujen mtDNA:n normaalia suuremmalle oksidatiiviselle stressille, sekä lisäävän mtDNA:n mutageneesiä, joten se soveltuu hyvin näiden kokeiden soluviljelmien vaurioittamiseen (Berneburg ym. 1997, Pascucci ym. 1997). Osa soluviljelmistä altistettiin 30 sekunnin ajaksi ultraviolettisäteilylle (aallonpituus 302 nm). Altistuksen jälkeen UV-käsitellyn viljelmän solujen annettiin palautua 24 tuntia kasvatusmediumissa ennen näytteiden keräämistä. Kerättyjen näytteiden avulla selvitettiin mahdolliset DNA2:n hiljentämisen ja UV-vaurioiden korjauksen yhteisvaikutukset solujen mitokondrio-DNA:n topologiaan, 7S-DNA:n määrään, sekä replikaatioon.

5.5.1 Topologia

Topologiset tutkimukset suoritettiin samoin kuin ddC:n vaikutuksia tutkittaessa. Fosforilevyn intensiteetit mitattiin Molecular Imager FX-fosfokuvantimella ja siirrettiin Exceliin analysoitavaksi (Kuva 20). Mitokondrio-DNA:n topologisten suhteiden vertailukohteina toimivat superkiertyneiden juosteiden suhde relaksoituneisiin renkaisiin, sekä näiden kahden suhteet koko näytteen ajouran intensiteettiin. Näytteille laskettiin lopulliset keskiarvot ja keskihajonnat niin siRNA-käsitellyille, kuin käsittelemättömille näytteille ja saaduista tuloksista muodostettiin kolme kuvaajaa (Kuva 21). Lisäksi topologisten erojen merkittävyys selvitettiin Studentin t-testillä. Kuvaajien ja t-testien perusteella UV-käsittelyn ja DNA2:n hiljentämisen yhteisvaikutus ei aiheuta huomattavia muutoksia mtDNA:n topologiassa (Taulukko 6).

Kuva 20: Fosforilevykuvantimella tuotettu kuva UV-tutkimusten topologiageelistä. Geeliin on merkitty sekä relaksoituneiden renkaiden, että superkiertyneiden juosteiden sijainnit, joita käytettiin tutkimuksen vertailukohtina. Yksi juoste molemmissa kontrollinäytteissä oli heikommin ladattu muihin juosteisiin verrattuna, joka aiheutti kyseisten juosteiden vähäisen tummuuden.

Kuva 21: UV-käsittelyn ja DNA2:n hiljentämisen vaikutukset mtDNA:n eri topologisten muotojen suhteisiin. Kuvaajat on muodostettu suhteista, joissa vertailtiin relaksoituneiden renkaiden tummuusarvoa koko ajojuosteen tummuusarvoon (A), superkiertyneiden juosteiden tummuutta koko juosteeseen (B), sekä superkiertyneiden juosteiden suhdetta relaksoituneisiin renkaisiin (C). Kuvaajissa on havaittavissa lievää muutosta topologisissa suhteissa, kun vertailtiin superkiertyneiden juosteiden suhteita niin relaksoituneisiin renkaisiin kuin koko juosteeseen, mutta tämä ero ei ole Studentin t-testin mukaan tilastollisesti merkittävä. Lisäksi kaikkien kuvaajien osalta tulosten luotettavuuteen vaikuttaa negatiivisesti myös tulosten suuri keskihajonta. Tämä on havaittavissa kaikissa kuvaajissa jossain määrin, mutta erityisesti kuvaajan A kontrollinäytteiden keskiarvoissa.

Taulukko 6: Fosforilevyn intensiteettiarvoista lasketut lopulliset keskiarvot, keskihajonnat, sekä Studentin t-testien tulokset UV-käsittelyn topologisista vaikutuksista DNA2-hiljennetyissä soluissa. T-testien tulokset osoittavat, että kuvaajissa havaittavat lievät eroavaisuudet siRNA-käsiteltyjen ja käsittelemättömien solujen välisissä topologisissa suhteissa eivät ole tilastollisesti merkittäviä.

5.5.2 7S-DNA

7S-DNA:n suhteellinen määrä mitokondrio-DNA:sta selvitettiin samoin kuin siRNA-hiljennyksen vaikutuksia tutkittaessa. Fosforilevyn valottuminen kuvannettiin ja saadun kuvan mtDNA:n ja 7S-DNA:n intensiteettiarvot mitattiin jokaiselle näytteelle, jonka jälkeen saadut arvot siirrettiin Exceliin analysoitavaksi (Kuva 22). Jotta DNA2:n hiljentämisen ja UV-käsittelyn yhteisvaikutuksia 7S-DNA:n suhteelliseen määrään voitaisiin selvittää, verrattiin 7S-DNA:n tummuusarvoja mitokondrio-DNA:n tummuusarvoihin, jonka jälkeen saaduista keskiarvoista ja keskihajonnoista muodostettiin kuvaaja (Kuva 23). Kuvaajan ja Studentin t-testin perusteella ultraviolettivalon ja DNA2:n hiljennyksen yhteisvaikutuksilla ei vaikuttaisi olevan merkitystä 7S-DNA:n suhteelliseen määrään tai mtDNA:n vähenemiseen käsittelemättömiin soluihin verrattuna (Taulukko 7).

Kuva 22: Fosforikuvantimen tuottama kuva 7S-DNA –tutkimusten aikana valotetusta fosforilevystä. Näytesarjat vasemmalta oikealle: UV-käsittelemätön, mutta siRNA-käsitelty soluviljelmä, UV-käsittelemätön kontrolli, UV- ja siRNA-käsitelty viljelmä ja UV-käsitelty kontrolli. Alhaalla oleva tumma alue on geeliajon aikana ylempänä olevasta mitokondrio-DNA:sta erkaantunut 7S-DNA.

Kuva 23: Kuvaaja UV-käsittelyn ja DNA2:n hiljentämisen yhteisvaikutuksista soluviljelmien 7S-DNA:n suhteelliseen määrään mitokondrio-DNA:sta. Kuvaajan ja Studentin t-testien perusteella UV- ja siRNA-käsittelyjen yhteisvaikutus ei näyttäisi vaikuttavan solujen 7S-DNA:n määrään lainkaan. 7S-7S-DNA:n määrän lievä nousu siRNA:lla käsiteltyjen näytteiden välillä voidaan todennäköisesti selittää hieman poikkeavilla latauksilla geeliajon aikana, mutta ilman tätä selitystäkin ero ei ole tilastollisesti tarpeeksi merkittävä.

Taulukko 7: UV-tutkimusten 7S-geelin fosforilevyn lopulliset intensiteettien keskiarvot ja keskihajonnat kontrolli- ja siRNA-käsitellyille näytteille, joista tulosten kuvaajat muodostettiin. Lisäksi myös Studentin t-testin p-arvo, jonka mukaan poikkeamat tutkittujen solujen 7S ja mtDNA:n välisissä suhteissa eivät ole tilastollisesti merkittäviä.

Kontrollien keskiarvot

siRNA-käsiteltyjen keskiarvot

Kontrollien keskihajonnat

siRNA-käsiteltyjen keskihajonnat

T-testin p-arvo

Käsittelemätön 0,040503 0,038611 0,001869 0,003393 0,52133 UV-käsitelty 0,037404 0,046962 0,005611 0,002162

5.5.3 2D-elektroforeesi

Viimeinen koe UV-valon ja DNA2:n hiljentämisen yhteisvaikutusten tutkimiseksi oli selvittää näiden vaikutus solujen mitokondrio-DNA:n replikaatioon ja sen välituotteisiin. Molecular Imager FX-kuvantajalla tuotetusta kuvasta voitiin päätellä aiempien käsittelyjen yhteisvaikutukset mitokondrio-DNA:n replikaatioon ja sen välituotteiden määriin (Kuva 24).

Saadun kuvan perusteella UV-käsittelemättömien kontrolli- ja DNA2-hiljennettyjen näytteiden välillä ei ole eroavaisuuksia replikaatiossa tai sen välituotteiden määrissä. UV-käsitellyillä soluilla vaikuttaisi olevan enemmän replikaation välituotteita käsittelemättömiin näytteisiin verrattuna, mutta myöhemmin suoritettu 1n-pisteen tummuuden kvantifikaatio latausmäärien selvittämiseksi paljasti tämän johtuvan suuremmasta näytteen latausmäärästä verrattuna UV:lla käsittelemättömiin näytteisiin.

Kuva 24: UV-tutkimusten 2D-geelin membraani kuvannettuna fosforikuvantimella. Kuvassa olevat näytteet ovat käsitelty kontrolli (A), ja siRNA-käsitelty näyte (B), UV-käsittelemätön kontrolli (C) ja UV-UV-käsittelemätön, mutta siRNA-käsitelty näyte (D). Kuvan tummuuksien perusteella UV-käsittelemättömillä näytteillä ei vaikuttaisi olevan poikkeavuuksia mtDNA:n replikaatiossa ja sen välituotteiden määrissä. UV-käsitellyissä näytteissä vaikuttaisi olevan enemmän replikaation välituotteita ja selkeämmin havaittavat y-kaaret. Nämä seikat todistavat UV-altistuksen aiheuttavan valtaisaa replikaation pysähtymistä mtDNA:n replikaatiovaiheeseen. Niissä näytteissä, joiden DNA2 oli hiljennetty siRNA:lla, ei vaikuttaisi olevan erityisiä poikkeavuuksia muihin näytteisiin verrattuna. Näytteiden mitatut intensiteetit on ilmoitettu numeerisesti kunkin näytteen 1n-pisteen alla.

5.6 DNA2:n hiljenemisen tarkistus

Koska aiempien kokeiden tulosten perusteella vaikutti siltä, että DNA2:n hiljentäminen siRNA-käsittelyllä ei merkittävästi vaikuttanut solujen mitokondrio-DNA:n ylläpitoon edes stressi- ja vauriotilanteissa, haluttiin varmistua, oliko aiemmin käytettyjen solunäytteiden DNA2 todella hiljentynyt siRNA:n vaikutuksesta. Tätä koetta varten valmistettiin myös uusi soluviljelmä, joista osa oli käsitelty siRNA:lla. Kvantitatiivisella PCR-menetelmällä tuotettuja uusia keskiarvoja ja keskihajontoja kontrolli- ja siRNA-käsitellyille näytteille vertailtiin vanhojen näytteiden arvojen kanssa, jolloin lopputuloksena oli lopulliset keskiarvot ja

-53

hajonnat sekä uusille, että vanhoille näytteille (Taulukko 8). Saaduista tuloksista muodostettiin myös kaksi kuvaajaa, yksi uusille (Kuva 25) ja yksi vanhoille näytteille (Kuva 26).

Sekä kuvaajien, että tuloksille suoritettujen Studentin t-testien perusteella voidaan todeta jonkin menneen väärin DNA2:n hiljentämisessä vanhojen näytteiden kohdalla.

Vanhojen näytteiden kohdalla ei ole havaittavissa lainkaan eroavaisuuksia kontrolli- ja siRNA-näytteiden välillä, kun taas uusilla soluilla suoritetussa hiljentämisessä on selkeästi havaittavissa suuri pudotus DNA2:n määrässä siRNA-käsitellyissä näytteissä. Tämä puolestaan auttaa selittämään aiempien kokeiden siRNA-käsittelyn epätavallisen heikot vaikutukset. Se myös saattaa näiden kokeiden tulokset epäluotettavaan valoon, jossa ainoastaan ddC- ja UV-käsittelyjen suorat vaikutukset voidaan olettaa olevan oikein. On mahdollista, että aiempien soluviljelmien DNA2 oli hyvin vähäisesti hiljentynyt siRNA-käsittelyn seurauksena, mutta sen vaikutukset saatuihin tuloksiin ovat vähäiset.

Todennäköisintä kuitenkin on, että aiemmissa kokeissa käytettyjen solujen DNA2:n hiljennys oli kokonaan epäonnistunut tai tehoton jonkin käsittelyn aikana tapahtuneen virheen takia.

Taulukko 8: DNA2:n hiljenemisen varmistamiskokeiden tulosten lopulliset keskiarvot ja keskihajonnat, sekä t-testien tulokset, sekä vanhoista, että uusista solunäytteistä. T-testin p-arvot on muodostettu vertailemalla kontrollinäytteitä siRNA 1+2 käsiteltyihin soluihin (vanhat solut), tai vertailemalla kontrollinäytteitä sekä siRNA 1 ja 2 käsiteltyihin soluihin, että siRNA 1+2 käsiteltyihin soluihin. Uusissa soluissa on havaittavissa merkittävä pudotus DNA2:n määrässä siRNA-käsitellyissä soluissa kontrolliin verrattuna, jota myös t-testin tulos puoltaa verrattuna vanhoihin solunäytteisiin.

Kuva 25: DNA2:n suhteelliset määrät uuden soluviljelmän kontrolli ja siRNA-käsitellyissä näytteissä. Kuvaajassa on havaittavissa hyvin merkittävä pudotus solujen DNA2:n määrässä siRNA-käsittelyjen seurauksena. Tämä pudotus on yhtä merkittävä niin siRNA 1:n, siRNA 2:n, kuin myös niiden yhteisvaikutuksen seurauksena.

Kuva 26: Vanhojen siRNA-käsiteltyjen ja kontrollinäytteiden DNA2:n hiljenemisen tarkistus.

Kuvaajassa on havaittavissa, että DNA2:n suhteellinen määrä pysyy lähes identtisenä kontrolli- ja siRNA-käsiteltyjen näytteiden välillä. Tämä puolestaan viittaa siihen, että aiemmissa tutkimuksissa käytettyjen näytteiden DNA2:n hiljeneminen on epäonnistunut, tai se on erittäin vähäistä siRNA-käsittelystä huolimatta. Huomioitavaa on myös kontrollinäytteiden suuri keskihajonta.

6 TULOSTEN TARKASTELU

Alkuperäisen tutkimussuunnitelman tarkoituksena oli selvittää ihmisen DNA2:n väliaikaisen yliekspression mahdollisia vaikutuksia solujen mitokondrioiden DNA:n ylläpidossa ja korjauksessa. DNA2:n on aiemmissa tutkimuksissa havaittu olevan yliekspressoitunut

esimerkiksi haiman syöpäsoluissa (Kumar ym. 2017), mikä tekee sen muiden vaikutusten tutkimisesta mielenkiintoista sen ollessa yliekspressoitunut soluissa. Tutkimuksen aloittamisen ja alustavien yliekspressiokokeiden jälkeen kävi kuitenkin selväksi, ettei DNA2:n yliekspressio toiminut viljellyissä HEK 293-soluissa kuten oli aluksi suunniteltu.

Western blot-menetelmällä tuotetuissa filmeissä ainoa havaittu DNA2:n yliekspressio osoittautui plasmidisekvensoinnin päätteeksi olevan AIDA:n aiheuttama, eikä DNA2:n kuten oli alun perin toivottu. Tämän vuoksi tutkimuskohde vaihtui DNA2:n yliekspressiosta sen hiljentämisen vaikutusten tutkimiseen.

DNA2 on aiemmissa tutkimuksissa osoittautunut, että sillä on jokin rooli mtDNA:n ylläpidossa ja replikaatiossa (Zheng ym. 2008, Duxin ym. 2009). Tämän vuoksi sen hiljentämisellä siRNA-käsittelyllä pitäisi olla negatiivisia vaikutuksia näiden prosessien aikana. Tuntemattoman syyn takia kuitenkin myös DNA2:n hiljentämisessä siRNA:lla ilmeni myöhemmin ongelmia. Suoritettuja kokeita yhdisti kaikkia yksi asia; DNA2:n hiljentämisellä ei vaikuttanut olevan suurta vaikutusta yhdenkään kokeen tuloksiin verrattuna kokeiden hiljentämättömiin kontrollinäytteisiin. Kun DNA2:n hiljentämisen varmennus päätettiin suorittaa uudelleen sekä uusilla soluviljelmillä, että vanhoista viljelmistä eristetyillä näytteillä, paljastui ettei vanhojen solujen DNA2 ollut hiljentynyt lainkaan, tai vain hyvin vähäisissä määrin. Tämä tulos puolestaan antaa aihetta kyseenalaistaa aiemmin suoritettujen kokeiden tulokset, joihin DNA2:n hiljentämisellä olisi saattanut olla mahdollisia vaikutuksia. Tämän seurauksena ainoat kokonaan luotettavat tulokset, joita kokeet tuottivat, liittyvät ddC:n ja UV-valon aiheuttamiin muutoksiin mtDNA:ssa. Näiden vaurioitusmetodien yhteisvaikutukset siRNA-käsittelyn kanssa voivat myös mahdollisesti osittain pitää paikkaansa, mutta niiden kohdalla on huomioitava, että valtaosa havaittavista muutoksista on mitä todennäköisimmin vaurioituksen aikaansaamaa, eikä DNA2:n hiljenemisen syytä. Vaikka oletettaisiin, että DNA2 olisi edes hieman hiljentynyt siRNA-käsittelyn seurauksena, ei sillä ollut havaittavaa, saatikka merkittävää vaikutusta soluviljelmien mtDNA:n topologiaan, kopionumeroon tai 7S-DNA:n suhteellisiin määriin.

Suoritetuissa kokeissa oli kuitenkin havaittavissa vaikutuksia solujen mtDNA:ssa, jotka oli altistettu joko ddC:lle tai UV-valolle. Tutkimuksissa paljastui ddC:n haitallinen vaikutus mtDNA:n replikaation aikana, jossa sen olemassaolo soluissa esti polymeraasi γ:n toiminnan, täten pysäyttäen suuren osan mitokondrioiden DNA:sta replikaatiovaiheeseen, mikä oli havaittavissa niin 2D-geelien analyyseissä, kuin mtDNA:n topologisten suhteiden tutkimuksissa. 2D-geelien näytteissä, jotka oli käsitelty ddC:llä esiintyi suuri määrä

RITOLS-56

välituotteita, jotka eivät kykene muuttumaan kaksijuosteiseksi DNA:ksi ilman polymeraasi γ:n toimintaa. Myös kyseisten geelien y-kaari tuotti voimakkaan signaalin, mikä myös viittaa replikaation pysähtymiseen ddC:n ollessa läsnä soluissa. Topologisten suhteiden osalta ddC-altistus lisäsi relaksoituneiden renkaiden suhteita niin katenaaneihin kuin superkiertyneisiin juosteisiin huomattavasti, joka myös on merkki replikaation pysähtymisestä. mtDNA relaksoituu ja avautuu replikaatiota varten, minkä ddC-altistus pysäyttää, johtaen relaksoituneiden mtDNA:n muotojen määrän kasvuun näytteissä. Samanlaisia ilmiöitä on havaittu myös aikaisemmissa tutkimuksissa, joissa soluviljelmiä on altistettu ddC:lle (Torregrosa-Muñumer ym. 2015, Torregrosa-Muñumer ym. 2017). Huomioitavaa havainto replikaatiotutkimuksissa oli havaittavissa näytteessä, joka oli käsitelty siRNA:lla, mutta ei ddC:llä. Tässä kyseisessä näytteessä oli havaittavissa kasvaneissa määrin samoja RITOLS-välituotteita, kuin ddC-käsitellyissä soluissa, mikä viittaisi siihen, että DNA2:n hiljentäminen olisi onnistunut kyseisen näytteen kohdalla edes osittain. Koska kyseinen ilmiö ei voi aiheutua polymeraasi γ:n toimimattomuudesta, saattaa se merkitä sitä, että DNA2:lla olisi jonkinlainen rooli mtDNA:n RITOLS-välituotteiden muuttamisessa kaksijuosteiseksi mtDNA:ksi yhdessä polymeraasi γ:n kanssa.

Kokeiden perusteella solujen UV-käsittelyllä ei vaikuttaisi olevan merkittävää vaikutusta solujen mtDNA:n topologisten muotojen suhteisiin tai sen 7S-DNA:n määriin.

UV-altistus tuotti kuitenkin havaittavia muutoksia mtDNA:n replikaatioon, jotka näkyivät 2D-geeleillä. UV-altistettujen solunäytteiden geeleissä oli havaittavissa suurta mtDNA:n replikaation pysähtymistä, joka oli nähtävissä kasvaneina määrinä replikaation erilaisia välituotteita. Samanlaisia vaikutuksia on myös aiemmin havaittu mtDNA:n replikaatiossa, jos soluja oli altistettu UV-valolle (Torregrosa-Muñumer ym. 2019). UV-kokeiden aikana solujen siRNA-käsittely ei tuottanut mitään havaittavia muutoksia mtDNA:n tutkituissa ominaisuuksissa.

7 JOHTOPÄÄTÖKSET

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää ihmisen DNA2-nukleaasi-helikaasin hiljentämisen tai yliekspression vaikutuksia solujen vahingonkorjaukseen, replikaation uudelleenkäynnistämiseen ja replikaatioon tutkimalla niiden mitokondrio-DNA:ta. Koska solujen DNA2:n yliekspressoiminen osoittautui haasteelliseksi, suoritettiin soluille sen sijaan DNA2:n hiljentäminen käyttäen sen tuotantoa häiritseviä pieniä RNA-palasia, siRNA:ta.

DNA2:n hiljentäminen siRNA:lla kuitenkin suurilta osin epäonnistui ja tämän vuoksi saadut tulokset ovat DNA2:n hiljentämisen vaikutusten osalta epäluotettavia.

Suoritetut tutkimukset eivät kuitenkaan jääneet kokonaan ilman hyödyllisiä tuloksia.

Sekä ddC-, että UV-käsittelyillä näyttäisi erinäisten suoritettujen kokeiden perusteella olevan haitallisia vaikutuksia solujen mitokondrio-DNA:han, joita oli havaittu myös aiemmin suoritetuissa tutkimuksissa liittyen mtDNA:han. UV-valolle altistaminen aiheutti soluviljelmissämme mtDNA:n replikaation suurta pysähtymistä, mutta se ei vaikuttanut muuten mtDNA:n tutkittuihin ominaisuuksiin. Samanlaisia vaikutuksia oli havaittavissa soluissa, jotka oli käsitelty ddC:llä. Replikaatio mitokondrioiden DNA:ssa pysähtyi suurelta osin, samalla jättäen jälkeensä suuria määriä RITOLS-välituotteita. ddC-käsittely aiheutti myös mtDNA:n topologian muuttumista suurelta osin relaksoituneiksi renkaiksi, jotka ovat sen yleinen muoto replikaation aikana. Nämä tulokset UV-valon ja ddC-käsittelyn osalta tukevat aiemmin tuotettua tutkimustietoa niiden vaikutuksesta mtDNA:n replikaatioon.

Tutkimusten aikana paljastui kuitenkin yksi mielenkiintoinen ilmiö, joka saattaisi viitata DNA2:n hiljentymisen onnistumiseen ddC-kokeiden aikana. Näytteessä, jonka DNA2 oli oletettavasti hiljentynyt siRNA-käsittelyn seurauksena, oli havaittavissa kasvaneita määriä RITOLS-välituotteita, joita oli nähtävissä myös ddC-käsitellyissä näytteissä. Koska solujen altistaminen ddC:lle estää polymeraasi γ:n toiminnan, saa se aikaan mtDNA:n replikaation pysähtymisen ja RITOLS-välituotteiden määrän kasvun, koska polymeraasi γ:lla on tärkeä osa niiden käsittelyssä. Tämä ddC:n aiheuttama RITOLS:ien määrän lisääntyminen normaalisti peittää allensa mahdolliset DNA2:n hiljentämisestä aiheutuvat muutokset RITOLS-määrissä, mikä puolestaan antaa olettaa, että DNA2:lla olisi jokin merkittävä rooli näiden välituotteiden käsittelyssä, koska niitä oli havaittavissa myös ddC-käsittelemättömissä, mutta DNA2-hiljennetyissä soluissa. Mitä todennäköisimmin tämä mahdollinen rooli on toimia yhdessä polymeraasi γ:n kanssa mtDNA:n replikaation vaiheessa, jossa yksijuosteiseen ja avautuneeseen mtDNA:han liittynyt RITOLS muunnetaan kaksijuosteiseksi mtDNA:ksi.

Koska kasvaneita DNA2-määriä on havaittu esimerkiksi haiman syöpäsoluissa, antaa tämä tutkimuksissa paljastunut tieto lisää luotettavuutta olettamukselle, että DNA2:lla on tärkeä

In document DNA2-nukleaasi-helikaasin vaikutus mitokondrio-DNA:n toiminnassa ja korjauksessa (sivua 42-0)