HEK 293-soluja transfektoitiin erilaisilla plasmideilla, jotta voitin selvittää, mitkä konstrukteista toimisivat yliekspression tuottamiseksi. Toimivaksi todetuista plasmidikonstrukteista voitaisiin luoda vakaita, kasvatettavia solulinjoja jatkotutkimuksia varten. Tämä mahdollinen yliekspressio oli havaittavissa Western blot-menetelmää käyttämällä. Ihmisen DNA2-polypeptidi on painoltaan noin 120 kilodaltonia, joten sen kuuluisi tuottaa yliekspressiossa filmillä selvästi havaittava signaali vasta-ainekäsittelyjen jälkeen. Markkerina käytetty PageRuler Plus tuotti geeliajon aikana asteikon, jossa DNA2:n pitäisi olla havaittavissa 110 ja 130 kDa:n välisellä alueella, mikäli yliekspressio on tapahtunut. Tämä analyysi suoritettiin useille erilaisille ekspressiokonstrukteille (pcDNA5/TO DNA2-1xflag, pcDNA5/TO MTS-DNA2-1xflag ja pcDNA5/TO MTS-DNA2-3xflag) käyttäen useita erilaisia, sekä jäniksessä että hiiressä tuotettuja, vasta-aineita ja niiden laimennoksia (Kuvat 6 ja 7). Käytetyissä plasmideissa oli osana niiden sekvenssiä joko 1x tai 3x flag-tag. Tämä flag-tag kyettiin havaitsemaan Western blot-menetelmän aikana käsittelemällä saatuja membraaneja flag-tag:in tunnistavilla vasta-aineilla. Lisäksi kahdesta käytetystä flag-tag:in omaavista plasmideista oli olemassa tuotetun proteiinin mitokondrioon ohjautumista ohjaavan sekvenssin MTS (mitochondrial targetting sequence) sisältävä versio.
Transfektiossa käytettyjen plasmidien sekvenssit varmistettiin lähettämällä niistä tehdyt näytteet sekvensointipalveluita tarjoavalle yritykselle (LightRun Sequencing Service, Eurofins Genomics). Kaikki muut plasmidit osoittautuivat omaavan oikean sekvenssin, paitsi pcDNA5/TO MTS-DNA2-3xflag, joka paljastui tuottavan adhesiiniproteiini AIDA:aa (adhesin involved in diffuse adherence), joka kyettiin havaitsemaan Western blot-filmillä.
AIDA jakaa saman flag-tag:in muiden käytettyjen plasmidien kanssa, jolloin se myös se oli havaittavissa käytettyjen flag-tag vasta-aineiden seurauksena.
Useiden erilaisten konstruktien ja vasta-ainekokeilujen jälkeen kävi selväksi, että DNA2:n yliekspressoiminen HEK-soluissa ei onnistunut. Yksikään Western blot-menetelmällä tuotettu filmi ei osoittanut DNA2:n yliekspressiota, ja ainoa merkittävä havainto osoittautui plasmidianalyysin jälkeen olevan AIDA:n aiheuttama. Koska DNA2:n
32
yliekspressoiminen ei ollut tämän tutkimuksen aikana mahdollista, vaihdettiin tutkimuksen tavoitteeksi selvittää DNA2:n hiljentämisen vaikutuksia stressin ja vahingonkorjauksen aikana.
Kuva 6: Kaksi Western blot-menetelmällä tuotettua filmiä DNA2:n yliekspressiotutkimuksista. Membraanit oli käsitelty primääristen vasta-aineiden rabbit anti-actin (A) ja rabbit anti-flag (B) 1:2000 laimennoksilla, sekä sekundäärisen vasta-aineen goat-anti-rabbit IgG HRP 1:15000 laimennoksella. Anti-actin vasta-ainetta käytettiin latauskontrollina selvittämään proteiinien latausmääriä. Ensimmäinen kuva sisältää kontrollien ja konstruktien lisäksi myös 42 tuntia aiemmin käsitellyn membraanin puhdistetut ja uudelleen vasta-ainekäsitellyt näytteet. Membraaneilla olevat proteiinit kulkevat geeliajon aikana painostaan riippuvan matkan, jonka pituutta markkeriin vertaamalla voidaan kyseinen proteiini selvittää. Filmeillä ei ole havaittavissa DNA2:n yliekspressiota 110-130 kDa:n välisellä alueella, mutta virheellisen plasmidin tuottama AIDA on havaittavissa noin 70 kDa:n kohdalla tummempina alueina kummassakin filmissä (punaiset nuolet). Lisäksi yhdessä filmin A näytteessä vaikuttaisi olevan DNA2:n hajoamistuotteita noin 70 kDa:n kohdalla (sininen nuoli).
Kuva 7: Western blot-menetelmällä tuotettu filmi DNA2:n yliekspressiotutkimuksista.
Membraani oli käsitelty primäärisen vasta-aineen mouse anti-flag 1:2000 laimennoksella ja sekundäärisen vasta-aineen goat-anti-mouse IgG 1:5000 laimennoksella. Filmin kolme ensimmäistä näytettä olivat kontrolleja ja kolme seuraavaa pcDNA5/TO DNA2-1xflag, pcDNA5/TO MTS-DNA2-1xflag ja pcDNA5/TO MTS-DNA2-3xflag-plasmideilla transfektoituja yliekspressiokonstrukteja. Soluissa ei ole havaittavissa DNA2:n yliekspressiota 110-130 kDa:n välisellä alueella.
33 5.2 293TREx-solujen DNA2-ekspressio
293TREx-soluviljelmiä oli transfektoitu pcDNA5 FRT/TO MTS-DNA2-myc- ja pOG44-plasmideilla ja onnistuneesti geenimuokatut solut oli eroteltu antibioottivalinnalla hygromysiiniä ja blastisidiiniä käyttäen. Syntyneen solulinjan DNA2-ekspressio oli mahdollista indusoida lisäämällä kasvatusmediumiin doksisykliini-antibioottia. DNA2:n doksisykliinin aiheuttama indusoituminen pystyttiin varmistamaan, kun Western blot-menetelmän tuottamalla filmillä oli havaittavissa voimakas tummuminen 110-130 kDa:n välisellä alueella PageRuler Plus-proteiinimarkkerin asteikossa niissä näytteissä, jotka oli käsitelty doksisykliinillä (Kuva 8). Induktioon käytettävän doksisykliinin konsentraatio kasvatusmediumissa oli 10 ng/ml.
Kuva 8: Western blot-menetelmällä tuotettu filmi transfektoitujen 293TREx-solujen induktiotutkimuksista. Membraani oli käsitelty primäärisen vasta-aineen mouse anti-myc 1:15000 laimennoksella ja sekundäärisen vasta-aineen goat-anti-mouse IgG 1:8000 laimennoksella. Kuvassa on havaittavissa doksisykliinillä käsitellyistä soluista eristetty proteiininäyte (vasemmalla) ja käsittelemätön kontrollinäyte (oikealla). Kuvassa on nähtävissä 110 kDA ja 130 kDA väliin jäävä tumma alue doksisykliininäytteessä, jota ei ole nähtävissä kontrollinäytteessä (punainen nuoli). Tämä tumma alue on noin 120 kDa:n suuruinen DNA2-proteiini, joka todistaa induktion onnistuneen.
34 5.3 DNA2:n hiljentäminen siRNA-transfektiolla
Ennen kuin soluja vaurioitettiin tai stressattiin, haluttiin selvittää pelkän DNA2:n hiljentämisen vaikutus solujen mitokondrio-DNA:n kopionumeroon, 7S-DNA:n määrään, sekä sen topologiaan. Näitä tutkimuksia varten HEK 293-soluviljemiä oli transfektoitu siRNA:lla DNA2:n hiljentämiseksi. Itse tutkimukset suoritettiin käyttäen Southern blot-menetelmää sekä topologian, että 7S-DNA:n määrän selvittämiseen, kun taas kopionumerotutkimukset suoritettiin hyödyntäen kvantitatiivista reaaliaikaista PCR-analyysiä.
Kopionumeroanalyysiin käytetty qPCR suoritettiin käyttäen kahteen eri fluoresoivaan väriin (FAM ja HEX) pohjautuvaa Taqman-menetelmää, jossa toisen värin fluoresenssi mittaa DNA-näytteen tuma-DNA:n määrää ja toinen mtDNA:n määrää. Laite mittaa reaktiosyklien aikana syntyvän fluoresenssin ja tuottaa sen noususta kuvaajan, samalla laskien eri näytteiden DNA-määrät standardisuoraa käyttäen (Kuva 9). Koska solun tuma sisältää kaksi kopiota jokaisesta sen geenistä, voidaan mtDNA:n suhteellinen kopionumeromäärä soluissa selvittää vertaamalla sen laskettua määrää tuman DNA:n laskettuun kopionumeroon.
Kuva 9: AriaMX qPCR-laitteen tuottama amplifikaatiokuvaaja kopionumerotutkimuksista.
Ylempi kuvaaja näyttää näytteiden nousevan fluoresenssin määrän. Vasemmalla on tuman DNA:n fluoresenssi ja oikealla mtDNA:n fluoresenssi. Alempi kuvaaja on kummallekin väriaineelle (FAM ja HEX) vertailukohtana toimiva standardisuora.
35
Saadut tulokset siirrettiin ja analysoitiin käyttäen Excel-taulukkolaskentaohjelmaa. AriaMx -ohjelma ilmoittaa amplifikaation Cq (∆R) -arvona ja kunkin näytteen DNA:n määrän nanogrammoina. Jokainen näyte oli mitattu kolmeen kertaan kolmesta kopiosta. Saadut mtDNA:n määrät jaettiin saman näytteen tuman DNA:n määrillä ja näin saatujen arvojen keskiarvo laskettiin jokaiselle näytteelle. Saatujen keskiarvojen uudet keskiarvot ja näiden keskihajonta laskettiin, jotta saatiin selville sekä negatiivikontrollien ja siRNA:lla käsiteltyjen näytteiden tulosten lopulliset keskiarvot ja niiden keskihajonta (Taulukko 1). Saaduista tuloksista muodostettiin kuvaaja (Kuva 10) ja tuloksille suoritettiin kaksisuuntainen ja heteroskedastinen t-testi tulosten merkittävyyden selvittämiseksi.
siRNA:lla käsitellyissä näytteissä oli havaittavissa marginaalinen mtDNA:n kopionumeron pudotus verrattuna negatiivikontrolleihin, mutta t-testin tuloksen 0,398131 mukaan eroa ei voida pitää tilastollisesti merkittävänä. Täten pelkällä DNA2:n hiljentämisellä ja siRNA-käsittelyllä ei vaikuttaisi olevan vaikutusta mtDNA:n kopionumeroon.
Taulukko 1: Kopionumeroanalyysin tulokset siRNA-käsittelyn vaikutuksista mtDNA:n kopionumeroon. Jokaisen näytteen keskiarvoista muodostettiin lopullinen keskiarvo ja sen keskihajonta ja saaduille tuloksille suoritettiin Studentin t-testi.
Negatiivikontrollien keskiarvo
siRNA 1+2 näytteiden
keskiarvo
Negatiivikontrollien keskihajonta
siRNA 1+2 näytteiden keskihajonta
T-testin p-arvo
0,937233133 0,90684083 0,043844526 0,033627691 0,3981
36
Kuva 10: Negatiivikontrolli- ja siRNA-käsiteltyjen näytteiden mtDNA:n kopionumeroiden keskiarvot sekä keskihajonnat. Kuvaajan pylväät ovat lähes identtiset kopionumeron osalta molemmissa näytteissä, joten siRNA-käsittelyllä ei ole vaikutusta solujen mtDNA:n kopionumeroon.
Southern blot-menetelmällä tuotetut 7S- ja topologiamembraanit hybridisoitiin käyttäen radioaktiivisiksi leimattuja koettimia. Radioaktiivinen signaali valotettiin fosforilevylle ja levy kuvannettiin käyttäen Molecular Imager FX-kuvantajaa. Saadusta kuvasta pystyttiin laitteen omaa ohjelmistoa käyttäen mittaamaan eri näytteiden signaalien vahvuuksia, joita keskenään vertailemalla pystyttiin selvittämään DNA2:n hiljentämisen vaikutus 7S-DNA:n määrään soluissa, sekä sen mahdollinen vaikutus mtDNA:n topologiaan (Kuva 11). 7S-kokeessa vertailukohteina olivat geeliajossa pidemmän matkan kulkenut 7S-DNA:n signaalin voimakkuuteen verrattuna ylempänä geelissä olevan mtDNA:n voimakkuuteen. Saaduista tuloksista muodostettiin kuvaaja, josta voitiin havaita vain hyvin marginaalinen pudotus 7S-DNA:n määrässä siRNA:lla käsitellyissä soluissa (Kuva 12), mutta kontrollinäytteiden suuri keskihajonta on myös huomioitavaa. Studentin t-testin p-arvo 0,59637 paljasti, ettei ero ole tilastollisesti merkittävä (Taulukko 2). Täten DNA2:n hiljentämisellä ei vaikuttaisi olevan merkittävää vaikutusta solujen 7S-DNA:n määrään ilman ulkoisia stressi- tai vauriotekijöitä.
7S-tutkimuksia varten valmistettu fosforimembraani kuvannettiin ja saadun kuvan arvoja vertailemalla muodostettiin kuvaaja DNA2:n hiljentämisen vaikutuksista 7S-DNA:n määrään (Kuva 12). DNA2:n hiljentämisen vaikutus mtDNA:n topologiaan selvitettiin vertailemalla katenaanien ja superkiertyneiden juosteiden määriä suhteessa relaksoituneiden
37
renkaiden määrään, ja laskemalla näille keskiarvot ja keskihajonta samaan tapaan kuin 7S-tutkimuksissa (Taulukko 3). Saaduista arvoista muodostettiin kuvaaja ja niille suoritettiin Studentin kaksisuuntainen t-testi (Kuva 13). Sekä kuvaaja että t-testi osoittivat, että solujen topologiassa oli havaittavissa vain hyvin lievää muutosta DNA2:n hiljentämisen jälkeen ja ettei muutos ole tilastollisesti merkittävä.
Kuva 11: Molecular Imager FX-kuvantajalla fosforilevyistä tuotetut 7S- (A) ja topologiamembraanien (B) kuvat. Kontrolli- ja siRNA-käsitellyt näytteet on analysoitu kolmena kopiona. Tummat alueet ovat geeliajon aikana niiden suuruudesta riippuvan matkan verran kulkeneita DNA-juosteita.
Kuva 12: 7S-tutkimuksista saatujen tummuusarvojen keskiarvoista muodostettu kuvaaja.
Kuvaajasta on havaittavissa lievä ero kontrollinäytteiden ja siRNA:lla käsiteltyjen näytteiden 7S-DNA:n määrässä, mutta ero ei ole tilastollisesti merkittävä. Huomioitavaa on myös kontrollinäytteiden suuri keskihajonta.
38
Taulukko 2: Kontrolli- ja siRNA-käsiteltyjen näytteiden lopulliset keskiarvot, keskihajonnat ja Studentin kaksisuuntaisen, heteroskedastisen t-testin tulokset 7S-DNA -tutkimuksista.
Negatiivikontrollien
0,16273 0,12536 0,09901 0,04483 0,59637
Kuva 13: Topologiatutkimuksista saatujen tummuusarvojen keskiarvoista muodostettu kuvaaja. Sekä katenaaneissa, että superkiertyneiden juosteiden määrässä verratuna relaksoituneisiin renkaisiin on havaittavissa hyvin pieni pudotus siRNA:lla käsitellyissä näytteissä kontrolleihin verrattuna. Ero ei kuitenkaan ole tilastollisesti merkittävä ja lisäksi katenaanien osalta siRNA-käsiteltyjen näytteiden keskihajonta on suurta, joka myös vaikuttaa tuloksiin.
Taulukko 3: Topologiatutkimusten tulosten lopulliset keskiarvot ja keskihajonnat, sekä Studentin t-testien tulokset kontrolli- ja siRNA-käsitellyille näytteille
Kontrollien
relaksoituneet 1,0672 0,96070 0,17814 0,43794 0,72561 Superkiertyneet
vs
relaksoituneet
0,44679 0,38595 0,14493 0,14579 0,63521
39 5.4 DNA2-hiljennettyjen solujen ddC-käsittely
Koska pelkästään DNA2:n hiljentämisellä siRNA:lla ei vaikuttaisi olevan merkittävää vaikutusta mitokondrio-DNA:n ylläpitoon, täytyi soluja vaurioittaa ja stressata mahdollisten korjausvaikutusten tutkimiseksi. 2,3-dideoksysytidiini (ddC) oli ensimmäinen mtDNA:n vaurioittamiseen käytettävä kemikaali, ja sen vaikutuksia soluihin tutkittiin analysoimalla solujen mtDNA:n kopionumeroa, topologiaa ja replikaation välituotteita. ddC, joka tunnetaan myös sen kaupallisella nimellä Zalcitabine, on yksi monista HIV-infektion hoidossa käytettävistä nukleosidi-käänteistranskriptaasi-inhibiittoreista (Nucleoside reverse transcriptase inhibitor, NRTI), ja sen toiminta perustuu sen kykyyn estää HI-viruksen RNA:n käänteiskopiointi uudeksi DNA:ksi, ja täten sen lisääntyminen (Young M, 2017). Sen on kuitenkin havaittu aiheuttavan esimerkiksi mtDNA:n määrän laskua soluissa ja HIV-potilaissa häiritsemällä mitokondrioiden polymeraasi γ:n toimintaa (Dalakas ym. 2001, Rocher ym.
2008).
5.4.1 mtDNA:n kopionumero-määrät
Aiemmin ddC-käsiteltyjen solujen mitokondrio-DNA:n mahdolliset kopionumeromuutokset selvitettiin käyttäen samanlaisia metodeja kuin siRNA-käsittelyn vaikutusten tutkimisen yhteydessä. AriaMX-laitteesta saadut arvot analysoitiin Excelillä samaan tapaan kuin siRNA-vaikutusten tutkimisen aikana, ja tuloksista muodostettiin kuvaaja (Kuva 14). T-testin ja tulosten tarkastelun perusteella siRNA-käsittelyllä ei vaikuttaisi olevan tilastollisesti merkittävää vaikutusta solujen mtDNA:n kopionumeroon (Taulukko 4). Tutkimus kuitenkin osoitti ddC-käsittelyn aiheuttavan mtDNA:n määrän huomattavaa laskua, joka alkaa palautumaan hitaasti altistuksen loputtua. Tämä oli nähtävissä pudonneissa mtDNA-määrissä ddC:lle altistetuissa soluissa verrattuna käsittelemättömiin soluihin, sekä mtDNA:n määrien nousussa 24 ja 48 tunnin palautumisen jälkeen.
40
Kuva 14: Kuvaaja ddC-käsittelyn vaikutuksista mitokondrio-DNA:n kopionumeroon. Vaikka siRNA-käsittely ei vaikuttaisi suoraan vaikuttavan mtDNA:n kopionumeroon, on kuvaajassa huomattavissa selkeä pudotus mtDNA:n määrässä ddC-käsitellyissä soluissa verrattuna käsittelemättömiin soluihin. Kun solujen annettiin palautua 24 ja 28 tuntia ddC-käsittelystä, myös mtDNA:n määrä alkoi hitaasti palautua.
Taulukko 4: qPCR-analyysin arvoista muodostetut lopulliset keskiarvot ja keskihajonnat ddC+siRNA-käsittelyjen vaikutuksista solujen mtDNA:n kopionumeroihin.
Käsittelemättömien ja ddC-käsiteltyjen näytteiden välillä on havaittavissa suuri ja tilastollisesti merkittävä pudotus kopionumerossa (p-arvo 0,00534), mutta siRNA ei vaikuttaisi tuottavan tilastollisesti merkittävää eroa kopionumerossa. Käsittelemätön 2,20001 2,02947 0,21852 0,03492 0,30812 0,00534 ddC-käsitelty 0,64821 0,74550 0,03910 0,07527 0,14095
24t
palautuminen
0,98745 0,83294 0,02104 0,02697 0,00182 48t
palautuminen 1,16295 1,36394 0,04337 0,09921 0,05541
41 5.4.2 Topologia
DNA2:n hiljentämisen ja ddC:llä aiheutettujen vahinkojen vaikutuksia solujen mitokondrio-DNA:n topologiaan tutkittiin käyttäen samoja menetelmiä kuin aiemmissa siRNA-hiljennyksen vaikutuksia tutkivissa tutkimuksissa. Fosforilevyn intensiteettiarvot mitattiin, jonka jälkeen saatuja arvoja analysoitiin Excelillä (Kuva 15). Vertailukohtina toimivat jälleen katenaanien ja superkiertyneiden juosteiden määrien keskiarvot suhteessa relaksoituneiden renkaiden keskiarvoon niin kontrolli- kuin siRNA-käsitellyissä näytteissä (Taulukko 5).
Saaduista tuloksista muodostettiin kaksi kuvaajaa; katenaanien määrä vastaan relaksoituneiden renkaiden määrä (Kuva 16) ja superkiertyneiden juosteiden määrä vastaan relaksoituneiden renkaiden määrä (Kuva 17). Saaduissa kuvaajissa on havaittavissa ddC:n aiheuttama mtDNA:n relaksoituneiden juosteiden suhteellisen määrän lisääntyminen soluissa verrattuna sen muihin topologisiin muotoihin, ja tämä muutos jatkuu myös pitkään käsittelyn lopettamisen jälkeen. Tämä johtuu siitä, että ddC-käsittely pysäyttää suuren osan mtDNA:sta replikaatiovaiheeseen, jolloin se on avonainen ja relaksoitunut. DNA2:n hiljentämisellä ei puolestaan vaikuttaisi olevan vaikutusta topologisten muotojen ilmenemissuhteissa.
Kuva 15: Molecular Imager FX-kuvantajalla fosforilevystä tuotettu ddC-tutkimusten topologiamembraanin kuva. Kuvassa on nähtävissä selkeästi mtDNA:n erilaisia topologia muotoja, jotka ovat jakautuneet geeliajon aikana niiden koon perusteella. Nämä ovat katenaanit (A), relaksoituneet renkaat (B) ja superkiertyneet juosteet (C). Blotin tummuus kuvaa tietyssä kohdassa kuvaa siinä olevan DNA:n määrää.
42
Kuva 16: DNA2:n hiljentämisen ja ddC-käsittelyn vaikutus mtDNA:n katenaanien ja relaksoituineiden renkaiden topologisiin suhteisiin. Kuvaajassa on nähtävissä ddC:n aiheuttama katenaani-mtDNA:n määrän putoaminen käsittelemättömiin soluihin verrattuna.
Kuvaajassa on myös havaittavissa lievä muutos katenaanien ja relaksoituneiden renkaiden topologisissa suhteissa.
Kuva 17: DNA2:n hiljentämisen ja ddC-käsittelyn vaikutus mtDNA:n superkiertyneiden juosteiden ja relaksoituneiden renkaiden topologisiin suhteisiin. Kuten katenaanien ja relaksoituneiden renkaiden suhteiden tutkimuksessa, kuvaajassa on nähtävissä ddC:n aiheuttama superkiertyneiden mtDNA-juosteiden määrän lasku ddC-käsitellyissä soluissa.
Myös sen hidas palautuminen 48 tunnin aikana on havaittavissa. ddC aiheuttaa muutoksia myös superkiertyneiden juosteiden ja relaksoituneiden renkaiden topologisissa suhteissa.
43
Taulukko 5: Fosforilevyn mitatuista intensiteettiarvoista lasketut lopulliset keskiarvot, keskihajonnat ja Studentin t-testien tulokset ddC-tutkimusten eri näytteille. Taulukon ylemmät arvot saatiin vertailemalla katenaanien suhteita relaksoituneisiin renkaisiin, kun taas alemmat on laskettu superkiertyneiden juosteiden suhteista relaksoituneisiin renkaisiin. T-testien p-arvot on laskettu erikseen jokaiselle kontrolli/siRNA -parille jokaisen erilaisen käsittelyn/palautumisen osalta. T-testien tulokset molemmissa vertailuissa osoittavat, ettei siRNA-käsittely aiheuta tilastollisesti merkittävää pudotusta käsittelemättömiin soluihin verrattuna katenaanien ja superkiertyneiden juosteiden määrissä, pois lukien 24t palautumisen jälkeen katenaanien ja relaksoituneiden juosteiden suhteissa, sekä käsittelemättömissä soluissa superkiertyneiden ja relaksoituneiden juosteiden suhteissa.
5.4.3 2D-elektroforeesi
DNA2:n hiljentämisen ja mtDNA:n ddC:llä vaurioittamisen yhteisvaikutuksia mtDNA:n replikaatioon ja sen välituotteiden määriin selvitettiin käyttäen 2D-geelielektroforeesia.
Ihmisen OH-koettimella hybridisoitu 2D-geelimembraani kuvannettiin Biomax-filmille (Kuvat 18 ja 19). 2D-membraanin 1n-pisteiden intensiteettiarvot mitattiin fosforilevystä AriaMX-kuvantimella, jotta voitiin varmistua eri näytteiden tasaisista latausarvoista, tai selvittää mahdolliset epätasaiset lataukset. Saaduista filmeistä tutkittiin mahdolliset muutokset mitokondrio-DNA:n replikaatiossa. Saatujen kuvien perusteella pelkkä ddC-käsittely aiheuttaa replikaation laajaa pysähtymistä, kuten oli havaittavissa myös topologisissa tutkimuksissa.
Jos solujen DNA2 oli hiljennetty siRNA:lla, vaikuttaisi solujen altistaminen ddC:lle pysäyttävän suuren osan mitokondrion DNA:sta replikaatiovaiheeseen. Tämä on havaittavissa kasvaneena määränä RITOLS-välituotteita niissä 2D-filmien osissa, joiden solut oli käsitelty sekä ddC:llä, että siRNA:lla, sekä selkeämpänä y-kaarena. Niitä oli myös havaittavissa kasvaneissa määrin myös siRNA:lla käsitellyssä kontrollinäytteessä. Näitä
44
RNA-palasia lisätään mitokondrio-DNA:n replikaation aikana laahaavaan juosteeseen sen suojelemiseksi, ennen kuin ne korvautuvat pysyvästi uudella DNA-juosteella. Koska RITOLS-välituotteita oli havaittavissa selkeästi myös näytteissä, joita ei ollut ddC-käsitelty, mutta joiden DNA2 oli hiljennetty, tämä saattaa merkitä sitä, että DNA2:lla voisi olla rooli mtDNA:n replikaation aikana. Tämä mahdollinen tehtävä voi liittyä siihen mtDNA:n replikaation vaiheeseen, jolloin RITOLS-välituotteita sisältävä DNA:RNA muunnetaan todelliseksi kaksijuosteiseksi mtDNA:ksi. Niissä soluissa, jotka oli käsitelty ddC:llä, kasvanut RITOLS-määrä on selitettävissä DNA-polymeraasi γ:n estyneenä toimintana, jolloin se ei kykene muuntamaan RITOLS:ia kaksijuosteiseksi DNA:ksi. Tällöin myös DNA2:n mahdollinen hiljentäminen ei vaikuta RITOLS-välituotteiden esiintymiseen yhtä selkeästi, kuin soluissa, joita ei ollut käsitelty ddC:llä.
45
Kuva 18: 2D-geelielektroforeesifilmi dideoksysytidiinikäsittelyn (100 µM) vaikutuksista mitokondrio-DNA:n replikaatioon ja sen välituotteiden määriin. Filmi sisältää kontrollinäytteen, siRNA-käsitellyn kontrollinäytteen, ddC-käsitellyn näytteen, sekä ddC+siRNA-käsitellyn näytteen. Näytteissä, jotka oli käsitelty joko siRNA:lla, tai ddC:llä on havaittavissa hieman enemmän RITOLS-välituotteita (punaiset ympyrät) verrattuna soluihin, joiden DNA2:ta ei ollut hiljennetty siRNA:lla. Nämä viittaavat siihen, että iso osa mtDNA:sta on pysähtynyt replikaatiovaiheeseen. ddC-käsitellyissä näytteissä myös y-kaari vaikuttaisi olevan voimakkaampi, mikä myös viittaa mtDNA:n replikaation pysähtymiseen soluissa 1n-pisteiden alla olevat numerot ovat kyseisten 1n-pisteiden intensiteettiarvoja, joita käytettiin näytteiden latausmäärien arvioimiseksi.
46
Kuva 19: Toinen ddC-tutkimuksissa tuotetuista 2D-geelin filmeistä. Filmi sisältää 24 ja 48 tuntia ddC-käsittelystä palautuneet näytteet siRNA-käsiteltyinä ja ilman käsittelyä. Kuten toisessa filmissä, näytteissä, jotka oli käsitelty sekä siRNA:lla, että ddC:llä on havaittavissa hieman enemmän RITOLS-välituotteita (punaiset ympyrät). 48 tuntia palautuneessa näytteessä vaikuttaisi olevan puolet vähemmän ladattua DNA:ta verrattuna 48t + siRNA-näytteeseen, mikä selittäisi sen verrattaisen heikkouden filmillä. Tämä on nähtävissä 1n-pisteiden alla olevia latausarvoja vertaamalla.
47 5.5 DNA2-hiljennettyjen solujen UV-käsittely
Erilaisten stressi- ja vauriotilanteiden vaikutusten tutkimiseksi, DN2-hiljennettyjä soluja vaurioitettiin myös UV-valolla. UV-valon on todistettu altistavan solujen mtDNA:n normaalia suuremmalle oksidatiiviselle stressille, sekä lisäävän mtDNA:n mutageneesiä, joten se soveltuu hyvin näiden kokeiden soluviljelmien vaurioittamiseen (Berneburg ym. 1997, Pascucci ym. 1997). Osa soluviljelmistä altistettiin 30 sekunnin ajaksi ultraviolettisäteilylle (aallonpituus 302 nm). Altistuksen jälkeen UV-käsitellyn viljelmän solujen annettiin palautua 24 tuntia kasvatusmediumissa ennen näytteiden keräämistä. Kerättyjen näytteiden avulla selvitettiin mahdolliset DNA2:n hiljentämisen ja UV-vaurioiden korjauksen yhteisvaikutukset solujen mitokondrio-DNA:n topologiaan, 7S-DNA:n määrään, sekä replikaatioon.
5.5.1 Topologia
Topologiset tutkimukset suoritettiin samoin kuin ddC:n vaikutuksia tutkittaessa. Fosforilevyn intensiteetit mitattiin Molecular Imager FX-fosfokuvantimella ja siirrettiin Exceliin analysoitavaksi (Kuva 20). Mitokondrio-DNA:n topologisten suhteiden vertailukohteina toimivat superkiertyneiden juosteiden suhde relaksoituneisiin renkaisiin, sekä näiden kahden suhteet koko näytteen ajouran intensiteettiin. Näytteille laskettiin lopulliset keskiarvot ja keskihajonnat niin siRNA-käsitellyille, kuin käsittelemättömille näytteille ja saaduista tuloksista muodostettiin kolme kuvaajaa (Kuva 21). Lisäksi topologisten erojen merkittävyys selvitettiin Studentin t-testillä. Kuvaajien ja t-testien perusteella UV-käsittelyn ja DNA2:n hiljentämisen yhteisvaikutus ei aiheuta huomattavia muutoksia mtDNA:n topologiassa (Taulukko 6).
48
Kuva 20: Fosforilevykuvantimella tuotettu kuva UV-tutkimusten topologiageelistä. Geeliin on merkitty sekä relaksoituneiden renkaiden, että superkiertyneiden juosteiden sijainnit, joita käytettiin tutkimuksen vertailukohtina. Yksi juoste molemmissa kontrollinäytteissä oli heikommin ladattu muihin juosteisiin verrattuna, joka aiheutti kyseisten juosteiden vähäisen tummuuden.
Kuva 21: UV-käsittelyn ja DNA2:n hiljentämisen vaikutukset mtDNA:n eri topologisten muotojen suhteisiin. Kuvaajat on muodostettu suhteista, joissa vertailtiin relaksoituneiden renkaiden tummuusarvoa koko ajojuosteen tummuusarvoon (A), superkiertyneiden juosteiden tummuutta koko juosteeseen (B), sekä superkiertyneiden juosteiden suhdetta relaksoituneisiin renkaisiin (C). Kuvaajissa on havaittavissa lievää muutosta topologisissa suhteissa, kun vertailtiin superkiertyneiden juosteiden suhteita niin relaksoituneisiin renkaisiin kuin koko juosteeseen, mutta tämä ero ei ole Studentin t-testin mukaan tilastollisesti merkittävä. Lisäksi kaikkien kuvaajien osalta tulosten luotettavuuteen vaikuttaa negatiivisesti myös tulosten suuri keskihajonta. Tämä on havaittavissa kaikissa kuvaajissa jossain määrin, mutta erityisesti kuvaajan A kontrollinäytteiden keskiarvoissa.
49
Taulukko 6: Fosforilevyn intensiteettiarvoista lasketut lopulliset keskiarvot, keskihajonnat, sekä Studentin t-testien tulokset UV-käsittelyn topologisista vaikutuksista DNA2-hiljennetyissä soluissa. T-testien tulokset osoittavat, että kuvaajissa havaittavat lievät eroavaisuudet siRNA-käsiteltyjen ja käsittelemättömien solujen välisissä topologisissa suhteissa eivät ole tilastollisesti merkittäviä.
5.5.2 7S-DNA
7S-DNA:n suhteellinen määrä mitokondrio-DNA:sta selvitettiin samoin kuin siRNA-hiljennyksen vaikutuksia tutkittaessa. Fosforilevyn valottuminen kuvannettiin ja saadun kuvan mtDNA:n ja 7S-DNA:n intensiteettiarvot mitattiin jokaiselle näytteelle, jonka jälkeen saadut arvot siirrettiin Exceliin analysoitavaksi (Kuva 22). Jotta DNA2:n hiljentämisen ja UV-käsittelyn yhteisvaikutuksia 7S-DNA:n suhteelliseen määrään voitaisiin selvittää, verrattiin 7S-DNA:n tummuusarvoja mitokondrio-DNA:n tummuusarvoihin, jonka jälkeen saaduista keskiarvoista ja keskihajonnoista muodostettiin kuvaaja (Kuva 23). Kuvaajan ja Studentin t-testin perusteella ultraviolettivalon ja DNA2:n hiljennyksen yhteisvaikutuksilla ei vaikuttaisi olevan merkitystä 7S-DNA:n suhteelliseen määrään tai mtDNA:n vähenemiseen käsittelemättömiin soluihin verrattuna (Taulukko 7).
50
Kuva 22: Fosforikuvantimen tuottama kuva 7S-DNA –tutkimusten aikana valotetusta fosforilevystä. Näytesarjat vasemmalta oikealle: UV-käsittelemätön, mutta siRNA-käsitelty soluviljelmä, UV-käsittelemätön kontrolli, UV- ja siRNA-käsitelty viljelmä ja UV-käsitelty kontrolli. Alhaalla oleva tumma alue on geeliajon aikana ylempänä olevasta mitokondrio-DNA:sta erkaantunut 7S-DNA.
Kuva 23: Kuvaaja UV-käsittelyn ja DNA2:n hiljentämisen yhteisvaikutuksista soluviljelmien 7S-DNA:n suhteelliseen määrään mitokondrio-DNA:sta. Kuvaajan ja Studentin t-testien perusteella UV- ja siRNA-käsittelyjen yhteisvaikutus ei näyttäisi vaikuttavan solujen 7S-DNA:n määrään lainkaan. 7S-7S-DNA:n määrän lievä nousu siRNA:lla käsiteltyjen näytteiden välillä voidaan todennäköisesti selittää hieman poikkeavilla latauksilla geeliajon aikana, mutta ilman tätä selitystäkin ero ei ole tilastollisesti tarpeeksi merkittävä.
51
Taulukko 7: UV-tutkimusten 7S-geelin fosforilevyn lopulliset intensiteettien keskiarvot ja keskihajonnat kontrolli- ja siRNA-käsitellyille näytteille, joista tulosten kuvaajat muodostettiin. Lisäksi myös Studentin t-testin p-arvo, jonka mukaan poikkeamat tutkittujen solujen 7S ja mtDNA:n välisissä suhteissa eivät ole tilastollisesti merkittäviä.
Kontrollien keskiarvot
siRNA-käsiteltyjen keskiarvot
Kontrollien keskihajonnat
siRNA-käsiteltyjen keskihajonnat
T-testin p-arvo
Käsittelemätön 0,040503 0,038611 0,001869 0,003393 0,52133 UV-käsitelty 0,037404 0,046962 0,005611 0,002162
5.5.3 2D-elektroforeesi
Viimeinen koe UV-valon ja DNA2:n hiljentämisen yhteisvaikutusten tutkimiseksi oli selvittää näiden vaikutus solujen mitokondrio-DNA:n replikaatioon ja sen välituotteisiin. Molecular Imager FX-kuvantajalla tuotetusta kuvasta voitiin päätellä aiempien käsittelyjen yhteisvaikutukset mitokondrio-DNA:n replikaatioon ja sen välituotteiden määriin (Kuva 24).
Saadun kuvan perusteella UV-käsittelemättömien kontrolli- ja DNA2-hiljennettyjen
Saadun kuvan perusteella UV-käsittelemättömien kontrolli- ja DNA2-hiljennettyjen