4.4.1 Totaali-DNA:n eristys
Totaali-DNA:n eristys soluviljelmistä suoritettiin käyttäen proteinaasi K-digestiota ja fenoli:kloroformi-ekstraktiota. Totaali-DNA:n eristäminen soluviljelmistä aloitettiin irrottamalla ne soluviljelymaljan pohjasta käyttäen 1x PBS tai trypsiiniä, riippuen siitä kuinka tiukasti solut olivat kiinni maljan pohjassa. Irrottamisen jälkeen solut siirrettiin mikroputkiin 1x PBS-nesteessä ja sentrifugoitiin pelletiksi 4 °C, 5 min 1000 g, jonka jälkeen PBS imettiin pois. Saatu solupelletti liuotettiin 500 µl lyysispuskuriin (10 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,4% SDS). Seuraavaksi lysaattiin lisättiin 20 µl proteinaasi K:ta (10 mg/ml), jonka jälkeen lysaattia inkuboitiin 37 °C lämpöhauteessa vähintään 2 t, välillä hieman sekoittaen. Inkubaation jälkeen lysaattiin lisättiin 50 µl 5M NaCl.
Fenoli:kloroformi-ekstraktio aloitettiin lisäämällä lysaattiin 500 µl fenoli:kloroformi:isoamyylialkoholiliuosta (25:24:1, pH 6,9), jonka jälkeen saatua seosta sekoitettiin noin 2 min ja sentrifugoitiin noin 5 min, 16000 g. mikroputkeen muodostunut ylempi vesifaasi pipetoitiin uuteen mikroputkeen ja samat toimenpiteet toistettiin uudelle putkelle, kunnes kahden faasin välissä ei enää havaittu valkoista interfaasia. Fenolijäänteiden poistamiseksi DNA:sta, sekoitettiin viimeiseksi saatuun vesifaasiin 500 µl kloroformia, jonka jälkeen se sentrifugoitiin uudestaan 16000 g:ssä 5 min, ja saatu vesifaasi pipetoitiin jälleen uuteen putkeen. Saatuun nesteeseen sekoitettiin kaksi kertaa sen tilavuuden verran (noin 1000 µl) kylmää 100% etanolia ja 1/10 sen tilavuudesta (50 µl) 3M natriumasetaattia, pH 5,3.
Mikäli DNA saostui näkyviin, siirryttiin seuraavaan vaiheeseen, mutta mikäli ei, inkuboitiin liuosta 30 min -80 °C. Saostunut DNA pelletoitiin sentrifugissa, 4 °C, 16000 g, noin 30 min,
22
jonka jälkeen neste pipetoitiin pois. Ylimääräisten suolojen poistamiseksi DNA:sta lisättiin pelletin päälle 1 ml 70% EtOH, ja sentrifugoitiin se uudestaan 4 °C, 5 min 16000 g. Tämän jälkeen kaikki neste poistettiin putkesta mahdollisimman tarkoin ja pelletti jätettiin kuivumaan noin 30 min. Kuivunut pelletti joko resuspensoitiin 100 µl TE-puskuriin (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA), tai digestoitiin yön yli 37 °C lämpöhauteessa digestionesteellä (1 µl Thermo Scientific Fast Digest Bgl II, 100 µl 1x Fast Digest Buffer (FD0084, Thermo Fisher Scientific). Digestion jälkeen saadun näytteen DNA-pitoisuus mitattiin Nanodrop ND-1000-spektrofotometrillä (NanoDrop Technologies, Inc, Yhdysvallat). Eristetyt DNA-näytteet säilytettiin -20 °C:ssä.
4.4.2 Southern blot
DNA-näytteiden Southern blottausta varten näytteitä ajettiin agaroosigeelissä yön yli matalalla, noin 32 V, virralla. Ajon jälkeen agaroosigeeliä inkuboitiin 2x 15 min depurinaatio-liuoksessa (0,25M HCl), jonka jälkeen ylimääräinen HCl huuhdottiin nopeasti pois MilliQ-vedellä. Tämän jälkeen geeliä inkuboitiin 2x 20 minuuttia denaturaatio-puskurissa (0,5M NaOH, 1,5M NaCl). Inkubointien jälkeen geelissä ollut DNA siirrettiin Hybond-XL nylonmembraanille (GE Healthcare) kapillaariblottauksen avulla. Blottaus suoritettiin asettamalla geelin päälle nylonmembraani, 2 suodatinpaperia, käsipaperia ja paino. DNA:n annettiin siirtyä geeliltä membraanille joko yön yli tai kunnes geeli oli kokonaan kuivunut.
Saatu nylonmembraani neutralisoitiin ja pidettiin kosteana 6x SSC-puskuriliuoksessa kiinnittämisen (cross-linking) aloittamiseen asti. Kiinnittäminen suoritettiin geelikuivurissa, 2 t 80 °C.
Kiinnitetty membraani esihybridisoitiin lämpökaapissa (65 °C) esilämmitetyllä Church:in hybridisaatiopuskurilla (0,25M NaPO4 pH 7,2, 7% SDS, 1 mM EDTA) noin 30 min ajan. Hybridisaatio suoritettiin yön yli lisäämällä lämpökaapissa olevalle membraanille noin 10 ml Church:in puskuria, johon oli lisätty radioaktiiviseksi leimattu denaturoitu koetin. Tämä koetin valmistettiin käyttäen kaupallista random prime leimausmenetelmää (Amersham Rediprime II DNA Labeling System, GE Healthcare), sekä G50-puhdistuspylvästä (Mini Quick Spin Columns, Roche). Radioaktiivisessa leimauksessa käytetyt koettimet olivat 7S (mtDNA 16177-40), 12S ja OH (mtDNA 37-611). 7S-koetinta käytettiin niin topologisissa, 7S- ja kopionumerotutkimuksissa, kun taas 12S- ja OH-koettimia käytettiin vain topologisissa
23
tutkimuksissa. Hybridisaation jälkeen membraani huuhdottiin lämpökaapissa (65 °C) 5 min + 3x 20 min 1x SSC (20x stock 3 M NaCl, 0,3 M natriumsitraatti pH 7,0), 0,1% SDS-liuoksella.
Liuos vaihdettiin uuteen jokaisen käyttökerran jälkeen. Pesujen jälkeen membraani käärittiin ohueen muovikalvoon ja siirrettiin kuvannuskasettiin fosforilevyn kanssa 1-3 päiväksi riippuen radioaktiivisen signaalin voimakkuudesta. Fosforilevyn signaali analysoitiin ja kuvattiin fosforikuvantimella (Molecular Imager FX, Bio-Rad). Vaihtoehtoisesti membraani voitiin kuvantaa röntgenfilmille (Kodak BioMax with BioMax MS Intensifying Screen).
Kuvauskasetti asetettiin -80 °C pakastimeen 1-5 päiväksi, jonka jälkeen filmi kehitettiin.
4.4.3 Topologia
Yhtenä tämän tutkimuksen kohteena oli selvittää, oliko DNA2:n ylikspressoinnilla tai hiljentämisellä vaikutusta mitokondrio-DNA:n topologiaan, esimerkiksi sen kierteisyyteen tai katenaaneihin. Eri käsittelyjen vaikutuksia soluviljelmien mtDNA:n topologiaan selvitettiin ajamalla eristettyjä DNA-näytteitä topologiageelillä, joka valmistettiin 0,4% agaroosista (ultrapure, Invitrogen) 1x TBE:ssä ilman etidiumbromidia. Geeli ajettiin TBE-puskurissa yön yli 32 V.
Geelin mtDNA:n topologiaa analysoitiin ennakkotiedolla, että superkiertyneet molekyylit liikkuivat geelissä ajon aikana pisimmän matkan. Lineaariset ja relaksoituneet molekyylit olisivat kulkeneet hieman lyhyemmän matkan ja näitä ylempänä geelissä arvioitiin olevan katenaaneja ja dimeerejä. DNA siirrettiin nylonmembraanille Southern blot-menetelmällä, hybridisoitiin radioaktiivisella koettimella (OH) ja valotettiin fosforilevylle.
Tämä levy skannattiin fosfokuvaajan avulla ja eri topologisten muotojen suhteet määriteltiin Quantity One-ohjelmalla (Bio-Rad). Vertailun kohteena toimivat fosfokuvaajasta saadut kontrolli- ja siRNA-käsiteltyjen näytteiden tummuusarvot katenaaneille, superkiertyneille ja rentoutuneille juosteille. Vertailemalla eri juosteiden suhteita kontrolli- ja siRNA-käsiteltyjen näytteiden välillä, ja suorittamalla näille arvoille Studentin kaksisuuntainen ja heteroskedastinen t-testi, voitiin selvittää siRNA-käsittelyn ja mtDNA:n vaurioittamisen vaikutusta mtDNA:n topologiaan.
24 4.4.4 7S-DNA
Topologisten tutkimusten lisäksi eristetyistä DNA-näytteistä haluttiin selvittää DNA2:n yliekspression ja hiljentämisen vaikutuksia mitokondrio-DNA:n 7S-DNA:han. 2 µg DNA-näytettä digestoitiin käyttäen 1 µl PvuII-restriktioentsyymiä (Thermo Fisher Scientific, ER0631) ja 2 µl 10x FastDigest Green buffer-digestiopuskuria (Thermo Fisher Scientific, B72). Näytteiden lopputilavuus oli 20 µl. Näytteitä digestoitiin 30 min 37 °C lämpöhauteessa, jonka jälkeen ne siirrettiin 10 min 75 °C lämpölevylle. Näytteet ajettiin 0,8%
agaroosigeelissä, joka oli valmistettu lisäämällä agaroosijauhetta ja 0,3 µl/ml EtBr:ää 1x TAE-puskuriin. Geelit ajettiin yön yli 20 V jännitteellä. Saadut geelit siirrettiin nylonmembraanille Southern blot-menetelmällä ja hybridisoitiin 7S-koettimella samaan tapaan kuin topologiageelit.
Hyödyntäen samaa fosfokuvaajaa ja laskennallisia metodeja kuin topologisissa tutkimuksissa, pystyttiin 7S-DNA:n suhde mtDNA:han vertailemaan kontrollien ja käsiteltyjen mtDNA-näytteiden välillä vertaamalla membraanien radioaktiivisten alueiden intensiivisyyttä. Intensiivisyyden avulla pystyttiin myös ottamaan huomioon mahdolliset epätasaiset lataukset, ja täten poikkeavat näytteiden pitoisuudet. Intensiteettianalyysistä saadut arvot, sekä neutraali tausta-arvo siirrettiin Excel -taulukkolaskentaohjelmaan, jossa jokaisesta mitatusta arvosta ensin vähennettiin tausta-arvo. Tämän jälkeen 7S-DNA:n intensiteettiarvot jaettiin ylemmän mtDNA:n intensiteettiarvoilla per näyte ja saaduista tuloksista laskettiin niin kontrolleille kuin siRNA-käsitellyille näytteille keskiarvot ja keskihajonnat.
4.4.5 2D-geeli elektroforeesi
Tutkimuksessa haluttiin selvittää myös DNA2:n hiljentämisen ja solujen vaurioittamisen vaikutusta mtDNA:n replikaatioon ja sen välituotteiden määriin. Tätä varten DNA-näytteille suoritettiin 2D neutraali/neutraali geelielektroforeesi. 10 µg DNA:ta digestoitiin 3 µl FastDigest HincII-restriktioentsyymiä (Thermo Fisher Scientific, FD0494) 1x FastDigest Green Buffer-puskurissa. Digestio tapahtui lämpökaapissa, 4 h 37 °C. Digestion jälkeen näytteille suoritettiin fenoli-kloroformiekstraktio sekoittamalla näytteisiin niiden tilavuuden verran fenoli:kloroformi:isoamyylialkoholia ja sentrifugoimalla niitä 5 min, 16000 g. Ylempi
25
vesifaasi siirrettiin uuteen putkeen ja siihen lisättiin 5 µl 10x DNA-latauspuskuria (50%
glycerol, 2 mM EDTA, 180 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,06% xyleenisyanoli ja bromofenolisininen). Geeliajon aikana DNA:n kulkeman matkan pituuden mittaamiseen käytettiin GeneRuler 1kb Plus DNA Ladder-markkeria (Thermo Fisher Scientific, SM1331).
Ensimmäisen ulottuvuuden geeli oli 0,4% agaroosigeeli (ultrapure) 1xTBE:ssä ilman EtBr:ää. Geeli ajettiin huoneenlämmössä yön yli 35 V jännitteellä. Ensimmäisen geeliajon jälkeen DNA:ta värjättiin 1x TBE:ssä, johon oli lisätty 20 µl 10 µg/µl EtBr 20 min ajan. Tämä suoritettiin, että voitiin varmistua DNA:n sijainneista UV-valon avulla, ja niiden irti leikkaamisen helpottamiseksi. Toisen ulottuvuuden geeli oli 0,95% agaroosigeeli, johon oli sekoitettu 1 µg/ml EtBr:ää. Tämä geeli valettiin ensimmäisen ulottuvuuden geelistä irti leikattujen geelijuosteiden ympärille ja geeli ajettiin 4 °C:ssä yön yli 100 V jännitteellä.
Ajopuskurina toimi 1x TBE, johon oli lisätty 0,1 µg/ml EtBr:ää. Geelin ylikuumenemisen ja sulamisen välttämiseksi ajopuskuria kierrätettiin koko ajon ajan pumpulla. Tämän ajon päätyttyä geelille suoritettiin Southern blot ja membraani hybridisoitiin OH-koettimella.