HEK 293-solujen väliaikainen transfektio DNA2:n yliekspressoimiseksi

4.1 Soluviljely

4.1.1 HEK 293-solujen väliaikainen transfektio DNA2:n yliekspressoimiseksi

HEK 293-solujen transfektiossa käytettiin erilaisia plasmideja, jotka olivat pcDNA5/TO DNA2-1xflag, pcDNA5/TO MTS-DNA2-1xflag, pcDNA5/TO MTS-DNA2-3xflag, pcDNA5 FRT/TO DNA2-1xflag, pcDNA5 FRT/TO DNA2-myc ja pcDNA5 FRT/TO MTS-DNA2-3xflag. Plasmidinäytteiden lisäksi oli kaksi transfektoimatonta kontrollia.

Transfektiota varten HEK-solut oli aiemmin jaettu 9 cm² pinta-alan omaaville soluviljelymaljoille. Transfektionesteet valmistettiin sekoittamalla 4 µg haluttua plasmidia 400 µl Optimem-mediumia. Sekoituksen jälkeen liuokseen sekoitettiin 6 µl transfektio-reagenssia (Turbofect, 13778-150, Thermo Fisher Scientific), jonka jälkeen liuoksen annettiin inkuboitua huoneenlämmössä 15 min. Inkubaation jälkeen transfektioliuos jaettiin tasaisesti kahdelle solumaljalle per plasmidinäyte, jonka jälkeen transfektoidut solumaljat siirrettiin takaisin inkubaattoriin odottamaan jatkotutkimuksia.

18 4.1.2 293TREx-solujen transfektio

Ennen transfektiota, 293TREx Flpln-solut oli jaettu kahdelle 6 cm halkaisijaltaan oleville soluviljelymaljoille. Kukin malja tarvitsi suhteessa 9:1 pcDNA5 FRT/TO MTSDNA2myc -plasmideja ja bakteeriviljelmästä kaupallisen E.Z.N.A Plasmid DNA Kit:in (D6942-01, Omega Bio-tek) ohjeiden mukaisesti eristettyjä, Flp-rekombinaasigeenin sisältäviä pOG44-plasmideja. Tämän transfektion tarkoituksena on integroida DNA2 -geeni TREx-solujen genomin haluttuun lokukseen, jotta se voidaan indusoida käyttäen doksisykliiniä. Sekä TREx-solut että aiemmin mainitut plasmidivektorit omaavat Flp:n tunnistavan alueen genomissaan, joka mahdollistaa tarkan, samaan lokukseen kohdistuvan genomialueen integraation Flp-rekombinaasin avulla. Tämän vuoksi uuden genomin integraatio on erittäin tehokas ja se kohdistuu aina haluttuun lokukseen solujen genomissa. Transfektio integroi soluihin myös antibioottiresistenttiysgeeni hygromysiini B:tä vastaan. Tämä plasmidiliuos sekoitettiin 600 µl TREx-soluille sopivaa Optimem-mediumia, jonka jälkeen liuokseen sekoitettiin 12 µl transfektio-reagenssia (Turbofect, Thermo Fisher Scientific) ja annettiin inkuboitua 15 min huoneenlämmössä. Tämän jälkeen liuos jaettiin tasaisesti kahdelle TREx-soluviljelymaljalle ja ne siirrettiin takaisin inkubaattoriin. Kahden päivän jälkeen TREx-solumaljoille lisättiin 15 µl hygromysiini B:tä ja 15 µl blastisidiiniä (ant-hg, ant-bl, Invivogen), joiden tarkoitus on tappaa ne solut, jotka eivät kanna sisällään 293TREx Flpln -vektoreita. Kaksi päivää antibioottikäsittelyn jälkeen solumaljoista poistettiin antibioottikäsittelyn seurauksena kuolleet solut.

4.2 DNA2:n hiljentäminen siRNA-transfektiolla

Soluviljelmille suoritettiin sitransfektio, jonka tarkoituksena oli aiheuttaa RNA-interferenssiä sitoutumalla DNA2:n synteesiin johtavaan lähetti-RNA:han, täten hiljentäen sitä koodaavan geenin toiminnan. siRNA-transfektiot suoritettiin HEK 293-soluille, jotka oli aikaisemmin jaettu kahteentoista soluviljelylevyn kuoppaan, jonka halkaisija on 35 mm ja pinta-ala 9 cm². Transfektionesteen valmistus aloitettiin sekoittamalla yhdessä mikroputkessa 225 µl Optimem-mediumia (31985-070 500 mL, Thermo Fisher Scientific) ja 12 µl lipofektamiini-transfektioreagenttia (Lipofectamine RNAiMAX, 13779-150, Thermo Fisher

Scientific). Toisessa mikroputkessa sekoitettiin 225 µl Optimem-mediumia ja 6,25 pM DNA2 siRNA 1 (4427037, siRNA ID s4173, locus ID 1763, Ambion Life Technologies) ja 6,25 pM DNA2 siRNA 2 (4427037, siRNA ID s4174, locus ID 1763, Ambion Life Technologies) (siRNA:n konsentraatio 10 pmol/µl). Tämän jälkeen kumpikin neste sekoitettiin keskenään ja annettiin inkuboitua huoneenlämmössä 5 min. Soluille, jotka transfektoitiin vain siRNA 1:llä tai siRNA 2:lla, valmistettiin transfektionesteet samoilla pitoisuuksilla, paitsi tällä kertaa yhtä siRNA:ta sekoitettiin nesteeseen 12,5 pM. Sama prosessi samoilla pitoisuuksilla toistettiin myös siRNA-negatiivikontrollin transfektionesteen valmistamiseksi. Inkubaation jälkeen yhden putken sisältö pipetoitiin tasaisesti kolmeen kahdestatoista soluviljelylevyn kuopasta tipoittain, jonka jälkeen solut siirrettiin inkubaattoriin odottamaan jatkotutkimuksia.

4.3 Proteiinien eristys

Proteiinien eristys viljellyistä soluista aloitettiin imemällä medium pois soluviljelymaljasta, jonka jälkeen solut irrotettiin maljan pohjasta lisäämällä soluviljelymaljaan 1 ml PBS ja tämän jälkeen pipetoimalla nestettä sisään ja ulos, kunnes kaikki solut olivat irronneet nesteeseen. Mikäli solut olivat tiukasti kiinni soluviljelymaljan pohjassa, irrotettiin ne huuhtomalla ne ensin kevyesti PBS:llä ja imemällä se pois, jonka jälkeen maljalle lisättiin 1 ml trypsiiniä irrottamaan solut. Kun solut olivat irronneet, siirrettiin solususpensio mikroputkeen, ja tämä putki 4 °C sentrifugiin 3 min, 1000 g. Tämän jälkeen putkesta poistettiin pipetoimalla neste ja syntynyt solupelletti resuspensoitiin 80-100 µl TOTEX-puskuria (20 mM Hepes pH 7,9, 400 mM NaCl, 20 % glyseroli, 1 % NP40, 1 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, 0,2 mM EGTA, 10 mM β-glyserofosfaatti, 10 mM NaF, 5 mM DTT, Complete^ proteinaasi-inhibiittoriseos), riippuen solupelletin koosta. Resuspensoitua solupellettiä pidettiin jäähauteessa 20 min, jonka jälkeen se siirrettiin noin 30 min -20 °C pakastimeen.

Pakastuksen jälkeen solususpensio sulatettiin jäähauteessa, välillä sekoittaen vortexilla. Kun solususpensio oli sulanut, siirrettiin se jälleen neljän celsiusasteen sentrifugiin viideksi minuutiksi, 16000 g. Fuugauksen jälkeen jäljellä oleva supernatantti siirrettiin uuteen mikroputkeen, ja täten valmis proteiininäyte säilytettiin -20 °C.

Eristettyjen proteiininäytteiden konsentraatioiden mittaukseen käytettiin Bradfordin menetelmää. 1 µl näytettä (tarvittaessa laimennettu) pipetoitiin 1 ml Bradford-liuosta (0,1 mg/ml Coomassie Brilliant Blue G250, 10 % EtOH, 8,5 % fosforihappo). Standardisuora

mittausta varten valmistettiin sekoittamalla 1 ml Bradford-liuosta 0, 2, 4, 6, 8, 10 ja 12 µg BSA:ta. Saatuja näytteitä inkuboitiin 15-20 minuuttia jäähauteessa, jonka jälkeen niiden absorbanssi mitattiin 595 nm aallonpituudessa käyttäen FluoStar Omega flourometriä (BMG Labtech). Näytteiden proteiinikonsentraatiot saatiin vertaamalla mitattuja absorbanssilukemia standardin vastaaviin.

4.3.1 Western blot

Eristetyt proteiininäytteet analysoitiin Western blot-menetelmää käyttäen. Geeliajossa käytettiin kaksiosaista akryyliamidigeeliä, joka koostui kasausgeelistä (4% akryyliamidi, 0,1% SDS, 125 mM Tris pH 6,8, 0,1% APS, 0,1% TEMED) ja ajogeelistä (8% akryyliamidi, 0,1% SDS, 375 Mm Tris pH 8,8, 0,1% APS, 0,1% TEMED). Ajokammio täytettiin 1x SDS-puskurilla (0,025 M Tris, 0,192 M glysiini, 0,1% SDS, pH 8,5). Proteiininäytteistä pipetoitiin 100 µg proteiinia, jonka jälkeen niihin lisättiin ¼ niiden tilavuudesta 5x Lämmli-latauspuskuria (250 nM Tris, pH 6,8, 10% SDS, 30% glyseroli, 0,5 M DTT, 0,02%

bromofenolisininen). Saatua sekoitusta keitettiin 5 min 95 °C, jonka jälkeen näytteet sekä proteiinimarkkeri (PageRuler Plus prestained protein ladder, Thermo Fisher Scientific) pipetoitiin geelin kuoppiin. Geeliä ajettiin noin 1,5 tuntia 100V. Ajon päätyttyä proteiinit siirrettiin geeliltä nitroselluloosa-kalvolle käyttäen electroblot-menetelmää siirtopuskurissa (1x SDS-puskuri + 20% metanoli), 1,5 t, 100V, 4 °C. Siirtoprosessin jälkeen membraanin huuhdottiin MilliQ-vedellä, värjättiin 1-2 min ajan Ponceau S-liuoksella (0,1% Ponceau S, 5% etikkahappo) ja ylimääräinen Ponceau S huuhdottiin uudestaan MilliQ-vedellä.

Kalvo siirrettiin huuhdottavaksi blokkausliuokseen (3% maitojauhetta TBST-puskurissa (20 nM Tris pH 7,6, 150 mM NaCl, 0,1% Tween-20)) noin tunniksi, jonka jälkeen se pestiin kaksi kertaa nopeasti 1x TBST:llä. TBST-pesun jälkeen kalvoa käsiteltiin yön yli primäärisessä vasta-aineessa, jonka jälkeen se pestiin 3x 5 min TBST:llä ja tämän jälkeen noin tunti sekundäärisessä aineessa. Tässä tutkimuksessa käytetyt primääriset vasta-aineet ja niiden konsentraatiot olivat rabbit anti-actin (A2066, Sigma, 1:2000), rabbit anti-flag (ABIN871107/20543, Antibodies-online/Proteintech, 1:2000 tai 1:4000), mouse anti-flag (ABIN1715174/Ebi T006, Antibodies-online, 1:1000 tai 1:2000), mouse anti-myc (SAB4700447, Sigma, 1:15000) ja rabbit anti-DNA2 (ABIN6388783, Antibodies-online, 1:1000 tai 1:500). Käytetyt sekundääriset vasta-aineet ja niiden konsentraatiot olivat

goat-21

anti-rabbit IgG HRP (A16104, NOVEX/Lifetech, 1:15000 tai 1:7500) ja goat-anti-mouse IgG (GTX77315, Genetex, 1:5000 tai 1:8000). Vasta-ainekäsittelyjen jälkeen kalvo huuhdottiin vielä 4x 10 min TBST:llä. Kalvon kuvantamiseksi suoritettiin noin minuutin kestävä Luminol-käsittely (10 ml 100 mM Tris-HCl pH 8,5, 22 µl 90 mM p-kumariinihappo DMSO:ssa, 50 µl 250 mM natrium-luminol DMSO:ssa, 3 µl 30% H202), jotta kalvo voitiin kuvantaa pimiössä filmille.

4.4 DNA-analyysit

4.4.1 Totaali-DNA:n eristys

Totaali-DNA:n eristys soluviljelmistä suoritettiin käyttäen proteinaasi K-digestiota ja fenoli:kloroformi-ekstraktiota. Totaali-DNA:n eristäminen soluviljelmistä aloitettiin irrottamalla ne soluviljelymaljan pohjasta käyttäen 1x PBS tai trypsiiniä, riippuen siitä kuinka tiukasti solut olivat kiinni maljan pohjassa. Irrottamisen jälkeen solut siirrettiin mikroputkiin 1x PBS-nesteessä ja sentrifugoitiin pelletiksi 4 °C, 5 min 1000 g, jonka jälkeen PBS imettiin pois. Saatu solupelletti liuotettiin 500 µl lyysispuskuriin (10 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,4% SDS). Seuraavaksi lysaattiin lisättiin 20 µl proteinaasi K:ta (10 mg/ml), jonka jälkeen lysaattia inkuboitiin 37 °C lämpöhauteessa vähintään 2 t, välillä hieman sekoittaen. Inkubaation jälkeen lysaattiin lisättiin 50 µl 5M NaCl.

Fenoli:kloroformi-ekstraktio aloitettiin lisäämällä lysaattiin 500 µl fenoli:kloroformi:isoamyylialkoholiliuosta (25:24:1, pH 6,9), jonka jälkeen saatua seosta sekoitettiin noin 2 min ja sentrifugoitiin noin 5 min, 16000 g. mikroputkeen muodostunut ylempi vesifaasi pipetoitiin uuteen mikroputkeen ja samat toimenpiteet toistettiin uudelle putkelle, kunnes kahden faasin välissä ei enää havaittu valkoista interfaasia. Fenolijäänteiden poistamiseksi DNA:sta, sekoitettiin viimeiseksi saatuun vesifaasiin 500 µl kloroformia, jonka jälkeen se sentrifugoitiin uudestaan 16000 g:ssä 5 min, ja saatu vesifaasi pipetoitiin jälleen uuteen putkeen. Saatuun nesteeseen sekoitettiin kaksi kertaa sen tilavuuden verran (noin 1000 µl) kylmää 100% etanolia ja 1/10 sen tilavuudesta (50 µl) 3M natriumasetaattia, pH 5,3.

Mikäli DNA saostui näkyviin, siirryttiin seuraavaan vaiheeseen, mutta mikäli ei, inkuboitiin liuosta 30 min -80 °C. Saostunut DNA pelletoitiin sentrifugissa, 4 °C, 16000 g, noin 30 min,

jonka jälkeen neste pipetoitiin pois. Ylimääräisten suolojen poistamiseksi DNA:sta lisättiin pelletin päälle 1 ml 70% EtOH, ja sentrifugoitiin se uudestaan 4 °C, 5 min 16000 g. Tämän jälkeen kaikki neste poistettiin putkesta mahdollisimman tarkoin ja pelletti jätettiin kuivumaan noin 30 min. Kuivunut pelletti joko resuspensoitiin 100 µl TE-puskuriin (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA), tai digestoitiin yön yli 37 °C lämpöhauteessa digestionesteellä (1 µl Thermo Scientific Fast Digest Bgl II, 100 µl 1x Fast Digest Buffer (FD0084, Thermo Fisher Scientific). Digestion jälkeen saadun näytteen DNA-pitoisuus mitattiin Nanodrop ND-1000-spektrofotometrillä (NanoDrop Technologies, Inc, Yhdysvallat). Eristetyt DNA-näytteet säilytettiin -20 °C:ssä.

4.4.2 Southern blot

DNA-näytteiden Southern blottausta varten näytteitä ajettiin agaroosigeelissä yön yli matalalla, noin 32 V, virralla. Ajon jälkeen agaroosigeeliä inkuboitiin 2x 15 min depurinaatio-liuoksessa (0,25M HCl), jonka jälkeen ylimääräinen HCl huuhdottiin nopeasti pois MilliQ-vedellä. Tämän jälkeen geeliä inkuboitiin 2x 20 minuuttia denaturaatio-puskurissa (0,5M NaOH, 1,5M NaCl). Inkubointien jälkeen geelissä ollut DNA siirrettiin Hybond-XL nylonmembraanille (GE Healthcare) kapillaariblottauksen avulla. Blottaus suoritettiin asettamalla geelin päälle nylonmembraani, 2 suodatinpaperia, käsipaperia ja paino. DNA:n annettiin siirtyä geeliltä membraanille joko yön yli tai kunnes geeli oli kokonaan kuivunut.

Saatu nylonmembraani neutralisoitiin ja pidettiin kosteana 6x SSC-puskuriliuoksessa kiinnittämisen (cross-linking) aloittamiseen asti. Kiinnittäminen suoritettiin geelikuivurissa, 2 t 80 °C.

Kiinnitetty membraani esihybridisoitiin lämpökaapissa (65 °C) esilämmitetyllä Church:in hybridisaatiopuskurilla (0,25M NaPO4 pH 7,2, 7% SDS, 1 mM EDTA) noin 30 min ajan. Hybridisaatio suoritettiin yön yli lisäämällä lämpökaapissa olevalle membraanille noin 10 ml Church:in puskuria, johon oli lisätty radioaktiiviseksi leimattu denaturoitu koetin. Tämä koetin valmistettiin käyttäen kaupallista random prime leimausmenetelmää (Amersham Rediprime II DNA Labeling System, GE Healthcare), sekä G50-puhdistuspylvästä (Mini Quick Spin Columns, Roche). Radioaktiivisessa leimauksessa käytetyt koettimet olivat 7S (mtDNA 16177-40), 12S ja OH (mtDNA 37-611). 7S-koetinta käytettiin niin topologisissa, 7S- ja kopionumerotutkimuksissa, kun taas 12S- ja OH-koettimia käytettiin vain topologisissa

tutkimuksissa. Hybridisaation jälkeen membraani huuhdottiin lämpökaapissa (65 °C) 5 min + 3x 20 min 1x SSC (20x stock 3 M NaCl, 0,3 M natriumsitraatti pH 7,0), 0,1% SDS-liuoksella.

Liuos vaihdettiin uuteen jokaisen käyttökerran jälkeen. Pesujen jälkeen membraani käärittiin ohueen muovikalvoon ja siirrettiin kuvannuskasettiin fosforilevyn kanssa 1-3 päiväksi riippuen radioaktiivisen signaalin voimakkuudesta. Fosforilevyn signaali analysoitiin ja kuvattiin fosforikuvantimella (Molecular Imager FX, Bio-Rad). Vaihtoehtoisesti membraani voitiin kuvantaa röntgenfilmille (Kodak BioMax with BioMax MS Intensifying Screen).

Kuvauskasetti asetettiin -80 °C pakastimeen 1-5 päiväksi, jonka jälkeen filmi kehitettiin.

4.4.3 Topologia

Yhtenä tämän tutkimuksen kohteena oli selvittää, oliko DNA2:n ylikspressoinnilla tai hiljentämisellä vaikutusta mitokondrio-DNA:n topologiaan, esimerkiksi sen kierteisyyteen tai katenaaneihin. Eri käsittelyjen vaikutuksia soluviljelmien mtDNA:n topologiaan selvitettiin ajamalla eristettyjä DNA-näytteitä topologiageelillä, joka valmistettiin 0,4% agaroosista (ultrapure, Invitrogen) 1x TBE:ssä ilman etidiumbromidia. Geeli ajettiin TBE-puskurissa yön yli 32 V.

Geelin mtDNA:n topologiaa analysoitiin ennakkotiedolla, että superkiertyneet molekyylit liikkuivat geelissä ajon aikana pisimmän matkan. Lineaariset ja relaksoituneet molekyylit olisivat kulkeneet hieman lyhyemmän matkan ja näitä ylempänä geelissä arvioitiin olevan katenaaneja ja dimeerejä. DNA siirrettiin nylonmembraanille Southern blot-menetelmällä, hybridisoitiin radioaktiivisella koettimella (OH) ja valotettiin fosforilevylle.

Tämä levy skannattiin fosfokuvaajan avulla ja eri topologisten muotojen suhteet määriteltiin Quantity One-ohjelmalla (Bio-Rad). Vertailun kohteena toimivat fosfokuvaajasta saadut kontrolli- ja siRNA-käsiteltyjen näytteiden tummuusarvot katenaaneille, superkiertyneille ja rentoutuneille juosteille. Vertailemalla eri juosteiden suhteita kontrolli- ja siRNA-käsiteltyjen näytteiden välillä, ja suorittamalla näille arvoille Studentin kaksisuuntainen ja heteroskedastinen t-testi, voitiin selvittää siRNA-käsittelyn ja mtDNA:n vaurioittamisen vaikutusta mtDNA:n topologiaan.

24 4.4.4 7S-DNA

Topologisten tutkimusten lisäksi eristetyistä DNA-näytteistä haluttiin selvittää DNA2:n yliekspression ja hiljentämisen vaikutuksia mitokondrio-DNA:n 7S-DNA:han. 2 µg DNA-näytettä digestoitiin käyttäen 1 µl PvuII-restriktioentsyymiä (Thermo Fisher Scientific, ER0631) ja 2 µl 10x FastDigest Green buffer-digestiopuskuria (Thermo Fisher Scientific, B72). Näytteiden lopputilavuus oli 20 µl. Näytteitä digestoitiin 30 min 37 °C lämpöhauteessa, jonka jälkeen ne siirrettiin 10 min 75 °C lämpölevylle. Näytteet ajettiin 0,8%

agaroosigeelissä, joka oli valmistettu lisäämällä agaroosijauhetta ja 0,3 µl/ml EtBr:ää 1x TAE-puskuriin. Geelit ajettiin yön yli 20 V jännitteellä. Saadut geelit siirrettiin nylonmembraanille Southern blot-menetelmällä ja hybridisoitiin 7S-koettimella samaan tapaan kuin topologiageelit.

Hyödyntäen samaa fosfokuvaajaa ja laskennallisia metodeja kuin topologisissa tutkimuksissa, pystyttiin 7S-DNA:n suhde mtDNA:han vertailemaan kontrollien ja käsiteltyjen mtDNA-näytteiden välillä vertaamalla membraanien radioaktiivisten alueiden intensiivisyyttä. Intensiivisyyden avulla pystyttiin myös ottamaan huomioon mahdolliset epätasaiset lataukset, ja täten poikkeavat näytteiden pitoisuudet. Intensiteettianalyysistä saadut arvot, sekä neutraali tausta-arvo siirrettiin Excel -taulukkolaskentaohjelmaan, jossa jokaisesta mitatusta arvosta ensin vähennettiin tausta-arvo. Tämän jälkeen 7S-DNA:n intensiteettiarvot jaettiin ylemmän mtDNA:n intensiteettiarvoilla per näyte ja saaduista tuloksista laskettiin niin kontrolleille kuin siRNA-käsitellyille näytteille keskiarvot ja keskihajonnat.

4.4.5 2D-geeli elektroforeesi

Tutkimuksessa haluttiin selvittää myös DNA2:n hiljentämisen ja solujen vaurioittamisen vaikutusta mtDNA:n replikaatioon ja sen välituotteiden määriin. Tätä varten DNA-näytteille suoritettiin 2D neutraali/neutraali geelielektroforeesi. 10 µg DNA:ta digestoitiin 3 µl FastDigest HincII-restriktioentsyymiä (Thermo Fisher Scientific, FD0494) 1x FastDigest Green Buffer-puskurissa. Digestio tapahtui lämpökaapissa, 4 h 37 °C. Digestion jälkeen näytteille suoritettiin fenoli-kloroformiekstraktio sekoittamalla näytteisiin niiden tilavuuden verran fenoli:kloroformi:isoamyylialkoholia ja sentrifugoimalla niitä 5 min, 16000 g. Ylempi

vesifaasi siirrettiin uuteen putkeen ja siihen lisättiin 5 µl 10x DNA-latauspuskuria (50%

glycerol, 2 mM EDTA, 180 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,06% xyleenisyanoli ja bromofenolisininen). Geeliajon aikana DNA:n kulkeman matkan pituuden mittaamiseen käytettiin GeneRuler 1kb Plus DNA Ladder-markkeria (Thermo Fisher Scientific, SM1331).

Ensimmäisen ulottuvuuden geeli oli 0,4% agaroosigeeli (ultrapure) 1xTBE:ssä ilman EtBr:ää. Geeli ajettiin huoneenlämmössä yön yli 35 V jännitteellä. Ensimmäisen geeliajon jälkeen DNA:ta värjättiin 1x TBE:ssä, johon oli lisätty 20 µl 10 µg/µl EtBr 20 min ajan. Tämä suoritettiin, että voitiin varmistua DNA:n sijainneista UV-valon avulla, ja niiden irti leikkaamisen helpottamiseksi. Toisen ulottuvuuden geeli oli 0,95% agaroosigeeli, johon oli sekoitettu 1 µg/ml EtBr:ää. Tämä geeli valettiin ensimmäisen ulottuvuuden geelistä irti leikattujen geelijuosteiden ympärille ja geeli ajettiin 4 °C:ssä yön yli 100 V jännitteellä.

Ajopuskurina toimi 1x TBE, johon oli lisätty 0,1 µg/ml EtBr:ää. Geelin ylikuumenemisen ja sulamisen välttämiseksi ajopuskuria kierrätettiin koko ajon ajan pumpulla. Tämän ajon päätyttyä geelille suoritettiin Southern blot ja membraani hybridisoitiin OH-koettimella.

4.5 RNA:n eristys

Soluviljelmien RNA eristettiin analysointia varten Trizol-ekstraktiolla. Ekstraktio aloitettiin imemällä kasvatusmaljoista kasvatusmedium pois, jonka jälkeen jokaiselle soluviljelymaljalle lisättiin 0,5 ml Trizol-reagenssia (Thermo Fisher Scientific, 15596026). Solujen annettiin hajota noin 1 min, jonka jälkeen syntynyt lyysaatti kerättiin soluviljelymaljasta käyttäen pientä lastaa ja se pipetoitiin mikroputkeen. Lyysaattiputkiin sekoitettiin 100 µl kloroformia ja niitä fuugattiin 5 min 16000 g, jonka jälkeen syntyneistä faaseista ylempi siirrettiin uuteen putkeen. Uuteen putkeen sekoitettiin 250 µl isopropanolia ja seosta inkuboitiin 10 min huoneenlämmössä. Inkubaation jälkeen näytettä fuugattiin 10 min 12000 g, 4 ^°C. Syntyneen pelletin ympäriltä poistettiin neste ja se pestiin 1 ml 70% EtOH:ia ja fuugattiin 5 minuuttia 12000 g, 4 ^°C. Pesun jälkeen EtOH poistettiin ja pelletin annettiin kuivua 10-15 min, jonka jälkeen pelletti liuotettiin noin 30 µl:aan RNAaasi-vapaata vettä. Saatujen näytteiden RNA-pitoisuus mitattiin Nanodrop ND-1000-spektrofotometrillä ja näytteet säilytettiin -80 ^°C.

26 4.5.1 Northern blot

DNA2:en geeniekspression tutkimiseksi soluista eristetyille RNA-näytteille suoritettiin agaroosi-elektroforeesi ja Northern-blottaus. Ennen geelin ajoa kaikki RNA-näytteiden kanssa kontaktissa olevat ajokammion osat puhdistettiin vetyperoksidiliuoksella. Geeliajossa käytettävä agaroosigeeli oli 0,8% agaroosia 1x MOPS-puskurissa (40 mM MOPS, 10 mM natriumasetaatti, 1 mM EDTA, pH 7,2), johon oli lisätty 5,5% formaldehydi. Agaroosigeelin valmistus ja kovettaminen tapahtui vetokaapissa.

Geeliajossa käytettävät näytteet valmistettiin pipetoimalla 2 µg eristettyä RNA-näytettä ja lisäämällä siihen RNAaasi-vapaata vettä, kunnes näytteen kokonaistilavuus oli 5,5 µl. 5,5 µl näytteeseen lisättiin 1 µl 10x MOPS, 3,5 µl formaldehydiä ja 10 µl formamidiä.

Näytettä kuumennettiin 65 °C 15 min, jonka jälkeen se jäähdytettiin nopeasti jäähauteessa.

Ennen geelille pipetoimista näytteisiin lisättiin 2 µl latausväriä (0,05% Bromofenolisininen 100% formamidissä). Markkerina käytettiin 2 µl RiboRuler High Range RNA ladder (Thermo Fisher Scientific, SM1821).

Ennen oikean ajon aloittamista kovettunut geeli oli esiajettu 15 min 60 V 1x MOPS-puskurissa (5.5% formaldehydi). Näytteiden ajo suoritettiin yön yli 30 V. Ajon jälkeen geeli huuhdottiin RNAaasi-vapaassa vedessä ja inkuboitiin sekoittajalla 20x SSC:ssä 20 min ajan.

Geeli blotattiin vetokaapissa Hybond-XL nylonmembraanille (GE Healthcare) kapillaariblottauksen avulla samoin kuin Southern blotissa. RNA:n kiinnittämiseksi saatu membraani kuivatettiin geelikuivaajassa 2 t, 80 °C. Hybridisaatioprosessi oli myös sama kuin Southern blotissa. Radioaktiivisessa leimauksessa käytetty koetin oli 2678 emäsparin mittainen sekvenssi DNA2:n koodaavan alueen loppupuolelta. Hybridisaation jälkeen membraani käärittiin ohueen muovikalvoon ja siirrettiin kuvannuskasettiin fosforilevyn kanssa 1-3 päiväksi riippuen radioaktiivisen signaalin voimakkuudesta. Fosforilevyn signaali analysoitiin ja kuvattiin fosforikuvantimella (Molecular Imager FX, Bio-Rad).

4.5.2 Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi

DNA2:en hiljentämisen onnistumisen selvittämiseksi eristetyille RNA-näytteille suoritettiin kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi (qPCR) SybrGreen:in kanssa käyttäen joko

Accustart II tai JumpStart PCR-mastermixejä. Kumpikin qPCR-menetelmä aloitettiin identtisellä käänteistranskriptiolla. Käänteistranskriptiota varten sekoitettiin 2 µl 5x qScript cDNA Supermix (Quantabio, 95048), 0,5 µg siRNA-käsiteltyä RNA-näytettä ja MilliQ-vettä, kunnes näytteen kokonaistilavuus oli 10 µl. RNA-näytteistä, joita ei ollut käsitelty siRNA:lla, valmistettiin kontrollinäytteet samalla metodilla. Suurimman RNA-pitoisuuden omaavasta kontrollinäytteestä valmistettiin myös standardisuora laimennossarjana (1-0,5-0,25-0,125-0,0625-0). Latauskontrollina käytettiin beeta-aktiinia. Näytteiden käänteistranskriptio suoritettiin PCR-laiteella (5 min 20 °C, 30 min 42 °C, 5 min 85 °C, 4 °C).

JumpStart-menetelmää käytettäessä qPCR näytteet valmistettiin sekoittamalla 10 µl JumpStart 2x Mastermix (Sigma, P2893), 250 nM ensimmäistä alukeseosta (DNA2 2678-forward + DNA2 myc Xho-reverse tai DNA2 2678-2678-forward + human DNA2 3164-reverse), 250 nM toista alukeseosta (human 28S 1259-forward + human 28S 2388-reverse tai human 18S 1259-forward + human 18S 2388-reverse), 1 µl SybrGreen (1:1000) ja 7 µl käänteiskopioinnista saatua näytettä + MilliQ-vettä per näytekaivo (20 µl kokonaistilavuus).

Jokaisesta näytteestä ja kontrollista tehtiin kolme kopiota ja standardisuorasta kaksi kopiota qPCR-levylle. Levy asetettiin qPCR-laitteeseen, jossa reaktio tapahtui (3 min 94 °C, 40 sykliä 20 s 94 °C, 20 s 58 °C, 30 s 72 °C).

Ajon päätyttyä laite tuotti reaktiokuvaajan, jota analysoimalla voitiin päätellä sekä amplifikaation, että DNA2:en hiljentämisen onnistuminen. Jokaisen qPCR-reaktion syklin aikana levyn kaivoissa olevan DNA:n määrä kasvaa eksponentiaalisesti, samalla kasvattaen myös kaivoista mitattavan fluoresenssin määrää eksponentiaalisesti.

Koska qPCR-näytteet oli valmistettu solujen RNA:sta käänteiskopioinnin avulla, pystyttiin tämän avulla arvioimaan soluissa olleen lähetti-RNA:n määrää, ja täten DNA2:n hiljentymistä. siRNA-käsittely häiritsee DNA2:n koodauksesta vastaavan lähetti-RNA:n toimintaa, ja täten myös siRNA-käsiteltyjen solujen amplifikaatiokäyrän (fluoresenssin määrä) pitäisi nousta hitaammin kuin kontrollinäytteiden, joita ei ole käsitelty siRNA:lla.

Beeta-aktiini toimi vertailukohteena, koska aiemmin soluille suoritetuilla käsittelyillä ei ollut vaikutusta sen ilmenemiseen, ja täten vertaamalla RNA-näytteiden käänteiskopioinnissa syntyneen DNA:n määrää beeta-aktiinin käänteiskopioidun DNA:n määrään, voitiin selvittää, oliko DNA2 onnistuneesti hiljennetty. Tilastollinen merkittävyys selvitettiin Studentin kaksisuuntaisella ja heteroskedastisella t-testillä.

AccuStart-menetelmässä valmistettiin ensin PCR Mastermix sekoittamalla jokaista näytekaivoa kohti 10 µl Accustart II PCR SuperMix (Quantabio, 95137), 1 µl SybrGreen (1:1000), 100 nM ensimmäistä alukeseosta, 100 nM toista alukeseosta ja 6,6 µl MilliQ-vettä.

Näytteistä ja kontrolleista valmistettiin kolme kopiota ja standardisuorasta kaksi kopiota.

Jokaiseen qPCR-levyn kaivoon lisättiin ensin 18 µl PCR Mastermixiä ja tämän jälkeen 2 µl käänteistranskriptiolla tuotettua DNA:ta, vettä tai standardisuoran liuosta, riippuen oliko kyseessä näyte-, kontrolli- vai standardisuoran kaivo. Reaktio suoritettiin samoilla asetuksilla ja analysoitiin samoin kuin JumpStart-menetelmässä.

4.6 Mitokondrio-DNA:n kopionumeroanalyysi

Koska yksi tutkimuksen kohde oli selvittää, oliko DNA2:en hiljentämisellä ja solujen vaurioittamisella vaikutusta mtDNA:n korjaukseen, selvitettiin siRNA:lla ja kemikaaleilla käsiteltyjen soluviljelmien mtDNA:n kopionumerot käyttäen hyväksi kvantitatiivista PCR-reaktiomenetelmää (Taqman). Taqman-menetelmä poikkeaa osittain Sybrgreen-menetelmästä.

Sybrgreen-menetelmässä näytteen fluoresenssi kasvaa eksponentiaalisesti PCR-reaktion jokaisen syklin jälkeen, kun fluoresoivat Sybrgreen-molekyylit integroituvat syntyviin DNA-juosteisiin. Taqman-menetelmässä komplementaariset koettimet liittyvät PCR-reaktion aikana niitä vastaavaan avonaiseen DNA-juosteeseen. Taqman-koetin koostuu koetinalueen lisäksi fluoresoivasta molekyylistä ja sen fluoresenssin estävästä molekyylistä. Kaksoisjuosteen synteesin aikana eksonukleaasiaktiivinen Taq-polymeraasi leikkaa nämä kaksi molekyyliä irti koetinjuosteesta, mikä mahdollistaa fluoresenssin syntymisen. Näin syntyvän fluoresenssin määrä kasvaa jokaisessa PCR-syklissä eksponentiaalisesti, kun uusia kaksoisjuosteita syntetisoidaan.

Analyysiä varten eristetyistä DNA-näytteistä valmistettiin 100 ng/µl laimennos, joiden kokonaistilavuus oli 100 µl. Laimennokset homogenisoitiin käyttäen sonikaattoria (10 s, 50% amplitudi, 0,5 s on/off) ja niiden pitoisuus varmistettiin Nanodrop ND-1000-spektrofotometrillä. Saaduista laimennoksista valmistettiin 25 ng/µl laimennokset, sekä korkeimman pitoisuuden omaavasta kontrollinäytteestä standardisuora (100, 50, 25, 10, 5, 2,5, 0 ng/µl).

qPCR-reaktiota varten valmistettiin PCR-mastermix, johon lisättiin 10 µl AccuTaq ready mix 2x ja 8 µl aluke/koetinseosta per näytekaivo. Aluke/koetinseos koostui seuraavista alukkeista ja koettimista: mtDNA forward primer (250 nM), mtDNA reverse primer (250 nM), mtDNA probe FAM (312 nM), nuclear forward primer (250 nM), nuclear reverse primer (250 nM) ja nuclear probe HEX (312 nM). Näyte- ja kontrollikaivot valmistettiin kolmena kopiona ja standardisuoran kaivot kahtena kopiona. Jokaiseen kaivoon lisättiin 2 µl näytettä/standardia ja 18 µl PCR-mastermixiä. Tasaisen koostumuksen ja sen pohjaan kertymisen varmistamiseksi qPCR-levy sekoitettiin nopeasti sentrifugissa. Kvantitatiivinen PCR suoritettiin qPCR-laitteella (AriaMX, Agilent), johon oli ohjelmoitu seuraava ohjelma reaktion suorittamiseksi: 95 °C 3 min, 40 sykliä 95 °C 15 s, 58 °C 15 s (luku), 72 °C 15 s.

Ohjelman päätyttyä laite tuotti amplifikaatiokuvaajan, jota analysoimalla voitiin päätellä, oliko solujen vaurioittamisella ja DNA2:en hiljentämisellä vaikutusta mtDNA:n kopionumeroon. AriaMx -ohjelma ilmoittaa amplifikaation Cq (∆R) -arvona. Kokeessa käytetyistä fluoresoivista väreistä FAM sitoutui mitokondrion DNA:han ja HEX puolestaan tuman DNA:han. Koska jokainen solu sisältää kaksi kopiota tuman geeneistä, tulisi tuman DNA:sta syntyvä fluoresenssi olla noin kaksinkertainen mtDNA:n fluoresenssiin verrattuna.

Vertaamalla saatuja fluoresenssiarvoja standardisuoran fluoresenssiin pystyttiin laskemaan kunkin näytteen mtDNA ja DNA-pitoisuudet nanogrammoina. Jakamalla mtDNA:n määrä tuman DNA:n määrällä voitiin selvittää aiempien käsittelyjen vaikutus mtDNA:n kopionumeroon ja suorittamalla näytteiden keskiarvoille kaksisuuntainen ja heteroskedastinen Studentin t-testi saatiin selville, mikäli ero oli tilastollisesti merkittävä.

4.7 Mitokondrio-DNA:n vaurioittaminen

Tässä tutkimuksessa haluttiin selvittää, mikäli DNA2:en hiljentäminen vaikuttaisi solujen mtDNA-vaurioiden korjaukseen. Tätä varten HEK-soluviljelmiä transfektoitiin siRNA:lla ja niiden perimäainesta vaurioitettiin kasvatuksen aikana käyttäen 2′-3′-dideoksisytidiiniä (ddC) ja UV-valoa. Kummassakin vaurioittamiskokeessa käytettiin pohjana HEK-soluja sisältävää 6-kuoppalevyjä (3 ml medium per kuoppa), joista jokaisesta levystä puolet kuopista oli transfektoitu siRNA:lla DNA2:en hiljentämiseksi.

30 4.7.1 ddC-käsittely

Käsittely aloitettiin jakamalla aikaisemmin kasvatettuja HEK-soluja tasaisesti neljälle 6-kuoppalevylle (24 kuoppaa) ja solujen annettiin kasvaa, kunnes ne peittivät noin 70%

In document DNA2-nukleaasi-helikaasin vaikutus mitokondrio-DNA:n toiminnassa ja korjauksessa (sivua 20-0)