MITOKONDRIO-DNA:N VAURIOIDEN MÄÄRITTÄMINEN PCR-MENETELMÄLLÄ
MIKA PALOHEINÄ
Pro gradu -tutkielma Itä-Suomen yliopisto Ympäristö- ja biotieteiden laitos
Biologia 2019
ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO
Ympäristö- ja biotieteiden laitos, biologia
PALOHEINÄ, MIKA: Mitokondrio-DNA:n vaurioiden määrittäminen PCR-menetelmällä Pro gradu -tutkielma, 50 s., liitteitä 0
Kesäkuu 2019
Avainsanat: mitokondrio, mtDNA, kaksois-PCR, siprofloksasiini, doksorubisiini, UVB Mitokondriot ovat solun energiavoimaloita, ja ne ovat vastuussa solun energia- aineenvaihdunnasta. Mitokondrioita esiintyy suurimmalla osalla tunnetuista eukaryooteista, ja niillä on oma genomi (mtDNA). mtDNA on noin 16,5 kiloemäksen kokoinen rengasmainen kaksijuosteinen DNA-molekyyli ja se sisältää 37 mitokondrion toiminnalle tärkeintä geeniä.
mtDNA sijaitsee mitokondrion matriisissa alati auki olevana kromatiinin kaltaisena molekyylinä, joka on jatkuvasti alttiina hapettavalle stressille sekä muille vauriontuottajille solun ulkoisista lähteistä. Mitokondrioiden vauriot ovat täten merkittävässä osassa monien sairauksien synnyssä.
Mitokondrionaalisen DNA:n vauriota voidaan määrittää melko nopeasti ja helposti kvantitatiivisella tosiaikaisella polymeraasiketjureaktiolla (PCR). Menetelmä on kuitenkin verrattain kallis ja hidas toteuttaa nykyisellään tarkasteltaessa matalaa vaurioastetta. Pitkät PCR:n alukkeet pitää ajaa erillisissä reaktioissa, sillä niiden toimintaan saattamisen optimointi yhteisessä reaktiossa on huomattavan vaikea prosessi. Tämän vuoksi toistettavien PCR-ajojen määrä on kaksinkertainen verrattuna yhdessä ajettaviin, joissa kaksi reaktiota suoritetaan yhdessä. PCR:t yhdistävä menetelmä tunnetaan nimellä multiplex PCR, jossa yhdistetään kaksi tai useampia PCR-reaktioita yhteiseksi yksittäiseksi PCR:ksi. Tällä menetelmällä on kuitenkin rajoitteet siinä, kuinka pitkiä PCR-tuotteita sillä on perinteisesti käytetty.
Tässä pro gradu -tutkielmassa tarkastellaan mahdollisuutta yhdistää pitkän ja lyhyen kantaman PCR:t yhteen yhteiseksi ”kaksois-PCR:ksi”. Yritetään muodostaa uusi kokeellinen PCR-koeasetelma pitkien PCR-tuotteiden kanssa ja tarkastella, kuinka hyvin menetelmä soveltuu mtDNA:n kvantitatiiviseen vaurion määritykseen. Lisäksi tässä pro gradu -tutkielmassa tarkastellaan erilaisia potentiaalisia mtDNA:n vaurion synnyttäjiä ja niiden havainnointia tosiaikaisen kvantitatiivisen PCR:n avulla.
Tässä tutkielmassa tehdyssä tutkimuksessa ei onnistuttu tekemään vakaasti ja toistettavasti toimivaa kaksois-PCR-asetelmaa mtDNA:n vaurion määrittämiseksi. Siitä huolimatta, että kokeellinen menetelmä toimi satunnaisesti, sitä ei voitu käyttää huonon toistettavuutensa vuoksi vaurion määritykseen. Tämän vuoksi mtDNA:n vaurionmääritykset suoritettiin erillisinä PCR-reaktioina.
Soluja, joiden mtDNA:n vaurioita tarkasteltiin, altistettiin tässä työssä näin:
doksorubisiinille 3,4 µM 2,5 t., siprofloksasiinille 80 µg/ml 23 t. ja ultraviolettivalolle 1,34 mJ/cm2 305 nm 30 s. Näytteitä analysoitiin tosiaikaisella kvantitatiivisella PCR-menetelmällä.
Kvantitatiivisessa analyysissä havaittiin, että doksorubisiini tuotti tilastollisesti merkitsevää vauriota HEK293-solujen mtDNA:ssa, mutta ei HeLa-solujen mtDNA:ssa. Myös ultraviolettivaloaltistus tuotti tilastollisesti merkitsevästi vauriota mtDNA:ssa. Mitatuista yhdisteistä ainoastaan siprofloksasiinilla ei havaittu tilastollisesti merkitsevästi mtDNA- vauriota millään solutyypillä.
UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND
Department of Environmental and Biological Sciences, biology
PALOHEINÄ, MIKA: Assessment of mitochondrial DNA damage via PCR-method MSc. Thesis, 50 pp., appendices 0
June 2019
Keywords: mitochondria, mtDNA, duplex-PCR, ciprofloxacin, doxorubicin, UVB
Mitochondria is the powerhouse of the cell, and they are responsible for the cellular energy metabolism. Most of the known eukaryotes have mitochondria, and the mitochondria possesses its own genome (mtDNA). mtDNA is about 16.5 kilobase sized ring-like double stranded DNA molecule and it contains 37 essential mitochondrial genes. mtDNA is located in the mitochondrial matrix constantly available as a chromatin-like molecule, which is constantly subject to both oxidative stress and other damage inducers from extracellular sources.
Mitochondrial damage is thus in a significant role in the birth of many diseases.
Mitochondrial DNA damage can be assessed quickly and easily with quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR). However, the method is expensive and slow to carry out as is when determining low levels of damage. Long PCR primers must be carried out in separate reactions and optimizing them to function together is quite challenging a process. Therefore, compared to those PCR’s that are carried out together, there are twice as many repeat PCR reactions when utilizing long range primers. The process that combines separate PCRs together is known as multiplex PCR method, where two or more PCRs are combined to a single PCR.
This method, however, has limitations in how long PCR products can be traditionally carried out.
In this Master of Sciences thesis, the possibility of combining a long- and short-range PCRs together into singular duplex-PCR is studied. A new novel PCR method is attempted to form with long PCR products and an observation is carried out as of how well that method is applicable to mtDNA quantitative damage assessment. Also, in this master thesis potential mtDNA damage forming substances are studied with quantitative real-time damage PCR.
In this thesis a working duplex-PCR for long PCR products where the method functions steadily and repeatedly could not be formed for mtDNA damage assessment. Despite that the novel method worked occasionally, it could not be utilized for its poor repeatability for damage assessment. Therefore, mtDNA damage assessments were carried out as separate PCR reactions.
Cells studied for mtDNA damage were subjected to: doxorubicin 3.4 µM 2.5 hrs., ciprofloxacin 80 µg/ml 23 hrs. and ultraviolet light 1.34 mJ/cm2 305 nm 30 s. The samples were analyzed with real-time quantitative PCR method.
In quantitative analysis, doxorubicin was observed to produce statistically significant amount of damage in HEK293 cell mtDNA, but not in HeLa cell mtDNA. Also, ultraviolet exposure induced statistically significant amount of damage in mtDNA. From the measured stressors, only ciprofloxacin did not yield statistically significant amount of mtDNA damage in any of the tested cell types.
SISÄLLYSLUETTELO
TERMISTÖ ...4
1 JOHDANTO ...5
2 KIRJALLISUUSKATSAUS...7
2.1 Mitokondriot ...7
2.2 Kvantitatiivinen PCR ...9
2.3 Kvantitatiivinen vaurion määritys -PCR ... 12
2.4 mtDNA:n vauriot ... 15
2.4.1 Topoisomeraasit ... 15
2.4.2 Doksorubisiini ... 16
2.4.3 Siprofloksasiini ... 17
2.4.4 UVB ... 18
3 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET JA HYPOTEESIT ... 18
4 AINEISTO JA MENETELMÄT... 19
4.1 HEK-solujen kasvatus ja fenoli-kloroformi-eristys qPCR-testausta varten... 19
4.2 Kaksois-PCR:n testaus ... 22
4.3 DNA:n BamHI-restriktioentsyymillä pilkkominen standardisuoran luomiseksi ... 24
4.4 HEK293-solujen DNA:n vaurioittaminen ultraviolettivalolla, doksorubisiinilla ja siprofloksasiinilla ... 25
4.5 HeLa-solujen DNA:n vaurioittaminen siprofloksasiinilla ja doksorubisiinilla ... 26
5 TULOKSET ... 28
5.1 Kaksois-PCR-menetelmän kehityksen vaiheet... 28
5.1.1 Alustava toimiva kaksois-PCR-asetelma ... 28
5.1.2 Kaksois-PCR:n testaus standardin luomiseksi mtDNA-vauriolle ... 29
5.1.3 Kaksois-PCR:n toiminnan parantelu ... 33
5.1.4 Kaksois-PCR-kokeen lopetus sekä alukkeiden vaihtaminen ... 34
5.2 HEK-solujen käsittely UV:lla, doksorubisiinilla ja siprofloksasiinilla ... 36
5.3 HeLa-solujen käsittely siprofloksasiinilla ... 37
5.4 HeLa-solujen käsittely doksorubisiinilla... 38
6 TULOSTEN TARKASTELU ... 39
7 JOHTOPÄÄTÖKSET ... 44
KIITOKSET ... 46
LÄHDELUETTELO ... 46
4 TERMISTÖ
8oxoG 8-oksoguaanini
Affisio Vaurio tai vioittuma (DNA:ssa)
Amplikoni PCR:ssä tuotettu DNA:n kohdejuosteen kopio
Amplifikaatio Kohdennetun DNA-sekvenssin monistaminen PCR:ssä
ATP Adenosiinitrifosfaatti, solun energia-aineenvaihdunnan molekyyli BER Emäksen poistokorjaus
bp Base pair, emäspari, mittayksikkö DMEM Solujen kasvatusliuos
dNTP Deoksinukleotiditrifosfaatti
HEK293 Tutkimuksessa käytetty ihmisen alkion munuaisen solujen linja HeLa Tutkimuksessa käytetty Henrietta Lacksin syöpäsolulinja Inkubointi Solujen viljely kasvatusliuoksessa lämpökaapissa
Kaksois-PCR Kokeellinen menetelmä kahden PCR:n yhteiseen toimintaan saattamiseksi kb Kilo base, tuhat emäsparia, mittayksikkö
Konfluenssi Yhteen kasvaneet solut. l. täysi soluviljely
LORD-Q Pitkän kantaman tosiaikainen PCR-analyysi DNA:n vaurion määritykseen mtDNA Mitokondrionaalinen DNA
NER Nukleotidin poistokorjaus
PBS Fosfaatilla puskuroitu suolaliuos solujen pesuun Pol-γ Polymeraasi-gamma
RITOLS Yksijuosteisen DNA:n suojaaminen RNA:lla mtDNA:n replikaatiossa ROS Reaktiiviset happiradikaalit
RT Huoneenlämpö
SLR PCR Puolipitkän kantaman tosiaikainen PCR
UV Ultraviolettisäteily: UVA, UVB, UVC ovat eri säteilyn aallonpituuksia qPCR Kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio
5 1 JOHDANTO
Mitokondrion genomi eli mitokondrionaalinen DNA (mtDNA) on tumallisesta DNA:sta erillinen genomi, joka on rakenteeltaan rengasmainen molekyyli, ja täten tärkeä osa mitokondriota sekä sen proteiinisynteesiä. Vaikka mtDNA on kiinnittyneenä mitokondrion solukalvoon nukleoideina, niillä ei ole tumallisen DNA:n tavoin histoneista koostuvia nukleosomeja, joiden ympärille mitokondrionaalinen DNA-pakkautuu suojaan (Gilkerson ym.
2013). Koska mtDNA on lähes jatkuvasti avoimena molekyylinä mitokondrion matriisissa, se on alttiina happiradikaalien synnyttämälle hapetusvauriolle. Lisäksi myös useat erilaiset myrkyt sekä säteily erilaisista ympäristön lähteistä voivat vaurioittaa mtDNA:ta merkittävästi. Näiden tekijöiden vuoksi mtDNA:lla on tumallista DNA:ta korkeampi mutaatioaste. (Nelson & Cox 2013).
Mitokondrio korjaa sen DNA:han akkumuloituvia vaurioita hyödyntämällä tähän tehtävään erikoistuneita entsyymejä ja proteiineja, jotka ovat osittain samankaltaisia kuin tumallisen DNA:n vastineet. Vaikka mitokondriolla tunnetaan monia erilaisia vaurion korjausmekanismeja, siltä puuttuu sellaisia merkittäviä mekanismeja, joita löytyy tumalliselta DNA:lta. Merkittävin näistä puutteista on mitokondrion puuttuva kyky korjata pyrimidiini- ja tymidiinidimeerejä. mtDNA poikkeaa tumallisesta DNA:sta myös siten, että se tarvitsee jatkuvasti sitä uusivaa replikaatiota korvaamaan mitofagiassa hajoavia molekyylejä. Toisin kuin jo erilaistuneiden solujen tumissa, joissa DNA:n synteesiä ei enää tapahdu, tumallisessa DNA:ssa ei myöskään tarvita sitä uusivaa replikaatiota. Tämän takia erilaiset mtDNA:ssa syntyvät vauriot voivat aiheuttaa mutaatioiden lisäksi ongelmia myös mtDNA:n replikaatiossa (Alexeyev ym. 2013).
Mitokondriossa on myös muita mekanismeja, jotka vaikuttavat mtDNA:n mutaatioasteeseen. Esimerkiksi mitokondrionaalisen DNA-polymeraasin γ:n (Pol-γ) tarkkuus riippuu deoksinukleotiditrifosfaattien (dNTP) saatavuudesta, joten vajavuudet dNTP:n tasoissa voivat aiheuttaa merkittäviä replikaatiovirheitä mtDNA:ssa. On kuitenkin huomattavaa, että suuretkaan mtDNA:n häviöt eivät ole välttämättä mitokondriolle tuhoisia. mtDNA:n redundantin luonteen vuoksi kussakin mitokondriossa on useita mtDNA:n kopioita ja jokaisessa diploidissa solussa on sadoista tuhansiin mitokondrioita, jonka avulla peruuttamattomasti vaurioituneet mtDNA:t voidaan korvata näiden jäljelle jäävien ehyiden mitokondrioiden genomien pohjalta (Song ym. 2005).
Hapetusvauriota mtDNA:ssa voidaan tarkastella erilaisten markkereiden avulla, joiden läsnäolo ilmentää määrällisesti DNA:han syntynyttä vauriota. Mitokondriossa tällaisia
6
markkereita ovat muun muassa 8-oksoguaanini (8oxoG), jonka läsnäolo ilmentää vaurioiden olemassaoloa mtDNA:ssa, vaikka se ei itsessään olekaan merkittävä vauriotyyppi (Leon ym.
2015). Muita olennaisia mtDNA:ssa ilmeneviä vahinkotyyppejä ovat niin kutsutut emäksettömät AP-kohdat (engl. abasic site) sekä juostekatkokset, jotka voivat aiheuttaa koko DNA:n replikaatiokoneiston pysähtymisen DNA-replikaatiossa. Kuitenkaan niitä mekanismeja, jotka korjaavat koko replikaatiohaarukan pysähtymistä, ei vielä tähän mennessä ole kyetty tunnistamaan (Nelson & Cox 2013).
mtDNA:ssa tarkasteltavaa vaurion astetta tutkitaan niin sanotulla lyhyen ja pitkän kantaman polymeraasiketjureaktiolla (PCR) samaan tapaan kuin tumallisessa genomissa. Menetelmän toiminta perustuu DNA-näytteen kahden PCR-mittauksen keskinäiseen vertailuun, jonka perusteella määritetään DNA:ssa ilmenevien juostekatkoksien määrää. Lyhyen kantaman PCR kertoo kokonaisen templaattijuosteen määrän reaktiossa, koska DNA:ssa olevien vaurioiden määrä ei vaikuta merkittävästi sen muodostamien PCR-tuotteiden (amplikoni) kokonaismäärään. Ja pitkän kantaman amplikoni kvantifioi DNA:ssa ilmenevää vauriota, koska se kattaa merkittävästi pidemmän osan replikoitavasta DNA:sta ja täten DNA:ssa ilmenevät satunnaisjakautuneet vauriot vaikuttavat todennäköisemmin sen monistamiseen (Santos ym.
2006).
PCR-menetelmä vaurion määritykseen on verrattain hyvin tunnettu ja toimivaksi todettu, mutta toiminnaltaan jokseenkin epäspesifi ja vaivalloinen menetelmä toteuttaa pitkillä amplikoneilla. Sen riippuvaisuus kahdesta erikseen tehtävästä mittauksesta heikentää tarkkuutta molemmilla sekä lyhyen että pitkän kantaman PCR:llä pipetointivirheistä syntyvien eroavaisuuksien vuoksi. Lisäksi erikseen ajettuna menetelmä on kallis suorittaa, sillä kaksi PCR-reaktiota per mitattava näyte kuluttavat merkittävästi reagensseja. Tämän vuoksi kaksi erillistä PCR:ä yhteiseksi yhdistävä PCR menetelmä onkin jo laajasti hyödynnetty prosessi kvantitatiivisissa mittauksissa vaurion määritykseksi lyhyillä amplikoneilla. Pidemmillä pitkän kantaman amplikoneilla tehtynä vastaava menetelmä on vielä verrattain uusi ja siksi huonosti dokumentoitu prosessi, jonka toimivaksi optimoinnista ja tarkkuudesta ei ole vielä kertynyt merkittävästi tutkimustietoa (Perkel 2012). Englanninkielisessä kirjallisuudessa kaksi PCR:ä toisiinsa yhdistävää menetelmää kutsutaan joko duplex-PCR- tai double-PCR-termeillä eri lähteiden mukaan. Tässä tutkielmassa kyseiseen menetelmään viitataan suomennetulla termillä ”kaksois-PCR.”
Tämän pro gradu -tutkielman tarkoituksena on tarkastella mtDNA:ta sekä siinä ilmeneviä vaurioita ja kehittää erikoistunutta kvantitatiivista polymeraasiketjureaktiomenetelmää (qPCR) vaurion määritykseen.
7 2 KIRJALLISUUSKATSAUS
2.1 Mitokondriot
Mitokondriot ovat eukaryoottisolujen energia-aineenvaihdunnasta vastuussa olevia soluorganelleja, joita löytyy suurimmalta osalta kaikista tunnetuista eukaryooteista. Niiden tehtävänä on tuottaa energiaa soluhengityksessä, joka tapahtuu osin mitokondrion ulkopuolella glykolyysinä ja osin mitokondrioissa sekä sitruunahappokiertona että oksidatiivisena fosforylaationa. Energiantuotannon lisäksi mitokondriot ovat vastuussa muista kriittisistä toiminnoista, kuten hemoglobiinin hemiosan biosynteesistä, ureakierron osasta sekä ohjatusta solukuolemasta eli apoptoosista (Christian & Spremulli 2011).
Mitokondrion ulkoinen rakenne koostuu kaksoiskalvostosta. Ulompi kalvoista muodostaa mitokondrion ulkoisen rakenteen ja antaa sille sen muodon toimimalla samalla suojaavana kuorena. Sisempi kalvoista on useaan kertaan laskostunutta, joka muodostaa kristoiksi kutsuttuja poimumaisia rakenteita. Tällä sisemmällä solukalvolla tapahtuu mitokondrion oksidatiivinen fosforylaatio, joka tuottaa protonigradientin avulla merkittävimmän osan solujen energiana käyttämästä ATP:stä (Vogel ym. 2006).
Koska mitokondrioilla on oma genominsa, mtDNA, ne poikkeavat tumaa lukuun ottamatta kaikista muista eläinsolun organelleista, joilla ei ole vastaavanlaisesti omaa erillistä genomiaan.
mtDNA:n replikaatio tapahtuu tumallisesta genomista erikseen osana mitokondrion omaa biogeneesiä. Tämä poikkeavuus johtunee eukaryoottisolun ja mitokondrion evolutiivisesta historiasta, jossa mitokondrio alkujaan kehittyi erikseen itsenäisenä yksisoluisena alkueliönä ja jossakin varhaisessa eukaryoottisolun evoluution vaiheessa se siirtyi eukaryoottisolun sisään osaksi sen toiminnallista rakennetta niin kutsutussa endosymbioosissa (Gray ym. 2001). Kun mitokondrio oli yhdistynyt eukaryoottisoluun omaksi soluorganellikseen, se menetti evoluution myötä suuren osan sen omaa toimintaansa ylläpitävästä genomista, jonka toiminta ja säätely siirtyivät solun tuman DNA:han (Nelson & Cox 2013).
Mitokondrion genomi muodostuu rengasmaisesta kaksijuosteisesta DNA-molekyylistä, joka on noin 16,5 kiloemäksen (kb, engl. kilobase) kokoinen molekyyli, eli 16 569 emäsparia (bp, engl. base pair). Se koodaa 13:a polypeptidiä, jotka ovat yksinomaan mitokondrion toiminnalle olennaisten solunsisäisen elektroninsiirtoketjun, kahden ribosomaalisen RNA:n (rRNA) ja 22 siirtäjä-RNA:n (sRNA) osia (Mandavilli ym. 2002).
8
Kaikki mitokondriossa syntetisoitavat proteiinit sijaitsevat mitokondrion sisäkalvolla, jossa ne toimivat elektroninsiirtoketjun alayksiköinä. Näihin kuuluu seitsemän kompleksi I:n alayksikköä (NADH: ubikinonin oksidoreduktaasi), yksi kompleksi III:n alayksikkö (ubikinoni: sytokromi c oksidoreduktaasi), kolme kompleksi IV:n alayksikköä (sytokromi c:
hapen oksidoreduktaasi) ja kaksi kompleksi V:n alayksikköä (ATP-syntaasi). Loput nisäkkään mitokondrion noin kahdesta tuhannesta proteiinista ovat sytoplasmassa syntetisoitavan tumallisen genomin tuotteita (Christian & Spremulli 2011). Myös kaikki mitokondrion säätelyyn sekä proteiinisynteesiin liittyvät proteiinit ovat siirtyneet tumallisen DNA:n koodaamiksi (Das ym. 2012).
mtDNA sijaitsee mitokondriossa sisäkalvon lähellä kromatiinin kaltaisena rakenteena, joka on järjestäytynyt mitokondrion kalvolle nukleoideiksi. Nukleoidit eristävät mtDNA:n ja koordinoivat mitokondrion solunsisäistä metabolismia (Gilkerson ym. 2013). mtDNA ei ole yhtä tiivistyneenä kuin tumallinen DNA, mikä tekee siitä tumallista DNA:ta alttiimman sekä hapettavalle että muunlaiselle ulkosyntyiselle vauriolle (Rothfuss ym. 2010). Mitokondrion genomin vauriot eritellään yleisesti joko hapettumisvaurioksi tai kemialliseksi vaurioksi. Näistä jälkimmäistä syntyy hyvin monista erilaisista yhdisteistä. Joita esimerkiksi ovat erilaiset lipofiiliset polysykliset aromaattiset hiilivedyt, atsovärit ja nitrosoamiinit, jotka synnyttävät DNA:han vauriota. Näiden yhdisteiden kertyminen mitokondrioon ulkopuolelta voi johtaa merkittäviin mtDNA:n muutoksiin joko piste- tai frameshift-mutaatioina (Mandavilli ym.
2002).
Reaktiiviset happiradikaalit (engl. Reactive Oxygen Species, ROS) ovat yleisesti mitokondrion elektroninsiirtoketjun toiminnan häiriön tuotteita. Mitokondriossa syntyy ROS:ia, kun elektroninsiirtoketju luovuttaa elektroneja vedelle, joka synnyttää vetyperoksidia (H2O2). Vetyperoksidi vuorostaan voi tuottaa fentonin reaktiossa vapaita happiradikaaleja (∙OH) mitokondrion matriisiin. Superoksidin dismutaasit muuntavat tarpeen mukaan näitä happiradikaaleja takaisin vetyperoksidiksi. Tällaiset yhdisteet kuitenkin ovat voimakkaasti hapettavia, ja siksi ne ovat haitallisia mtDNA:lle, joka on altis hapettumisen vauriolle (Kang &
Hamasaki 2003). Yksi tunnettu mtDNA:ssa kumuloivaa hapettumisvauriota muodostava yhdiste on 8oxoG. Se on hapettunut emäksen affisio, joka voi pariutua mm. adeniinin ja sytosiinin kanssa aiheuttaen transversio-mutaatioita (G-C → T-A) mtDNA:ssa (Leon ym.
2015). 8oxoG:tä käytetään yleisesti tutkimuksessa mtDNA:n vaurion määritykseen. Se ei kuitenkaan itsessään ole todennäköinen DNA-mutaation tuottaja, sillä useat erilaiset vaurionkorjausmekanismit mitokondriossa korjaavat sen synnyttämää DNA-vauriota. 8oxoG ei myöskään inhiboi mitokondrionaalisten DNA-polymeraasien (Pol-γ ja Taq-polymeraasi
9
PCR:ssä) toimintaa, jonka vuoksi sitä ei voi tunnistaa kaikilla menetelmillä. 8oxoG:tä ilmenee vain oksidatiivisessa stressissä, ja muut DNA-vauriota synnyttävät stressit eivät välttämättä johda 8oxoG-tason nousuun, jonka vuoksi se ei ole ihanteellinen yhdiste tarkkailtavaksi DNA:n vaurionmäärityksessä (Stevnsner 2002). mtDNA:n vaurioittaminen erilaisilla yhdisteillä, joiden tiedetään tuottavan DNA-polymeraasia pysäyttäviä juosteen affisioita, tuottavat merkittävästi paremman tarkastelukohdan vaurioiden tarkasteluun. Esimerkiksi antrasykliinien on todettu synnyttävän merkittävää mtDNA-vauriotaihmisen sydänsoluilla ROS-yhdisteiden kautta (Lebrecht ym. 2005). Myös muiden yhdisteiden, kuten fluorokinolonien, on epäilty aiheuttavan mtDNA-vauriota (Dias & Bailly 2005). Joidenkin fluorokinolonien tiedetään vaikuttavan inhiboiden mitokondrionaalista DNA-gyraasia ja topoisomeraasia sekä synnyttävän ROS:ia, joka voi vaurioittaa osaltaan mtDNA:ta. Kuitenkaan kaikilla fluorokinoloneilla ei tunneta suoraa DNA:n vauriota synnyttävää mekanismia (Lowes, ym.
2009). Mitokondriolla tunnetaan useita vaurionkorjausmekanismeja, joihin kuuluvat pyrimidiinejä korjaava suoran palautuksen korjaus (engl. direct reversal), replikaation virheitä korjaava emäksen poistokorjaus (engl. base excision repair, BER), sekä useita erilaisia DNA:n juostekatkoksen ja emäksen korjausmekanismeja (mm. Alexeyev ym. 2013). Kuitenkaan mitokondriolla ei ole nukleotidin poistokorjausta (engl. nucleotide excision repair, NER), minkä vuoksi mtDNA:sta ei pystytä korjaamaan erityisesti säteilystä johtuvaa vauriota (Clayton ym. 1974).
2.2 Kvantitatiivinen PCR
Polymeraasiketjureaktio on 1980-luvulla kehitetty menetelmä, jonka avulla voidaan monistaa DNA:ta näytteestä hyödyntämällä polymeraasientsyymiä (Mullis ym. 1986). Kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktioanalyysi (qPCR) on 1990-luvulla PCR:stä jatkokehitetty menetelmä, jonka avulla mitataan tunnetun DNA:n määrää näytteestä (Higuchi ym. 1993). Samoihin aikoihin 1990-luvulla kehitettiin myös DNA:n vauriota mittaava PCR, jonka avulla voitiin tarkastella PCR:ssä monistettujen DNA-fragmenttien vaurion astetta erottelemalla syntyneet DNA-fragmentit toisistaan PCR:n jälkeisellä prosessoinnilla (Ponti ym. 1991). Vasta 2006 kehitettiin näiden kahden PCR:n tapaan toimiva tosiaikainen vaurion määritys -qPCR, jonka avulla DNA-vauriota pystyttiin mittaamaan tarkasti ja tosiaikaisesti PCR-reaktiossa (Santos ym. 2006). Tosiaikaisessa vaurion määritys -qPCR:ssä käytetään yleisesti jaoteltuna kahta erilaista tosiaikaisen kemian menetelmää havainnointiin. Ensimmäinen niistä perustuu SYBR Green -menetelmän fluoresenssiin, ja toinen TaqMan-menetelmän fluoresenssiin. Menetelmät
10
eroavat toisistaan toiminnallisesti ja kummallakin niistä on omat erityiset vahvuudet ja heikkoudet.
SYBR green -menetelmän värin toiminta perustuu siihen, että se havaitsee polymeraasiketjureaktion tuotteet sitoutumalla kaksijuosteiseen PCR:än. Kun väriä lisätään näytteeseen, se sitoutuu kaikkeen saatavilla olevaan kaksijuosteiseen DNA:han, ja sitoutuneena se fluoresoi 488 nanometrin (nm) aallonpituudella. PCR:n aikana DNA-polymeraasi monistaa alukkeen aloittamaa kohdesekvenssin monistamista, joka tuottaa sekvenssin mukaisia amplikoneja. Tämän jälkeen SYBR-väri sitoutuu kaikkiin syntyneisiin uusiin kaksijuosteisiin DNA:n kopioihin. Sitä mukaa kun PCR:ä prosessoidaan, SYBR-väriä sitovaa PCR-tuotetta muodostuu jatkuvasti enemmän (mm. ThermoFisher Scientific 03.09.2018, Biosyn 04.03.2019). Fluoresenssin voimakkuus PCR:ssä on suoraan verrannollinen syntyvän tuotteen määrään. Se muodostaa PCR-laitteen mittauksen kuvaajassa kasvukäyrän, josta voi päätellä näytteessä olevan DNA-määrän. SYBR green -väri soveltuu kaikkien DNA-tuotteiden havaitsemiseen riippumatta näytteestä, eikä määrityksessä tarvita erillistä koetinta, joka vähentää suoritettavan kokeen reagenssien kuluja (mm. Morrison ym. 1998, Nygard ym. 2007).
Edellä esitettyjen syiden takia SYBR green -väriä on kuitenkin ongelmallista käyttää, sillä epäspesifinen amplifikaatio voi muodostaa väärän positiivisen signaalin. Epäspesifisten DNA- jaksojen monistuminen näytteessä aiheuttaa ongelmia DNA:n määrityksessä, minkä vuoksi spesifisten haluttujen DNA-tuotteiden havainnointi vaatii työlään alukkeiden suunnittelun ja testauksen toimiakseen (Perkel 2012). SYBR green -menetelmä on myös altis pipetointivirheille kokeessa käytettävien useiden koeputkien ja pipetointivaiheiden vuoksi haluttuja referenssinäytteitä ja sekvenssejä määritettäessä. Tämän vuoksi se ei sovellu herkkien kaksois-PCR-kokeiden suorittamiseen (Steffi Goffart suull. tied. 14.01.2019).
TaqMan-kemia on toimivaksi havaittu menetelmä tarkkuutta vaativiin ja toistettaviin kokeisiin PCR-tuotteilla. TaqMan-kemia perustuu oligonukleotidiseen koettimeen, joka sisältää fluoresoivan reportterivärin 5’-päässä ja vaimenninvärin 3’-päässä, joka absorboi reportterivärin fluoresenssia ollessaan sen läheisyydessä. Koetin kiinnittyy kohdesekvenssiin PCR:n alukkeiden liittymisvaiheessa, ja Taq-DNA polymeraasin 5’-nukleaasin aktiivisuus katkaisee koettimen, kun entsyymi polymerisoi sitomissekvenssin. Katkaisu irrottaa reportterivärin vaimenninväristä, jonka ansiosta reportterivärin fluoresenssi tulee havaittaviin.
Loput koettimesta irtoaa kohdejuosteesta polymeraasin vaikutuksesta ja aluke saattaa alulle amplikonin monistamisen normaaliin tapaan templaattijuosteen loppuun asti. Tämä mekanismi toistuu PCR:ssä sitä mukaa kun koettimia leikataan pois uusien tuotteiden monistumisen tieltä,
11
jolloin syntyy monistetun kohdejuosteen määrän esittävän fluoresenssin voimakkuuden kasvua (mm. ThermoFisher Scientific 03.09.2018, Biosyn 04.03.2019).
TaqMan-kemian edut SYBR-väriin verrattuna tulevat siitä, että ainoastaan koettimen hybridisaatiosekvenssien synteesi synnyttää fluoresoivaa signaalia, jolloin epäspesifinen DNA:n monistaminen näytteessä ei haittaa kohdesekvenssin monistumisen havainnointia synnyttämällä väärää positiivista signaalia. TaqMan-kemiassa koettimet voidaan leimata erilaisilla tunnistettavilla reportteriväreillä, jotka mahdollistavat usean erilaisen sekvenssin amplifikaation havaitsemisen samassa reaktiossa. Myös PCR:n jälkeinen analyysi taustakohinaa lisäävästä koettimen spontaanista hajoamisesta reaktiossa ilman syntynyttä tuotetta voidaan eliminoida TaqMan-kemiassa, mikä helpottaa ja nopeuttaa analyysin suoritusta. TaqMan-kemian merkittävin heikkous tulee siitä, että eri koettimet pitää syntetisoida jokaista erilaista sekvenssiä varten erikseen (mm. ThermoFisher Scientific 03.09.2018, Biosyn 04.03.2019).
Tosiaikainen vaurion määritys -qPCR hyödyntää standardisuoraa templaattinäytteen lähtömäärän määrittämiseksi. Standardi voidaan saada näytteiden laimennossarjasta, jossa on tunnettu määrä samasta DNA:sta restriktiopilkottua ja ehyttä ei-restriktioentsyymipilkottua näytettä laimennettuna keskenään tunnetussa suhteessa. Laimennossarjasta mitataan se arvo amplifikaatiokäyrästä, jossa jokainen laimennoksen näytteistä ylittää raja-arvon PCR-syklin (Ct) aikaa vasten tarkasteltuna. Mittauksista saadut amplifikaatiokäyrät ovat kääntäen verrannollisia näytteen DNA-määrään, sillä mitä vähemmän mitattavassa näytteessä on DNA:ta, sitä myöhemmin amplifikaatiokäyrä risteää Ct:n kanssa (kuva 1). Laimennossarjojen kustakin Ct-arvosta muodostetaan suora tunnettujen laimennosten pitoisuuksien kanssa, josta määritetään kulmakerroin (joka määrittää PCR:n hyötysuhdetta), y-akselin leikkauspiste (joka määrittää arvoa, jossa x=0) ja R2 eli totaalivariaatio (joka määrittää, kuinka hyvin regressiosuora sijoittuu annetuille datapisteille). Kun standardisuora on määritetty, sitä vasten tarkasteltuna voidaan määrittää muiden tutkittavien näytteiden templaattien määrää näytteen Ct-arvosta (mm. ThermoFisher Scientific 27.03.2019).
12
Kuva 1. Esimerkkikuva PCR:n amplifikaatiosta, jossa on merkattu syklien määrä x-akselille ja fluoresenssi y-akselille. PCR:n mittausten raja-arvo on merkattu sinisellä janalla, jonka risteämiskohta (Ct) on merkitty nuolella amplifikaatiokäyrän ja raja-arvon leikkauspisteeseen.
PCR:n mittauksen kolme vaihetta, 1. aloitus, 2. eksponentiaalinen kasvu ja 3. kasvun pysähtyminen, on merkitty kuvaajaan numeroilla (Muokattu: Hugget & O’Grady 03.09.2018).
2.3 Kvantitatiivinen vaurion määritys -PCR
Tosiaikaista qPCR-menetelmää on käytetty onnistuneesti DNA:n vaurion määritykseen laboratorio-oloissa useilla eri malliorganismeilla, joihin luetaan myös ihmisen solut.
Tosiaikaisen vaurionmallinnus-qPCR -menetelmän toimivuutta, sen hyötyjä sekä soveltuvuutta mtDNA:n vaurion mittauksessa on raportoitu kattavasti kirjallisuudessa (mm. Hunter ym.
2010). Perinteisen tosiaikaisen qPCR:n lisäksi on olemassa myös aiemmin kehitetty ns.
semikvantitatiivinen PCR-menetelmä, jolle on ominaista se, että tutkittavan DNA:n tai RNA:n kvantitatiivinen analyysi tapahtuu vasta PCR:n reaktion jälkeen lopputuotetta analysoimalla.
Merkittävä ero tällä menetelmällä uudempaan tosiaikaiseen qPCR:än on siinä, että tuotetta ei analysoida suoraan PCR:ssä. Reaktion jälkeiseen analysointiin on olemassa erilaisia menetelmiä, kuten esimerkiksi näytteiden prosessointi geelielektroforeesilla ja siitä syntyneiden koon mukaan järjestäytyneiden DNA-molekyylien analysointi (Marone ym. 2001).
Semikvantitatiivinen PCR-menetelmä soveltuu huonosti DNA:n vaurion määritykseen, sillä menetelmä kattaa verrattain kapean dynaamisen alueen kvantitatiivisessa mittauksessa. Lisäksi eksponentiaalisen vaiheen määritys PCR-reaktiolle kullekin tutkittavalle geenille ja näytteelle on aikaa vievää ja työlästä (Breljak ym. 2005).
13
Tosiaikainen qPCR-menetelmä vaurion tunnistuksessa on vakiintunut laajalti laboratoriokäyttöön. Menetelmä perustuu siihen, että PCR:n replikaation tehokkuus on kääntäen verrannollinen monistettavan alueen juosteessa esiintyviin affisioihin. Vertailemalla pitkän ja lyhyen kantaman amplikonien määriä keskenään niiden välinen erotus paljastaa DNA- näytteiden juosteiden vaurioasteen. Vaurioituneen templaattijuosteen amplikonit monistuvat PCR:ssä heikommin kuin ehyet, koska juostevauriot estävät PCR:n polymeraasin toimintaa juosteen monistamisessa. Kvantitatiivisessa analyysissä amplifioidaan sekä pitkän että lyhyen kantaman alukkeiden monistamia templaattijaksoja DNA:ssa yhdessä. Vauriot DNA:ssa jakautuvat satunnaisesti eri kohtiin koko DNA-juosteen alueelle, jolloin ne todennäköisemmin sijoittuvat pitkän kuin lyhyen kantaman amplikonin alueelle (Ayala-Torres ym. 2000). Koska lyhyen kantaman jakso on verrattain lyhyt (noin 100-200 emästä), voidaan olettaa, että satunnaisesti jakautunut DNA-vaurio ei todennäköisesti osu lyhyelle DNA-jakson alueelle.
Täten lyhyen kantaman PCR:ä voidaan käyttää määrittämään näytteen DNA:n kohdesekvenssin määrän. Vastaavasti todennäköisyys sille, että mutaatiot osuvat pitkän kantaman amplikonin jaksolle, on korkea, sillä amplikonina käytetään mahdollisimman pitkää sekvenssiä (yli 1 000 emästä). Tällöin vauriot DNA:ssa johtavat heikentyneeseen amplifikaatioon pitkän kantaman amplikoneilla haittaamalla PCR-reaktiossa käytettävän DNA-polymeraasin toimintaa.
Heikentynyttä amplifikaatiota pitkän kantaman PCR:ssä voidaan täten verrata lyhyen kantaman amplikoniin, jossa DNA-vaurioiden tuoma amplifikaation heikkeneminen ei näy. Pitkän ja lyhyen kantaman PCR:n replikaation suhteita vertailemalla keskenään pystytään päättelemään DNA:n vaurioaste per DNA-sekvenssin osa (noin 10 kb per sekvenssi) (Meyer 2009).
Tosiaikaisen qPCR:n fluoresenssin mittauksista tarkastellaan vaurioastetta tekemällä vaurion määritys ”pitkän kantaman tosiaikainen PCR-analyysi DNA:n vaurion kvantifioimiseksi” -menetelmällä (engl. long-run real-time PCR technique for DNA-damage quantification, LORD-Q). Se on DNA:n vaurioasteen määrittämisen analysointimenetelmä, joka on kehitetty aiempien tosiaikaisten qPCR-menetelmien pohjalta suurien näytemäärien nopeaan analysointiin. Perinteisen tosiaikaisen vaurionmallinnus-qPCR:n rajoite vaurion määrityksessä tulee siinä monistettavan amplikonin pituudesta, joka on verrattain lyhyt, vain joitakin satoja emäspareja pitkä sekvenssi, joka ei välttämättä ilmennä riittävän hyvin satunnaisjakautunutta vauriota DNA:ssa vaurioasteen ollessa hyvin vähäinen. Tämän vuoksi LORD-Q-menetelmä hyödyntää merkittävästi aiempaa qPCR:ä pidempiä templaattijuosteita vaurion määrityksessä. Mikäli juostevauriot ovat tasaisesti jakautuneet templaattijuosteessa, LORD-Q:ssa käytetyt pidemmät amplikonit sisältävät todennäköisemmin polymeraasia inhiboivia DNA-modifikaatioita, joka ilmenee pitkän kantaman amplikonin monistaman
14
juosteen myöhästyneenä eksponentiaalisena amplifikaatiovaiheena PCR:ssä (Lehle ym. 2013).
Tämä näkyy PCR-mittauksessa käyrän Ct-määreestä (kuva 1). Amplikonin pituus ja DNA:n juostevauriot koetinsekvenssissä korreloivat lineaarisesti keskenään, eli pidemmät DNA- koettimet parantavat DNA-vaurion kvantifioimista (Hugget & O’Grady 2018).
LORD-Q-menetelmä ohittaa ongelmat perinteisen qPCR:n sensitiivisyydessä siinä käytettävän rajoitetun PCR-tuotteen pituuden muodostaman epätarkkuuden osalta. Paranneltu menetelmä mahdollistaa pidempien DNA-sekvenssien amplifikaation ja kvantifioimisen PCR:ssä. Lisäksi koettimen pituuden kasvattaminen suosii vähäisien DNA-vauriomäärien tunnistamista, jotka saattavat jäädä huomaamatta perinteisessä qPCR:ssä. LORD-Q- menetelmällä on mahdollista havaita DNA:n vauriota sekä tumallisessa että mitokondrionaalisessa DNA:ssa, jonka vuoksi se on kattava analysointimenetelmä useiden erityyppisten vaurioiden tunnistamiseen. Koska LORD-Q-menetelmällä voidaan tehdä tarkka ja kattava vaurioasteen määritys verrattain pienistä ~50 ng/µl DNA-näytteistä reaaliajassa käyttäen noin 3-4 kb pituisia amplikoneja, se soveltuu erityisesti pienien DNA-näytemäärien ja matalan asteen vaurion määritykseen (Dannenmann ym. 2017).
LORD-Q-menetelmän on käytännössä todettu toimivan DNA-vaurion kvantifioimisessa altistamalla ihmisen Jurkat T -lymfosyyttisoluja eriasteisille genotoksiineille. Näitä ovat muun muassa 254 nm UVC-valo, sisplatiini, etoposidi ja bleomysiini, joiden kaikkien vauriota on kyetty tunnistamaan DNA:ssa. Useista testatuista genotoksiineista ainoastaan etoposidin ei havaittu vaurioittavan tehdyssä kokeessa mtDNA:ta, vaikka sen aiheuttamaa vauriota havaittiin tumallisessa DNA:ssa. Tutkimuksessa myös havaittiin, että LORD-Q-menetelmä pystyy havaitsemaan sellaiset pienet vauriot matalissa altistuksissa genotoksiineille, jotka eivät olleet solulle tappavia (Lehle ym. 2013).
Tunnetaan myös toinen tosiaikainen PCR, puolipitkän kantaman PCR (engl. Semi long-run PCR, SLR PCR), jonka on havaittu toimivan DNA:n vaurioasteen määrittämisessä pitkän kantaman PCR-menetelmän veroisesti (Rothfuss ym. 2009). SLR PCR on LORD-Q:sta muunneltu PCR-menetelmä, joka hyödyntää lyhyempää, noin 1,5-2 kb pituista amplikonia, vaurion määrityksessä saavuttaen kuitenkin vastaavan erotteluresoluution kuin pidemmillä amplikoneilla. SLR PCR:n havaittiin toimivan yhtä hyvin sekä tumallisen DNA:n että mtDNA:n kanssa. Se tuotti vähemmän epäspesifisiä PCR-tuotteita geelielektroforeesissa tarkasteltuna kuin pitkän kantaman amplikoneilla, mutta oli kuitenkin yhtä tarkka vaurioasteen määrityksessä kuin LORD-Q (Zhu & Coffman 2017).
15 2.4 mtDNA:n vauriot
2.4.1 Topoisomeraasit
DNA:n topoisomeraasi on entsyymi, joka katalysoi topologista DNA:n isomerisaatiota katkaisemalla ja yhdistämällä yhtä tai kumpaakin DNA:n juostetta (mm. Gellert 1981, Campbell 2008). Tunnetut topoisomeraasit jaotellaan yleisesti kahteen pääryhmään: tyypin 1 ja tyypin 2 topoisomeraaseihin. Tyypin 1 topoisomeraasi katalysoi muutosta DNA:n topologiassa tekemällä katkoksen yhteen kaksoisjuosteisen DNA:n juosteista, mikä on tärkeä mekanismi DNA-juosteen kierteisyyden vähentämiseksi. Tyypin 2 topoisomeraasit katalysoivat muutoksia DNA:n topologiassa katkaisemalla molemmat kaksijuosteisen DNA:n juosteista DNA:n superkierteisyyden ja muiden DNA-vyyhtien selvittämiseksi (Miller ym. 1981). Sekä tyypin 1 että tyypin 2 topoisomeraasien toiminta mitokondrioissa on melko huonosti tunnettu. Viime vuosina on kuitenkin saatu selville, että Top 2 vähentää mtDNA:n positiivista superkierteisyyttä (Hangas ym. 2018). Lisäksi on saatu selville, että mitokondrionaalinen TOP1 vähentää mtDNA:n negatiivista superkierteisyyttä (Baechler ym. 2019). Erityyppisten topoisomeraasien inhibiittoreita on tunnistettu mitokondriossa, ja niiden toiminnan on todettu inhiboivan sekä tumallisia että mitokondrionaalisia entsyymejä (Lawrence ym. 1993).
Monet topoisomeraaseja inhiboivista myrkyistä ovat syöpälääkkeitä, joiden toiminta on olennaista syöpäsolujen kasvun hidastamiseksi. Lääkkeinä käytettävät topoisomeraasimyrkyt toimivat tappamalla liian nopeasti lisääntyviä soluja pitäen normaalit hitaammin jakautuvat solut hengissä (mm. Delgado ym. 2018). Topoisomeraasin inhibiittoreita on useita erilaisia, mutta niillä kaikilla on samankaltainen toiminnallinen mekanismi. Ne häiritsevät tai keskeyttävät topoisomeraasin ohjaaman DNA:n katkaisun ja uudelleenliittämisen mekanismia (Laponogov 2009). Topoisomeraasimyrkyt saattavat synnyttää toiminnallaan juostekatkoksia tai muita emäsvirheitä DNA:ssa (Robinson ym. 1991). Esimerkiksi antrasykliineihin kuuluvan doksorubisiini-syöpälääkkeen on todettu synnyttävän kaksoisjuostekatkoksia nisäkkäiden tumallisessa DNA:ssa (Capranico ym. 1990). Kuitenkaan kattavaa tutkimusta topoisomeraasimyrkkyjen vaikutuksesta mitokondrionaalisissa topoisomeraasissa ja niiden vaikutuksesta mtDNA:han ei ole vielä tehty.
16 2.4.2 Doksorubisiini
Doksorubisiini on antrasykliinien ryhmään kuuluva yleisesti käytetty syöpälääke, jonka tärkein toiminnallinen mekanismi on topoisomeraasi 2:n inhibitio. Tämä mekanismi johtaa kattaviin tumallisen DNA:n vaurioihin nopeasti monistuvissa soluissa. Koska syöpäsolujen DNA:lla on virheellisesti toimiva replikaatiomekanismi, ne kuolevat doksorubisiinin vaikutuksesta toisin kuin normaalit solut, joiden replikaatio on hallittua. Doksorubisiinin pitkäaikaiskäytössä sen sivuvaikutuksena ilmenee annosspesifistä myöhään ilmenevää kroonista kardiotoksisuutta, jota on myös havaittu in vivo -kokeissa rotilla (Lefrak ym. 1973). Altistetuilla rotilla havaittiin merkittävästi kohonnutta sydämen lihassolujen mtDNA:n vauriota (Zhou ym. 2001).
Samanlainen korrelaatio on myös havaittu kliinisissä ihmiskokeissa, joissa doksorubisiinilla sekä muilla antrasykliineillä lääkittyjen ihmisten sydämistä ja luustolihaksista post mortem - kerättyjä näytteitä tutkittiin mtDNA:n vaurioiden ilmenemistä eri menetelmin.
Doksorubisiinille altistetuissa sydänlihaksissa oli merkittävä ero mtDNA:n vaurion asteessa muihin lihasnäytteisiin verrattuna, eikä luustolihasnäytteissä havaittu juuri ollenkaan doksorubisiinin synnyttämiä vaurioita (Lebrecht ym. 2005). Vaikka doksorubisiinin tiedetään vaikuttavan kliinisesti useissa erilaisissa solutyypeissä, in vitro -kokeissa sydämen soluilla sen on kuitenkin havaittu synnyttävän mitokondrion toimintaa heikentävää ROS-vahinkoa (mm.
Bien ym. 2010, Ichikawa ym. 2014).
Tutkimuksessa ihmisen soluilla on havaittu kohonnutta superoksiditasoa doksorubisiinialtistuksen jälkeen. Tämä korreloi elektroninsiirtoketjun heikentyneen toiminnan kanssa, mikä aiheuttaa entsyymiaktiivisuuden laskua sekä sytokromi c -oksidaasilla (COX) että nikotiiniamidiadeniinidinukleotidin hydrogenaasilla (NADH) sukkinaattidehydrogenaasin määrän pysyessä samalla kokeessa muuttumattomana (Lebrecht ym. 2005). Doksorubisiinin tuottama mitokondrioita vaurioittava ROS vaikuttaa hengitysketjun toimintaan sekä suorasti että epäsuorasti. Se inhiboi mitokondrion sisäkalvon elektroninsiirtoketjua sitoutuen kardiolipiiniin estäen sen toiminnan (Goormaghtigh ym. 1989). Doksorubisiini vaikuttaa myös topoisomeraasia inhiboiden muodostamalla juosteita sitovia addukteja DNA:han.
Doksorubisiinin varsinainen vaikutus mtDNA:ssa ilmenee juostevaurioita synnyttävän mekanismin kautta, mikä häiritsee mtDNA:n ylläpitoa ja ekspressiota (Lebrecht ym. 2005).
Ihmisen fibroblastisoluilla on havaittu, että antrasykliinien ryhmään kuuluvat yhdisteet sitoutuvat tumallisen DNA:n lisäksi myös mtDNA:han. Lisäksi tutkimuksessa havaittiin, että antrasykliinien sisäänotto soluun on tasaista, mutta niiden pitoisuudet mitokondriossa vaihtelivat kuitenkin merkittävästi (Ashley & Poulton 2008). Antrasykliinien välillä on
17
havaittavissa merkittäviä eroja niiden siirtymisestä mitokondrioon, mutta tarkkaa mekanismia antrasykliinien siirtymisestä ei täysin tunneta (Lebrecht ym. 2005). Doksorubisiinilla on antrasykliineistä vahvin mitokondrionaalinen affiniteetti, ja se kykenee siirtymään solutyypistä riippuen nopeasti mitokondrion matriisiin suoraan interaktioon mtDNA:n kanssa. Kuitenkin kaikilla antrasykliineillä on havaittu merkittävän vahva affiniteetti kardiolipiinille, mikä voi osaltaan selittää doksorubisiinin nopean siirtymisen ja akkumuloitumisen mitokondrion matriisiin kalvoston poikki, vaikka vaikutus ei ulotu muihin antrasykliineihin yhtä vahvasti (Nicolay ym. 1984). Kuitenkin matalia määriä kardiolipiiniä sisältävillä soluilla havaitaan lähes yhtä voimakasta doksorubisiinin sisäänottoa mitokondrion matriisiin kuin normaaleilla soluilla, joten kardiolipiinin vaikutusta antrasykliinien siirtymiselle soluihin ei kuitenkaan täysin tunneta (Ashley & Poulton 2008).
2.4.3 Siprofloksasiini
Siprofloksasiini on 4-fluorokinoloni, jota käytetään yleisesti mikrobi-infektioiden hoidossa.
Sen antibakteerinen aktiivisuus perustuu bakteerisen DNA-gyraasi-entsyymin inhibitioon (Anderson ym. 1998). 4-kinolonien, joihin siprofloksasiini kuuluu, on havaittu aiheuttavan mtDNA:n määrän vähenemistä, mitokondrionaalista hengitysketjun heikkenemistä, glykolyysireaktion kasvua ja viivästynyttä kasvua sille altistetuissa soluissa. Siprofloksasiinin on havaittu tuottavan sijaintispesifisiä kaksoisjuosteen katkoksia mtDNA:ssa, mutta ei tumallisessa DNA:ssa, minkä vuoksi se on mahdollinen mitokondriomyrkky (Lawrence ym.
1993).
Siprofloksasiini, joka inhiboi bakteerista DNA-gyraasi-entsyymiä, inhiboi myös nisäkkäiden topoisomeraasi 2 β:n mitokondrionaalista isoformia, joka korjaa mtDNA:n superkierteisyyttä ja säätelee replikaation aloitusta (Hangas ym. 2018). Topoisomeraasin inhibiittorit vaikuttavat merkittävästi mtDNA-metabolismiin. Koska sekä tyypin 1 että tyypin 2 topoisomeraasien toiminta mitokondrioissa on melko huonosti tunnettu, kattavaa tutkimusta ei ole tehty siitä, miten niiden toiminnan häiriöt vaikuttavat mitokondrion toimintaan ja mtDNA:han. Useat erityyppiset topoisomeraasien inhibiittorit voivat kuitenkin inhiboida sekä tumallisia että mitokondrionaalisia topoisomeraaseja (Lawrence ym. 1993). Siprofloksasiinin tiedetään keskeyttävän topoisomeraasi 2:n toimintaa ihmisen tumallisessa DNA:ssa ja siten synnyttävän kaksoisjuostekatkoksia (Bredberg ym. 1991). Tämän lisäksi siprofloksasiinin tiedetään häiritsevän myös mitokondriaalisen topoisomeraasi 2:n toimintaa ja mtDNA:n
18
replikaatiota C2C12- ja HEK293-soluilla, mikä ilmenee mtDNA:n replikaatiovälituotteiden määrän alenemisena jo 80 µg/ml:n pitoisuudessa (Hangas ym. 2018).
2.4.4 UVB
Ultraviolettisäteilylle (UV) altistettavissa soluissa tiedetään syntyvän välillisenä vaikutuksena sekä ROS-yhdisteitä että reaktiivisia typpiyhdisteitä, jotka aiheuttavat merkittäviä vauriota DNA:ssa (Gniadecki ym. 2000). Ultraviolettisäteily kykenee myös synnyttämään suorana vaikutuksena pyrimidiini- ja tymidiinidimeerirakenteita sekä muita vaurioita DNA:ssa, jotka pysäyttävät DNA:n replikaation (McCulloch ym. 2004). Yleisesti UV-säteily jaetaan kolmeen tyyppiin: UVA-, UVB- ja UVC-säteily, joista UVA- ja UVB-säteilyt vaikuttavat merkittävimmin DNA:ta vaurioittavasti UVC-säteilyn vaurion asteen pysyessä matalampana.
UVB:lla on lyhyempi aallonpituus kuin UVA:lla, eli se on korkeaenergisempää säteilyä, jonka vuoksi se kykenee synnyttämään noin tuhatkertaisesti enemmän affisiota DNA:ssa kuin UVA- säteily (Widel ym. 2014). Tämä on merkittävä tekijä, kun halutaan altistaa soluja DNA-vaurion synnyttämiseksi. Solun tumallisessa DNA:ssa pyrimidiinidimeerien affisiot pystytään korjaamaan NER-mekanismilla (Lehmann 1995). Toisin kuin tumallisella DNA:lla, mtDNA:lla ei ole NER:iä tai vastaavaa metaboliareittiä, joka pystyisi korjaamaan mtDNA:n kaksoisjuostetta vääristäviä pyrimidiinidimeerejä. Vaikka mitokondriolla on kyky nukleotidien affisioiden korjaukseen pelkästään BER-mekanismin kautta, se ei kuitenkaan kykene korjaamaan ultraviolettisäteilyn synnyttämiä dimeerejä, jotka akkumuloituvat haitallisesti mtDNA:han (mm. Clayton ym. 1974, Birch-Machin ym. 2012).
Kliinisissä tutkimuksissa tymidiinidimeerien havaitseminen mtDNA:sta on todettu onnistuvan helposti PCR-menetelmiä hyödyntämällä, minkä vuoksi niiden havaitseminen on verrattain helppoa (Kumar ym. 2004). mtDNA:n vaurio UV-altistuksessa syntyy jo merkittävän pienellä säteilyannoksella, noin 1,34 mj/cm2, joka on riittävästi aiheuttamaan vauriota mtDNA:ssa ilman, että tumallisen DNA:n vauriot aiheuttaisivat soluille DNA-stressiä (Torregrosa-Muñumer ym. 2015).
3 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET JA HYPOTEESIT
Tämän tutkimuksen tavoite on kehittää kaksois-PCR-menetelmää mtDNA:n vaurion määrittämiseksi yhdistämällä lyhyen ja pitkän kantaman PCR:t yhteiseksi PCR:ksi ja kokeellisesti muuntelemalla eri muuttujia toimivan yhteensopivuuden takaamiseksi. Lisäksi
19
tarkoituksena on tutkia erilaisilla stressitekijöillä altistettujen HEK293- ja HeLa-solujen mtDNA:ta sopivimmalla qPCR-menetelmällä niiden vaurioasteen määrittämiseksi. Tutkielman työ toteutettiin laboratoriossa altistamalla viljeltyjä HEK-239- ja HeLa-soluja siprofloksasiinille, doksorubisiinille sekä ultraviolettivalolle. Soluille tehtiin DNA-eristys, joista saaduista näytteistä määritettiin mtDNA:n vaurioastetta tosiaikaisella vaurion määritys qPCR:llä. Tässä työssä haluttiin tutkia sitä, onko kaksois-PCR-menetelmä soveltuva mtDNA:n vaurion määritykseen ja havaitaanko siprofloksasiinilla sekä doksorubisiinilla vaikutusta mtDNA:n vaurioina.
Tutkimustyölle laaditut nollahypoteesit ovat: ”Kvantitatiivinen kaksois-PCR ei toimi luotettavana menetelmänä mitokondrionaalisen DNA:n vaurion havaitsemiseen”, sekä ”Siprofloksasiinin, doksorubisiinin ja ultraviolettivalon välillä ei ole tilastollisesti merkitsevää eroa mtDNA:n vaurion synnyssä”.
4 AINEISTO JA MENETELMÄT
4.1 HEK-solujen kasvatus ja fenoli-kloroformi-eristys qPCR-testausta varten
T-antigeenillä kuolemattomaksi transformoidun ihmisen solulinjan (HEK293) soluja kasvatettiin mitokondrionaalisen DNA:n vaurioiden tunnistamistöitä varten kaksois-PCR- menetelmällä testattavaksi. Solut kasvatettiin matalan glukoosin DMEM-liuoksessa (engl.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium, Biowest Cat-No. L0103), johon oli lisätty naudan sikiön seerumia (engl. Foetal Bovine Serum) 10 % pitoisuuteen. Täydessä konfluenssissa olevasta 15 cm HEK-solumaljasta otettiin solut talteen imemällä kasvatusliuos pois ja pesemällä solut 5 ml PBS-liuoksella (engl. Phosphate-Buffered Saline; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, ja 2 mM KH2PO4 pH 7,4). Solut siirrettiin sentrifugiputkiin ja sentrifugoitiin 5 min 400 g huoneenlämmössä (RT, engl. room temperature). Uudelleen suspensoidusta solumäärästä jaettiin 17 % kuudelle 3,5 cm kasvatusmaljalevylle. Vuorokauden kuluttua soluille tehtiin fenoli-kloroformi-menetelmällä DNA:n eristys.
Fenoli-kloroformi-eristystä varten solut irrotettiin 1 ml PBS-liuoksella alustasta mikrosentrifugiputkiin ja sentrifugoitiin 5 min 1 000 g RT. PBS poistettiin ja solut hajotettiin 500 µl DNA lyysauspuskurilla (10 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.4 % SDS), jota pipetoitiin edestakaisin kapeakärkisen pipetin läpi, kunnes solurykelmät hajosivat liuokseen tasaisesti. Liuokseen lisättiin 20 µl proteinaasi K:ta (10 mg/ml), ja lysaatti inkuboitiin
20
noin 12 tunnin ajan 37 °C lämpötilassa. Näytteisiin lisättiin 50 µl 5 M NaCl avustamaan proteiini-DNA-kompleksien hajoamista.
Inkuboinnin jälkeen näytteille suoritettiin puhdistus, jossa DNA eristettiin muusta lysaatista ja solujäämistä. Näytteiden puhdistus aloitettiin lisäämällä näytteisiin 500 µl fenoli-kloroformi- isoamyylialkoholi-seosta (25:24:1, pH 6,9). Näytteitä sekoitettiin kääntöpöydällä noin 30 min ajan, jonka jälkeen näytteet sentrifugoitiin 5 min 15 000 g RT faasien erottamiseksi. Ylempi DNA:ta sisältävä faasi pipetoitiin talteen puhtaisiin mikrosentrifugiputkiin, joihin lisättiin 500 µl kloroformia ja sekoitettiin ravistelemalla manuaalisesti 5 min ajan, jotta ylimääräinen fenoli poistuisi näytteistä. Näytteet sentrifugoitiin uudestaan 5 min 15 000 g RT ja ylempi faasi pipetoitiin talteen puhtaisiin mikrosentrifugiputkiin.
DNA saostettiin lisäämällä näytteisiin kaksinkertainen tilavuus kylmää 98 % etanolia sekä 1/10 tilavuus 3 M natriumasetaattia pH 5,3. Näytteet sekoitettiin ja jätettiin inkuboitumaan kahden tunnin ajaksi -20 °C lämpötilaan. Saostunut DNA pelletoitiin sentrifugoimalla näytteet 30 min 16 000 g +4 °C lämpötilassa. Neste poistettiin, näytteisiin lisättiin 1 ml 70 % etanolia ja ne sentrifugoitiin 5 min 16 000 g RT. Neste pipetoitiin pois ja mikrosentrifugiputket jätettiin kannet auki kuivumaan noin 15 min ajaksi RT, jotta jäljelle jäänyt neste haihtuisi pois. Tämän jälkeen mikrosentrifugiputkiin pipetoitiin 100 µl TE-puskuria (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM Na2-EDTA) ja DNA-pelletit suspensoitiin uudelleen liuokseen pipetoimalla niitä edestakaisin varovaisesti, jotta pelletit hajoaisivat paremmin, jonka jälkeen näytteet varastoitiin +4 °C lämpötilaan.
Näytteiden DNA-pitoisuudet mitattiin Nanodrop ND-1000 -spektrofotometrillä. Mikäli havaittiin, että näytteiden DNA-pitoisuudet poikkesivat peräkkäisinä toistoina toisistaan yli 10 %, voitiin päätellä, että näytteet eivät olleet liuenneet tarpeeksi, jolloin niille toistettiin liuotus lisäämällä noin 100 µl TE-puskuria ja sekoittamalla näytteitä lämpöhauteessa muutaman tunnin ajan. Näytteiden sekoittumisen parantamiseksi niitä pipetoitiin varovaisesti muutamia kertoja edestakaisin kapeakärkisen pipetin avulla, jotta yhteen liittynyt DNA liukenisi paremmin liuokseen. Tämän jälkeen näytteiden pitoisuudet mitattiin uudelleen Nanodrop ND-1000 -spektrofotometrillä ja todettiin, että näytteiden mittaukset poikkesivat toisistaan alle 10 %, jolloin niiden katsottiin olevan riittävän homogeenisiä qPCR-kokeita varten.
Spektrofotometrillä saatujen arvojen pohjalta kullekin näytteelle tehtiin 50 ng/µl laimennokset TE-puskuriin 100 µl lopputilavuuteen. Näytteiden pitoisuudet tarkastettiin laimennoksen jälkeen Nanodrop ND-1000 -spektrofotometrillä ja havaittiin, että niiden pitoisuudet olivat yhteneväisiä, mutta keskimäärin noin 10 ng/µl pienemmät kuin oli oletettu.
21
Tämä otettiin huomioon näytteitä myöhemmässä vaiheessa annosteltaessa. Yhdelle laimentamattomalle DNA-näytteelle valmisteltiin lisäksi erillinen restriktioentsyymin pilkkominen 100 µl lopputilavuuteen käyttäen 2 µl KpnI-entsyymiä, 10 µl 10x Fast Digest -puskuria sekä 35 µg/µl DNA:ta. Restriktioentsyymipilkkomisliuos vietiin inkubaattoriin +37 °C lämpötilaan noin 24 tunnin ajaksi.
DNA-näytteille tehtiin qPCR-koe, jolla määritettiin sopivat mtDNA-pitoisuudet tuleville kaksois-PCR-kokeille. Valmisteltiin DNA-laimennossarja valmiista näytteistä 100 ng/µl, 50 ng/µl, 25 ng/µl, 12,5 ng/µl ja 6,25 ng/µl pitoisuuksiin, jonka jälkeen valmisteltiin PCR master mix -seos (taulukko 1). Näytteet valmisteltiin jäähauteella valkoisilla 96-kuoppalevyillä (Sarstedt 96 fast PCR fullskirt), joihin käytettiin kirkkaita tasaisia kansia (Sarstedt 8-strip optical clear flat cap). PCR-kokeet ajettiin Agilent Genomicsin G8830A AriaMx Real-Time PCR -laitteella. PCR-ajojen lämpösykliprotokollan profiilina käytettiin valmiita viitearvoja, jotka säädettiin kokeeseen sopivaksi (taulukko 2).
Taulukko 1. Tosiaikaisessa vaurion määritys -qPCR-reaktioseoksessa käytetyt pitoisuudet yksikköineen. PCR-reaktioseoksessa loput reaktioseoksen tilavuudesta täytetään nukleiinihappovapaalla vedellä, joka on merkattu taulukkoon x:llä.
Taulukko 2. Tosiaikaisen vaurion määritys -qPCR:n lämpöprofiili. Kuuma aloitus (engl. Hot Start) varmistaa, että epäspesifinen alukkeiden sitoutuminen huoneenlämmössä ei häiritsisi varsinaista PCR:ä. Amplifikaatiovaiheessa tapahtuu PCR:n varsinainen DNA:n monistuminen.
Amplifikaatiovaiheen vaiheet ovat: denaturaatio, alukkeiden liittymisvaihe ja synteesi (engl.
Amplification, Denaturation, Annealing, Extension).
qPCR:n reaktioseos Pitoisuus Yksikkö
2x AccuStart II PCR SuperMix 50 %
Lyhyt PCR etualuke 100 nM
Lyhyt PCR taka-aluke 100 nM
VIC -leimattu fluoresoiva koetin 125 nM
DNA 6,25 - 100 ng
H2O x µl
Lopputilavuus 140 µl
Kuuma aloitus
Denaturaatio Alukkeiden liittymisvaihe Synteesi
Lämpötila (°C) 95 95 58 72
Aika (min) 5:00 0:15 0:15 0:15
Amplifikaatio, 40 sykliä
22 4.2 Kaksois-PCR:n testaus
Mitokondrionaalisen DNA-vaurion tunnistamismenetelmän parantamista tutkittiin tekemällä useita PCR-kokeita, joissa sovellettiin standardoitua PCR-koeasetelmaa. PCR-ajoihin tehtiin PCR master mix -seos, joka valmistettiin käyttämällä Quanta Bio AccuStart II PCR SuperMix -liuosta (Cat. No. 95137), jossa oli 2x pitoisuudessa kokeeseen tarvittavat puskuriliuos, nukleosiditrifosfaatit ja Taq DNA -polymeraasi valmiina seoksena. Valmista master mix -seosta lisättiin jokaiseen PCR-reaktioliuokseen puolet lopputilavuudesta.
Näytteeseen lisättiin kokeesta riippuva määrä pitkän kantaman Hs5999F etu- ja Hs14841R taka-aluketta (engl. forward and reverse primers) sekä kokeesta riippuva määrä lyhyen kantaman Hs3322F etu- ja Hs3410R taka-aluketta (taulukko 3). Näytteisiin lisättiin myös FAM- ja VIC-leimattua fluoresoivaa koetinta sekä pitkälle että lyhyelle amplikonille. Koettimet liittyvät monistettavaan DNA:han, mutta eivät vielä tässä vaiheessa fluoresoi vaimentimen vuoksi. Vasta PCR:n alukkeiden ohjaavan monistumisen takia tapahtuva juosteen korvaaminen saa DNA-polymeraasin irrottamaan reportterivärin koettimesta, jolloin syntyy fluoresoiva signaali merkkinä monistumisesta. Työssä käytetyt alukkeiden ja koettimien sitoutumispaikat sekä restriktioentsyymien katkaisukohdat mtDNA-molekyylissä on esitetty kuvassa 2 (kuva 2).
Loput tilavuudesta reaktioseoksessa täytettiin nukleiinihappovapaalla sterilisoidulla vedellä (taulukko 4). Näytteet valmisteltiin valkoisilla 96-kuoppalevyillä (Sarstedt 96 fast PCR fullskirt) ja kirkkailla tasaisilla kansilla (Sarstedt 8-strip optical clear flat cap). Templaattina käytettiin noin 200 ng KpnI-pilkottua DNA:ta. Näytteet valmisteltiin jäähdytetyllä telineellä, joka piti näytteiden lämpöaltistuksen minimissä samalla varoen altistamasta valoherkkiä koettimia huoneen valolle.
PCR-kokeet ajettiin Agilent Genomicsin G8830A AriaMx Real-Time PCR -laitteella. PCR- ajojen lämpösykliprotokollassa käytettiin valmiita viitearvoja, jotka säädettiin kokeeseen sopiviksi (taulukko 5).
23
Taulukko 3. PCR:ssä käytettyjen alukkeiden ja koettimien sekvenssit. Taulukossa esitetyt VIC- ja FAM-koettimet ilmaisevat kyseisiä reportterivärejä. Koettimien ”MGB” tulee englannin kielen sanoista ”minor groove binder quencher” (matalaan uurteeseen sitoutuva vaimentaja), joka suurentaa alukkeen sitomiskykyä ja samalla vaimentaa koettimen fluoresenssia ennen kuin se leikataan pois.
Kuva 2. Ihmisen mtDNA-molekyylin malliin on merkitty työssä käytetyt pitkän ja lyhyen kantaman amplikonit, FAM- ja VIC-leimatut koettimet pitkälle ja lyhyelle sekvensseille sekä restriktioentsyymien katkaisevat kohdat. BamHI-entsyymi katkaisee DNA-juosteen pitkän kantaman sekvenssin kohdalta ja KnpI-entsyymi katkaisee juosteen monistettujen sekvenssien ulkopuolelta. Kuvassa esitetty pitkä etualuke oli kokeissa ensin käytetty aluke, joka tuottaa PCR:ssä 8 843 emäsparia pitkän amplikonin (Pitkä PCR). Tämä vaihdettiin myöhemmin kokeissa paremmin toimivaksi havaittuun pitkään etualukkeeseen 2, joka tuottaa PCR:ssä lyhyemmän 4 691 emäsparia pitkän amplikonin (Pitkä PCR 2).
Alukkeen/koettimen nimi DNA-sekvenssi
Pitkä PCR-etualuke (Hs5999F) TCT AAG CCT CCT TAT TCG AGC CGA Pitkä PCR-taka-aluke (Hs14841R) TTT CAT CAT GCG GAG ATG TTG GAT GG Pitkä PCR-etualuke 2 (HS10131F) ACC ACA ACT CAA CGG CTA CA
FAM-leimattu fluoresoiva koetin
(hmtDNA probe 13546) FAM- ACA AAC GCC TGA GCC CTA -MGB Lyhyt PCR-etualuke (HS 3322F) CTC CTA CTC CTC ATT GTA
Lyhyt PCR-taka-aluke (HS 3410R) TTG CGT AGT TGT ATA TAG C VIC-leimattu fluoresoiva koetin
(MTDNA PROBE 3346 (ND1)) VIC - CTAATCGCAATGGC- MGB
24
Taulukko 4. Kaksois-PCR-reaktioseoksen lopulliset pitoisuudet yksikköineen. Kokeissa käytetyt minimi- ja maksimipitoisuudet alukkeille ja DNA:lle, joita muunneltiin eri työvaiheissa tarpeen mukaan, on merkattu *-symbolilla taulukkoon. PCR-reaktioseoksessa loput reaktioseoksen tilavuudesta täytetään steriilillä nukleiinihappovapaalla vedellä, jota merkitään taulukossa x:llä.
Taulukko 5. Kaksois-PCR:n lämpöprofiili kuumalla aloituksella ja 40 syklin amplifikaatiolla.
Taulukossa on ilmaistu PCR-ajon lämpötilat ja niissä käytettävät ajat (min) kullekin vaiheelle.
4.3 DNA:n BamHI-restriktioentsyymillä pilkkominen standardisuoran luomiseksi
PCR-menetelmän toimivuutta mtDNA-vaurion tunnistamiseen testattiin mittaamalla DNA:n monistumisen aste eriasteisesti restriktioentsyymillä pilkotussa reaktioseoksessa. Kokeen DNA-laimennokset tehtiin käyttäen osaa ehyttä ja osaa entsyymillä pilkottua mtDNA:ta, jota oli pilkottu monistettavalta sekvenssialueelta restriktioentsyymin avulla. Työ suoritettiin valmistelemalla DNA-näytteille BamHI-restriktioentsyymipilkkominen, joka katkaisee mtDNA:n juosteen 14 259. emäsparin kohdalta. Restriktioentsyymillä pilkkominen tehtiin kappaleessa 4.1 esitetyn menetelmän mukaisesti 100 ng/µl pitoisuudella noin tunnin ajan inkuboiden +37 °C. Lisäksi valmistettiin ei-pilkottu näyte samasta DNA-näytteestä, jota laimennettiin sterilisoidulla vedellä noin 100 ng/µl pitoisuuteen. Pilkotuista ja ei-pilkotuista näytteistä valmistettiin kolme rinnakkaista laimennossarjaa, jossa ei-pilkottu DNA oli 1:0 - 10:1 - 5:1 - 1:1 - 1:5 - 0:1 -suhteessa BamHI-pilkottuun DNA:han. Näytteet käytettiin PCR-ajossa kappaleen 4.2 mukaisella kaksois-PCR-menetelmällä.
Kaksois-PCR:n reaktioseos Pitoisuus Yksikkö 2x AccuStart II PCR SuperMix 1x x
Pitkä PCR-etualuke 50-300* nM
Pitkä PCR-taka-aluke 50-300* nM
FAM-leimattu fluoresoiva koetin 125 nM
Lyhyt PCR-etualuke 50-250* nM
Lyhyt PCR-taka-aluke 50-250* nM
VIC-leimattu fluoresoiva koetin 125 nM
DNA 50-300* ng
H2O x µl
Lopputilavuus x µl
Kuuma aloitus
Denaturaatio Alukkeiden liittymisvaihe Synteesi
Lämpötila (°C) 94 94 59 72
Aika (min) 5:00 0:10 0:10 3:00
Amplifikaatio, 40 sykliä
25
4.4 HEK293-solujen DNA:n vaurioittaminen ultraviolettivalolla, doksorubisiinilla ja siprofloksasiinilla
Kasvatettuja HEK293-soluja jaettiin kahteentoista 3 ml kasvatusmaljaan DMEM-kasvatusliuokseen kappaleen 4.1 kuvauksen mukaisesti. Maljoista kolme kappaletta käsiteltiin 80 µg/ml siprofloksasiinilla. Siprofloksasiininäytteiden altistus kesti noin 24 t ajan.
Kolmeen maljoista lisättiin 3,4 µM doksorubisiinia. Doksorubisiininäytteiden altistus kesti noin 2,5 t ajan. Lisäksi kolme maljaa altistettiin 1,34 mJ/cm2 302 nm UVB-valolle 30 s ajan. Kolme maljaa jätettiin käsittelemättömiksi kontrollinäytteiksi. Kaikilta kasvatusmaljoilta kerättiin solut talteen DNA:n fenoli-kloroformiuuttoa varten. DNA:n uutto suoritettiin kappaleen 4.1 mukaisesti tehden näytteille etanolisaostus. DNA-näytteet jätettiin inkuboitumaan proteinaasi K:n lisäyksen jälkeen lämpöhauteeseen noin 20 tunnin ajaksi. Eristetyt DNA-näytteet resuspensoitiin suoraan KpnI-restriktioentsyymipilkkomiseen käyttämällä 40 µl FastDigest- puskuria, 6 µl entsyymiä ja 354 µl H2O 400 µl:n tilavuuteen. Näytteitä inkuboitiin lämpökaapissa +37 °C lämpötilassa noin 12 tunnin ajan. Entsyymipilkkomisen jälkeen näytteiden DNA-pitoisuus mitattiin Nanodrop ND-1000 -spektrofotometrillä. Mittausten pohjalta näytteet laimennettiin 100 ng/µl pitoisuuteen, jonka jälkeen ne ajettiin PCR:llä erillisinä rinnakkaisina lyhyen ja pitkän kantaman reaktioina. Pitkän kantaman PCR- reaktioseos ja lyhyen kantaman PCR-reaktioseos valmistettiin toisistaan eri resepteillä (taulukko 6).
26
Taulukko 6. Pitkän ja lyhyen kantaman PCR-reaktioseokset erillisille reaktioille. Taulukossa on esitetty kokeessa käytetyt pitoisuudet yksikköineen. PCR-reaktioseoksen tilavuudesta loput täytettiin nukleiinihappovapaalla vedellä, jota merkitään taulukossa x:llä.
4.5 HeLa-solujen DNA:n vaurioittaminen siprofloksasiinilla ja doksorubisiinilla
DMEM-liuoksessa kasvatettuja HeLa-soluja siirrostettiin kahdelle 3,5 cm 6-kuoppalevylle noin puoleen konfluenssiin, joista toinen käsiteltiin 80 µg/ml siprofloksasiinilla. Noin 23 tunnin jälkeen solut kerättiin talteen ja DNA:ta eristettiin kappaleen 4.1 mukaisesti. DNA-näytteitä inkuboitiin 17 tunnin ajan +37 °C KpnI-entsyymipilkonnassa lämpöhauteessa. Tämän jälkeen näytteistä mitattiin DNA-pitoisuudet Nanodrop ND-1000 -spektrofotometrillä, jonka pohjalta näytteet laimennettiin 100 ng/µl pitoisuuksiin ja niille tehtiin erilliset pitkän ja lyhyen kantaman PCR:t edellisessä kappaleessa kuvatulla tavalla.
DMEM-liuoksessa kasvatettuja HeLa-soluja siirrostettiin kahdelle 3,5 cm 6-kuoppalevylle, joista toinen käsiteltiin 3,4 µM doksorubisiinilla noin 2,5 tunnin ajaksi ja toinen jätettiin kontrolliksi. Soluista eristettiin DNA:ta kappaleen 4.1 mukaan, josta poikkeavasti DNA- näytteet inkuboitiin 20 minuuttia -80 °C lämpötilassa etanolisaostusvaiheessa pidemmän -20 °C inkuboinnin sijasta. Näytteet jätettiin 18 tunnin ajaksi KpnI-restriktioentsyymipilkontaan inkuboitumaan +37 °C, jonka jälkeen niistä mitattiin DNA-pitoisuudet. Mittausten pohjalta näytteet laimennettiin 100 ng/µl pitoisuuksiin, ja niille tehtiin erilliset pitkän ja lyhyen kantaman PCR:t.
PCR-reaktioseos pitkän kantaman alukkeelle Pitoisuus Yksikkö
2x AccuStart II PCR SuperMix 50 %
Pitkä PCR-etualuke 100 nM
Pitkä PCR-taka-aluke 100 nM
FAM-leimattu fluoresoiva koetin 125 nM
DNA 100 ng
H2O x µl
Lopputilavuus 780 µl
PCR-reaktioseos lyhyen kantaman alukkeelle Pitoisuus Yksikkö
2x AccuStart II PCR SuperMix 50 %
Lyhyt PCR-etualuke 100 nM
Lyhyt PCR-taka-aluke 100 nM
VIC-leimattu fluoresoiva koetin 125 nM
DNA 100 ng
H2O x µl
Lopputilavuus 780 µl
27
PCR-kokeesta saatu data analysoitiin LORD-Q-data-analyysillä, joka perustuu tosiaikaisen PCR:n pitkien ja lyhyiden fragmenttien Ct-arvojen mittauksiin sekä niiden vertailuun.
Käsitellyiltä soluilta eristettyä DNA:ta verrattiin rinnakkain käsittelemättömiin kontrollinäytteisiin. Juostekatkoksien määrä laskettiin jokaisen DNA:n 10 kb emäsparille tilastollisella määrityskaavalla (kuva 3). Kaavan EL- ja ES-määreet ovat amplifikaation hyötysuhteet pitkälle ja lyhyelle koettimelle. Jokainen näyte analysoitiin kolmena rinnakkaisena toistona, ja niiden keskiarvoista laskettiin käytettävät Ct-arvot sekä pitkän että lyhyen kantaman amplifikaatioille. a on emäsparien määrä pitkässä fragmentissa, ja n on kontrollinäytteiden määrä. EL ja ES määritettiin useiden DNA-laimennoksien lineaarisen regression analyysillä.
Kuva 3. LORD-Q-data-analyysin matemaattinen kaava mtDNA:n juosteen katkoksien määrittämiseksi. Esitetyssä kaavassa EL- ja ES merkitsevät amplifikaation hyötysuhdetta pitkälle ja lyhyelle koettimelle. Ct-arvot (Cp) määritettiin AriaMx-ohjelmistolla PCR-ajoista mitatuilta pitkiltä ja lyhyiltä fragmenteilta, joita verrattiin käsittelemättömiä DNA-standardeja vasten; a on emäsparien määrä pitkässä PCR-fragmentissa ja n on kontrollinäytteiden määrä referenssinäytteissä. EL ja ES määritettiin DNA-näytteiden laimennossarjalla sekä lineaariregression analyysillä.
28 5 TULOKSET
5.1 Kaksois-PCR-menetelmän kehityksen vaiheet
5.1.1 Alustava toimiva kaksois-PCR-asetelma
Kaksois-PCR:ssä testattiin kolme eri DNA-pitoisuutta (50, 100 ja 200 ng/µl pitoisuudet) KpnI-restriktioentsyymillä pilkottua DNA:ta, jossa käytettiin lyhyen kantaman aluketta 100 nM, pitkän kantaman aluketta 500 nM sekä kumpaakin fluoresoivaa koetinta 125 nM. Koe ajettiin muunnellulla PCR-lämpöprofiililla (taulukko 6). PCR:n havaittiin toimivan ihanteellisimmin 200 ng/µl pitoisuudella molemmille alukeparille, jotka on eroteltu kuvaajassa väreillä (kuva 4).
Taulukko 6. Kaksois-PCR:n lämpöprofiili kuumalla aloituksella ja 40 syklin amplifikaatiolla.
Taulukossa on ilmaistu PCR-ajon lämpötilat ja niissä käytettävät ajat kullekin vaiheelle.
Kuuma aloitus
Denaturaatio Alukkeiden liittymisvaihe Synteesi
Lämpötila (°C) 94 94 60 72
Aika (min) 05:00 00:30 00:30 07:00
Amplifikaatio, 40 sykliä
29
Kuva 4. Kaksois-PCR:n amplifikaatiokäyrät 50, 100 ja 200 ng/µl pitoisuuksissa KpnI- restriktioentsyymillä pilkottua DNA:ta. Kuvaajassa esitetyt amplifikaatiokäyrät, jotka saatiin 200 ng/µl pitoisuudella, on merkattu väreillä; vihreät käyrät merkitsevät lyhyen kantaman PCR:n amplifikaatiota ja siniset käyrät merkitsevät pitkän kantaman PCR:n amplifikaatiota.
Kaikki amplifikaatiokäyrät 50 ja 100 ng/µl templaattijuosteille on merkitty harmaalla. Vihreä ja sininen jana kuvastavat vastaavasti AriaMx-ohjelmiston asettamia VIC- ja FAM- fluoresenssimittauksien raja-arvoja kaikille näytteille.
5.1.2 Kaksois-PCR:n testaus standardin luomiseksi mtDNA-vauriolle
Valmisteltiin laimennossarjat kahdesta DNA-näytteestä mtDNA:n vauriostandardin luomiseksi: BamHI-restriktioentsyymillä pilkottua DNA:ta ja pilkkomatonta DNA:ta sekoitettiin viiteen näytteeseen eri suhteissa. Laimennossarjat valmistettiin käyttämällä sekä 100 ng/µl DNA:ta (taulukko 7) että 200 ng/µl DNA:ta (taulukko 8). 100 ng/µl DNA-ajossa havaittiin, että fluoresenssin raja-arvo ei ylittynyt FAM:llä leimatuissa pitkän kantaman PCR:ssa kaikille näytteille (kuva 5). 200 ng/µl DNA-ajossa havaittiin, että fluoresenssin raja- arvo ei ylittynyt pitkän kantaman PCR:ssa (kuva 7). PCR-standardin DNA-pitoisuutta Ct-sykliä vasten tarkasteltuna muodosti suoran kuvaajassa, jonka kulmakerroin sekä totaalivariaatio (R2) kuitenkin poikkeavat liian paljon halutusta (kulmakerroin ≥ -3,6; R2 < 0,99). Täten standardisuoraa ei voitu muodostaa sekä 100 ng/µl (kuva 6) että 200 ng/µl pitoisuuksille (kuva 8).
