Tosiaikaista qPCR-menetelmää on käytetty onnistuneesti DNA:n vaurion määritykseen laboratorio-oloissa useilla eri malliorganismeilla, joihin luetaan myös ihmisen solut.
Tosiaikaisen vaurionmallinnus-qPCR -menetelmän toimivuutta, sen hyötyjä sekä soveltuvuutta mtDNA:n vaurion mittauksessa on raportoitu kattavasti kirjallisuudessa (mm. Hunter ym.
2010). Perinteisen tosiaikaisen qPCR:n lisäksi on olemassa myös aiemmin kehitetty ns.
semikvantitatiivinen PCR-menetelmä, jolle on ominaista se, että tutkittavan DNA:n tai RNA:n kvantitatiivinen analyysi tapahtuu vasta PCR:n reaktion jälkeen lopputuotetta analysoimalla.
Merkittävä ero tällä menetelmällä uudempaan tosiaikaiseen qPCR:än on siinä, että tuotetta ei analysoida suoraan PCR:ssä. Reaktion jälkeiseen analysointiin on olemassa erilaisia menetelmiä, kuten esimerkiksi näytteiden prosessointi geelielektroforeesilla ja siitä syntyneiden koon mukaan järjestäytyneiden DNA-molekyylien analysointi (Marone ym. 2001).
Semikvantitatiivinen PCR-menetelmä soveltuu huonosti DNA:n vaurion määritykseen, sillä menetelmä kattaa verrattain kapean dynaamisen alueen kvantitatiivisessa mittauksessa. Lisäksi eksponentiaalisen vaiheen määritys PCR-reaktiolle kullekin tutkittavalle geenille ja näytteelle on aikaa vievää ja työlästä (Breljak ym. 2005).
13
Tosiaikainen qPCR-menetelmä vaurion tunnistuksessa on vakiintunut laajalti laboratoriokäyttöön. Menetelmä perustuu siihen, että PCR:n replikaation tehokkuus on kääntäen verrannollinen monistettavan alueen juosteessa esiintyviin affisioihin. Vertailemalla pitkän ja lyhyen kantaman amplikonien määriä keskenään niiden välinen erotus paljastaa DNA-näytteiden juosteiden vaurioasteen. Vaurioituneen templaattijuosteen amplikonit monistuvat PCR:ssä heikommin kuin ehyet, koska juostevauriot estävät PCR:n polymeraasin toimintaa juosteen monistamisessa. Kvantitatiivisessa analyysissä amplifioidaan sekä pitkän että lyhyen kantaman alukkeiden monistamia templaattijaksoja DNA:ssa yhdessä. Vauriot DNA:ssa jakautuvat satunnaisesti eri kohtiin koko DNA-juosteen alueelle, jolloin ne todennäköisemmin sijoittuvat pitkän kuin lyhyen kantaman amplikonin alueelle (Ayala-Torres ym. 2000). Koska lyhyen kantaman jakso on verrattain lyhyt (noin 100-200 emästä), voidaan olettaa, että satunnaisesti jakautunut DNA-vaurio ei todennäköisesti osu lyhyelle DNA-jakson alueelle.
Täten lyhyen kantaman PCR:ä voidaan käyttää määrittämään näytteen DNA:n kohdesekvenssin määrän. Vastaavasti todennäköisyys sille, että mutaatiot osuvat pitkän kantaman amplikonin jaksolle, on korkea, sillä amplikonina käytetään mahdollisimman pitkää sekvenssiä (yli 1 000 emästä). Tällöin vauriot DNA:ssa johtavat heikentyneeseen amplifikaatioon pitkän kantaman amplikoneilla haittaamalla PCR-reaktiossa käytettävän DNA-polymeraasin toimintaa.
Heikentynyttä amplifikaatiota pitkän kantaman PCR:ssä voidaan täten verrata lyhyen kantaman amplikoniin, jossa DNA-vaurioiden tuoma amplifikaation heikkeneminen ei näy. Pitkän ja lyhyen kantaman PCR:n replikaation suhteita vertailemalla keskenään pystytään päättelemään DNA:n vaurioaste per DNA-sekvenssin osa (noin 10 kb per sekvenssi) (Meyer 2009).
Tosiaikaisen qPCR:n fluoresenssin mittauksista tarkastellaan vaurioastetta tekemällä vaurion määritys ”pitkän kantaman tosiaikainen PCR-analyysi DNA:n vaurion kvantifioimiseksi” -menetelmällä (engl. long-run real-time PCR technique for DNA-damage quantification, LORD-Q). Se on DNA:n vaurioasteen määrittämisen analysointimenetelmä, joka on kehitetty aiempien tosiaikaisten qPCR-menetelmien pohjalta suurien näytemäärien nopeaan analysointiin. Perinteisen tosiaikaisen vaurionmallinnus-qPCR:n rajoite vaurion määrityksessä tulee siinä monistettavan amplikonin pituudesta, joka on verrattain lyhyt, vain joitakin satoja emäspareja pitkä sekvenssi, joka ei välttämättä ilmennä riittävän hyvin satunnaisjakautunutta vauriota DNA:ssa vaurioasteen ollessa hyvin vähäinen. Tämän vuoksi LORD-Q-menetelmä hyödyntää merkittävästi aiempaa qPCR:ä pidempiä templaattijuosteita vaurion määrityksessä. Mikäli juostevauriot ovat tasaisesti jakautuneet templaattijuosteessa, LORD-Q:ssa käytetyt pidemmät amplikonit sisältävät todennäköisemmin polymeraasia inhiboivia DNA-modifikaatioita, joka ilmenee pitkän kantaman amplikonin monistaman
14
juosteen myöhästyneenä eksponentiaalisena amplifikaatiovaiheena PCR:ssä (Lehle ym. 2013).
Tämä näkyy PCR-mittauksessa käyrän Ct-määreestä (kuva 1). Amplikonin pituus ja DNA:n juostevauriot koetinsekvenssissä korreloivat lineaarisesti keskenään, eli pidemmät DNA-koettimet parantavat DNA-vaurion kvantifioimista (Hugget & O’Grady 2018).
LORD-Q-menetelmä ohittaa ongelmat perinteisen qPCR:n sensitiivisyydessä siinä käytettävän rajoitetun PCR-tuotteen pituuden muodostaman epätarkkuuden osalta. Paranneltu menetelmä mahdollistaa pidempien DNA-sekvenssien amplifikaation ja kvantifioimisen PCR:ssä. Lisäksi koettimen pituuden kasvattaminen suosii vähäisien DNA-vauriomäärien tunnistamista, jotka saattavat jäädä huomaamatta perinteisessä qPCR:ssä. LORD-Q-menetelmällä on mahdollista havaita DNA:n vauriota sekä tumallisessa että mitokondrionaalisessa DNA:ssa, jonka vuoksi se on kattava analysointimenetelmä useiden erityyppisten vaurioiden tunnistamiseen. Koska LORD-Q-menetelmällä voidaan tehdä tarkka ja kattava vaurioasteen määritys verrattain pienistä ~50 ng/µl DNA-näytteistä reaaliajassa käyttäen noin 3-4 kb pituisia amplikoneja, se soveltuu erityisesti pienien DNA-näytemäärien ja matalan asteen vaurion määritykseen (Dannenmann ym. 2017).
LORD-Q-menetelmän on käytännössä todettu toimivan DNA-vaurion kvantifioimisessa altistamalla ihmisen Jurkat T -lymfosyyttisoluja eriasteisille genotoksiineille. Näitä ovat muun muassa 254 nm UVC-valo, sisplatiini, etoposidi ja bleomysiini, joiden kaikkien vauriota on kyetty tunnistamaan DNA:ssa. Useista testatuista genotoksiineista ainoastaan etoposidin ei havaittu vaurioittavan tehdyssä kokeessa mtDNA:ta, vaikka sen aiheuttamaa vauriota havaittiin tumallisessa DNA:ssa. Tutkimuksessa myös havaittiin, että LORD-Q-menetelmä pystyy havaitsemaan sellaiset pienet vauriot matalissa altistuksissa genotoksiineille, jotka eivät olleet solulle tappavia (Lehle ym. 2013).
Tunnetaan myös toinen tosiaikainen PCR, puolipitkän kantaman PCR (engl. Semi long-run PCR, SLR PCR), jonka on havaittu toimivan DNA:n vaurioasteen määrittämisessä pitkän kantaman PCR-menetelmän veroisesti (Rothfuss ym. 2009). SLR PCR on LORD-Q:sta muunneltu PCR-menetelmä, joka hyödyntää lyhyempää, noin 1,5-2 kb pituista amplikonia, vaurion määrityksessä saavuttaen kuitenkin vastaavan erotteluresoluution kuin pidemmillä amplikoneilla. SLR PCR:n havaittiin toimivan yhtä hyvin sekä tumallisen DNA:n että mtDNA:n kanssa. Se tuotti vähemmän epäspesifisiä PCR-tuotteita geelielektroforeesissa tarkasteltuna kuin pitkän kantaman amplikoneilla, mutta oli kuitenkin yhtä tarkka vaurioasteen määrityksessä kuin LORD-Q (Zhu & Coffman 2017).
15 2.4 mtDNA:n vauriot
2.4.1 Topoisomeraasit
DNA:n topoisomeraasi on entsyymi, joka katalysoi topologista DNA:n isomerisaatiota katkaisemalla ja yhdistämällä yhtä tai kumpaakin DNA:n juostetta (mm. Gellert 1981, Campbell 2008). Tunnetut topoisomeraasit jaotellaan yleisesti kahteen pääryhmään: tyypin 1 ja tyypin 2 topoisomeraaseihin. Tyypin 1 topoisomeraasi katalysoi muutosta DNA:n topologiassa tekemällä katkoksen yhteen kaksoisjuosteisen DNA:n juosteista, mikä on tärkeä mekanismi DNA-juosteen kierteisyyden vähentämiseksi. Tyypin 2 topoisomeraasit katalysoivat muutoksia DNA:n topologiassa katkaisemalla molemmat kaksijuosteisen DNA:n juosteista DNA:n superkierteisyyden ja muiden DNA-vyyhtien selvittämiseksi (Miller ym. 1981). Sekä tyypin 1 että tyypin 2 topoisomeraasien toiminta mitokondrioissa on melko huonosti tunnettu. Viime vuosina on kuitenkin saatu selville, että Top 2 vähentää mtDNA:n positiivista superkierteisyyttä (Hangas ym. 2018). Lisäksi on saatu selville, että mitokondrionaalinen TOP1 vähentää mtDNA:n negatiivista superkierteisyyttä (Baechler ym. 2019). Erityyppisten topoisomeraasien inhibiittoreita on tunnistettu mitokondriossa, ja niiden toiminnan on todettu inhiboivan sekä tumallisia että mitokondrionaalisia entsyymejä (Lawrence ym. 1993).
Monet topoisomeraaseja inhiboivista myrkyistä ovat syöpälääkkeitä, joiden toiminta on olennaista syöpäsolujen kasvun hidastamiseksi. Lääkkeinä käytettävät topoisomeraasimyrkyt toimivat tappamalla liian nopeasti lisääntyviä soluja pitäen normaalit hitaammin jakautuvat solut hengissä (mm. Delgado ym. 2018). Topoisomeraasin inhibiittoreita on useita erilaisia, mutta niillä kaikilla on samankaltainen toiminnallinen mekanismi. Ne häiritsevät tai keskeyttävät topoisomeraasin ohjaaman DNA:n katkaisun ja uudelleenliittämisen mekanismia (Laponogov 2009). Topoisomeraasimyrkyt saattavat synnyttää toiminnallaan juostekatkoksia tai muita emäsvirheitä DNA:ssa (Robinson ym. 1991). Esimerkiksi antrasykliineihin kuuluvan doksorubisiini-syöpälääkkeen on todettu synnyttävän kaksoisjuostekatkoksia nisäkkäiden tumallisessa DNA:ssa (Capranico ym. 1990). Kuitenkaan kattavaa tutkimusta topoisomeraasimyrkkyjen vaikutuksesta mitokondrionaalisissa topoisomeraasissa ja niiden vaikutuksesta mtDNA:han ei ole vielä tehty.
16 2.4.2 Doksorubisiini
Doksorubisiini on antrasykliinien ryhmään kuuluva yleisesti käytetty syöpälääke, jonka tärkein toiminnallinen mekanismi on topoisomeraasi 2:n inhibitio. Tämä mekanismi johtaa kattaviin tumallisen DNA:n vaurioihin nopeasti monistuvissa soluissa. Koska syöpäsolujen DNA:lla on virheellisesti toimiva replikaatiomekanismi, ne kuolevat doksorubisiinin vaikutuksesta toisin kuin normaalit solut, joiden replikaatio on hallittua. Doksorubisiinin pitkäaikaiskäytössä sen sivuvaikutuksena ilmenee annosspesifistä myöhään ilmenevää kroonista kardiotoksisuutta, jota on myös havaittu in vivo -kokeissa rotilla (Lefrak ym. 1973). Altistetuilla rotilla havaittiin merkittävästi kohonnutta sydämen lihassolujen mtDNA:n vauriota (Zhou ym. 2001).
Samanlainen korrelaatio on myös havaittu kliinisissä ihmiskokeissa, joissa doksorubisiinilla sekä muilla antrasykliineillä lääkittyjen ihmisten sydämistä ja luustolihaksista post mortem -kerättyjä näytteitä tutkittiin mtDNA:n vaurioiden ilmenemistä eri menetelmin.
Doksorubisiinille altistetuissa sydänlihaksissa oli merkittävä ero mtDNA:n vaurion asteessa muihin lihasnäytteisiin verrattuna, eikä luustolihasnäytteissä havaittu juuri ollenkaan doksorubisiinin synnyttämiä vaurioita (Lebrecht ym. 2005). Vaikka doksorubisiinin tiedetään vaikuttavan kliinisesti useissa erilaisissa solutyypeissä, in vitro -kokeissa sydämen soluilla sen on kuitenkin havaittu synnyttävän mitokondrion toimintaa heikentävää ROS-vahinkoa (mm.
Bien ym. 2010, Ichikawa ym. 2014).
Tutkimuksessa ihmisen soluilla on havaittu kohonnutta superoksiditasoa doksorubisiinialtistuksen jälkeen. Tämä korreloi elektroninsiirtoketjun heikentyneen toiminnan kanssa, mikä aiheuttaa entsyymiaktiivisuuden laskua sekä sytokromi c -oksidaasilla (COX) että nikotiiniamidiadeniinidinukleotidin hydrogenaasilla (NADH) sukkinaattidehydrogenaasin määrän pysyessä samalla kokeessa muuttumattomana (Lebrecht ym. 2005). Doksorubisiinin tuottama mitokondrioita vaurioittava ROS vaikuttaa hengitysketjun toimintaan sekä suorasti että epäsuorasti. Se inhiboi mitokondrion sisäkalvon elektroninsiirtoketjua sitoutuen kardiolipiiniin estäen sen toiminnan (Goormaghtigh ym. 1989). Doksorubisiini vaikuttaa myös topoisomeraasia inhiboiden muodostamalla juosteita sitovia addukteja DNA:han.
Doksorubisiinin varsinainen vaikutus mtDNA:ssa ilmenee juostevaurioita synnyttävän mekanismin kautta, mikä häiritsee mtDNA:n ylläpitoa ja ekspressiota (Lebrecht ym. 2005).
Ihmisen fibroblastisoluilla on havaittu, että antrasykliinien ryhmään kuuluvat yhdisteet sitoutuvat tumallisen DNA:n lisäksi myös mtDNA:han. Lisäksi tutkimuksessa havaittiin, että antrasykliinien sisäänotto soluun on tasaista, mutta niiden pitoisuudet mitokondriossa vaihtelivat kuitenkin merkittävästi (Ashley & Poulton 2008). Antrasykliinien välillä on
17
havaittavissa merkittäviä eroja niiden siirtymisestä mitokondrioon, mutta tarkkaa mekanismia antrasykliinien siirtymisestä ei täysin tunneta (Lebrecht ym. 2005). Doksorubisiinilla on antrasykliineistä vahvin mitokondrionaalinen affiniteetti, ja se kykenee siirtymään solutyypistä riippuen nopeasti mitokondrion matriisiin suoraan interaktioon mtDNA:n kanssa. Kuitenkin kaikilla antrasykliineillä on havaittu merkittävän vahva affiniteetti kardiolipiinille, mikä voi osaltaan selittää doksorubisiinin nopean siirtymisen ja akkumuloitumisen mitokondrion matriisiin kalvoston poikki, vaikka vaikutus ei ulotu muihin antrasykliineihin yhtä vahvasti (Nicolay ym. 1984). Kuitenkin matalia määriä kardiolipiiniä sisältävillä soluilla havaitaan lähes yhtä voimakasta doksorubisiinin sisäänottoa mitokondrion matriisiin kuin normaaleilla soluilla, joten kardiolipiinin vaikutusta antrasykliinien siirtymiselle soluihin ei kuitenkaan täysin tunneta (Ashley & Poulton 2008).
2.4.3 Siprofloksasiini
Siprofloksasiini on 4-fluorokinoloni, jota käytetään yleisesti mikrobi-infektioiden hoidossa.
Sen antibakteerinen aktiivisuus perustuu bakteerisen DNA-gyraasi-entsyymin inhibitioon (Anderson ym. 1998). 4-kinolonien, joihin siprofloksasiini kuuluu, on havaittu aiheuttavan mtDNA:n määrän vähenemistä, mitokondrionaalista hengitysketjun heikkenemistä, glykolyysireaktion kasvua ja viivästynyttä kasvua sille altistetuissa soluissa. Siprofloksasiinin on havaittu tuottavan sijaintispesifisiä kaksoisjuosteen katkoksia mtDNA:ssa, mutta ei tumallisessa DNA:ssa, minkä vuoksi se on mahdollinen mitokondriomyrkky (Lawrence ym.
1993).
Siprofloksasiini, joka inhiboi bakteerista DNA-gyraasi-entsyymiä, inhiboi myös nisäkkäiden topoisomeraasi 2 β:n mitokondrionaalista isoformia, joka korjaa mtDNA:n superkierteisyyttä ja säätelee replikaation aloitusta (Hangas ym. 2018). Topoisomeraasin inhibiittorit vaikuttavat merkittävästi mtDNA-metabolismiin. Koska sekä tyypin 1 että tyypin 2 topoisomeraasien toiminta mitokondrioissa on melko huonosti tunnettu, kattavaa tutkimusta ei ole tehty siitä, miten niiden toiminnan häiriöt vaikuttavat mitokondrion toimintaan ja mtDNA:han. Useat erityyppiset topoisomeraasien inhibiittorit voivat kuitenkin inhiboida sekä tumallisia että mitokondrionaalisia topoisomeraaseja (Lawrence ym. 1993). Siprofloksasiinin tiedetään keskeyttävän topoisomeraasi 2:n toimintaa ihmisen tumallisessa DNA:ssa ja siten synnyttävän kaksoisjuostekatkoksia (Bredberg ym. 1991). Tämän lisäksi siprofloksasiinin tiedetään häiritsevän myös mitokondriaalisen topoisomeraasi 2:n toimintaa ja mtDNA:n
18
replikaatiota C2C12- ja HEK293-soluilla, mikä ilmenee mtDNA:n replikaatiovälituotteiden määrän alenemisena jo 80 µg/ml:n pitoisuudessa (Hangas ym. 2018).
2.4.4 UVB
Ultraviolettisäteilylle (UV) altistettavissa soluissa tiedetään syntyvän välillisenä vaikutuksena sekä ROS-yhdisteitä että reaktiivisia typpiyhdisteitä, jotka aiheuttavat merkittäviä vauriota DNA:ssa (Gniadecki ym. 2000). Ultraviolettisäteily kykenee myös synnyttämään suorana vaikutuksena pyrimidiini- ja tymidiinidimeerirakenteita sekä muita vaurioita DNA:ssa, jotka pysäyttävät DNA:n replikaation (McCulloch ym. 2004). Yleisesti UV-säteily jaetaan kolmeen tyyppiin: UVA-, UVB- ja UVC-säteily, joista UVA- ja UVB-säteilyt vaikuttavat merkittävimmin DNA:ta vaurioittavasti UVC-säteilyn vaurion asteen pysyessä matalampana.
UVB:lla on lyhyempi aallonpituus kuin UVA:lla, eli se on korkeaenergisempää säteilyä, jonka vuoksi se kykenee synnyttämään noin tuhatkertaisesti enemmän affisiota DNA:ssa kuin UVA-säteily (Widel ym. 2014). Tämä on merkittävä tekijä, kun halutaan altistaa soluja DNA-vaurion synnyttämiseksi. Solun tumallisessa DNA:ssa pyrimidiinidimeerien affisiot pystytään korjaamaan NER-mekanismilla (Lehmann 1995). Toisin kuin tumallisella DNA:lla, mtDNA:lla ei ole NER:iä tai vastaavaa metaboliareittiä, joka pystyisi korjaamaan mtDNA:n kaksoisjuostetta vääristäviä pyrimidiinidimeerejä. Vaikka mitokondriolla on kyky nukleotidien affisioiden korjaukseen pelkästään BER-mekanismin kautta, se ei kuitenkaan kykene korjaamaan ultraviolettisäteilyn synnyttämiä dimeerejä, jotka akkumuloituvat haitallisesti mtDNA:han (mm. Clayton ym. 1974, Birch-Machin ym. 2012).
Kliinisissä tutkimuksissa tymidiinidimeerien havaitseminen mtDNA:sta on todettu onnistuvan helposti PCR-menetelmiä hyödyntämällä, minkä vuoksi niiden havaitseminen on verrattain helppoa (Kumar ym. 2004). mtDNA:n vaurio UV-altistuksessa syntyy jo merkittävän pienellä säteilyannoksella, noin 1,34 mj/cm2, joka on riittävästi aiheuttamaan vauriota mtDNA:ssa ilman, että tumallisen DNA:n vauriot aiheuttaisivat soluille DNA-stressiä (Torregrosa-Muñumer ym. 2015).
3 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET JA HYPOTEESIT
Tämän tutkimuksen tavoite on kehittää kaksois-PCR-menetelmää mtDNA:n vaurion määrittämiseksi yhdistämällä lyhyen ja pitkän kantaman PCR:t yhteiseksi PCR:ksi ja kokeellisesti muuntelemalla eri muuttujia toimivan yhteensopivuuden takaamiseksi. Lisäksi
19
tarkoituksena on tutkia erilaisilla stressitekijöillä altistettujen HEK293- ja HeLa-solujen mtDNA:ta sopivimmalla qPCR-menetelmällä niiden vaurioasteen määrittämiseksi. Tutkielman työ toteutettiin laboratoriossa altistamalla viljeltyjä HEK-239- ja HeLa-soluja siprofloksasiinille, doksorubisiinille sekä ultraviolettivalolle. Soluille tehtiin DNA-eristys, joista saaduista näytteistä määritettiin mtDNA:n vaurioastetta tosiaikaisella vaurion määritys qPCR:llä. Tässä työssä haluttiin tutkia sitä, onko kaksois-PCR-menetelmä soveltuva mtDNA:n vaurion määritykseen ja havaitaanko siprofloksasiinilla sekä doksorubisiinilla vaikutusta mtDNA:n vaurioina.
Tutkimustyölle laaditut nollahypoteesit ovat: ”Kvantitatiivinen kaksois-PCR ei toimi luotettavana menetelmänä mitokondrionaalisen DNA:n vaurion havaitsemiseen”, sekä ”Siprofloksasiinin, doksorubisiinin ja ultraviolettivalon välillä ei ole tilastollisesti merkitsevää eroa mtDNA:n vaurion synnyssä”.
4 AINEISTO JA MENETELMÄT
4.1 HEK-solujen kasvatus ja fenoli-kloroformi-eristys qPCR-testausta varten
T-antigeenillä kuolemattomaksi transformoidun ihmisen solulinjan (HEK293) soluja kasvatettiin mitokondrionaalisen DNA:n vaurioiden tunnistamistöitä varten kaksois-PCR-menetelmällä testattavaksi. Solut kasvatettiin matalan glukoosin DMEM-liuoksessa (engl.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium, Biowest Cat-No. L0103), johon oli lisätty naudan sikiön seerumia (engl. Foetal Bovine Serum) 10 % pitoisuuteen. Täydessä konfluenssissa olevasta 15 cm HEK-solumaljasta otettiin solut talteen imemällä kasvatusliuos pois ja pesemällä solut 5 ml PBS-liuoksella (engl. Phosphate-Buffered Saline; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, ja 2 mM KH2PO4 pH 7,4). Solut siirrettiin sentrifugiputkiin ja sentrifugoitiin 5 min 400 g huoneenlämmössä (RT, engl. room temperature). Uudelleen suspensoidusta solumäärästä jaettiin 17 % kuudelle 3,5 cm kasvatusmaljalevylle. Vuorokauden kuluttua soluille tehtiin fenoli-kloroformi-menetelmällä DNA:n eristys.
Fenoli-kloroformi-eristystä varten solut irrotettiin 1 ml PBS-liuoksella alustasta mikrosentrifugiputkiin ja sentrifugoitiin 5 min 1 000 g RT. PBS poistettiin ja solut hajotettiin 500 µl DNA lyysauspuskurilla (10 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.4 % SDS), jota pipetoitiin edestakaisin kapeakärkisen pipetin läpi, kunnes solurykelmät hajosivat liuokseen tasaisesti. Liuokseen lisättiin 20 µl proteinaasi K:ta (10 mg/ml), ja lysaatti inkuboitiin
20
noin 12 tunnin ajan 37 °C lämpötilassa. Näytteisiin lisättiin 50 µl 5 M NaCl avustamaan proteiini-DNA-kompleksien hajoamista.
Inkuboinnin jälkeen näytteille suoritettiin puhdistus, jossa DNA eristettiin muusta lysaatista ja solujäämistä. Näytteiden puhdistus aloitettiin lisäämällä näytteisiin 500 µl fenoli-kloroformi-isoamyylialkoholi-seosta (25:24:1, pH 6,9). Näytteitä sekoitettiin kääntöpöydällä noin 30 min ajan, jonka jälkeen näytteet sentrifugoitiin 5 min 15 000 g RT faasien erottamiseksi. Ylempi DNA:ta sisältävä faasi pipetoitiin talteen puhtaisiin mikrosentrifugiputkiin, joihin lisättiin 500 µl kloroformia ja sekoitettiin ravistelemalla manuaalisesti 5 min ajan, jotta ylimääräinen fenoli poistuisi näytteistä. Näytteet sentrifugoitiin uudestaan 5 min 15 000 g RT ja ylempi faasi pipetoitiin talteen puhtaisiin mikrosentrifugiputkiin.
DNA saostettiin lisäämällä näytteisiin kaksinkertainen tilavuus kylmää 98 % etanolia sekä 1/10 tilavuus 3 M natriumasetaattia pH 5,3. Näytteet sekoitettiin ja jätettiin inkuboitumaan kahden tunnin ajaksi -20 °C lämpötilaan. Saostunut DNA pelletoitiin sentrifugoimalla näytteet 30 min 16 000 g +4 °C lämpötilassa. Neste poistettiin, näytteisiin lisättiin 1 ml 70 % etanolia ja ne sentrifugoitiin 5 min 16 000 g RT. Neste pipetoitiin pois ja mikrosentrifugiputket jätettiin kannet auki kuivumaan noin 15 min ajaksi RT, jotta jäljelle jäänyt neste haihtuisi pois. Tämän jälkeen mikrosentrifugiputkiin pipetoitiin 100 µl TE-puskuria (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM Na2-EDTA) ja DNA-pelletit suspensoitiin uudelleen liuokseen pipetoimalla niitä edestakaisin varovaisesti, jotta pelletit hajoaisivat paremmin, jonka jälkeen näytteet varastoitiin +4 °C lämpötilaan.
Näytteiden DNA-pitoisuudet mitattiin Nanodrop ND-1000 -spektrofotometrillä. Mikäli havaittiin, että näytteiden DNA-pitoisuudet poikkesivat peräkkäisinä toistoina toisistaan yli 10 %, voitiin päätellä, että näytteet eivät olleet liuenneet tarpeeksi, jolloin niille toistettiin liuotus lisäämällä noin 100 µl TE-puskuria ja sekoittamalla näytteitä lämpöhauteessa muutaman tunnin ajan. Näytteiden sekoittumisen parantamiseksi niitä pipetoitiin varovaisesti muutamia kertoja edestakaisin kapeakärkisen pipetin avulla, jotta yhteen liittynyt DNA liukenisi paremmin liuokseen. Tämän jälkeen näytteiden pitoisuudet mitattiin uudelleen Nanodrop ND-1000 -spektrofotometrillä ja todettiin, että näytteiden mittaukset poikkesivat toisistaan alle 10 %, jolloin niiden katsottiin olevan riittävän homogeenisiä qPCR-kokeita varten.
Spektrofotometrillä saatujen arvojen pohjalta kullekin näytteelle tehtiin 50 ng/µl laimennokset TE-puskuriin 100 µl lopputilavuuteen. Näytteiden pitoisuudet tarkastettiin laimennoksen jälkeen Nanodrop ND-1000 -spektrofotometrillä ja havaittiin, että niiden pitoisuudet olivat yhteneväisiä, mutta keskimäärin noin 10 ng/µl pienemmät kuin oli oletettu.
21
Tämä otettiin huomioon näytteitä myöhemmässä vaiheessa annosteltaessa. Yhdelle laimentamattomalle DNA-näytteelle valmisteltiin lisäksi erillinen restriktioentsyymin pilkkominen 100 µl lopputilavuuteen käyttäen 2 µl KpnI-entsyymiä, 10 µl 10x Fast Digest -puskuria sekä 35 µg/µl DNA:ta. Restriktioentsyymipilkkomisliuos vietiin inkubaattoriin +37 °C lämpötilaan noin 24 tunnin ajaksi.
DNA-näytteille tehtiin qPCR-koe, jolla määritettiin sopivat mtDNA-pitoisuudet tuleville kaksois-PCR-kokeille. Valmisteltiin DNA-laimennossarja valmiista näytteistä 100 ng/µl, 50 ng/µl, 25 ng/µl, 12,5 ng/µl ja 6,25 ng/µl pitoisuuksiin, jonka jälkeen valmisteltiin PCR master mix -seos (taulukko 1). Näytteet valmisteltiin jäähauteella valkoisilla 96-kuoppalevyillä (Sarstedt 96 fast PCR fullskirt), joihin käytettiin kirkkaita tasaisia kansia (Sarstedt 8-strip optical clear flat cap). PCR-kokeet ajettiin Agilent Genomicsin G8830A AriaMx Real-Time PCR -laitteella. PCR-ajojen lämpösykliprotokollan profiilina käytettiin valmiita viitearvoja, jotka säädettiin kokeeseen sopivaksi (taulukko 2).
Taulukko 1. Tosiaikaisessa vaurion määritys -qPCR-reaktioseoksessa käytetyt pitoisuudet yksikköineen. PCR-reaktioseoksessa loput reaktioseoksen tilavuudesta täytetään nukleiinihappovapaalla vedellä, joka on merkattu taulukkoon x:llä.
Taulukko 2. Tosiaikaisen vaurion määritys -qPCR:n lämpöprofiili. Kuuma aloitus (engl. Hot Start) varmistaa, että epäspesifinen alukkeiden sitoutuminen huoneenlämmössä ei häiritsisi varsinaista PCR:ä. Amplifikaatiovaiheessa tapahtuu PCR:n varsinainen DNA:n monistuminen.
Amplifikaatiovaiheen vaiheet ovat: denaturaatio, alukkeiden liittymisvaihe ja synteesi (engl.
Amplification, Denaturation, Annealing, Extension).
qPCR:n reaktioseos Pitoisuus Yksikkö
2x AccuStart II PCR SuperMix 50 %
Lyhyt PCR etualuke 100 nM
22 4.2 Kaksois-PCR:n testaus
Mitokondrionaalisen DNA-vaurion tunnistamismenetelmän parantamista tutkittiin tekemällä useita PCR-kokeita, joissa sovellettiin standardoitua PCR-koeasetelmaa. PCR-ajoihin tehtiin PCR master mix -seos, joka valmistettiin käyttämällä Quanta Bio AccuStart II PCR SuperMix -liuosta (Cat. No. 95137), jossa oli 2x pitoisuudessa kokeeseen tarvittavat puskuriliuos, nukleosiditrifosfaatit ja Taq DNA -polymeraasi valmiina seoksena. Valmista master mix -seosta lisättiin jokaiseen PCR-reaktioliuokseen puolet lopputilavuudesta.
Näytteeseen lisättiin kokeesta riippuva määrä pitkän kantaman Hs5999F etu- ja Hs14841R taka-aluketta (engl. forward and reverse primers) sekä kokeesta riippuva määrä lyhyen kantaman Hs3322F etu- ja Hs3410R taka-aluketta (taulukko 3). Näytteisiin lisättiin myös FAM- ja VIC-leimattua fluoresoivaa koetinta sekä pitkälle että lyhyelle amplikonille. Koettimet liittyvät monistettavaan DNA:han, mutta eivät vielä tässä vaiheessa fluoresoi vaimentimen vuoksi. Vasta PCR:n alukkeiden ohjaavan monistumisen takia tapahtuva juosteen korvaaminen saa DNA-polymeraasin irrottamaan reportterivärin koettimesta, jolloin syntyy fluoresoiva signaali merkkinä monistumisesta. Työssä käytetyt alukkeiden ja koettimien sitoutumispaikat sekä restriktioentsyymien katkaisukohdat mtDNA-molekyylissä on esitetty kuvassa 2 (kuva 2).
Loput tilavuudesta reaktioseoksessa täytettiin nukleiinihappovapaalla sterilisoidulla vedellä (taulukko 4). Näytteet valmisteltiin valkoisilla 96-kuoppalevyillä (Sarstedt 96 fast PCR fullskirt) ja kirkkailla tasaisilla kansilla (Sarstedt 8-strip optical clear flat cap). Templaattina käytettiin noin 200 ng KpnI-pilkottua DNA:ta. Näytteet valmisteltiin jäähdytetyllä telineellä, joka piti näytteiden lämpöaltistuksen minimissä samalla varoen altistamasta valoherkkiä koettimia huoneen valolle.
kokeet ajettiin Agilent Genomicsin G8830A AriaMx Real-Time PCR -laitteella. PCR-ajojen lämpösykliprotokollassa käytettiin valmiita viitearvoja, jotka säädettiin kokeeseen sopiviksi (taulukko 5).
23
Taulukko 3. PCR:ssä käytettyjen alukkeiden ja koettimien sekvenssit. Taulukossa esitetyt VIC- ja FAM-koettimet ilmaisevat kyseisiä reportterivärejä. Koettimien ”MGB” tulee englannin kielen sanoista ”minor groove binder quencher” (matalaan uurteeseen sitoutuva vaimentaja), joka suurentaa alukkeen sitomiskykyä ja samalla vaimentaa koettimen fluoresenssia ennen kuin se leikataan pois.
Kuva 2. Ihmisen mtDNA-molekyylin malliin on merkitty työssä käytetyt pitkän ja lyhyen kantaman amplikonit, FAM- ja VIC-leimatut koettimet pitkälle ja lyhyelle sekvensseille sekä restriktioentsyymien katkaisevat kohdat. BamHI-entsyymi katkaisee DNA-juosteen pitkän kantaman sekvenssin kohdalta ja KnpI-entsyymi katkaisee juosteen monistettujen sekvenssien ulkopuolelta. Kuvassa esitetty pitkä etualuke oli kokeissa ensin käytetty aluke, joka tuottaa PCR:ssä 8 843 emäsparia pitkän amplikonin (Pitkä PCR). Tämä vaihdettiin myöhemmin kokeissa paremmin toimivaksi havaittuun pitkään etualukkeeseen 2, joka tuottaa PCR:ssä lyhyemmän 4 691 emäsparia pitkän amplikonin (Pitkä PCR 2).
Alukkeen/koettimen nimi DNA-sekvenssi
Pitkä PCR-etualuke (Hs5999F) TCT AAG CCT CCT TAT TCG AGC CGA Pitkä PCR-taka-aluke (Hs14841R) TTT CAT CAT GCG GAG ATG TTG GAT GG Pitkä PCR-etualuke 2 (HS10131F) ACC ACA ACT CAA CGG CTA CA
FAM-leimattu fluoresoiva koetin
(hmtDNA probe 13546) FAM- ACA AAC GCC TGA GCC CTA -MGB Lyhyt PCR-etualuke (HS 3322F) CTC CTA CTC CTC ATT GTA
Lyhyt PCR-taka-aluke (HS 3410R) TTG CGT AGT TGT ATA TAG C VIC-leimattu fluoresoiva koetin
(MTDNA PROBE 3346 (ND1)) VIC - CTAATCGCAATGGC- MGB
24
Taulukko 4. Kaksois-PCR-reaktioseoksen lopulliset pitoisuudet yksikköineen. Kokeissa käytetyt minimi- ja maksimipitoisuudet alukkeille ja DNA:lle, joita muunneltiin eri työvaiheissa tarpeen mukaan, on merkattu *-symbolilla taulukkoon. PCR-reaktioseoksessa
Taulukko 4. Kaksois-PCR-reaktioseoksen lopulliset pitoisuudet yksikköineen. Kokeissa käytetyt minimi- ja maksimipitoisuudet alukkeille ja DNA:lle, joita muunneltiin eri työvaiheissa tarpeen mukaan, on merkattu *-symbolilla taulukkoon. PCR-reaktioseoksessa