T-antigeenillä kuolemattomaksi transformoidun ihmisen solulinjan (HEK293) soluja kasvatettiin mitokondrionaalisen DNA:n vaurioiden tunnistamistöitä varten kaksois-PCR-menetelmällä testattavaksi. Solut kasvatettiin matalan glukoosin DMEM-liuoksessa (engl.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium, Biowest Cat-No. L0103), johon oli lisätty naudan sikiön seerumia (engl. Foetal Bovine Serum) 10 % pitoisuuteen. Täydessä konfluenssissa olevasta 15 cm HEK-solumaljasta otettiin solut talteen imemällä kasvatusliuos pois ja pesemällä solut 5 ml PBS-liuoksella (engl. Phosphate-Buffered Saline; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, ja 2 mM KH2PO4 pH 7,4). Solut siirrettiin sentrifugiputkiin ja sentrifugoitiin 5 min 400 g huoneenlämmössä (RT, engl. room temperature). Uudelleen suspensoidusta solumäärästä jaettiin 17 % kuudelle 3,5 cm kasvatusmaljalevylle. Vuorokauden kuluttua soluille tehtiin fenoli-kloroformi-menetelmällä DNA:n eristys.
Fenoli-kloroformi-eristystä varten solut irrotettiin 1 ml PBS-liuoksella alustasta mikrosentrifugiputkiin ja sentrifugoitiin 5 min 1 000 g RT. PBS poistettiin ja solut hajotettiin 500 µl DNA lyysauspuskurilla (10 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.4 % SDS), jota pipetoitiin edestakaisin kapeakärkisen pipetin läpi, kunnes solurykelmät hajosivat liuokseen tasaisesti. Liuokseen lisättiin 20 µl proteinaasi K:ta (10 mg/ml), ja lysaatti inkuboitiin
20
noin 12 tunnin ajan 37 °C lämpötilassa. Näytteisiin lisättiin 50 µl 5 M NaCl avustamaan proteiini-DNA-kompleksien hajoamista.
Inkuboinnin jälkeen näytteille suoritettiin puhdistus, jossa DNA eristettiin muusta lysaatista ja solujäämistä. Näytteiden puhdistus aloitettiin lisäämällä näytteisiin 500 µl fenoli-kloroformi-isoamyylialkoholi-seosta (25:24:1, pH 6,9). Näytteitä sekoitettiin kääntöpöydällä noin 30 min ajan, jonka jälkeen näytteet sentrifugoitiin 5 min 15 000 g RT faasien erottamiseksi. Ylempi DNA:ta sisältävä faasi pipetoitiin talteen puhtaisiin mikrosentrifugiputkiin, joihin lisättiin 500 µl kloroformia ja sekoitettiin ravistelemalla manuaalisesti 5 min ajan, jotta ylimääräinen fenoli poistuisi näytteistä. Näytteet sentrifugoitiin uudestaan 5 min 15 000 g RT ja ylempi faasi pipetoitiin talteen puhtaisiin mikrosentrifugiputkiin.
DNA saostettiin lisäämällä näytteisiin kaksinkertainen tilavuus kylmää 98 % etanolia sekä 1/10 tilavuus 3 M natriumasetaattia pH 5,3. Näytteet sekoitettiin ja jätettiin inkuboitumaan kahden tunnin ajaksi -20 °C lämpötilaan. Saostunut DNA pelletoitiin sentrifugoimalla näytteet 30 min 16 000 g +4 °C lämpötilassa. Neste poistettiin, näytteisiin lisättiin 1 ml 70 % etanolia ja ne sentrifugoitiin 5 min 16 000 g RT. Neste pipetoitiin pois ja mikrosentrifugiputket jätettiin kannet auki kuivumaan noin 15 min ajaksi RT, jotta jäljelle jäänyt neste haihtuisi pois. Tämän jälkeen mikrosentrifugiputkiin pipetoitiin 100 µl TE-puskuria (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM Na2-EDTA) ja DNA-pelletit suspensoitiin uudelleen liuokseen pipetoimalla niitä edestakaisin varovaisesti, jotta pelletit hajoaisivat paremmin, jonka jälkeen näytteet varastoitiin +4 °C lämpötilaan.
Näytteiden DNA-pitoisuudet mitattiin Nanodrop ND-1000 -spektrofotometrillä. Mikäli havaittiin, että näytteiden DNA-pitoisuudet poikkesivat peräkkäisinä toistoina toisistaan yli 10 %, voitiin päätellä, että näytteet eivät olleet liuenneet tarpeeksi, jolloin niille toistettiin liuotus lisäämällä noin 100 µl TE-puskuria ja sekoittamalla näytteitä lämpöhauteessa muutaman tunnin ajan. Näytteiden sekoittumisen parantamiseksi niitä pipetoitiin varovaisesti muutamia kertoja edestakaisin kapeakärkisen pipetin avulla, jotta yhteen liittynyt DNA liukenisi paremmin liuokseen. Tämän jälkeen näytteiden pitoisuudet mitattiin uudelleen Nanodrop ND-1000 -spektrofotometrillä ja todettiin, että näytteiden mittaukset poikkesivat toisistaan alle 10 %, jolloin niiden katsottiin olevan riittävän homogeenisiä qPCR-kokeita varten.
Spektrofotometrillä saatujen arvojen pohjalta kullekin näytteelle tehtiin 50 ng/µl laimennokset TE-puskuriin 100 µl lopputilavuuteen. Näytteiden pitoisuudet tarkastettiin laimennoksen jälkeen Nanodrop ND-1000 -spektrofotometrillä ja havaittiin, että niiden pitoisuudet olivat yhteneväisiä, mutta keskimäärin noin 10 ng/µl pienemmät kuin oli oletettu.
21
Tämä otettiin huomioon näytteitä myöhemmässä vaiheessa annosteltaessa. Yhdelle laimentamattomalle DNA-näytteelle valmisteltiin lisäksi erillinen restriktioentsyymin pilkkominen 100 µl lopputilavuuteen käyttäen 2 µl KpnI-entsyymiä, 10 µl 10x Fast Digest -puskuria sekä 35 µg/µl DNA:ta. Restriktioentsyymipilkkomisliuos vietiin inkubaattoriin +37 °C lämpötilaan noin 24 tunnin ajaksi.
DNA-näytteille tehtiin qPCR-koe, jolla määritettiin sopivat mtDNA-pitoisuudet tuleville kaksois-PCR-kokeille. Valmisteltiin DNA-laimennossarja valmiista näytteistä 100 ng/µl, 50 ng/µl, 25 ng/µl, 12,5 ng/µl ja 6,25 ng/µl pitoisuuksiin, jonka jälkeen valmisteltiin PCR master mix -seos (taulukko 1). Näytteet valmisteltiin jäähauteella valkoisilla 96-kuoppalevyillä (Sarstedt 96 fast PCR fullskirt), joihin käytettiin kirkkaita tasaisia kansia (Sarstedt 8-strip optical clear flat cap). PCR-kokeet ajettiin Agilent Genomicsin G8830A AriaMx Real-Time PCR -laitteella. PCR-ajojen lämpösykliprotokollan profiilina käytettiin valmiita viitearvoja, jotka säädettiin kokeeseen sopivaksi (taulukko 2).
Taulukko 1. Tosiaikaisessa vaurion määritys -qPCR-reaktioseoksessa käytetyt pitoisuudet yksikköineen. PCR-reaktioseoksessa loput reaktioseoksen tilavuudesta täytetään nukleiinihappovapaalla vedellä, joka on merkattu taulukkoon x:llä.
Taulukko 2. Tosiaikaisen vaurion määritys -qPCR:n lämpöprofiili. Kuuma aloitus (engl. Hot Start) varmistaa, että epäspesifinen alukkeiden sitoutuminen huoneenlämmössä ei häiritsisi varsinaista PCR:ä. Amplifikaatiovaiheessa tapahtuu PCR:n varsinainen DNA:n monistuminen.
Amplifikaatiovaiheen vaiheet ovat: denaturaatio, alukkeiden liittymisvaihe ja synteesi (engl.
Amplification, Denaturation, Annealing, Extension).
qPCR:n reaktioseos Pitoisuus Yksikkö
2x AccuStart II PCR SuperMix 50 %
Lyhyt PCR etualuke 100 nM
22 4.2 Kaksois-PCR:n testaus
Mitokondrionaalisen DNA-vaurion tunnistamismenetelmän parantamista tutkittiin tekemällä useita PCR-kokeita, joissa sovellettiin standardoitua PCR-koeasetelmaa. PCR-ajoihin tehtiin PCR master mix -seos, joka valmistettiin käyttämällä Quanta Bio AccuStart II PCR SuperMix -liuosta (Cat. No. 95137), jossa oli 2x pitoisuudessa kokeeseen tarvittavat puskuriliuos, nukleosiditrifosfaatit ja Taq DNA -polymeraasi valmiina seoksena. Valmista master mix -seosta lisättiin jokaiseen PCR-reaktioliuokseen puolet lopputilavuudesta.
Näytteeseen lisättiin kokeesta riippuva määrä pitkän kantaman Hs5999F etu- ja Hs14841R taka-aluketta (engl. forward and reverse primers) sekä kokeesta riippuva määrä lyhyen kantaman Hs3322F etu- ja Hs3410R taka-aluketta (taulukko 3). Näytteisiin lisättiin myös FAM- ja VIC-leimattua fluoresoivaa koetinta sekä pitkälle että lyhyelle amplikonille. Koettimet liittyvät monistettavaan DNA:han, mutta eivät vielä tässä vaiheessa fluoresoi vaimentimen vuoksi. Vasta PCR:n alukkeiden ohjaavan monistumisen takia tapahtuva juosteen korvaaminen saa DNA-polymeraasin irrottamaan reportterivärin koettimesta, jolloin syntyy fluoresoiva signaali merkkinä monistumisesta. Työssä käytetyt alukkeiden ja koettimien sitoutumispaikat sekä restriktioentsyymien katkaisukohdat mtDNA-molekyylissä on esitetty kuvassa 2 (kuva 2).
Loput tilavuudesta reaktioseoksessa täytettiin nukleiinihappovapaalla sterilisoidulla vedellä (taulukko 4). Näytteet valmisteltiin valkoisilla 96-kuoppalevyillä (Sarstedt 96 fast PCR fullskirt) ja kirkkailla tasaisilla kansilla (Sarstedt 8-strip optical clear flat cap). Templaattina käytettiin noin 200 ng KpnI-pilkottua DNA:ta. Näytteet valmisteltiin jäähdytetyllä telineellä, joka piti näytteiden lämpöaltistuksen minimissä samalla varoen altistamasta valoherkkiä koettimia huoneen valolle.
kokeet ajettiin Agilent Genomicsin G8830A AriaMx Real-Time PCR -laitteella. PCR-ajojen lämpösykliprotokollassa käytettiin valmiita viitearvoja, jotka säädettiin kokeeseen sopiviksi (taulukko 5).
23
Taulukko 3. PCR:ssä käytettyjen alukkeiden ja koettimien sekvenssit. Taulukossa esitetyt VIC- ja FAM-koettimet ilmaisevat kyseisiä reportterivärejä. Koettimien ”MGB” tulee englannin kielen sanoista ”minor groove binder quencher” (matalaan uurteeseen sitoutuva vaimentaja), joka suurentaa alukkeen sitomiskykyä ja samalla vaimentaa koettimen fluoresenssia ennen kuin se leikataan pois.
Kuva 2. Ihmisen mtDNA-molekyylin malliin on merkitty työssä käytetyt pitkän ja lyhyen kantaman amplikonit, FAM- ja VIC-leimatut koettimet pitkälle ja lyhyelle sekvensseille sekä restriktioentsyymien katkaisevat kohdat. BamHI-entsyymi katkaisee DNA-juosteen pitkän kantaman sekvenssin kohdalta ja KnpI-entsyymi katkaisee juosteen monistettujen sekvenssien ulkopuolelta. Kuvassa esitetty pitkä etualuke oli kokeissa ensin käytetty aluke, joka tuottaa PCR:ssä 8 843 emäsparia pitkän amplikonin (Pitkä PCR). Tämä vaihdettiin myöhemmin kokeissa paremmin toimivaksi havaittuun pitkään etualukkeeseen 2, joka tuottaa PCR:ssä lyhyemmän 4 691 emäsparia pitkän amplikonin (Pitkä PCR 2).
Alukkeen/koettimen nimi DNA-sekvenssi
Pitkä PCR-etualuke (Hs5999F) TCT AAG CCT CCT TAT TCG AGC CGA Pitkä PCR-taka-aluke (Hs14841R) TTT CAT CAT GCG GAG ATG TTG GAT GG Pitkä PCR-etualuke 2 (HS10131F) ACC ACA ACT CAA CGG CTA CA
FAM-leimattu fluoresoiva koetin
(hmtDNA probe 13546) FAM- ACA AAC GCC TGA GCC CTA -MGB Lyhyt PCR-etualuke (HS 3322F) CTC CTA CTC CTC ATT GTA
Lyhyt PCR-taka-aluke (HS 3410R) TTG CGT AGT TGT ATA TAG C VIC-leimattu fluoresoiva koetin
(MTDNA PROBE 3346 (ND1)) VIC - CTAATCGCAATGGC- MGB
24
Taulukko 4. Kaksois-PCR-reaktioseoksen lopulliset pitoisuudet yksikköineen. Kokeissa käytetyt minimi- ja maksimipitoisuudet alukkeille ja DNA:lle, joita muunneltiin eri työvaiheissa tarpeen mukaan, on merkattu *-symbolilla taulukkoon. PCR-reaktioseoksessa loput reaktioseoksen tilavuudesta täytetään steriilillä nukleiinihappovapaalla vedellä, jota merkitään taulukossa x:llä.
Taulukko 5. Kaksois-PCR:n lämpöprofiili kuumalla aloituksella ja 40 syklin amplifikaatiolla.
Taulukossa on ilmaistu PCR-ajon lämpötilat ja niissä käytettävät ajat (min) kullekin vaiheelle.
4.3 DNA:n BamHI-restriktioentsyymillä pilkkominen standardisuoran luomiseksi
PCR-menetelmän toimivuutta mtDNA-vaurion tunnistamiseen testattiin mittaamalla DNA:n monistumisen aste eriasteisesti restriktioentsyymillä pilkotussa reaktioseoksessa. Kokeen DNA-laimennokset tehtiin käyttäen osaa ehyttä ja osaa entsyymillä pilkottua mtDNA:ta, jota oli pilkottu monistettavalta sekvenssialueelta restriktioentsyymin avulla. Työ suoritettiin valmistelemalla DNA-näytteille BamHI-restriktioentsyymipilkkominen, joka katkaisee mtDNA:n juosteen 14 259. emäsparin kohdalta. Restriktioentsyymillä pilkkominen tehtiin kappaleessa 4.1 esitetyn menetelmän mukaisesti 100 ng/µl pitoisuudella noin tunnin ajan inkuboiden +37 °C. Lisäksi valmistettiin ei-pilkottu näyte samasta DNA-näytteestä, jota laimennettiin sterilisoidulla vedellä noin 100 ng/µl pitoisuuteen. Pilkotuista ja ei-pilkotuista näytteistä valmistettiin kolme rinnakkaista laimennossarjaa, jossa ei-pilkottu DNA oli 1:0 - 10:1 - 5:1 - 1:1 - 1:5 - 0:1 -suhteessa BamHI-pilkottuun DNA:han. Näytteet käytettiin PCR-ajossa kappaleen 4.2 mukaisella kaksois-PCR-menetelmällä.
Kaksois-PCR:n reaktioseos Pitoisuus Yksikkö 2x AccuStart II PCR SuperMix 1x x
Pitkä PCR-etualuke 50-300* nM
25
4.4 HEK293-solujen DNA:n vaurioittaminen ultraviolettivalolla, doksorubisiinilla ja siprofloksasiinilla
Kasvatettuja HEK293-soluja jaettiin kahteentoista 3 ml kasvatusmaljaan DMEM-kasvatusliuokseen kappaleen 4.1 kuvauksen mukaisesti. Maljoista kolme kappaletta käsiteltiin 80 µg/ml siprofloksasiinilla. Siprofloksasiininäytteiden altistus kesti noin 24 t ajan.
Kolmeen maljoista lisättiin 3,4 µM doksorubisiinia. Doksorubisiininäytteiden altistus kesti noin 2,5 t ajan. Lisäksi kolme maljaa altistettiin 1,34 mJ/cm2 302 nm UVB-valolle 30 s ajan. Kolme maljaa jätettiin käsittelemättömiksi kontrollinäytteiksi. Kaikilta kasvatusmaljoilta kerättiin solut talteen DNA:n fenoli-kloroformiuuttoa varten. DNA:n uutto suoritettiin kappaleen 4.1 mukaisesti tehden näytteille etanolisaostus. DNA-näytteet jätettiin inkuboitumaan proteinaasi K:n lisäyksen jälkeen lämpöhauteeseen noin 20 tunnin ajaksi. Eristetyt DNA-näytteet resuspensoitiin suoraan KpnI-restriktioentsyymipilkkomiseen käyttämällä 40 µl FastDigest-puskuria, 6 µl entsyymiä ja 354 µl H2O 400 µl:n tilavuuteen. Näytteitä inkuboitiin lämpökaapissa +37 °C lämpötilassa noin 12 tunnin ajan. Entsyymipilkkomisen jälkeen näytteiden DNA-pitoisuus mitattiin Nanodrop ND-1000 -spektrofotometrillä. Mittausten pohjalta näytteet laimennettiin 100 ng/µl pitoisuuteen, jonka jälkeen ne ajettiin PCR:llä erillisinä rinnakkaisina lyhyen ja pitkän kantaman reaktioina. Pitkän kantaman PCR-reaktioseos ja lyhyen kantaman PCR-PCR-reaktioseos valmistettiin toisistaan eri resepteillä (taulukko 6).
26
Taulukko 6. Pitkän ja lyhyen kantaman PCR-reaktioseokset erillisille reaktioille. Taulukossa on esitetty kokeessa käytetyt pitoisuudet yksikköineen. PCR-reaktioseoksen tilavuudesta loput täytettiin nukleiinihappovapaalla vedellä, jota merkitään taulukossa x:llä.
4.5 HeLa-solujen DNA:n vaurioittaminen siprofloksasiinilla ja doksorubisiinilla
DMEM-liuoksessa kasvatettuja HeLa-soluja siirrostettiin kahdelle 3,5 cm 6-kuoppalevylle noin puoleen konfluenssiin, joista toinen käsiteltiin 80 µg/ml siprofloksasiinilla. Noin 23 tunnin jälkeen solut kerättiin talteen ja DNA:ta eristettiin kappaleen 4.1 mukaisesti. DNA-näytteitä inkuboitiin 17 tunnin ajan +37 °C KpnI-entsyymipilkonnassa lämpöhauteessa. Tämän jälkeen näytteistä mitattiin DNA-pitoisuudet Nanodrop ND-1000 -spektrofotometrillä, jonka pohjalta näytteet laimennettiin 100 ng/µl pitoisuuksiin ja niille tehtiin erilliset pitkän ja lyhyen kantaman PCR:t edellisessä kappaleessa kuvatulla tavalla.
DMEM-liuoksessa kasvatettuja HeLa-soluja siirrostettiin kahdelle 3,5 cm 6-kuoppalevylle, joista toinen käsiteltiin 3,4 µM doksorubisiinilla noin 2,5 tunnin ajaksi ja toinen jätettiin kontrolliksi. Soluista eristettiin DNA:ta kappaleen 4.1 mukaan, josta poikkeavasti DNA-näytteet inkuboitiin 20 minuuttia -80 °C lämpötilassa etanolisaostusvaiheessa pidemmän -20 °C inkuboinnin sijasta. Näytteet jätettiin 18 tunnin ajaksi KpnI-restriktioentsyymipilkontaan inkuboitumaan +37 °C, jonka jälkeen niistä mitattiin DNA-pitoisuudet. Mittausten pohjalta näytteet laimennettiin 100 ng/µl pitoisuuksiin, ja niille tehtiin erilliset pitkän ja lyhyen kantaman PCR:t.
PCR-reaktioseos pitkän kantaman alukkeelle Pitoisuus Yksikkö
2x AccuStart II PCR SuperMix 50 %
Pitkä PCR-etualuke 100 nM
2x AccuStart II PCR SuperMix 50 %
Lyhyt PCR-etualuke 100 nM
27
PCR-kokeesta saatu data analysoitiin LORD-Q-data-analyysillä, joka perustuu tosiaikaisen PCR:n pitkien ja lyhyiden fragmenttien Ct-arvojen mittauksiin sekä niiden vertailuun.
Käsitellyiltä soluilta eristettyä DNA:ta verrattiin rinnakkain käsittelemättömiin kontrollinäytteisiin. Juostekatkoksien määrä laskettiin jokaisen DNA:n 10 kb emäsparille tilastollisella määrityskaavalla (kuva 3). Kaavan EL- ja ES-määreet ovat amplifikaation hyötysuhteet pitkälle ja lyhyelle koettimelle. Jokainen näyte analysoitiin kolmena rinnakkaisena toistona, ja niiden keskiarvoista laskettiin käytettävät Ct-arvot sekä pitkän että lyhyen kantaman amplifikaatioille. a on emäsparien määrä pitkässä fragmentissa, ja n on kontrollinäytteiden määrä. EL ja ES määritettiin useiden DNA-laimennoksien lineaarisen regression analyysillä.
Kuva 3. LORD-Q-data-analyysin matemaattinen kaava mtDNA:n juosteen katkoksien määrittämiseksi. Esitetyssä kaavassa EL- ja ES merkitsevät amplifikaation hyötysuhdetta pitkälle ja lyhyelle koettimelle. Ct-arvot (Cp) määritettiin AriaMx-ohjelmistolla PCR-ajoista mitatuilta pitkiltä ja lyhyiltä fragmenteilta, joita verrattiin käsittelemättömiä DNA-standardeja vasten; a on emäsparien määrä pitkässä PCR-fragmentissa ja n on kontrollinäytteiden määrä referenssinäytteissä. EL ja ES määritettiin DNA-näytteiden laimennossarjalla sekä lineaariregression analyysillä.
28 5 TULOKSET
5.1 Kaksois-PCR-menetelmän kehityksen vaiheet
5.1.1 Alustava toimiva kaksois-PCR-asetelma
Kaksois-PCR:ssä testattiin kolme eri DNA-pitoisuutta (50, 100 ja 200 ng/µl pitoisuudet) KpnI-restriktioentsyymillä pilkottua DNA:ta, jossa käytettiin lyhyen kantaman aluketta 100 nM, pitkän kantaman aluketta 500 nM sekä kumpaakin fluoresoivaa koetinta 125 nM. Koe ajettiin muunnellulla PCR-lämpöprofiililla (taulukko 6). PCR:n havaittiin toimivan ihanteellisimmin 200 ng/µl pitoisuudella molemmille alukeparille, jotka on eroteltu kuvaajassa väreillä (kuva 4).
Taulukko 6. Kaksois-PCR:n lämpöprofiili kuumalla aloituksella ja 40 syklin amplifikaatiolla.
Taulukossa on ilmaistu PCR-ajon lämpötilat ja niissä käytettävät ajat kullekin vaiheelle.
Kuuma aloitus
Denaturaatio Alukkeiden liittymisvaihe Synteesi
Lämpötila (°C) 94 94 60 72
Aika (min) 05:00 00:30 00:30 07:00
Amplifikaatio, 40 sykliä
29
Kuva 4. Kaksois-PCR:n amplifikaatiokäyrät 50, 100 ja 200 ng/µl pitoisuuksissa KpnI-restriktioentsyymillä pilkottua DNA:ta. Kuvaajassa esitetyt amplifikaatiokäyrät, jotka saatiin 200 ng/µl pitoisuudella, on merkattu väreillä; vihreät käyrät merkitsevät lyhyen kantaman PCR:n amplifikaatiota ja siniset käyrät merkitsevät pitkän kantaman PCR:n amplifikaatiota.
Kaikki amplifikaatiokäyrät 50 ja 100 ng/µl templaattijuosteille on merkitty harmaalla. Vihreä ja sininen jana kuvastavat vastaavasti AriaMx-ohjelmiston asettamia VIC- ja FAM-fluoresenssimittauksien raja-arvoja kaikille näytteille.
5.1.2 Kaksois-PCR:n testaus standardin luomiseksi mtDNA-vauriolle
Valmisteltiin laimennossarjat kahdesta DNA-näytteestä mtDNA:n vauriostandardin luomiseksi: BamHI-restriktioentsyymillä pilkottua DNA:ta ja pilkkomatonta DNA:ta sekoitettiin viiteen näytteeseen eri suhteissa. Laimennossarjat valmistettiin käyttämällä sekä 100 ng/µl DNA:ta (taulukko 7) että 200 ng/µl DNA:ta (taulukko 8). 100 ng/µl DNA-ajossa havaittiin, että fluoresenssin raja-arvo ei ylittynyt FAM:llä leimatuissa pitkän kantaman PCR:ssa kaikille näytteille (kuva 5). 200 ng/µl DNA-ajossa havaittiin, että fluoresenssin raja-arvo ei ylittynyt pitkän kantaman PCR:ssa (kuva 7). PCR-standardin DNA-pitoisuutta Ct-sykliä vasten tarkasteltuna muodosti suoran kuvaajassa, jonka kulmakerroin sekä totaalivariaatio (R2) kuitenkin poikkeavat liian paljon halutusta (kulmakerroin ≥ -3,6; R2 < 0,99). Täten standardisuoraa ei voitu muodostaa sekä 100 ng/µl (kuva 6) että 200 ng/µl pitoisuuksille (kuva 8).
30
Taulukko 7. Restriktioentsyymipilkotun ja ei-restriktioentsyymipilkotun DNA:n standardin laimennossuhteet sekä tilavuudet (µl) standardin luomiseksi 100 ng/µl DNA-pitoisuuksilla.
Taulukko 8. Restriktioentsyymipilkotun ja ei-restriktioentsyymipilkotun DNA-standardin laimennossuhteet sekä tilavuudet (µl) standardin luomiseksi 200 ng/µl DNA-pitoisuuksilla.
Kuva 5. Kaksois-PCR:n amplifikaatiokäyrät BamHI-restriktioentsyymillä pilkotun DNA:n ja ei-restriktioentsyymipilkotun DNA:n sekoitukselle 100 ng/µl pitoisuudessa. Kuvaajassa amplifikaatiokäyrät annetussa pitoisuudessa on merkattu väreillä; vihreät käyrät merkitsevät lyhyen kantaman PCR:n amplifikaatiota koko mtDNA-määrästä, ja siniset käyrät merkitsevät pitkän kantaman PCR:n amplifikaatiota ehjästä templaatista, jota restriktioentsyymi ei ole katkaissut. Vihreä ja sininen jana kuvastavat VIC- ja FAM-reportterivärien erottumista taustasta AriaMx-ohjelmiston asettamien rajojen perusteella.
Ei-restriktoitu DNA BamHI-restriktoitu DNA
Laimennossuhde 10:1 3:1 1:1 1:3 1:10 Laimennossuhde
Tilavuus (µl) 9+1 6+3 5+5 3+6 1+9 Tilavuus (µl)
Ei-restriktoitu DNA BamHI-restriktoitu DNA
Laimennossuhde 10:1 3:1 1:1 Laimennossuhde
Tilavuus (µl) 9+1 6+3 5+5 Tilavuus (µl)
31
Kuva 6. PCR:n ei-restriktioentsyymipilkotun DNA:n pitoisuus, suhteessa raja-arvon PCR-sykli (Cq) 100 ng/µl kokonaisessa pitoisuudessa. Kuvaajassa on esitetty DNA-laimennosnäytteiden mittausten perusteella määritetty käyrä, jonka kulmakerroin sekä totaalivariaatio (R2) poikkeavat liiaksi halutusta, jolloin standardisuoraa ei voida muodostaa luotettavasti. Katkoviiva kuvastaa mittauksista saatua käyrää ja tasainen viiva janaa, jolle mittausten olisi asetuttava.
32
Kuva 7. Kaksois-PCR:n amplifikaatiokäyrät BamHI-restriktioentsyymillä pilkotun DNA:n ja ei-restriktioentsyymipilkotun DNA:n laimennokselle 200 ng/µl pitoisuudessa. Kuvaajassa amplifikaatiokäyrät annetussa pitoisuudessa on merkattu väreillä; vihreät käyrät merkitsevät lyhyen kantaman PCR:n amplifikaatiota koko mtDNA-määrästä, ja siniset käyrät merkitsevät pitkän kantaman PCR:n amplifikaatiota ehjästä templaatista, jota BamHI ei ole katkaissut.
Vihreä ja sininen jana kuvastavat VIC- ja FAM-reportterivärien erottumista taustasta AriaMx-ohjelmiston asettamien rajojen perusteella.
33
Kuva 8. PCR:n ei-restriktioentsyymipilkotun DNA:n pitoisuus suhteessa raja-arvon PCR-sykliin (Cq) 200 ng/µl kokonaisessa DNA-pitoisuudessa. Kuvaajassa on esitetty DNA-laimennosnäytteiden käyrä, jonka kulmakerroin sekä totaalivariaatio (R2) poikkeavat liiaksi halutusta, jolloin standardisuoraa ei voida muodostaa luotettavasti. Katkoviiva kuvastaa mittauksista saatua käyrää ja tasainen viiva janaa, jolle mittausten olisi asetuttava.
5.1.3 Kaksois-PCR:n toiminnan parantelu
Valmisteltiin kaksois-PCR, jonka pitkän kantaman aluke vaihdettiin lyhyempään, noin 4645 bp pitkän fragmentin muodostavaan FAM-leimattuun koettimeen. Kokeessa tehtiin kappaleen 4.2 mukaiset PCR-ajot, joissa käytettiin pitkän kantaman aluketta 300 nM ja VIC-leimattua lyhyttä aluketta 250 nM. Uuden alukkeen vuoksi PCR:n lämpöprofiili muutettiin, jolloin alukkeiden liittymisvaihe tapahtui +59 °C lämpötilassa 10 sekuntia ja synteesivaihe +72 °C kolme minuuttia. Havaittiin, että lyhyen ja pitkän kantaman kohdesekvenssit ylittävät raja-arvon yhtä aikaa, mutta hitaammin kuin erikseen, jolloin amplifikaatio ei ehdi täysin tasaantumaan nousun jälkeen 40 toistosyklin aikana (kuva 9). Tämä ei kuitenkaan haitannut työn suoritusta.
34
Kuva 9. Onnistunut kaksois-PCR, jossa käytetään eri alukkeita ja jossa syntyy 4645 bp pitkä PCR-tuote (templaattina 100 ng/µl KnpI-restriktioentsyymillä pilkottua DNA:ta). Kuvaajassa esitetyt PCR:n amplifikaatiokäyrät on merkattu väreillä; vihreät käyrät merkitsevät lyhyen kantaman PCR:n amplifikaatiota ja siniset käyrät merkitsevät pitkän kantaman PCR:n amplifikaatiota. Vihreä ja sininen jana kuvastavat VIC- ja FAM-reportterivärien erottumista taustasta AriaMx-ohjelmiston asettamien arvojen perusteella.
5.1.4 Kaksois-PCR-kokeen lopetus sekä alukkeiden vaihtaminen
Valmisteltiin koeasetelma, jossa mitataan mtDNA:n vaurioastetta menadionilla ja kaliumbromidilla käsitellyistä HEK-soluista, ja lisäksi valmisteltiin yksi kontrollinäyte. DNA-näytteet oltiin pilkottu KnpI-restriktioentsyymillä koetta varten. Kaksois-PCR-koe suoritettiin kappaleen 5.1.3 mukaisesti. Havaittiin, että lyhyen kantaman PCR ei toimi tarpeeksi hyvin, jotta se ylittäisi raja-arvon PCR-sykliin (Ct). Samalla huomattiin, että pitkän kantaman amplikonit monistuvat riittävästi onnistuen saavuttamaan nousun hidastumisvaiheen, mikä saattaa ilmentää sitä, että suoritettu koeasetelma ei ole riittävä koetta varten (kuva 10).
Suoritettu kaksois-PCR ei toimi ihanteellisesti, jotta lyhyen ja pitkän kantaman amplikonit monistuisivat voimakkaasti. Tämä ei kuitenkaan haittaa PCR:stä tehtävää analyysiä merkittävästi. Toistetuissa kaksois-PCR-kokeissa PCR-tuotteiden monistuminen pitkän ja lyhyen amplikonin kohdalla vaihteli eri kokeiden välillä näennäisen epämääräisesti ja sattumanvaraisesti. Tämän vuoksi kaksois-PCR-koeasetelman todettiin olevan liian epäluotettava kokeiden jatkon kannalta, sillä riittävän tarkasti toimivaa ja toistettavaa
35
koeasetelmaa ei saatu luotua. Täten päätettiin luopua kaksois-PCR-koeasetelmasta, ja kokeet suoritettiin loppuun ajamalla lyhyen ja pitkän kantaman PCR:t erikseen hyödyntäen muilta osin samaa protokollaa kuin aiemmin. Erikseen ajettuna PCR:n todettiin toimivan tarpeeksi hyvin ja odotetun kaltaisesti, jotta sitä voitiin käyttää mtDNA-vaurion havaitsemiseen (kuva 11).
Kuva 10. Kaksois-PCR käsiteltyjen HEK-solujen mtDNA:n vaurioasteen määrittämiseksi, jossa todettiin kaksois-PCR:n olevan liian epäluotettava toistettavissa kokeissa. Kuvaajassa esitetyt PCR:n amplifikaatiokäyrät annetussa pitoisuudessa on merkattu väreillä: vihreät käyrät merkitsevät lyhyen kantaman PCR:n amplifikaatiota ja siniset käyrät merkitsevät pitkän kantaman PCR:n amplifikaatiota. Vastaavasti vihreä ja sininen jana kuvastavat VIC- ja FAM-reportterivärien erottumista taustasta AriaMx-ohjelmiston asettaman arvon perusteella, joista havaitaan lyhyen kantaman PCR-tuotteiden fluoresenssin jäävän annetun raja-arvon alapuolelle, eikä se täten erotu taustasta juuri ollenkaan.
36
Kuva 11. Erilliset lyhyen ja pitkän kantaman PCR:t. Kuvaajassa esitetty menadionilla ja kaliumbromidilla käsiteltyjen HEK-solujen mtDNA:n vaurioaste kontrollia vasten vertailtuna.
Kuvaajassa sinisellä värillä ovat merkitty kontrollinäytteet, punaisella värillä menadionikäsittely ja vihreällä värillä kaliumbromidikäsittely. Ylempien käyrien joukko kuvastaa lyhyen kantaman amplikoneja ja alempien käyrien joukko kuvastaa pitkän kantaman amplikoneja. Sininen jana kuvaajassa merkitsee FAM-reportterivärin erottumista taustasta AriaMx-ohjelmiston asettamien arvojen perusteella.
5.2 HEK-solujen käsittely UV:lla, doksorubisiinilla ja siprofloksasiinilla
HEK-soluja käsiteltiin vaurion määrittämiseksi siprofloksasiinilla 80 µg/ml noin 24 tunnin altistuksessa, doksorubisiinilla 3,4 µM 2,5 tunnin altistuksessa tai 302 nm UVB-valolla 1,34 mJ/cm2 305 nm 30 s. Altistuksessa syntynyttä mtDNA-vauriota määritettiin erillisissä pitkän ja lyhyen kantaman PCR:ssä käyttämällä käsittelemättömien solujen rinnakkaisnäytettä referenssinä. Havaittiin, että UV-käsittely synnytti tilastollisesti merkitsevän eron, mutta siprofloksasiini- sekä doksorubisiinikäsittelyt eivät synnyttäneet tilastollisesti merkitsevää eroa (kuva 12). Jokaiseen mtDNA-molekyyliin syntyi UVB-altistuksessa keskimääräisesti 18,5 affisiota, doksorubisiinialtistuksessa 3,8 affisiota ja siprofloksasiinialtistuksessa keskimääräisesti 7,52 affisiota enemmän kuin kontrolleissa.
37
Kuva 12. mtDNA-vauriot UV-, doksorubisiini- ja siprofloksasiinikäsitellyissä HEK-soluissa.
UV-altistuksella havaittiin tilastollisesti merkitsevä ero mtDNA:n vaurioasteessa. Kuvaajassa y-akselilla on esitetty juostevaurioiden keskiarvoinen määrä yhtä mtDNA-molekyyliä kohden.
Käsittelemättömien ja käsiteltyjen näytteiden välisen eron merkitsevyys laskettiin Studentin t-testillä (kaksisuuntainen, erisuuruiset varianssit). Merkitsevyystaso on ilmoitettu kullekin käsittelylle annetulla p-arvolla, jossa p ≤ 0,05 ilmaisee tilastollista merkitsevyyttä. Virhepylväät kuvaajassa merkitsevät näytteiden molemminsuuntaista keskihajontaa.
5.3 HeLa-solujen käsittely siprofloksasiinilla
HeLa-solut altistettiin 80 µg/ml siprofloksasiinille noin 23 tunnin ajan kuutena rinnakkaisena näytteenä, joita verrattiin kuutta rinnakkaista käsittelemätöntä kontrollinäytettä vasten.
Näytteille tehtiin kvantitatiiviset pitkän ja lyhyen kantaman PCR:t syntyneiden mtDNAvaurioiden määrittämiseksi. PCR:stä saatuja tuloksia tarkasteltiin Microsoftin Excel -ohjelmalla suorittamalla mittauksille Studentin tilastollinen t-testi. Analyysissä ei havaittu tilastollisesti merkitsevää vaikutusta DNA-juosteiden katkoksissa kontrollin ja siprofloksasiinin välillä (kuva 13). Siprofloksasiinilla mtDNA-molekyyliin syntyi keskimääräisesti 1,9 affisiota lisää.
p = 0,04
p = 0,44
p = 0,15
-10,00 -5,00 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00
Kontrolli UV Doksorubisiini Siprofloksasiini DNA-vaurioiden määrä mtDNA-molekyylissä
38
Kuva 13. mtDNA-vaurioiden määrä 80 ug/ml siprofloksasiinilla käsitellyissä
Kuva 13. mtDNA-vaurioiden määrä 80 ug/ml siprofloksasiinilla käsitellyissä