Topoisomeraasit

DNA:n topoisomeraasi on entsyymi, joka katalysoi topologista DNA:n isomerisaatiota katkaisemalla ja yhdistämällä yhtä tai kumpaakin DNA:n juostetta (mm. Gellert 1981, Campbell 2008). Tunnetut topoisomeraasit jaotellaan yleisesti kahteen pääryhmään: tyypin 1 ja tyypin 2 topoisomeraaseihin. Tyypin 1 topoisomeraasi katalysoi muutosta DNA:n topologiassa tekemällä katkoksen yhteen kaksoisjuosteisen DNA:n juosteista, mikä on tärkeä mekanismi DNA-juosteen kierteisyyden vähentämiseksi. Tyypin 2 topoisomeraasit katalysoivat muutoksia DNA:n topologiassa katkaisemalla molemmat kaksijuosteisen DNA:n juosteista DNA:n superkierteisyyden ja muiden DNA-vyyhtien selvittämiseksi (Miller ym. 1981). Sekä tyypin 1 että tyypin 2 topoisomeraasien toiminta mitokondrioissa on melko huonosti tunnettu. Viime vuosina on kuitenkin saatu selville, että Top 2 vähentää mtDNA:n positiivista superkierteisyyttä (Hangas ym. 2018). Lisäksi on saatu selville, että mitokondrionaalinen TOP1 vähentää mtDNA:n negatiivista superkierteisyyttä (Baechler ym. 2019). Erityyppisten topoisomeraasien inhibiittoreita on tunnistettu mitokondriossa, ja niiden toiminnan on todettu inhiboivan sekä tumallisia että mitokondrionaalisia entsyymejä (Lawrence ym. 1993).

Monet topoisomeraaseja inhiboivista myrkyistä ovat syöpälääkkeitä, joiden toiminta on olennaista syöpäsolujen kasvun hidastamiseksi. Lääkkeinä käytettävät topoisomeraasimyrkyt toimivat tappamalla liian nopeasti lisääntyviä soluja pitäen normaalit hitaammin jakautuvat solut hengissä (mm. Delgado ym. 2018). Topoisomeraasin inhibiittoreita on useita erilaisia, mutta niillä kaikilla on samankaltainen toiminnallinen mekanismi. Ne häiritsevät tai keskeyttävät topoisomeraasin ohjaaman DNA:n katkaisun ja uudelleenliittämisen mekanismia (Laponogov 2009). Topoisomeraasimyrkyt saattavat synnyttää toiminnallaan juostekatkoksia tai muita emäsvirheitä DNA:ssa (Robinson ym. 1991). Esimerkiksi antrasykliineihin kuuluvan doksorubisiini-syöpälääkkeen on todettu synnyttävän kaksoisjuostekatkoksia nisäkkäiden tumallisessa DNA:ssa (Capranico ym. 1990). Kuitenkaan kattavaa tutkimusta topoisomeraasimyrkkyjen vaikutuksesta mitokondrionaalisissa topoisomeraasissa ja niiden vaikutuksesta mtDNA:han ei ole vielä tehty.

16 2.4.2 Doksorubisiini

Doksorubisiini on antrasykliinien ryhmään kuuluva yleisesti käytetty syöpälääke, jonka tärkein toiminnallinen mekanismi on topoisomeraasi 2:n inhibitio. Tämä mekanismi johtaa kattaviin tumallisen DNA:n vaurioihin nopeasti monistuvissa soluissa. Koska syöpäsolujen DNA:lla on virheellisesti toimiva replikaatiomekanismi, ne kuolevat doksorubisiinin vaikutuksesta toisin kuin normaalit solut, joiden replikaatio on hallittua. Doksorubisiinin pitkäaikaiskäytössä sen sivuvaikutuksena ilmenee annosspesifistä myöhään ilmenevää kroonista kardiotoksisuutta, jota on myös havaittu in vivo -kokeissa rotilla (Lefrak ym. 1973). Altistetuilla rotilla havaittiin merkittävästi kohonnutta sydämen lihassolujen mtDNA:n vauriota (Zhou ym. 2001).

Samanlainen korrelaatio on myös havaittu kliinisissä ihmiskokeissa, joissa doksorubisiinilla sekä muilla antrasykliineillä lääkittyjen ihmisten sydämistä ja luustolihaksista post mortem -kerättyjä näytteitä tutkittiin mtDNA:n vaurioiden ilmenemistä eri menetelmin.

Doksorubisiinille altistetuissa sydänlihaksissa oli merkittävä ero mtDNA:n vaurion asteessa muihin lihasnäytteisiin verrattuna, eikä luustolihasnäytteissä havaittu juuri ollenkaan doksorubisiinin synnyttämiä vaurioita (Lebrecht ym. 2005). Vaikka doksorubisiinin tiedetään vaikuttavan kliinisesti useissa erilaisissa solutyypeissä, in vitro -kokeissa sydämen soluilla sen on kuitenkin havaittu synnyttävän mitokondrion toimintaa heikentävää ROS-vahinkoa (mm.

Bien ym. 2010, Ichikawa ym. 2014).

Tutkimuksessa ihmisen soluilla on havaittu kohonnutta superoksiditasoa doksorubisiinialtistuksen jälkeen. Tämä korreloi elektroninsiirtoketjun heikentyneen toiminnan kanssa, mikä aiheuttaa entsyymiaktiivisuuden laskua sekä sytokromi c -oksidaasilla (COX) että nikotiiniamidiadeniinidinukleotidin hydrogenaasilla (NADH) sukkinaattidehydrogenaasin määrän pysyessä samalla kokeessa muuttumattomana (Lebrecht ym. 2005). Doksorubisiinin tuottama mitokondrioita vaurioittava ROS vaikuttaa hengitysketjun toimintaan sekä suorasti että epäsuorasti. Se inhiboi mitokondrion sisäkalvon elektroninsiirtoketjua sitoutuen kardiolipiiniin estäen sen toiminnan (Goormaghtigh ym. 1989). Doksorubisiini vaikuttaa myös topoisomeraasia inhiboiden muodostamalla juosteita sitovia addukteja DNA:han.

Doksorubisiinin varsinainen vaikutus mtDNA:ssa ilmenee juostevaurioita synnyttävän mekanismin kautta, mikä häiritsee mtDNA:n ylläpitoa ja ekspressiota (Lebrecht ym. 2005).

Ihmisen fibroblastisoluilla on havaittu, että antrasykliinien ryhmään kuuluvat yhdisteet sitoutuvat tumallisen DNA:n lisäksi myös mtDNA:han. Lisäksi tutkimuksessa havaittiin, että antrasykliinien sisäänotto soluun on tasaista, mutta niiden pitoisuudet mitokondriossa vaihtelivat kuitenkin merkittävästi (Ashley & Poulton 2008). Antrasykliinien välillä on

17

havaittavissa merkittäviä eroja niiden siirtymisestä mitokondrioon, mutta tarkkaa mekanismia antrasykliinien siirtymisestä ei täysin tunneta (Lebrecht ym. 2005). Doksorubisiinilla on antrasykliineistä vahvin mitokondrionaalinen affiniteetti, ja se kykenee siirtymään solutyypistä riippuen nopeasti mitokondrion matriisiin suoraan interaktioon mtDNA:n kanssa. Kuitenkin kaikilla antrasykliineillä on havaittu merkittävän vahva affiniteetti kardiolipiinille, mikä voi osaltaan selittää doksorubisiinin nopean siirtymisen ja akkumuloitumisen mitokondrion matriisiin kalvoston poikki, vaikka vaikutus ei ulotu muihin antrasykliineihin yhtä vahvasti (Nicolay ym. 1984). Kuitenkin matalia määriä kardiolipiiniä sisältävillä soluilla havaitaan lähes yhtä voimakasta doksorubisiinin sisäänottoa mitokondrion matriisiin kuin normaaleilla soluilla, joten kardiolipiinin vaikutusta antrasykliinien siirtymiselle soluihin ei kuitenkaan täysin tunneta (Ashley & Poulton 2008).

2.4.3 Siprofloksasiini

Siprofloksasiini on 4-fluorokinoloni, jota käytetään yleisesti mikrobi-infektioiden hoidossa.

Sen antibakteerinen aktiivisuus perustuu bakteerisen DNA-gyraasi-entsyymin inhibitioon (Anderson ym. 1998). 4-kinolonien, joihin siprofloksasiini kuuluu, on havaittu aiheuttavan mtDNA:n määrän vähenemistä, mitokondrionaalista hengitysketjun heikkenemistä, glykolyysireaktion kasvua ja viivästynyttä kasvua sille altistetuissa soluissa. Siprofloksasiinin on havaittu tuottavan sijaintispesifisiä kaksoisjuosteen katkoksia mtDNA:ssa, mutta ei tumallisessa DNA:ssa, minkä vuoksi se on mahdollinen mitokondriomyrkky (Lawrence ym.

1993).

Siprofloksasiini, joka inhiboi bakteerista DNA-gyraasi-entsyymiä, inhiboi myös nisäkkäiden topoisomeraasi 2 β:n mitokondrionaalista isoformia, joka korjaa mtDNA:n superkierteisyyttä ja säätelee replikaation aloitusta (Hangas ym. 2018). Topoisomeraasin inhibiittorit vaikuttavat merkittävästi mtDNA-metabolismiin. Koska sekä tyypin 1 että tyypin 2 topoisomeraasien toiminta mitokondrioissa on melko huonosti tunnettu, kattavaa tutkimusta ei ole tehty siitä, miten niiden toiminnan häiriöt vaikuttavat mitokondrion toimintaan ja mtDNA:han. Useat erityyppiset topoisomeraasien inhibiittorit voivat kuitenkin inhiboida sekä tumallisia että mitokondrionaalisia topoisomeraaseja (Lawrence ym. 1993). Siprofloksasiinin tiedetään keskeyttävän topoisomeraasi 2:n toimintaa ihmisen tumallisessa DNA:ssa ja siten synnyttävän kaksoisjuostekatkoksia (Bredberg ym. 1991). Tämän lisäksi siprofloksasiinin tiedetään häiritsevän myös mitokondriaalisen topoisomeraasi 2:n toimintaa ja mtDNA:n

18

replikaatiota C2C12- ja HEK293-soluilla, mikä ilmenee mtDNA:n replikaatiovälituotteiden määrän alenemisena jo 80 µg/ml:n pitoisuudessa (Hangas ym. 2018).

2.4.4 UVB

Ultraviolettisäteilylle (UV) altistettavissa soluissa tiedetään syntyvän välillisenä vaikutuksena sekä ROS-yhdisteitä että reaktiivisia typpiyhdisteitä, jotka aiheuttavat merkittäviä vauriota DNA:ssa (Gniadecki ym. 2000). Ultraviolettisäteily kykenee myös synnyttämään suorana vaikutuksena pyrimidiini- ja tymidiinidimeerirakenteita sekä muita vaurioita DNA:ssa, jotka pysäyttävät DNA:n replikaation (McCulloch ym. 2004). Yleisesti UV-säteily jaetaan kolmeen tyyppiin: UVA-, UVB- ja UVC-säteily, joista UVA- ja UVB-säteilyt vaikuttavat merkittävimmin DNA:ta vaurioittavasti UVC-säteilyn vaurion asteen pysyessä matalampana.

UVB:lla on lyhyempi aallonpituus kuin UVA:lla, eli se on korkeaenergisempää säteilyä, jonka vuoksi se kykenee synnyttämään noin tuhatkertaisesti enemmän affisiota DNA:ssa kuin UVA-säteily (Widel ym. 2014). Tämä on merkittävä tekijä, kun halutaan altistaa soluja DNA-vaurion synnyttämiseksi. Solun tumallisessa DNA:ssa pyrimidiinidimeerien affisiot pystytään korjaamaan NER-mekanismilla (Lehmann 1995). Toisin kuin tumallisella DNA:lla, mtDNA:lla ei ole NER:iä tai vastaavaa metaboliareittiä, joka pystyisi korjaamaan mtDNA:n kaksoisjuostetta vääristäviä pyrimidiinidimeerejä. Vaikka mitokondriolla on kyky nukleotidien affisioiden korjaukseen pelkästään BER-mekanismin kautta, se ei kuitenkaan kykene korjaamaan ultraviolettisäteilyn synnyttämiä dimeerejä, jotka akkumuloituvat haitallisesti mtDNA:han (mm. Clayton ym. 1974, Birch-Machin ym. 2012).

Kliinisissä tutkimuksissa tymidiinidimeerien havaitseminen mtDNA:sta on todettu onnistuvan helposti PCR-menetelmiä hyödyntämällä, minkä vuoksi niiden havaitseminen on verrattain helppoa (Kumar ym. 2004). mtDNA:n vaurio UV-altistuksessa syntyy jo merkittävän pienellä säteilyannoksella, noin 1,34 mj/cm², joka on riittävästi aiheuttamaan vauriota mtDNA:ssa ilman, että tumallisen DNA:n vauriot aiheuttaisivat soluille DNA-stressiä (Torregrosa-Muñumer ym. 2015).

3 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET JA HYPOTEESIT

Tämän tutkimuksen tavoite on kehittää kaksois-PCR-menetelmää mtDNA:n vaurion määrittämiseksi yhdistämällä lyhyen ja pitkän kantaman PCR:t yhteiseksi PCR:ksi ja kokeellisesti muuntelemalla eri muuttujia toimivan yhteensopivuuden takaamiseksi. Lisäksi

19

tarkoituksena on tutkia erilaisilla stressitekijöillä altistettujen HEK293- ja HeLa-solujen mtDNA:ta sopivimmalla qPCR-menetelmällä niiden vaurioasteen määrittämiseksi. Tutkielman työ toteutettiin laboratoriossa altistamalla viljeltyjä HEK-239- ja HeLa-soluja siprofloksasiinille, doksorubisiinille sekä ultraviolettivalolle. Soluille tehtiin DNA-eristys, joista saaduista näytteistä määritettiin mtDNA:n vaurioastetta tosiaikaisella vaurion määritys qPCR:llä. Tässä työssä haluttiin tutkia sitä, onko kaksois-PCR-menetelmä soveltuva mtDNA:n vaurion määritykseen ja havaitaanko siprofloksasiinilla sekä doksorubisiinilla vaikutusta mtDNA:n vaurioina.

Tutkimustyölle laaditut nollahypoteesit ovat: ”Kvantitatiivinen kaksois-PCR ei toimi luotettavana menetelmänä mitokondrionaalisen DNA:n vaurion havaitsemiseen”, sekä ”Siprofloksasiinin, doksorubisiinin ja ultraviolettivalon välillä ei ole tilastollisesti merkitsevää eroa mtDNA:n vaurion synnyssä”.

4 AINEISTO JA MENETELMÄT

4.1 HEK-solujen kasvatus ja fenoli-kloroformi-eristys qPCR-testausta varten

T-antigeenillä kuolemattomaksi transformoidun ihmisen solulinjan (HEK293) soluja kasvatettiin mitokondrionaalisen DNA:n vaurioiden tunnistamistöitä varten kaksois-PCR-menetelmällä testattavaksi. Solut kasvatettiin matalan glukoosin DMEM-liuoksessa (engl.

Dulbecco’s Modified Eagle Medium, Biowest Cat-No. L0103), johon oli lisätty naudan sikiön seerumia (engl. Foetal Bovine Serum) 10 % pitoisuuteen. Täydessä konfluenssissa olevasta 15 cm HEK-solumaljasta otettiin solut talteen imemällä kasvatusliuos pois ja pesemällä solut 5 ml PBS-liuoksella (engl. Phosphate-Buffered Saline; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, ja 2 mM KH2PO4 pH 7,4). Solut siirrettiin sentrifugiputkiin ja sentrifugoitiin 5 min 400 g huoneenlämmössä (RT, engl. room temperature). Uudelleen suspensoidusta solumäärästä jaettiin 17 % kuudelle 3,5 cm kasvatusmaljalevylle. Vuorokauden kuluttua soluille tehtiin fenoli-kloroformi-menetelmällä DNA:n eristys.

Fenoli-kloroformi-eristystä varten solut irrotettiin 1 ml PBS-liuoksella alustasta mikrosentrifugiputkiin ja sentrifugoitiin 5 min 1 000 g RT. PBS poistettiin ja solut hajotettiin 500 µl DNA lyysauspuskurilla (10 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.4 % SDS), jota pipetoitiin edestakaisin kapeakärkisen pipetin läpi, kunnes solurykelmät hajosivat liuokseen tasaisesti. Liuokseen lisättiin 20 µl proteinaasi K:ta (10 mg/ml), ja lysaatti inkuboitiin

20

noin 12 tunnin ajan 37 °C lämpötilassa. Näytteisiin lisättiin 50 µl 5 M NaCl avustamaan proteiini-DNA-kompleksien hajoamista.

Inkuboinnin jälkeen näytteille suoritettiin puhdistus, jossa DNA eristettiin muusta lysaatista ja solujäämistä. Näytteiden puhdistus aloitettiin lisäämällä näytteisiin 500 µl fenoli-kloroformi-isoamyylialkoholi-seosta (25:24:1, pH 6,9). Näytteitä sekoitettiin kääntöpöydällä noin 30 min ajan, jonka jälkeen näytteet sentrifugoitiin 5 min 15 000 g RT faasien erottamiseksi. Ylempi DNA:ta sisältävä faasi pipetoitiin talteen puhtaisiin mikrosentrifugiputkiin, joihin lisättiin 500 µl kloroformia ja sekoitettiin ravistelemalla manuaalisesti 5 min ajan, jotta ylimääräinen fenoli poistuisi näytteistä. Näytteet sentrifugoitiin uudestaan 5 min 15 000 g RT ja ylempi faasi pipetoitiin talteen puhtaisiin mikrosentrifugiputkiin.

DNA saostettiin lisäämällä näytteisiin kaksinkertainen tilavuus kylmää 98 % etanolia sekä 1/10 tilavuus 3 M natriumasetaattia pH 5,3. Näytteet sekoitettiin ja jätettiin inkuboitumaan kahden tunnin ajaksi -20 °C lämpötilaan. Saostunut DNA pelletoitiin sentrifugoimalla näytteet 30 min 16 000 g +4 °C lämpötilassa. Neste poistettiin, näytteisiin lisättiin 1 ml 70 % etanolia ja ne sentrifugoitiin 5 min 16 000 g RT. Neste pipetoitiin pois ja mikrosentrifugiputket jätettiin kannet auki kuivumaan noin 15 min ajaksi RT, jotta jäljelle jäänyt neste haihtuisi pois. Tämän jälkeen mikrosentrifugiputkiin pipetoitiin 100 µl TE-puskuria (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM Na2-EDTA) ja DNA-pelletit suspensoitiin uudelleen liuokseen pipetoimalla niitä edestakaisin varovaisesti, jotta pelletit hajoaisivat paremmin, jonka jälkeen näytteet varastoitiin +4 °C lämpötilaan.

Näytteiden DNA-pitoisuudet mitattiin Nanodrop ND-1000 -spektrofotometrillä. Mikäli havaittiin, että näytteiden DNA-pitoisuudet poikkesivat peräkkäisinä toistoina toisistaan yli 10 %, voitiin päätellä, että näytteet eivät olleet liuenneet tarpeeksi, jolloin niille toistettiin liuotus lisäämällä noin 100 µl TE-puskuria ja sekoittamalla näytteitä lämpöhauteessa muutaman tunnin ajan. Näytteiden sekoittumisen parantamiseksi niitä pipetoitiin varovaisesti muutamia kertoja edestakaisin kapeakärkisen pipetin avulla, jotta yhteen liittynyt DNA liukenisi paremmin liuokseen. Tämän jälkeen näytteiden pitoisuudet mitattiin uudelleen Nanodrop ND-1000 -spektrofotometrillä ja todettiin, että näytteiden mittaukset poikkesivat toisistaan alle 10 %, jolloin niiden katsottiin olevan riittävän homogeenisiä qPCR-kokeita varten.

Spektrofotometrillä saatujen arvojen pohjalta kullekin näytteelle tehtiin 50 ng/µl laimennokset TE-puskuriin 100 µl lopputilavuuteen. Näytteiden pitoisuudet tarkastettiin laimennoksen jälkeen Nanodrop ND-1000 -spektrofotometrillä ja havaittiin, että niiden pitoisuudet olivat yhteneväisiä, mutta keskimäärin noin 10 ng/µl pienemmät kuin oli oletettu.

21

Tämä otettiin huomioon näytteitä myöhemmässä vaiheessa annosteltaessa. Yhdelle laimentamattomalle DNA-näytteelle valmisteltiin lisäksi erillinen restriktioentsyymin pilkkominen 100 µl lopputilavuuteen käyttäen 2 µl KpnI-entsyymiä, 10 µl 10x Fast Digest -puskuria sekä 35 µg/µl DNA:ta. Restriktioentsyymipilkkomisliuos vietiin inkubaattoriin +37 °C lämpötilaan noin 24 tunnin ajaksi.

DNA-näytteille tehtiin qPCR-koe, jolla määritettiin sopivat mtDNA-pitoisuudet tuleville kaksois-PCR-kokeille. Valmisteltiin DNA-laimennossarja valmiista näytteistä 100 ng/µl, 50 ng/µl, 25 ng/µl, 12,5 ng/µl ja 6,25 ng/µl pitoisuuksiin, jonka jälkeen valmisteltiin PCR master mix -seos (taulukko 1). Näytteet valmisteltiin jäähauteella valkoisilla 96-kuoppalevyillä (Sarstedt 96 fast PCR fullskirt), joihin käytettiin kirkkaita tasaisia kansia (Sarstedt 8-strip optical clear flat cap). PCR-kokeet ajettiin Agilent Genomicsin G8830A AriaMx Real-Time PCR -laitteella. PCR-ajojen lämpösykliprotokollan profiilina käytettiin valmiita viitearvoja, jotka säädettiin kokeeseen sopivaksi (taulukko 2).

Taulukko 1. Tosiaikaisessa vaurion määritys -qPCR-reaktioseoksessa käytetyt pitoisuudet yksikköineen. PCR-reaktioseoksessa loput reaktioseoksen tilavuudesta täytetään nukleiinihappovapaalla vedellä, joka on merkattu taulukkoon x:llä.

Taulukko 2. Tosiaikaisen vaurion määritys -qPCR:n lämpöprofiili. Kuuma aloitus (engl. Hot Start) varmistaa, että epäspesifinen alukkeiden sitoutuminen huoneenlämmössä ei häiritsisi varsinaista PCR:ä. Amplifikaatiovaiheessa tapahtuu PCR:n varsinainen DNA:n monistuminen.

Amplifikaatiovaiheen vaiheet ovat: denaturaatio, alukkeiden liittymisvaihe ja synteesi (engl.

Amplification, Denaturation, Annealing, Extension).

qPCR:n reaktioseos Pitoisuus Yksikkö

2x AccuStart II PCR SuperMix 50 %

Lyhyt PCR etualuke 100 nM

22 4.2 Kaksois-PCR:n testaus

Mitokondrionaalisen DNA-vaurion tunnistamismenetelmän parantamista tutkittiin tekemällä useita PCR-kokeita, joissa sovellettiin standardoitua PCR-koeasetelmaa. PCR-ajoihin tehtiin PCR master mix -seos, joka valmistettiin käyttämällä Quanta Bio AccuStart II PCR SuperMix -liuosta (Cat. No. 95137), jossa oli 2x pitoisuudessa kokeeseen tarvittavat puskuriliuos, nukleosiditrifosfaatit ja Taq DNA -polymeraasi valmiina seoksena. Valmista master mix -seosta lisättiin jokaiseen PCR-reaktioliuokseen puolet lopputilavuudesta.

Näytteeseen lisättiin kokeesta riippuva määrä pitkän kantaman Hs5999F etu- ja Hs14841R taka-aluketta (engl. forward and reverse primers) sekä kokeesta riippuva määrä lyhyen kantaman Hs3322F etu- ja Hs3410R taka-aluketta (taulukko 3). Näytteisiin lisättiin myös FAM- ja VIC-leimattua fluoresoivaa koetinta sekä pitkälle että lyhyelle amplikonille. Koettimet liittyvät monistettavaan DNA:han, mutta eivät vielä tässä vaiheessa fluoresoi vaimentimen vuoksi. Vasta PCR:n alukkeiden ohjaavan monistumisen takia tapahtuva juosteen korvaaminen saa DNA-polymeraasin irrottamaan reportterivärin koettimesta, jolloin syntyy fluoresoiva signaali merkkinä monistumisesta. Työssä käytetyt alukkeiden ja koettimien sitoutumispaikat sekä restriktioentsyymien katkaisukohdat mtDNA-molekyylissä on esitetty kuvassa 2 (kuva 2).

Loput tilavuudesta reaktioseoksessa täytettiin nukleiinihappovapaalla sterilisoidulla vedellä (taulukko 4). Näytteet valmisteltiin valkoisilla 96-kuoppalevyillä (Sarstedt 96 fast PCR fullskirt) ja kirkkailla tasaisilla kansilla (Sarstedt 8-strip optical clear flat cap). Templaattina käytettiin noin 200 ng KpnI-pilkottua DNA:ta. Näytteet valmisteltiin jäähdytetyllä telineellä, joka piti näytteiden lämpöaltistuksen minimissä samalla varoen altistamasta valoherkkiä koettimia huoneen valolle.

kokeet ajettiin Agilent Genomicsin G8830A AriaMx Real-Time PCR -laitteella. PCR-ajojen lämpösykliprotokollassa käytettiin valmiita viitearvoja, jotka säädettiin kokeeseen sopiviksi (taulukko 5).

23

Taulukko 3. PCR:ssä käytettyjen alukkeiden ja koettimien sekvenssit. Taulukossa esitetyt VIC- ja FAM-koettimet ilmaisevat kyseisiä reportterivärejä. Koettimien ”MGB” tulee englannin kielen sanoista ”minor groove binder quencher” (matalaan uurteeseen sitoutuva vaimentaja), joka suurentaa alukkeen sitomiskykyä ja samalla vaimentaa koettimen fluoresenssia ennen kuin se leikataan pois.

Kuva 2. Ihmisen mtDNA-molekyylin malliin on merkitty työssä käytetyt pitkän ja lyhyen kantaman amplikonit, FAM- ja VIC-leimatut koettimet pitkälle ja lyhyelle sekvensseille sekä restriktioentsyymien katkaisevat kohdat. BamHI-entsyymi katkaisee DNA-juosteen pitkän kantaman sekvenssin kohdalta ja KnpI-entsyymi katkaisee juosteen monistettujen sekvenssien ulkopuolelta. Kuvassa esitetty pitkä etualuke oli kokeissa ensin käytetty aluke, joka tuottaa PCR:ssä 8 843 emäsparia pitkän amplikonin (Pitkä PCR). Tämä vaihdettiin myöhemmin kokeissa paremmin toimivaksi havaittuun pitkään etualukkeeseen 2, joka tuottaa PCR:ssä lyhyemmän 4 691 emäsparia pitkän amplikonin (Pitkä PCR 2).

Alukkeen/koettimen nimi DNA-sekvenssi

Pitkä PCR-etualuke (Hs5999F) TCT AAG CCT CCT TAT TCG AGC CGA Pitkä PCR-taka-aluke (Hs14841R) TTT CAT CAT GCG GAG ATG TTG GAT GG Pitkä PCR-etualuke 2 (HS10131F) ACC ACA ACT CAA CGG CTA CA

FAM-leimattu fluoresoiva koetin

(hmtDNA probe 13546) FAM- ACA AAC GCC TGA GCC CTA -MGB Lyhyt PCR-etualuke (HS 3322F) CTC CTA CTC CTC ATT GTA

Lyhyt PCR-taka-aluke (HS 3410R) TTG CGT AGT TGT ATA TAG C VIC-leimattu fluoresoiva koetin

(MTDNA PROBE 3346 (ND1)) VIC - CTAATCGCAATGGC- MGB

24

Taulukko 4. Kaksois-PCR-reaktioseoksen lopulliset pitoisuudet yksikköineen. Kokeissa käytetyt minimi- ja maksimipitoisuudet alukkeille ja DNA:lle, joita muunneltiin eri työvaiheissa tarpeen mukaan, on merkattu *-symbolilla taulukkoon. PCR-reaktioseoksessa loput reaktioseoksen tilavuudesta täytetään steriilillä nukleiinihappovapaalla vedellä, jota merkitään taulukossa x:llä.

Taulukko 5. Kaksois-PCR:n lämpöprofiili kuumalla aloituksella ja 40 syklin amplifikaatiolla.

Taulukossa on ilmaistu PCR-ajon lämpötilat ja niissä käytettävät ajat (min) kullekin vaiheelle.

4.3 DNA:n BamHI-restriktioentsyymillä pilkkominen standardisuoran luomiseksi

PCR-menetelmän toimivuutta mtDNA-vaurion tunnistamiseen testattiin mittaamalla DNA:n monistumisen aste eriasteisesti restriktioentsyymillä pilkotussa reaktioseoksessa. Kokeen DNA-laimennokset tehtiin käyttäen osaa ehyttä ja osaa entsyymillä pilkottua mtDNA:ta, jota oli pilkottu monistettavalta sekvenssialueelta restriktioentsyymin avulla. Työ suoritettiin valmistelemalla DNA-näytteille BamHI-restriktioentsyymipilkkominen, joka katkaisee mtDNA:n juosteen 14 259. emäsparin kohdalta. Restriktioentsyymillä pilkkominen tehtiin kappaleessa 4.1 esitetyn menetelmän mukaisesti 100 ng/µl pitoisuudella noin tunnin ajan inkuboiden +37 °C. Lisäksi valmistettiin ei-pilkottu näyte samasta DNA-näytteestä, jota laimennettiin sterilisoidulla vedellä noin 100 ng/µl pitoisuuteen. Pilkotuista ja ei-pilkotuista näytteistä valmistettiin kolme rinnakkaista laimennossarjaa, jossa ei-pilkottu DNA oli 1:0 - 10:1 - 5:1 - 1:1 - 1:5 - 0:1 -suhteessa BamHI-pilkottuun DNA:han. Näytteet käytettiin PCR-ajossa kappaleen 4.2 mukaisella kaksois-PCR-menetelmällä.

Kaksois-PCR:n reaktioseos Pitoisuus Yksikkö 2x AccuStart II PCR SuperMix 1x x

Pitkä PCR-etualuke 50-300* nM

25

4.4 HEK293-solujen DNA:n vaurioittaminen ultraviolettivalolla, doksorubisiinilla ja siprofloksasiinilla

Kasvatettuja HEK293-soluja jaettiin kahteentoista 3 ml kasvatusmaljaan DMEM-kasvatusliuokseen kappaleen 4.1 kuvauksen mukaisesti. Maljoista kolme kappaletta käsiteltiin 80 µg/ml siprofloksasiinilla. Siprofloksasiininäytteiden altistus kesti noin 24 t ajan.

Kolmeen maljoista lisättiin 3,4 µM doksorubisiinia. Doksorubisiininäytteiden altistus kesti noin 2,5 t ajan. Lisäksi kolme maljaa altistettiin 1,34 mJ/cm² 302 nm UVB-valolle 30 s ajan. Kolme maljaa jätettiin käsittelemättömiksi kontrollinäytteiksi. Kaikilta kasvatusmaljoilta kerättiin solut talteen DNA:n fenoli-kloroformiuuttoa varten. DNA:n uutto suoritettiin kappaleen 4.1 mukaisesti tehden näytteille etanolisaostus. DNA-näytteet jätettiin inkuboitumaan proteinaasi K:n lisäyksen jälkeen lämpöhauteeseen noin 20 tunnin ajaksi. Eristetyt DNA-näytteet resuspensoitiin suoraan KpnI-restriktioentsyymipilkkomiseen käyttämällä 40 µl FastDigest-puskuria, 6 µl entsyymiä ja 354 µl H2O 400 µl:n tilavuuteen. Näytteitä inkuboitiin lämpökaapissa +37 °C lämpötilassa noin 12 tunnin ajan. Entsyymipilkkomisen jälkeen näytteiden DNA-pitoisuus mitattiin Nanodrop ND-1000 -spektrofotometrillä. Mittausten pohjalta näytteet laimennettiin 100 ng/µl pitoisuuteen, jonka jälkeen ne ajettiin PCR:llä erillisinä rinnakkaisina lyhyen ja pitkän kantaman reaktioina. Pitkän kantaman PCR-reaktioseos ja lyhyen kantaman PCR-PCR-reaktioseos valmistettiin toisistaan eri resepteillä (taulukko 6).

26

Taulukko 6. Pitkän ja lyhyen kantaman PCR-reaktioseokset erillisille reaktioille. Taulukossa on esitetty kokeessa käytetyt pitoisuudet yksikköineen. PCR-reaktioseoksen tilavuudesta loput täytettiin nukleiinihappovapaalla vedellä, jota merkitään taulukossa x:llä.

4.5 HeLa-solujen DNA:n vaurioittaminen siprofloksasiinilla ja doksorubisiinilla

DMEM-liuoksessa kasvatettuja HeLa-soluja siirrostettiin kahdelle 3,5 cm 6-kuoppalevylle noin puoleen konfluenssiin, joista toinen käsiteltiin 80 µg/ml siprofloksasiinilla. Noin 23 tunnin jälkeen solut kerättiin talteen ja DNA:ta eristettiin kappaleen 4.1 mukaisesti. DNA-näytteitä inkuboitiin 17 tunnin ajan +37 °C KpnI-entsyymipilkonnassa lämpöhauteessa. Tämän jälkeen näytteistä mitattiin DNA-pitoisuudet Nanodrop ND-1000 -spektrofotometrillä, jonka pohjalta näytteet laimennettiin 100 ng/µl pitoisuuksiin ja niille tehtiin erilliset pitkän ja lyhyen kantaman PCR:t edellisessä kappaleessa kuvatulla tavalla.

DMEM-liuoksessa kasvatettuja HeLa-soluja siirrostettiin kahdelle 3,5 cm 6-kuoppalevylle, joista toinen käsiteltiin 3,4 µM doksorubisiinilla noin 2,5 tunnin ajaksi ja toinen jätettiin kontrolliksi. Soluista eristettiin DNA:ta kappaleen 4.1 mukaan, josta poikkeavasti DNA-näytteet inkuboitiin 20 minuuttia -80 °C lämpötilassa etanolisaostusvaiheessa pidemmän -20 °C inkuboinnin sijasta. Näytteet jätettiin 18 tunnin ajaksi KpnI-restriktioentsyymipilkontaan inkuboitumaan +37 °C, jonka jälkeen niistä mitattiin DNA-pitoisuudet. Mittausten pohjalta näytteet laimennettiin 100 ng/µl pitoisuuksiin, ja niille tehtiin erilliset pitkän ja lyhyen kantaman PCR:t.

PCR-reaktioseos pitkän kantaman alukkeelle Pitoisuus Yksikkö

2x AccuStart II PCR SuperMix 50 %

Pitkä PCR-etualuke 100 nM

2x AccuStart II PCR SuperMix 50 %

Lyhyt PCR-etualuke 100 nM

27

PCR-kokeesta saatu data analysoitiin LORD-Q-data-analyysillä, joka perustuu tosiaikaisen PCR:n pitkien ja lyhyiden fragmenttien Ct-arvojen mittauksiin sekä niiden vertailuun.

Käsitellyiltä soluilta eristettyä DNA:ta verrattiin rinnakkain käsittelemättömiin kontrollinäytteisiin. Juostekatkoksien määrä laskettiin jokaisen DNA:n 10 kb emäsparille tilastollisella määrityskaavalla (kuva 3). Kaavan EL- ja ES-määreet ovat amplifikaation hyötysuhteet pitkälle ja lyhyelle koettimelle. Jokainen näyte analysoitiin kolmena rinnakkaisena toistona, ja niiden keskiarvoista laskettiin käytettävät Ct-arvot sekä pitkän että lyhyen kantaman amplifikaatioille. a on emäsparien määrä pitkässä fragmentissa, ja n on kontrollinäytteiden määrä. EL ja ES määritettiin useiden DNA-laimennoksien lineaarisen regression analyysillä.

Kuva 3. LORD-Q-data-analyysin matemaattinen kaava mtDNA:n juosteen katkoksien määrittämiseksi. Esitetyssä kaavassa EL- ja ES merkitsevät amplifikaation hyötysuhdetta pitkälle ja lyhyelle koettimelle. Ct-arvot (Cp) määritettiin AriaMx-ohjelmistolla PCR-ajoista mitatuilta pitkiltä ja lyhyiltä fragmenteilta, joita verrattiin käsittelemättömiä DNA-standardeja vasten; a on emäsparien määrä pitkässä PCR-fragmentissa ja n on kontrollinäytteiden määrä referenssinäytteissä. EL ja ES määritettiin DNA-näytteiden laimennossarjalla sekä lineaariregression analyysillä.

28 5 TULOKSET

5.1 Kaksois-PCR-menetelmän kehityksen vaiheet

5.1.1 Alustava toimiva kaksois-PCR-asetelma

Kaksois-PCR:ssä testattiin kolme eri DNA-pitoisuutta (50, 100 ja 200 ng/µl pitoisuudet) KpnI-restriktioentsyymillä pilkottua DNA:ta, jossa käytettiin lyhyen kantaman aluketta 100 nM, pitkän kantaman aluketta 500 nM sekä kumpaakin fluoresoivaa koetinta 125 nM. Koe ajettiin muunnellulla PCR-lämpöprofiililla (taulukko 6). PCR:n havaittiin toimivan ihanteellisimmin 200 ng/µl pitoisuudella molemmille alukeparille, jotka on eroteltu kuvaajassa väreillä (kuva 4).

Taulukko 6. Kaksois-PCR:n lämpöprofiili kuumalla aloituksella ja 40 syklin amplifikaatiolla.

Taulukossa on ilmaistu PCR-ajon lämpötilat ja niissä käytettävät ajat kullekin vaiheelle.

Kuuma aloitus

Denaturaatio Alukkeiden liittymisvaihe Synteesi

Lämpötila (°C) 94 94 60 72

Aika (min) 05:00 00:30 00:30 07:00

Amplifikaatio, 40 sykliä

29

Kuva 4. Kaksois-PCR:n amplifikaatiokäyrät 50, 100 ja 200 ng/µl pitoisuuksissa KpnI-restriktioentsyymillä pilkottua DNA:ta. Kuvaajassa esitetyt amplifikaatiokäyrät, jotka saatiin 200 ng/µl pitoisuudella, on merkattu väreillä; vihreät käyrät merkitsevät lyhyen kantaman

Kuva 4. Kaksois-PCR:n amplifikaatiokäyrät 50, 100 ja 200 ng/µl pitoisuuksissa KpnI-restriktioentsyymillä pilkottua DNA:ta. Kuvaajassa esitetyt amplifikaatiokäyrät, jotka saatiin 200 ng/µl pitoisuudella, on merkattu väreillä; vihreät käyrät merkitsevät lyhyen kantaman

In document Mitokondrio-DNA:n vaurioiden määrittäminen PCR-menetelmällä (sivua 16-0)