2.2.1. ELISA
ELISA-menetelmää käytetään näytteessä esiintyvän antigeenin tai vasta-aineen määrän mittaamiseen (Paulie ym. 2006). ELISAn yleisimmin käytetty muoto on nk. ”sandwich” (kuva 6; ks. myös Abbas ym 2010, s. 526). Sandwichiä käytetään yleisimmin jonkin antigeenin määrittämiseen. Tällöin kuoppalevyn kuoppaan kiinnitetään tutkittavalle antigeenille spesifistä monoklonaalista vasta-ainetta vakioitu määrä niin, että antigeeniensidontadomeeneja jää vapaaksi. Sitten tutkittavaa näytettä pipetoidaan kuoppaan. (Vaihtoehtoisesti kyse voi olla pohjaan kiinnitettävän vasta-aineen detektoinnista, jolloin antigeenin määrä on tunnettu.) Näytteen sisältämät antigeenimolekyylit tarttuvat vasta-ainemolekyylien antigeeninsidontadomeeneihin.
Seuraavaksi kuoppaan lisätään toista kyseiselle antigeenille spesifistä mutta toiseen epitooppiin liittyvää monoklonaalista vasta-ainetta, joka myös sitoutuu antigeenimolekyyliin. Joko näiden tai erillisten sekundaarivasta-aineiden Fc-domeeneihin on liitetty tai liittyy entsyymi.
Entsyymi katalysoi reaktion, jossa näytteeseen lisättävä substraatti muuttuu aineeksi, jolla on alkuperäisestä poikkeava absorptiospektri. ELISAsta on olemassa myös mm. fluoresenssiin ja radioaktiivisiin leimoihin perustuvia muunnelmia.
Yleisimmin ELISAssa käytetyt entsyymit ovat emäksinen fosfataasi (alkaline phosphatase), piparjuuriperoksidaasi (horseradish peroxidase) ja β-galaktosidaasi. Ennen entsyymien substraatin lisäystä sitoutumaton entsyymi huuhdotaan pois. Sitten entsyymien aikaansaamasta värjäytymästä voidaan standardien perusteella määrittää spektrofotometrin avulla entsyymien, sitä kautta vasta-ainemolekyylien ja sitä kautta antigeenimolekyylien konsentraatio näytteessä.
Kuva 6. ”Sandwich”-ELISA
1. Pohjustusvasta-ainetta on kiinnitetty kuopan pohjalle. 2. Kuoppaan lisätään tutkittavaa näytettä, jonka antigeenistä osa tarttuu vasta-aineisiin. 3. Ylimääräinen antigeeni on huuhdottu pois. 4. Kuoppaan on lisätty vasta-ainetta, johon on liitetty tai liittyy entsyymejä. Ylimääräisen entsyymilinkatun vasta-aineen poishuuhtelu on tässä ohitettu. Yleistä myös on, ettei entsyymejä liitetä suoraan näihin vasta-aineisiin, vaan käytetään vielä sekundaarivasta-ainekerrosta. 5.
Entsyymit tuottavat liuokseen väriainetta substraattien lisäyksen jälkeen.
1 2 3 4 5
Sandwichin lisäksi ELISAsta on muita variantteja, joista kuvassa 7 on esitelty epäsuoraa ELISA-menetelmää (Thermo Fisher Scientific 2013). Suora menetelmä on muuten samanlainen, mutta entsyymi on linkattuna ensimmäiseen vasta-ainekerrokseen. Epäsuora menetelmä, jossa käytetään sekundaarivasta-ainetta, on näistä kahdesta yleisempi (kohdassa 2.1.6 käsitellyistä syistä). Menetelmää voidaan käyttää näytteen sisältämän antigeenin osoitukseen, jolloin näytettä kiinnitetään epäspesifisesti pohjaan. Vaihtoehtoisesti voidaan määrittää liuoksessa olevaa vasta-ainetta, jolloin tutkittava vasta-aine on ensimmäinen vasta-ainekerros. Näin tehtiin tässä tutkimuksessa.
2.2.2. Western blot
Western blotissa näytteen proteiinit erotellaan ensin polyakryyliamidigeelielektroforeesilla eli PAGE:lla (Boyer 2000). Proteiinit voivat olla natiivikonformaatiossa, jolloin muutkin tekijät kuin molekyylipaino vaikuttavat proteiinien geelille sijoittumiseen, tai ne voidaan denaturoida ja varata negatiivisesti SDS:n (Sodium Dodecyl Sulfate) avulla (SDS-PAGE).
Natiivikonformaatiossa olevat proteiinit voidaan erotella geelille isoelektrisen fokusoinnin avulla. Isoelektrisessa fokusoinnissa geelille aikaansaadaan pH-gradientti. Geeliin kohdistettu sähkökenttä saa proteiinit liikkumaan, kunnes ne osuvat pH-alueelle, jolla niiden kokonaisvaraus on neutraali; tätä kohtaa geelillä kutsutaan isoelektriseksi pisteeksi.
SDS on negatiivisesti varautunut yhdiste, joka päällystää proteiinit ei-kovalenttisesti. Kun myös huolehditaan proteiineissa mahdollisesti esiintyvien, tertiäärirakennetta ylläpitävien disulfidisidosten poistamisesta pelkistämällä ne esim. merkaptoetanolin avulla, SDS saa
1 2 3 4 5
Kuva 7. Epäsuora ELISA
1. Antigeeniä on kiinnitetty kuopan pohjalle. 2. Kuoppaan lisätään vasta-ainetta, josta osa tarttuu antigeeniin. 3. Ylimääräinen vasta-aine on huuhdottu pois. 4. Kuoppaan on lisätty aineet, joihin on liitetty tai liittyy entsyymejä. Ylimääräisen sekundaarivasta-aineen poishuuhtelu on tässä ohitettu. 5. Entsyymit tuottavat liuokseen väriainetta substraattien lisäyksen jälkeen. Piirros tehty Wikimedia Commonsin kuvan pohjalta, jonka on tehnyt nimimerkki Cawang.
proteiinit oikenemaan polypeptidiketjuiksi, niin että sekundaari-, tertiääri ja kvartäärirakenteet häviävät. SDS myös tekee proteiinien väliset luontaiset varauserot merkityksettömiksi.
Proteiinien liike sähkökentässä perustuu SDS:n varaukseen, ja pidemmät polypeptidiketjut liikkuvat geelissä hitaammin. Tällöin proteiinit asettuvat geelille molekyylipainonsa mukaiseen järjestykseen. Molekyylipainoja voidaan arvioida ajamalla samoissa olosuhteissa molekyylejä joiden molekyylipainot tunnetaan, ja tarkastelemalla näiden kulkemia matkoja (”ladder”).
Koeasetelmassa on otettava huomioon, että ei-kovalentisti tai disulfidisidoksin (mikäli nämä poistetaan) toisiinsa kiinnittyvät alayksiköt irtoavat toisistaan, ja päätyvät geelille eri kohtiin, mikäli niillä on eri molekyylipainot.
SDS:ää hyödynnettäessä valmistetaan usein erikseen ylä- ja alageeli. Geeliliuskat ovat toimivassa kokoonpanossa pystyssä ja ylägeeli alageelin yläpuolella. Ylägeelin (stacking gel) polyakryyliamidi on harvempaa, ja siinä on matalampi pH ja erilainen ionikoostumus kuin alageelissä (resolving gelissä). Ylägeeliin valetaan kaivot, joihin proteiinit pipetoidaan.
Kaivojen välinen geeli estää näytteiden sekoittumista toisiinsa. Elektroforeesin käynnistyttyä proteiinit kuitenkin siirtyvät ylägeelissä nopeasti ylä- ja alageelin väliselle rajapinnalle, jonne proteiinit keskittyvät vaakasuuntaisiksi muodostelmiksi samalle lähtöviivalle. Erottelu tapahtuu alageelissä, jonka tiheämpi polyakryyliamidi vastustaa molekyylien kulkua enemmän. Ns.
gradienttigeeliä käytettäessä erillistä ylägeeliä ei tarvita.
Elektroforeesin jälkeen proteiinit siirretään geelistä kalvolle, jossa proteiinit säilyvät kuivumisen jälkeen hyvin, ja josta niitä voidaan paikallistaa vasta-aineiden avulla. Kalvomateriaalina käytetään joko nitroselluloosaa, PVDF:ää (polyvinyylidifluoridia) tai nylonia, joista kullakin on hyvät ja huonot puolensa, ja joista nitroselluloosaa käytetään yleisimmin. Tässä tutkimuksessa käytettiin PVDF:ää. Käytetyt kalvot sitovat proteiineja epäspesifisesti vesipakoisuuteen perustuen (Boyer 2000, s. 322). Proteiinit siirretään geelistä kalvolle kapillaari-ilmiön tai yleisimmin sähkökentän avulla. Kapillaari-ilmiötä voidaan käyttää, jos ei käytetä SDS:ää; jos SDS on käytössä, käytetään sähkökenttää, jolloin vaihe sujuu nopeammin.
Molekyylipaino ja isoelektrinen piste ovat proteiinien ominaisuuksia, joita voidaan hyödyntää niiden tunnistamisessa. Reaktiivisuus tietyn vasta-aineen kanssa on kolmas ominaisuus.
Yhdistämällä molekyylipaino tai isoelektrinen piste immunologiseen tunnistukseen saadaan pienennettyä virheellisen positiivisen tuloksen todennäköisyyttä. Western blot siis itsessään sisältää jonkinasteisen kontrollin vasta-aineen spesifisyydelle.
Jotta kalvosta voitaisiin luodata vasta-aineella tiettyä proteiinia, kalvon polymeerejä täytyy estää sitomasta lisää proteiineja, joita vasta-aineetkin ovat. Tämä onnistuu käsittelemällä kalvo proteiininsiirron jälkeen jollain valmisteella, joka sitoutuu polymeereihin vieden näin epäspesifiset sitoutumispaikat vasta-aineilta. Tähän käytetään naudan veren albumiinia (bovine
serum albumin, BSA) tai rasvatonta maitojauhetta, joka sisältää paljon erilaisia proteiineja.
Tämän käsittelyn jälkeen kalvoa inkuboidaan primaarivasta-aineen kanssa. Pesun (joka poistaa sitoutumattomat vasta-ainemolekyylit) jälkeen kalvoa inkuboidaan sekundaarivasta-aineen kanssa.
Western blotissa on perinteisesti visualisoitu proteiinin sijainti kalvolla hyödyntämällä värillisiä saostumia tuottavia reaktioita. Tällaisia saadaan aikaan esim. piparjuuriperoksidaasi-entsyymin avulla sopivia substraatteja käyttäen. Myös autoradiografisia menetelmiä, joissa vasta-aine leimataan radioaktiivisella isotoopilla, on käytetty. Muiden menetelmien kehityttyä autoradiografiasta on melko pitkälti luovuttu, sillä sen käyttämistä monimutkaistavat säteilyturvallisuusnäkökohdat.
Uudempi ja väriä tuottavia menetelmiä paljon, jopa tuhat kertaa, herkempi tapa signaalin tuottamiseen on peroksidaasin katalysoima kemiluminenssi (Boyer 2000, s. 324).
Kemiluminesenssia hyödynnettiin tämänkin tutkimuksen Western blotissa. Tässä tutkimuksessa käytetty kemiluminesenssin muoto on seuraavanlainen (Miura ym. 1998). Immuunikomplekseihin kiinnittynyt piparjuuriperoksidaasi katalysoi reaktion, jossa vetyperoksidi hapettaa luminolin.
Luminolista hapettunut yhdiste muokkautuu edelleen reaktiossa jodofenolin kanssa, minkä jälkeen siitä irtoaa 3-aminoftalaatti-ioni ja valoa, jota emittoituu voimakkaimmin 5 – 20 min siitä, kun reagenssit on saatettu yhteen.
Vaihtoehtoisesti sekundaarivasta-aineeseen voidaan liittää fluorokromeja ja saada signaali niiden fluoresenssista. Menetelmän herkkyys on perinteisesti ollut pienempi kuin kemiluminesenssin, mutta signaalin vahvuus on lineaarisemmassa suhteessa proteiinin määrään. Valmistaja Licor kertoo verkkosivuillaan uuden near infrared fluorescence –kuvantamismenetelmän pärjäävän kemiluminesenssille herkkyytensäkin puolesta. Fluorokromien käytön ongelmana on tiettyjen biomolekyylien autofluoresenssi, joka antaa taustaa.
Natiivi-Westernin avulla on mahdollista arvioida vasta-aineen spesifisyyttä sovellutuksissa, joissa proteiinin natiivimuoto säilyy. Vasta-aineen oikea toiminta voidaan kontrolloida sen tunnistaman proteiinin isoelektrisen pisteen perusteella. Koska SDS-western denaturoi näytteen proteiinit, sen antamat tulokset vasta-aineen spesifisyydestä eivät ole yleistettävissä muihin olosuhteisiin.
On hyvä varmistaa, aiheuttaako Western blotissa käytetty sekundaarivasta-aine epäspesifistä signaalia. Tämä saadaan selville tekemällä koe ilman primaarivasta-ainetta. Jos tällöin ilmenee vyöhykkeitä, niiden takana on sekundaarivasta-aineen sitoutuminen näytteessä oleviin proteiineihin. Voimakas tausta kertoo luultavasti sekundaarivasta-aineen sitoutumisesta kalvon
polymeereihin, jolloin sen blokkaus BSA:lla tai maitoproteiinilla ei ole onnistunut täydellisesti.