AIVOKUDOKSEN IMMUNOHISTOKEMIALLISEEN VÄRJÄYKSEEN KÄYTETTYJEN VASTA-AINEIDEN SPESIFISYYDEN TESTAAMINEN
Henri Rönkkö Pro gradu –tutkielma Biotieteiden koulutusohjelma, biokemia Luonnontieteiden ja metsätieteiden tiedekunta / biotieteet Itä-Suomen yliopisto Toukokuu 2013
ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, Luonnontieteiden ja metsätieteiden tiedekunta Biotieteiden koulutusohjelma, biokemian pääaine
RÖNKKÖ, HENRI J. T. : Aivokudoksen immunohistokemialliseen värjäykseen käytettyjen vasta-aineiden spesifisyyden testaaminen
Pro gradu -tutkielma, 68 sivua
Ohjaajat: tutkimusjohtaja, dosentti, FT Riitta Miettinen, UEF, tutkimusjohtaja, FT Antero Salminen, UEF, yliopistotutkija, FT Ale Närvänen, UEF, nuorempi tutkija, FM Tapio Nuutinen, UEF ja yliopistolehtori, dosentti, FT Annikka Linnala-Kankkunen, UEF.
Marraskuu 2012
______________________________________________________________________
Avainsanat: immunohistokemiallinen värjäys, vasta-aineiden spesifisyys, hippokampus, kalretiniini
Työssä pyrittiin testaamaan viiden kaupallisesti tuotetun, rutiininomaisesti aivokudoksen immunohistokemialliseen tutkimukseen käytetyn vasta-ainevalmisteen spesifisyyttä. Näin tehtiin, koska julkaisija oli edellyttänyt laboratoriolta itsenäistä vasta-aineiden testaamista.
Kaikilla valmisteilla tehtiin SDS-PAGE-pohjainen Western Blot kohdekudoksen, rotan hippokampuksen, proteomille. Yksi vasta-ainevalmisteista, anti-kalretiniini, affiniteettipuhdistettiin käyttäen rekombinantti-kalretiniinia sitomaan spesifiset vasta- ainemolekyylit. Alkuperäisellä valmisteella ja puhdistuksesta saaduilla fraktioilla tehtiin immunohistokemiallinen värjäys rotan aivoleikkeelle. Värjäystuloksia verrattiin toisiinsa ja Allen Brain Atlaksesta löytyneeseen hiiren in situ –hybridisaatiokuvaan sekä yleisellä tasolla että erityisesti hippokampusta tarkastellen. Western blot -analyysissä saatiin melko paljon epäspesifistä signaalia. Osalla vasta-ainevalmisteista spesifinen signaali oli epäspesifistä voimakkaampaa, osalla ei. Epäspesifisyys saattoi johtua SDS-PAGElle ominaisesta proteiinien denaturoitumisesta. Immunohistokemiallisten värjäysten perusteella alkuperäinen anti-kalretiniini ei tullut affiniteettipuhdistamalla merkittävästi spesifisemmäksi.
Immunohistokemialliset tulokset olivat samansuuntaiset hiiren in situ -hybridisaatiokuvien kanssa, joskaan eivät täysin samanlaiset, mitä voivat selittää yksilönsisäiset ja lajienväliset erot proteiinin ja vastaavan lähetti-RNA:n sijainnissa. Tutkimusta parantaisi, jos saataisiin in situ -hybridisaatiokuva rotan aivoista ja/tai onnistuttaisiin erottelemaan proteiinit Western Blotissa vähemmän denaturoivasti, esimerkiksi isoelektrisellä fokusoinnilla.
Näiden onnistuessa affiniteettipuhdistus ei luultavasti antaisi tutkimukselle paljon lisäarvoa.
Monoklonaalisten valmisteiden tapauksessa spesifisyyden tarkastukseksi riittänee yleensä värjäys rinnakkaisvalmisteella.
UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND, Faculty of Science and Forestry Study Programme of Biosciences, Major of Biochemistry
RÖNKKÖ, HENRI J. T. : Assessing the Specificity of Antibodies Used for Immunohistochemical Staining of Brain Tissue
Master’s Thesis, 68 pages
Supervisors: Group Leader, Docent Riitta Miettinen, PhD, UEF, Group Leader Antero Salminen, PhD, UEF, Research Scientist Ale Närvänen, PhD, UEF, Younger Scientist Tapio Nuutinen, MSc, UEF and Lecturer, Docent Annikka Linnala-Kankkunen, PhD, UEF.
November 2012
______________________________________________________________________
Keywords: immunohistochemical staining, specificity of antibodies, hippocampus, calretinin The goal of the work was to test the specificity of five commercially produced antibodies routinely used for immonohistochemical staining of brain tissue. The goal was set because a publisher had demanded independent testing of antibody specificity from the research group. An SDS-PAGE based Western Blot was performed with each of the antibodies on the proteome of the rat hippocampus. One of the products, anti-calretinine, was affinity purified, using recombinant calretinin to bind the specific antibody molecules. A series of rat brain slices were immunohistochemically stained using both the original product and the fractions obtained from the purification. The immunohistochemical results were compared with each other as well as to a mouse situ hybridization image obtained from Allen Brain Atlas, both on the general level and specifically with respect to the hippocampus. In the Western Blot analysis, a high level of unspecific signal was obtained. With some of the antibody products the specific signal was stronger the unspecific one, with others it was not. The unspecificity may have been caused by the denaturation of proteins characteristic of SDS-PAGE. Based on the immunohistochemical stains, the process of affinity purification did not significantly increase the specificity of the anti-calretinine. The immunohistochemical staining results were similar to the in situ hybridization patterns of the mouse brain, though not identical, which may be explained by intra-individual and interspecies differences in the localization of protein and the respective messenger RNA. The study would be improved by the acquisition of an in situ hybridization image of a rat brain and/or a variation of Western Blotting that utilized a less denaturing way of protein separation, such as isoelectric focusing. Should one succeed in these, affinity purification would not add much to the picture. In the case of monoclonal products, staining with another monoclonal produced against the same antigen is probably, in the majority of cases, a sufficient means of testing specificity.
ESIPUHE
Yksi keskeinen syy siihen, että Riitta Miettisen laboratorio oli minulle yksi vaihtoehto hakiessani gradupaikkaani, oli kiinnostukseni aivoja kohtaan. En ollut vakuuttunut siitä, että jatkaisin tutkijanuraani gradunteon jälkeen (kuten en ole edelleenkään). Tutkijanuran jatkuessakin menetelmät ja aihepiirit voivat vaihtua väitöskirjaprojektin alkaessa. Yritin kuitenkin rajoittuneesta näkökulmastani jonkin verran spekuloida, mikä saattaisi olla minulle
”hyödyllistä”.
Immunohistokemiaa käytetään neurotieteissä paljon hermoston organisaation selvittämiseen, ja Miettisen laboratoriossa oli selvitelty erilaisten interneuronien paikkaa hippokampuksen, tuon deklaratiivista muistia palvelevan aivorakenteen, verkostoissa. Hermoston organisaatio on kiinnostanut minua pitkään, koska sen tunteminen lienee yksi hermoston toiminnan ymmärtämiseen vaadittavista tekijöistä. Toisaalta uskon myös, että toiminnan ymmärtäminen pelkästään organisaation pohjalta ei hermostomme tapauksessa ole yksinkertainen tehtävä.
Laboratoriotutkimukset tehtiin kolmessa vaiheessa kolmessa eri laboratoriossa. Tämän paketin organisointi ja koordinointi vei oman osansa graduprojektiin käytetystä energiasta.
Laboratoriossa päivät olivat joskus pitkiä, ja muita tekemisiään joutui välillä rajoittamaan. Sama päti toki toisinkin päin: lääketieteen opintojen aloitus ja erinäiset muut toimet ovat hajauttaneet graduprojektia ajallisesti.
Karvaat pettymykset epäonnistuneiden suoritusten jälkeen ovat asia, jonka itse kukin tieteentekijä uransa varrella joutunee kohtaamaan. Mutta silloin kun kokeen saattoi jälkeenpäin todeta tulleen onnistuneesti tehdyksi oltuaan ensin neuroottisen epävarma siitä, tuliko kaikki
”tehtyä oikein”, tuntui elämä hetken valoisammalta.
Miettisen ohjauksella aloin luonnostella tutkielmani runkoa jo ennen laboratorioon astumista, ja käytännön töiden loputtua tunsin kulkeneeni pitkänkin tien. Sain kuitenkin nähdä, että tekemistä riitti vielä runsaasti. Pyrkiessäni kirjoittamaan tutkielmaa loppuun loppu ei välillä tuntunut lähestyvän lainkaan, koska yritykset vastata kysymyksiin tuntuivat synnyttävän uusia kysymyksiä ja jokainen tehty ratkaisu poikivan uusia ratkaisunpaikkoja. Tuntui, kuin olisin zoomannut fraktaaliin, joka aina vain muutti muotoaan sen sijaan, että olisi päästänyt minut lähemmäksi itseään. Mutta lopulta eräänä päivänä huomasin, että tekemäni lopulliset viimeistelyt olivatkin sillä kertaa olleet oikeasti lopullisia.
Kuten mainittu, tämän tutkimuksen teossa hyödynnettiin kolmen eri laboratorion tietotaitoa ja varustusta. Pääohjaaja, dosentti Riitta Miettinen antoi tutkimusaiheen ja johdatti minut immunohistokemian maailmaan. Hänen laboratoriossaan tein immunohistokemialliset
värjäykset. Tutkimusjohtaja, filosofian tohtori Antero Salmiselta puolestaan saatiin tarvittavat asiat Western Blotien tekoon. Suuren osan käytännön opastuksesta hänen laboratoriossaan antoi nuorempi tutkija, filosofian maisteri Tapio Nuutinen. Western blot lienee ollut mittavin kaikista tämän työn laboratorio-osuuksista. Affiniteettipuhdistuksen tein filosofian tohtori, yliopistotutkija Ale Närväsen laboratoriossa, jossa töiden suoritusta ohjasi filosofian maisteri, projektitutkija Sari Pitkänen. Lehtori Annikka Linnala-Kankkunen puolestaan toimi yhdyssiteenä biokemian laitokseen. Kiitän kaikkia tämän gradun valmistumiseen myötävaikuttaneita.
LYHENNELUETTELO ABA =
ABC = AEC = BSA =
CA 1, 2 tai 3 = DAB = ELISA = Fc-domeeni = FITC = FDC = GABA = HAT-liuos = Ig =
ISH = PAP = PBS = PVDF = SDS = SDS-PAGE = TBS =
Tris =
Allen Brain Atlas Avidin-Biotin Complex 3-amino-9-EthylCarbazole Bovine Serum Albumin
Cornu Ammonis, hippokampuksen osa
3,3’-DiAminoBenzidineTAI 3,3’-DiAminoBenzidine tetrahydrochloride
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
Fragment, Crystallisable –domeeni (vasta-ainemolekyylin “häntä”) Fluorescein IsoThioCyanate
Follicular Dendritic Cell
Gamma-AminoButyric Acid (gamma-aminovoihappo) Hypoxanthine-Aminopterin-Thymidine -kasvatusliuos ImmunoGlobulin
In Situ Hybridization Peroxidase Anti-Peroxidase Phosphate-Buffered Saline PolyVinylidene DiFluoride Sodium Dodecyl Sulphate
SDS PolyAcrylamide Gel Electrophoresis Tris Buffered Saline
Trishydroxymethylaminomethane
SISÄLLYSLUETTELO
1. JOHDANTO 8
2. KIRJALLISUUSKATSAUS 10
2.1. Vasta-aineet 10
2.1.1. Elimistön vasta-ainetuotanto 10
2.1.2. Vasta-aineiden isotyypit 15
2.1.3. Mono- ja polyklonaaliset vasta-ainevalmisteet 17
2.1.4. Vasta-ainevalmisteiden tuotanto 18
2.1.5. Vasta-aineiden affiniteetti ja spesifisyys ja tuotantoprosessin optimointi
niiden kannalta 20
2.1.6. Vasta-aineella paikantaminen biotieteellisessä tutkimuksessa 23 2.2. Vasta-aineita hyödyntäviä molekyylibiologisia menetelmiä 25
2.2.1. ELISA 25
2.2.2. Western blot 26
2.3. Immunohistokemialliset menetelmät 29
2.3.1. Menetelmien perusteoria 29
2.3.2. Leimat ja signaalin havaitseminen 29
2.3.3. Vasta-aineiden spesifisyyden kontrollointi 32
2.4. Affiniteettipuhdistus 36
2.5. Hippokampus 37
2.5.1. Yleistä hippokampuksesta 37
2.5.2. Tunteiden ja stressin vaikutus hippokampuksen toimintaan 38 2.5.3. Tutkittujen vasta-aineiden antigeenit hippokampuksessa 38
3. TUTKIMUKSEN TAVOITTEET 41
4. MATERIAALIT JA MENETELMÄT 42
4.1. Materiaalit 42
4.1.1. Kudostyyppi, testatut primaarivasta-aineet ja rekombinantti-kalretiniini
42
4.2. Menetelmät 43
4.2.1. Kudosnäytteiden hankinta ja esikäsittely 43
4.2.2. Western blot 43
4.2.2.1. Elektroforeesi ja siirrostus 43
4.2.2.2. Immuunikompleksien muodostaminen 44
4.2.2.3. Signaalin tuotto ja kerääminen 45
4.2.3. Kalretiniinin vasta-aineen affiniteettipuhdistus 45
4.2.4. ELISA 47
4.2.5. Immunohistokemiallinen värjäys 48
5. TULOKSET 51
5.1. Vasta-aineiden toiminta Western blotin olosuhteissa 51
5.2. Affiniteettipuhdistuksen arviointi ELISAlla 54
5.3 Immunohistokemiallisen värjäyksen tulokset 54
6. POHDINTA 60
7. LÄHDELUETTELO 65
1. JOHDANTO
Immunohistokemiallista värjäystä käytetään runsaasti sekä kliinisessä diagnostiikassa että bio- ja lääketieteellisessä tutkimuksessa. Immunohistokemian avulla saadaan paikallistettua makromolekyylejä kudoksesta. Neurotieteissä sitä käytetään hermoston organisaation selvittämiseen. Immunohistokemian avulla on mahdollista tunnistaa hermostosta mm. erilaisia solutyyppejä ja niiden tuoja- ja viejähaarakkeillaan muodostamia ratoja.
Immunohistokemiassa hyödynnetään vasta-aineita, joita tuotetaan immunisoimalla eläimiä makromolekyylille. Immunohistokemian antama tieto on luotettavaa kuitenkin vain siinä tapauksessa, että käytetyt vasta-aineet ovat spesifisiä kohteilleen. Tässä tutkimuksessa pyrittiin kehittämään käytäntö, jolla immunohistokemiallinen laboratorio voisi varmistua vasta-ainevalmisteen spesifisyydestä. Vaikka valmistajat kontrolloivat tuotteitaan, vaaditaan tutkijoitakin usein arvioimaan työkalujensa taso. Näin oli käynyt myös Riitta Miettiselle.
Lehteen lähetetty käsikirjoitus oli tullut takaisin kera vaateen, että spesifisyys olisi todistettava.
Osaa tutkittavista vasta-aineista oli valmistajan mukaan arvioitu SDS-PAGE-pohjaisella Western Blotilla. SDS kuitenkin denaturoi antigeeneina toimivat proteiinit, joten se ei välttämättä ole luotettava keino arvioida vasta-aineiden toimintaa ympäristössä, jossa proteiinit ovat luontaisessa konformaatiossaan. Western blotit SDS:n kera tehtiin tässä tutkimuksessa kaikille tutkittaville vasta-aineille, eikä suurin osa niistä toiminut tällöin spesifisesti.
Tutkittavia vasta-aineita ei ollut puhdistettu muista aspiroidun ruumiinnesteen komponenteista. Ylimääräisten komponenttien vaikutusta valmisteen spesifisyyteen arvioitiin affiniteettipuhdistamalla yksi kaupallinen polyklonaalinen vasta-ainevalmiste, kalretiniinin antiseerumi SWANTilta. Puhdistuksen jälkeen tehtiin immunohistokemiallinen värjäys rotan aivoleikkeelle alkuperäisellä valmisteella sekä puhdistuksesta saadulla spesifisellä ja epäspesifisellä fraktiolla, ja verrattiin tuloksia keskenään. Epäpuhtausfraktion todettiin tuottavan jonkin verran taustaa, mutta alkuperäinen valmiste ja puhdistettu fraktio antoivat yhtenevät tulokset.
Immunohistokemiallisen värjäyksen tulosta verrattiin myös lähetti-RNA:n paikallistumiseen eli in situ -hybridisaatioon (ISH) perustuvia kuvia, joita on hiiren aivoista kerätty Allen Brain Atlas –tietokantaan. Tulokset olivat samansuuntaisia.
Tutkielmassa ehdotetaan myös muutoksia spesifisyyden arviointiin käytettävään menetelmäpatteristoon. Luotettavampi vertailukohta vasta-aineen tuottamalle värjäytymistulokselle rotan aivoissa olisi ISH rotan aivoista hiiren sijaan. Jos rotan aivoleikkeestä saataisiin ISH-kuva joko itse ottamalla tai muualta, ISH itsessään voisi olla riittävän pitävä tapa
spesifisyyden osoittamiseen, joskin tulosten tulkintaa voisivat välillä hankaloittaa mahdolliset erot proteiinin ja lähetti-RNA:n sijainneissa. ISH:n tueksi voisi yrittää saada aikaan Western Blotin vähemmän denaturoivilla menetelmillä. Tällainen saattaisi olla mahdollista saada aikaan erottelemalla proteiinit niiden isoelektrisen pisteen perusteella. Vasta-ainevalmisteen affiniteettipuhdistuksen tuottaman lisähyödyn näitä menetelmiä käytettäessä arvioidaan olevan useimmissa tapauksissa vähäinen. Monoklonaalisten valmisteiden tapauksessa spesifisyyden selvittämiseksi voi riittää rinnakkainen värjäys rinnakkaisvalmisteella, mikäli sellainen on saatavissa.
2. KIRJALLISUUSKATSAUS
2.1. Vasta-aineet
2.1.1. Elimistön vasta-ainetuotanto
Vasta-aineita (kuva 1) esiintyy leuallisilla selkärankaisilla (Abbas ym. 2010, s. 6). Ne ovat immunoglobuliinien ryhmään kuuluvia proteiineja, joiden tehtävä elimistössä on tarttua vieraisiin makromolekyyleihin (Abbas ym. 2010, s. 75). Näin ne auttavat torjumaan elimistön toimintaa uhkaavia loiseliöitä, mikrobeja ja viruksia. Yksi vasta-ainemolekyyli tarttuu hanakimmin juuri tiettyyn kohteeseen, mitä kutsutaan spesifisyydeksi. Spesifisyyden määräävät vasta-ainemolekyylin antigeenejä sitovien domeenien kohdemolekyylin kanssa muodostamat sähköstaattiset vuorovaikutukset (ionit ja dipolit, Van der Waals, vesihakuisuus-vesipakoisuus), joiden syntyminen edellyttää pinnanmuotojen yhteensopivuutta ja oikeanlaisia varauksia oikeissa paikoissa.
Vasta-aineet ovat tärkeä osa adaptiivista immuunijärjestelmää. Immuunipuolustuksen toinen peruskomponentti on synnynnäinen immuunijärjestelmä, joka reagoi esim. havaitessaan bakteerien kalvorakenteille yleisesti ominaisia lipopolysakkarideja. Synnynnäinen immuniteetti ei kuitenkaan riitä huolehtimaan koko immuunipuolustuksesta, koska taudinaiheuttajien
Antigeeni
Fc-domeenit (“häntä”)
Kuva 1. Yleisluontoinen kaavakuva IgG-vasta-ainemolekyylistä Muokattu Wikipedian kuvasta, jonka tehnyt nimimerkki Fvasconcellos.
Tässä irrallisiksi piirrettyjä ketjuja sitovat oikeasti toisiinsa disulfidisidokset.
Antigeeniä sitovat domeenit
evoluutio on paljon nopeampaa kuin isäntäeliöiden, minkä takia taudinaiheuttajille kehittyy helposti tapoja kiertää synnynnäinen immuniteettijärjestelmä, bakteerien kohdalla esim.
lipopolysakkaridien naamiointi muilla makromolekyyleillä. Taudinaiheuttajien evoluutiota nopeuttaa nopea sukupolvien vaihtuminen ja suuret populaatiokoot, sekä joukko muita tekijöitä.
Bakteerit voivat vaihtaa keskenään perimätekijöitään esim. plasmidien ja transposonien muodossa, bakteriofagienkin (bakteerien virusten) joskus osallistuessa sekoitusprosessiin (Campbell ja Reece 2008, s. 386). Bakteerien geneettiset elementit useinkin siirtyvät bakteerilajilta toiselle. Esimerkkinä Escherichia colin tiettyjen EHEC-kantojen (EnteroHaemorrhagic E.
Coli) edustajilla on genomiin integroituneen bakteriofagin koodittama, aitotumallisissa soluissa proteiinisynteesin pysäyttävä Shiga-toksiini, joka on lähes identtinen erään Shigella dysentriae –muodon tuottaman toksiinin kanssa (Hedman ym. 2010, s. 181).
Virukset puolestaan voivat poimia geneettisiä elementtejä isäntäeliöistään, ja eri virusten genomit voivat sekoittua, kun erilaisia viruksia pesii samassa solussa. Lisäksi etenkin RNA- ja yksisäie-DNA-virusten geneettisen materiaalin replikaatiossa syntyy mutaatioita enemmän kuin isäntäeliön DNA-replikaatiossa. Tiheämpi mutatoituminen lisää toimintakyvyltään huonompien varianttien syntymisen todennäköisyyttä, mutta tämän haitan mahdollisesti kompensoi suurempi muuntelu, joka antaa suojaa immuunijärjestelmää vastaan (Hedman ym.
2010, s. 466 - 469).
Adaptiivinen immuunijärjestelmä antaa elimistölle mahdollisuuden pysyä nopeasti muuntuvien taudinaiheuttajien perässä, vaikka voittamaton se ei sentään ole. Kun vieraita molekyylejä pääsee kehon sisään, adaptiivisessa immuunijärjestelmässä käynnistyy immunisoitumisprosessi. Sen kuluessa syntyy elimistössä valmiina olevista B-soluista suuria määriä spesifistä vasta-ainetta tuottavia plasmasoluja sekä muistisoluja. (Vastaavanlaisen prosessin käyvät läpi myös T-solut soluvälitteisen immuniteetin puolella, mutta aihepiiri on tämän vasta-aineisiin liittyvän gradun ulkopuolella.) Plasmasolut ovat lyhytikäisiä, mutta niitä voidaan tuottaa nopeasti muistisoluista, jos vasta-ainetuotannon alun perin laukaissutta molekyyliä eli antigeeniä pääsee elimistöön uudestaan.
Jo se, että vasta-aine sitoutuu toksiinin, viruksen tai bakteerin pintaan, auttaa usein vähentämään elimistöön kohdistuvaa uhkaa. Tätä partikkelin päällystymistä vasta-aineilla kutsutaan opsonoinniksi. Tämä yksistään ei kuitenkaan yleensä ole riittävä puolustusmekanismi niin mikrobeja kuin viruksiakaan vastaan. Mikrobeilla on elävinä olentoina pintansa alla viruksista ja toksiineista poiketen omia toimintoja, joita opsonointi ei pysty pysäyttämään. Virukset puolestaan lisääntyvät elimistön soluissa (kuten myös jotkin bakteerit), ja vapautuvat niistä suurina määrinä tartuttamaan muita soluja. Vasta-aineet eivät välttämättä ehdi neutraloida kaikkia viruksia, eivätkä joka tapauksessa pääse solujen sisään.
Mikrobeja vastaan puolustautumista edistää opsonoinnin edesauttama fagosytoosi, joka usein myös edellyttää opsonointia. Fagosytoosi on energiaa kuluttava prosessi, jota käytetään yli 0,5 µm:n kokoisiin partikkeleihin (Abbas ym. 2010, s. 36). Fagosytoosissa syöjäsolu ottaa partikkelin sisäänsä solukalvostaan kuromaansa rakkulaan. Tämän jälkeen syöjäsolu pyrkii hajottamaan fagosytoidun aineksen. Elimistömme syöjäsoluja ovat makrofagi-monosyyttilinjan solut sekä neutrofiiliset granulosyytit, ja niillä on kalvoreseptori, jonka avulla ne paikallistavat partikkeliin tarttuneet vasta-aineet. Monilla mikrobilajeilla on molekyylirakenteita, joiden funktio on haitata fagosytoosia, ja opsonointi on usein välttämätöntä niiden fagosytoimiseksi.
Fagosytoosilla on merkitystä myös viruksia vastaan puolustautumisessa, joiden fagosytointi on täysin opsonoinnista riippuvaa.
Syöjäsolut toimivat enimmäkseen soluvälitilassa. Verenkierrossa mikrobien tuhoamisesta huolehtii pääosin komplementtijärjestelmä, joka koostuu joukosta proteiineja. Se voi toimia osana niin synnynnäistä kuin hankittua immuunijärjestelmää. Jälkimmäisessä tapauksessa komplementtivasteen laukaisee vasta-aineen sitoutuminen mikrobin pintaan.
Komplementtivasteessa komplementtiproteiineista muodostuu mikrobin solukalvoon sen läpäiseviä kanavia (membrane attack complex). Nämä reiät häiritsevät mikrobin toimintaa saaden sen lopulta kuolemaan. Eosinofiiliset granulosyytit, jotka tuhoavat loiseliöitä pommittamalla niitä hajotusentsyymeillään, tunnistavat nekin kohteensa siihen tarrautuneiden vasta-aineiden perusteella.
Virusinfektion taltuttamisessa adaptiivisen immuunijärjestelmän soluvälitteinen osa on yleensä vasta-ainevälitteistä oleellisempi. Kun sytotoksinen T-solu (T tulee Thymuksesta eli kateenkorvasta, jossa T-solut kypsyvät) havaitsee elimistön oman solun pinnan MHCI- kompleksissa vierasantigeenin, se käynnistää tapahtumaketjun, jonka tarkoitus on solun hävittäminen. Soluvälitteinen järjestelmä on tarpeen paitsi solujen sisälle meneviä taudinaiheuttajia vastaan puolustautumisessa, myös esisyöpäsolujen poistamisessa (Abbas ym.
2010, s. 122).
Luonto on täynnä biologista variaatiota. On ollut taudinaiheuttajakantoja, jotka ovat kyenneet lyömään useimpien ihmisten immuunijärjestelmän; vastaavasti henkiinjääneillä ihmisillä on ollut ominaisuuksia, jotka ovat suojanneet kyseisiä kantoja vastaan. Monille bakteerilajeille ja virustyypeille on luonnollisesti kehittynyt sopeutumia, joiden avulla ne pystyvät suojautumaan adaptiiviseltakin immuunijärjestelmältä ainakin niin pitkään, että ehtivät leviämään uusiin isäntiin. Isäntänsä elimistön nopeasti romuttava taudinaiheuttaja ei kuitenkaan monissa olosuhteissa ole kovin leviämiskykyinen. Esim. HIV lopulta tyypillisesti saa aikaan isäntänsä kuoleman (ainakin ilman antiretroviraalisia lääkkeitä), mutta prosessi on hidas. Toisaalta arviolta n. 10 %:lla eurooppalaisperäisistä ihmisistä on geenimutaatio, joka homotsygoottisena
antaa vahvan, joskaan ei täydellisen, suojan HIV:tä vastaan (Lucotte 2001). Mutaation suhteellisen korkea frekvenssi saattaa johtua siitä, että se on aikaisemmin suojannut joltain muulta taudinaiheuttajalta.
Elimistön kyky kehittää vasta-ainetta antigeenille, jota se ja mahdollisesti koko sen edustama laji ei ole koskaan aikaisemmin kohdannut, nojaa vahvasti muuntelun ja valinnan hyödyntämiseen.
Sikiönkehityksen aikana B-solujen vasta-ainegeenielementeissä tapahtuu rekombinaatiota, ja syntyy joukko B-soluklooneja, joista kukin tuottaa vasta-ainetta, jolla on omanlaisensa antigeeninsidontadomeeni (Abbas ym. 2010, s. 155). Osa B-soluklooneista reagoi elimistön omiin molekyyleihin; nämä kloonit elimistö pyrkii poistamaan. Elimistöön jää arviolta 107 erilaista B-solukloonia. Antigeenin kohdatessaan elimistö vielä tuottaa osasta näitä soluja entistä spesifimpejä ja tehokkaampia vasta-aineita valmistavia versioita muuntelu- ja valintasyklin avulla.
B-solua, joka ei ole vielä kohdannut antigeeniään, kutsutaan naiiviksi. Sen tuottamilla vasta- aineilla on domeeni, joka ankkuroi vasta-aineen solukalvoon (vakioalueestaan, niin että vaihtelevat alueet voivat edelleen sitoa antigeenejä). Nämä solukalvoon kiinnittyneet vasta- aineet toimivat reseptorien tavoin.
Elimistöä itseään vastaan toimivia vasta-aineita tuottavat B-solut pyritään tuhoamaan heti, kun ne ovat erilaistuneet luuytimen hematopoieettisista kantasoluista. Tämä tuhoaminen perustuu siihen, että elimistö antaa apoptoosi- eli solukuolemakäskyjä niille B-soluille, jotka luuytimessä tarttuvat reseptorivasta-aineillaan johonkin. Luuytimessä ei tavallisesti ole vierasantigeenejä, joten valintaprosessi tuhoaa niitä B-soluja, joiden vasta-aineet reagoivat elimistön omiin molekyyleihin. Käytännössä tällaisiakin B-soluja voi päästä seulan läpi, osaksi siksi, että luuytimessä ei esiinny kaikkia elimistön antigeenejä, ainakaan kovin suurina pitoisuuksina.
Tämän jälkeen B-solut päätyvät imusolmukkeisiin. Siellä ne alkavat lisääntyä, ja osa linjoista johtaa lopullisiin plasmasoluihin, jotka tuottavat vasta-aineesta solunulkoiseen tilaan erittyvää muotoa. Osana prosessia vasta-aineet mukautuvat paremmin elimistön kohtaamaa immunologista haastetta vastaaviksi. Tässä tapahtumasarjassa ovat keskeisessä osassa auttaja- T-solut (helper T cell), dendriittisolut (DC eli Dendritic Cell) ja follikulaariset dendriittisolut (FDC eli Follicular Dendritic Cell).
Dendriittisolut fagosytoivat mikrobeja. Mikrobien tunnistaminen tapahtuu mikrobien tiettyjen yleisesti ilmentämien pinta-antigeenien, kuten mannoosin, perusteella (Abbas ym. 2010, s. 120).
Mikrobit hajotetaan dendriittisolujen sisällä. Proteiineja pilkkoutuu lyhyiksi peptideiksi, joiden osasia päätyy dendriittisolujen solukalvolle MHCII-proteiineihin (Major Histocompatibility Complex) sitoutuneina.
Imusolmukkessa on imukerästen ulkopuolisessa tilassa aktivoitumattomia auttaja-T-soluja, jotka tunnustelevat reseptoreillaan jatkuvasti dendriittisolujen MHCII-proteiineja (Abbas ym.
2010, s. 223). B-soluille analogisella tavalla auttaja-T-solutkin muodostavat klooneja, joista kukin ilmentää kalvoreseptoria, joka reagoi tietynlaisiin antigeeneihin. Kun sopiva auttaja-T- solu löytää MHCII:sta antigeeninsä, se aktivoituu ja siirtyy imukeräsen rajapintaan.
Samalla imukeräsessä sijaitsevat naiivit B-solut, jotka tuottavat sopivanlaista vasta-ainetta, aktivoituvat löytäessään antigeeniään. Ne fagosytoivat antigeeniä, ja sisään otettuja proteiineja hajoaa peptideiksi B-solujen MHCII:ien esiteltäviksi. Aktivoituneet B-solut myös siirtyvät imukeräsen rajapinnalle.
Imukeräsen rajapinnalla aktivoituneet B- ja auttaja-T-solut kohtaavat. Jos auttaja-T-solu havaitsee kalvoreseptorillaan antigeeniaan B-solun MHCII:ssa, auttaja-T-solu aktivoi B-solun edelleen uuteen toimintatilaan. Tällöin B-solu muuttaa imukeräsen sisäosaan, jossa on follikulaarisia dendriittisoluja (Abbas ym. 2010, s. 228). Näitä soluja ei tule sekoittaa yllä mainittuihin auttaja-T-solujen kanssa vuorovaikuttaviin dendriittisoluihin. Follikulaarisilla dendriittisoluilla ei ole MHCII-proteiineja. Niillä on Fc- (Fragment, crystallizable, vasta- ainemolekyylin ”häntä”) ja komplementtireseptoreita, joiden avulla ne pystyvät tarttumaan vasta-aineisiin ja komplementtiin ja sitä kautta niiden kompleksoimiin antigeeneihin, joita follikulaariset dendriittisolut sitten esittelevät B-soluille pilkkomattomina.
T-solujen aktivoimat B-solut, jotka tarttuvat follikulaarisen dendriittisolun esittelemään molekyyliin, saavat follikulaariselta dendriittisolulta lisääntymissignaalin. Tällöin nämä B-solut alkavat lisääntyä, ja samalla niiden Ig V –eksonien (jotka koodittavat vasta-aineiden Variable-alueita, jotka määräävät vasta-aineiden spesifisyyden) DNA:n pistemutaatiotaajuus kohoaa nisäkkäillä 103 - 104 –kertaiseksi muuhun DNA:han nähden (Abbas ym. 2010, s. 233).
Näin syntyy joukko muunnelmia alkuperäisestä B-solusta. Ne muunnelmat, jotka tarttuvat antigeeniinsa vahvimmin, viettävät pidempiä aikoja tiiviissä kosketuksessa follikulaaristen dendriittisolujen kanssa, ja saavat eniten lisääntymiskäskyjä. Tämän toistaan seuraavista muuntelu- ja valintavaiheista koostuvan prosessin vaikutuksesta syntyy B-soluja, jotka tuottavat vieläkin vahvemmin antigeeniinsa sitoutuvia vasta-aineita. Prosessin englanninkielinen nimi on affinity maturation.
On hyvä huomata, että B-solulla ja sitä aktivoivalla auttaja-T-solulla ei tarvitse olla eikä luultavasti yleensä olekaan sama epitooppi. B-solut tunnistavat reseptoreillaan yleensä natiivissa konformaatiossa olevia kokonaisia biomolekyylejä, kun taas auttaja-T-solut tunnistavat lyhyitä peptidejä, joita niitä esittelevät solut ovat pilkkoneet endosytoimistaan suuremmista molekyyleistä. B-solun ja sitä aktivoivan auttaja-T-solun antigeenina tulee
kuitenkin toimia sama molekyyli. Koska T-solut tunnistavat vain peptidejä, ne voivat aktivoida B-soluja ainoastaan, jos antigeeni on tai siihen on kiinteässä yhteydessä peptidi. Vasta-aineiden tuottaminen onnistuu joskus myös peptideistä vapaita molekyylejä vastaan, mutta vaste jää tällöin usein vaatimattomammaksi. B-soluvasteen saattaa mahdollistaa tällaisissa tapauksissa antigeenin sitoutuminen proteiineihin kehossa (Abbas ym. 2010, s. 114). Osa ei-peptideistä ei laukaise vasta-ainetuotantoa ollenkaan.
Seuraava vaihe B-solujen kypsymisessä on vasta-aineen isotyypin vaihto. Vasta-ainemolekyylin solukalvoon sitova domeeni häviää. Tämän jälkeen vasta-ainemolekyylit pystyvät liikkumaan vapaasti, ja ne jakautuvat tasaisesti elimistön solunulkoiseen nestetilaan. B-solusta on tullut plasmasolu. Plasmasolujen energiankulutus on suurta ja proteiinisynteesi laajamittaista, ja ne polttavatkin itsensä loppuun muutamassa päivässä. Uusia plasmasoluja kuitenkin eriytyy B-solukannasta niin pitkään kuin antigeeniä havaitaan, ja osasta plasmasoluja eriytyvät muistisolut ylläpitävät immuniteettia pidemmällä aikajänteellä.
2.1.2. Vasta-aineiden isotyypit
Useampaa kuin yhtä vasta-aineen isotyyppiä esiintyy ainakin Tetrapoda-yläluokan eläimillä (sammakkoeläimillä, matelijoilla, linnuilla ja nisäkkäillä). Eniten erilaisia isotyyppejä tiedetään olevan nisäkkäillä. Tässä tarkastellaan ihmiselimistössä esiintyviä isotyyppejä (Abbas ym.
2010, s. 87).
B-solut, jotka eivät vielä ole kohdanneet antigeeniään, ilmentävät isotyyppejä IgD ja IgM (kuva 2). Ne ovat kiinni solukalvossa ja toimivat reseptorien tavoin. Plasmasoluksi muuntuessaan B-solu vaihtaa isotyyppinsä vapaasti liikkuvaan. Olosuhteet ratkaisevat, minkä isotyypin vasta-
Kuva 3. IgG-vasta-aine Piirretty Abbasin ym. (2010) mukaan.
Kuva 2. Kaavakuva IgM-kompleksista Piirretty Abbasin ym. (2010) mukaan.
Solukalvossa kiinni oleva muoto on monomeerinen.
ainetta elimistössä tarvitaan, ja eri immuunisolujen erittämillä sytokiineilla on suuri merkitys siinä, minkä isotyypin B-solu valitsee (Abbas ym. 2010, s. 228).
Ensimmäinen vapaasti liikkuva vasta-aine, jota immunisoitumisen yhteydessä aletaan tuottaa, on IgM:n solunulkoiseen tilaan erittyvä versio. Muista vasta-aineista poiketen se esiintyy pentameerina, jossa viisi vasta-ainemolekyyliä on liittynyt kovalentisti Fc-domeeneistaan yhteen. Tämä parantaa IgM:n kykyä tarttua taudinaiheuttajiin, mutta hidastaa sen diffuusiota kudoksissa. IgM on tehokas aktivoimaan komplementtireaktiota.
Immuunivasteen edetessä pidemmälle muuntelu- ja valintasykli tuottaa B-solupopulaatioita, joiden tuottamien vasta-aineiden antigeenejä sitovat domeenit tarttuvat antigeeniin tiukemmin.
Nämä vasta-aineet pystyvät täten toimimaan pentameereja pienempinä kokonaisuuksina ja samalla kulkeutumaan kudoksessa paremmin. Edenneessä immuunivasteessa tuotetuista vasta- aineista yleisluontoisin on IgG (kuva 3), joka esiintyy monomeerina. IgM:n tavoin sekin voi aktivoida komplementtireaktion. Sen tärkeitä erityistehtäviä ovat fagosytoosin auttaminen ja väliaikaisen passiivisen immuniteetin anto jälkikasvulle, johon se kulkeutuu maidon ja istukan kautta.
Jos on merkkejä siitä, että antigeenit ovat peräisin monisoluisista loisista, aletaan erittää IgE- tyypin vasta-aineita (kuva 4), jotka ovat nekin monomeerisia. Kun IgE on päällystänyt loisen, loisia torjuva eosinofiili-granulosyytti löytää sen helpommin. IgE myös osallistuu paikallisen tulehdustilan aikaansaamiseen. IgE on normaalisti harvalukuinen, eikä siksi aktivoi syöttösolua, jonka aktivointiin tarvitaan useampi IgE. Kun kehossa on vieraita partikkeleita, joihin IgE sitoutuu, muodostuu useita IgE-molekyylejä sisältäviä komplekseja, jotka pystyvät aktivoimaan syöttösoluja, saaden nämä sidekudoksessa ja limakalvoilla esiintyvät solut vapauttamaan tulehdustekijöitä. IgE:n ympärillä pyörivällä immuunijärjestelmän osalla on merkitystä myös allergiana tunnetussa toimintahäiriössä. On esitetty, että loiskuormitus vähentäisi allergioiden esiintyvyyttä.
IgA (kuva 5) puolestaan on vasta-ainetyyppi, jota erittyy kyynelnesteeseen, sylkeen, keuhkojen ja ruoansulatuskanavan limaan sekä virtsa- ja sukuelinten eritteisiin. Se säilyttää toimintakykynsä ruoansulatuskanavassa muita isotyyppejä paremmin, ja suojaa kehoa Kuva 4. IgE
Piirretty Abbasin ym. (2010) mukaan.
Kuva 5. IgA
Piirretty Abbasin ym. (2010) mukaan.
limakalvoille kulkeutuneilta mikrobeilta. IgA esiintyy dimeerinä, ja on kehon eniten tuotettu vasta-aineisotyyppi.
2.1.3. Mono- ja polyklonaaliset vasta-ainevalmisteet
Vasta-aineille on kehitetty erilaisia sovellutuksia tutkimustyöhön, diagnostiikkaan ja terveyden- ja sairaanhoitoon. Ensimmäinen askel tuotannossa on eläimen immunisointi antigeenillä. Saadut vasta-aineet ovat yleensä IgG-tyyppiä. Jonkin verran vasta-aineita tuotetaan kananmunissa, jolloin isotyyppi on nisäkkäissä esiintymätöntä IgY-tyyppiä (Tini ym. 2001).
Koska antigeenissä on yleensä useita epitooppeja – kohtia, jonka tunnistava B-solu elimistöstä löytyy – yksi antigeeni yleensä aktivoi useamman eri B-solukloonin. Täten immuunivaste saa aikaan vasta-aineseoksen, jossa vasta-ainemolekyyleillä on erilaisia polypeptidisekvenssejä vaihtelevilla alueillaan (variable regions). Siten seoksessa on vasta-aineita, jotka sitoutuvat antigeenin eri epitooppeihin. Tällaista seosta kutsutaan polyklonaaliseksi vasta-aineeksi.
Pelkästään yhdenlaisen vasta-ainemolekyylin joukkoa kutsutaan monoklonaaliseksi vasta- aineeksi. Molemmilla on sovellutuksia tutkimuksessa ja lääketieteessä, ja halutunlaisten vasta- aineiden tuotantoon on tekniikkansa (Abcam 2012). Monoklonaalisen vasta-aineen tuottaminen on monimutkaisempaa ja kalliimpaa kuin polyklonaalisen tuottaminen. Yleisesti ottaen monoklonaaliset vasta-aineet ovat polyklonaalisia spesifisempiä. Koska monoklonaaliset vasta- aineet sitoutuvat vain yhteen antigeenin epitoopeista, monoklonaaliset vasta-aineet löytävät epitooppeja useammasta kuin yhdestä makromolekyylistä polyklonaalisia epätodennäköisemmin.
Tämä spesifisyys on hyödyksi niin tietyissä terapeuttisissa kuin tutkimuksellisissakin sovellutuksissa. Monoklonaalisen vasta-aineen käyttö vähentää virheellisten positiivisten tulosten todennäköisyyttä ristiinreagoinnin vähentyessä, ja esim. proteiinin tietyn domeenin spesifinen tunnistaminen tulee mahdolliseksi. Taustasignaali vähenee, ja koska erien välillä ei ole toiminnallisia eroja, kuten joskus polyklonaalisten tapauksessa, tutkimusten toistettavuus paranee.
Joihinkin käyttötarkoituksiin polyklonaaliset vasta-aineet sopivat paremmin. Jos antigeenin määrät ovat pieniä, esimerkiksi tutkittaessa kudosta, jossa tutkittavaa proteiinia ilmentyy vähän, polyklonaalisen suurempi herkkyys on eduksi. Polyklonaalinen vasta-aine on monoklonaalista vähemmän herkkä antigeenin pienille poikkeavuuksille, joita voi aiheuttaa esim. polymorfia (peptidisekvenssien yksilökohtainen vaihtelu) tai se, että eri ekspressiosysteemeissä proteiinin glykosylaatio voi olla erilaista. Polyklonaalinen vasta-aine myös tunnistaa denaturoituneen proteiinin monoklonaalista todennäköisemmin, koska se tunnistaa useita eri epitooppeja, joista jokin voi säilyä tunnistuskelpoisena. Polyklonaaliset vasta-aineet myös todennäköisemmin
tunnistavat homologisen proteiinin eri eliölajeista.
2.1.4. Vasta-ainevalmisteiden tuotanto
Ensimmäinen käyttöalue ihmiskehon ulkopuolella tuotetuille vasta-aineille oli ihmisten passiivinen immunisointi tauteja vastaan eläimissä tuotetun antiseerumin avulla. Eläimiin ruiskutettiin taudinaiheuttajia, ja ne alkoivat valmistaa vasta-aineita. Yleensä antiseerumin tuotantoon käytettiin hevosta, koska siitä voitiin laskea suurempia määriä verta kuin pienemmistä eläimistä. Nämä vasta-aineet olivat luonnollisesti polyklonaalisia. Niin eläimistä kuin ihmisistäkin eristettyjä vasta-aineita käytetään yhä useiden tautien hoitoon ja toksiinien vaarattomaksi tekemiseen. Tutkimuskäyttöön polyklonaalisia vasta-aineita tuotetaan yleensä pienemmissä eläimissä. Osa kerätään myös immunisoitujen kanojen keltuaisista (Tini ym.
2001). Munien käytön hyviä puolia on mm., että eläimiä ei tarvitse stressata veren keräämisellä ja että vasta-ainetta saadaan samassa ajassa yhtä kanaa kohti enemmän kuin vastaavankokoisesta nisäkkäästä.
Immuunireaktion tehostamiseksi voi olla tarpeen ruiskuttaa eläimeen antigeenin lisäksi adujuvanttia, ainetta, joka aktivoi synnynnäistä immuunijärjestelmää, joka vuorostaan aktivoi adaptiivista järjestelmää (Abbas ym. 2010). Lisäksi voi olla tarpeen kiinnittää molekyyli proteiiniin (esim. glutaraldehydillä), jotta molekyyliä vastaan saataisiin syntymään vasta- ainetta. Kompleksia vastaan syntyvistä vasta-aineista osa tarttuu alkuperäiseen molekyyliin eli hapteeniin, osa myös tai ainoastaan proteiiniin. Menetelmää täytyy usein käyttää, jos halutaan vasta-aineita ei-peptidiä vastaan (koska ilman auttaja-T-soluvuorovaikutuksia vasta- ainetuotanto voi jäädä vähäiseksi tai olemattomaksi, ks. kohta 2.1.1).
Kohler and Milstein julkaisivat monoklonaalisten vasta-aineiden tuotantomenetelmän 1975.
Seuraavassa esitetty kuvaus menetelmästä perustuu Encyclopedia of Life Sciences –teoksen artikkeliin Production of Monoclonal Antibodies (Liddell 2005) sekä kirjaan Cellular and Molecular Immunology (Abbas ym. 2010). Kuten polyklonaalisten vasta-aineiden tuotannossa, ensimmäinen askel on eläimen immunisointi. Monoklonaalisten vasta-aineiden tapauksessa kyseessä on Balb/c-kannan hiiri. Immunisoitua eläintä ei kuitenkaan käytetä suoraan vasta- aineen tuotantoon, vaan sopivia monoklonaalisia vasta-aineita tuottavien plasmasolujen lähteenä.
Immunisoinnin jälkeen eläimelle annetaan uusi annos samaa antigeeniä. Tämä saa sille spesifistä vasta-ainetta tuottavien plasmasolujen määrän kasvamaan huomattavasti muutamassa päivässä.
Sen jälkeen hiiri lopetetaan, ja sen pernasta otetaan talteen plasmasoluja. Niitä sijoitetaan
kuoppalevyn kuoppiin yhdessä myeloomasolujen kanssa. (Myelooma on plasmasoluperäinen syöpä.) Plasma- ja myeloomasoluja saadaan sulautumaan hybridoomasoluiksi polyetyleeniglykolikäsittelyllä.
Kasvuliuoksessa on hypoksantiinia, aminopteriinia ja tymidiiniä, joista se saa nimekseen HAT- liuos. Sen tehtävä on estää myeloomasolujen ja kahden myeloomasolun muodostamien hybridien lisääntyminen. Aminopteriini estää soluja käyttämästä pääasiallista puriinien synteesitietään, jolloin niiden ainoaksi tavaksi tuottaa puriineja jää turvautuminen niin kutsuttuun pelastustiehen (salvage pathway), puriinien muokkaamiseen hypoksantiinista ja tymidiinistä. Myeloomasolut on kuitenkin käsitelty niin, etteivät ne tuota hypoksantiiniguaniinifosforibosyylitransferaasi- entsyymiä, joka katalysoi tähän tarvittavaa reaktiota.
Koska myeloomasolut eivät pysty syntetisoimaan puriineja, ne eivät pysty kahdentamaan DNA:taan, eivätkä näin ollen jakautumaan. Hiirestä saadut plasmasolut sen sijaan pystyvät tuottamaan puriineja pelastusteitse ja voivat jakautua. Plasmasolupopulaatiot eivät kuitenkaan selviydy soluviljelmässä muutamaa viikkoa pidempään, kuten eivät myöskään pelkkien plasmasolujen muodostamat hybridit. Plasma- ja myeloomasoluista muodostuneet hybridoomasolut sen sijaan jakautuvat ja selviytyvät viljelmässä loputtomiin, koska niillä on sekä pernasoluilta saatu kyky syntetisoida puriineja että myeloomasoluilta saatu ”kuolemattomuus”.
(Syöpäsolujen kyky selviytyvä ja jakaantua viljelmissä ei vaikuttaisi yleensä heikentyvän ajan kuluessa.) Näin HAT-kasvualustaa käyttämällä saadaan valikoitua soluista plasma- ja myeloomasolujen muodostamat hybridoomasolut.
Sitten hybridoomasolut sekoitetaan suurempaan nestetilavuuteen, laimentaen solupitoisuutta niin, että nesteestä otetussa näytteessä voidaan odottaa olevan keskimäärin yksi solu. Näytteet siirretään 96-kuoppaisen, ns. mikrotiitterikuoppalevyn kuoppiin, ja hybridoomasolujen annetaan lisääntyä. Mikäli kuoppaan tuli vain yksi solu, siihen muodostuu monoklooni. Mikäli soluja tuli kuoppaan enemmän kuin yksi, korjautuu tämä virhe myöhemmässä vaiheessa.
Solujen lisäännyttyä viljelynesteeseen erittyneiden vasta-aineiden reaktiivisuutta antigeenin kanssa tutkitaan esim. ELISA-menetelmällä (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Jos kuoppaan todetaan erittyneen antigeenille reaktiivista vasta-ainetta, kloonien toisistaan erottuminen varmistetaan laimennosta ja viljelyä vuorottelemalla tai hajauttamalla solut puolikiinteään agariin, johon kasvaa pesäkkeitä yksittäisistä soluista. Reaktiivista vasta-ainetta tuottavat kloonit valikoidaan jälleen.
Vasta-aineen reaktiivisuus antigeenin kanssa testissä ei riitä takaamaan spesifisyyttä.
Reaktiivisuuskaan ei ole vielä taattu kaikissa menetelmissä, kuten esimerkiksi Western blotissa, jossa proteiinit ovat SDS:n denaturoimia, tai immunohistokemiassa. Valikoitujen solukloonien
tuottamien vasta-aineiden toimintaa täytyy arvioida tavoilla, jotka varmistavat vasta-aineiden oikeanlaisen toiminnan niiden lopullisessa käyttökohteessa.
Aikaisemmin monoklonaalisten vasta-aineiden laajamittaiseen tuotantoon käytettiin yleensä hiiriä ja askitesmenetelmää. Askites on lääketieteellinen termi vatsaonteloon kerääntyvälle nesteelle. Menetelmässä hybridoomasoluja ruiskutetaan hiiren vatsaonteloon. Ne lisääntyvät ja tuottavat vasta-ainepitoista nestettä. Vatsan turpoamista odotetaan noin kaksi viikkoa, minkä jälkeen askitesta imetään ruiskulla. Käytetyt hiiret ovat samaa Balb/c-kantaa kuin ne, joista B- ja myeloomasolut eristettiin, mikä mahdollistaa tuotettujen hybridoomasolujen kasvattamisen niiden sisällä ilman kudosyhteensopivuusongelmia.
Nykyään monoklonaalisia vasta-aineita tuotetaan yleisemmin soluviljelmissä (Böcker ja Buchwalow, s. 5). Askitesmenetelmä on kustannustehokkaampi, mutta soluviljelmien käyttöä puoltavat eettiset näkökohdat. Askitesmenetelmä aiheuttaa hiirille kärsimystä, vaikka käytössä on ollut ohjeita askitesnesteen kertymisen ja keräämiskertojen rajoittamiseksi. Soluviljelmässä voidaan jatkaa hybridoomasolujen kasvatusta, tai vasta-aineen geeni voidaan siirtää johonkin muuhun solulinjaan, kuten kiinankääpiöhamsterin munasarjasyöpäsoluihin (CHO, Chinese Hamster Ovary cells). Rekombinantti-DNA-tekniikan avulla myös home- ja kasvisolut on saatu tuottamaan monoklonaalista vasta-ainetta kasvatusliuokseensa ja kanat muniinsa, mutta näitä tekniikoita ei vielä hyödynnetä tuotannossa ainakaan kovin laajamittaisesti (Zhu ym. 2005).
Monoklonaalisten vasta-aineiden tuottamisessa soluviljelmissä ja/tai ei-eläinsoluissa on sekin hyvä puoli, että nämä tuotantojärjestelmät eivät tuota muita kuin haluttua vasta-ainetta.
Askitesnesteessä on jonkin verran hiiren oman immuunijärjestelmän tuottamia muita vasta- aineita.
2.1.5. Vasta-aineiden affiniteetti ja spesifisyys ja tuotantoprosessin optimointi niiden kannalta
Sitä, kuinka vahvasti vasta-ainemolekyyli sitoutuu kohteeseensa, kutsutaan sen affiniteetiksi (Kimball 2003). Affiniteetin määrittämiseen on tarjolla erilaisia menetelmävaihtoehtoja.
Perinteisesti vasta-ainemolekyylin affiniteettia tiettyä molekyyliä kohtaan on määritetty tasapainodialyysillä (equilibrium dialysis). Sitä varten tarvitaan kalvo, joka päästää lävitseen antigeenin mutta ei vasta-ainetta, ja nestetila, jonka kalvo jakaa kahtia. Diffuusion vaikutuksesta antigeenimolekyylit alkavat liikkua nestetilasta toiseen. Jos vasta-ainemolekyylin affiniteetti antigeenille on nolla, antigeeni on jakautunut tasapainotilassa tasaisesti kumpaankin nestetilaan. Mitä korkeampi affiniteetti on, sitä enemmän tasapainotila poikkeaa tästä
tilanteesta vasta-ainemolekyyliä sisältävän puolen hyväksi. Yksi menetelmä, joka sopii nesteen antigeenipitoisuuden arviointiin, on tuonnempana käsiteltävä ELISA.
Affiniteetin määrittämiseen sovelletaan myös muita menetelmiä, joiden käyttöön liittyy erilaisia etuja, mutta joiden selittäminen vaatii enemmän fysiikan käsitteistöä ja mennee siten tämän tutkielman aihealueen ulkopuolelle. Tällaisia menetelmiä ovat ainakin high-mass Matrix- Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) –massaspektrometria ja Surface Plasmon Resonance (SPR) (Bich ym. 2008). (Esim. YouTubesta löytää näistä helposti havainnollisia animaatioita.)
Korkea affiniteetti ei kuitenkaan yksinään vielä tarkoita sitä, että vuorovaikutus olisi myös spesifinen – että vasta-ainemolekyylillä olisi korkean affiniteetin vuorovaikutuksia ainoastaan tarkastellun antigeenin kanssa. Riittävän samankaltaisia epitooppeja voi löytyä muistakin kohteista. Proteiineihin liittyen voidaan todeta, että elimistössä on monia toistensa kanssa vaihtelevasti homologisia proteiineja, ja myös ei-homologisilla proteiineilla voi olla keskenään samankaltaisia epitooppeja. Eri sovelluskentät asettavat vasta-aineen spesifisyydelle erilaisia vaatimuksia, joten vasta-aineen spesifisyyden testaamiseen valitaan menetelmät sen mukaan, mihin vasta-ainetta on tarkoitus käyttää. Näitä menetelmiä käydään läpi tarkemmin tuonnempana.
Vasta-aineen spesifisyyteen tähtääviä ratkaisuja voidaan tehdä jo tuotantovaiheessa (Polak ja van Noorden 1987). Antigeenin on hyvä olla mahdollisimman puhdasta, jotta immunisaatiossa ei syntyisi vasta-aineita ylimääräisiä antigeenejä kohtaan. Nämä ylimääräiset vasta-aineet voisivat aiheuttaa tutkimuksissa ylimääräistä signaalia. Mikäli antigeeniä täytyy käyttää hapteenina osana suurempaa kompleksia, kompleksin suurempi molekyyli pyritään luonnollisesti valitsemaan siten, että sitä tai sen kaltaisia molekyylejä ei esiintyisi lopullisessa käyttökohteessa. Monoklonaalisten vasta-aineiden tuotannossa tämän asian kanssa ei tarvitse olla yhtä tarkka kuin polyklonaalisten kohdalla, koska monoklonaalisten tuotantoprosessissa on mahdollista valita solulinja, jonka tuottamat vasta-aineet reagoivat ainoastaan hapteeniin.
Sellainenkin vasta-aine, jota elimistö tuottaa haluttua antigeeniä (eikä esim. antigeenivalmisteen epäpuhtautta) vastaan, voi reagoida ristiin. Tällaisten vasta-aineiden syntymisen todennäköisyyttä voidaan vähentää ottamalla selvää siitä, mitkä antigeeniproteiinin pintarakenteista ovat kaikista omaleimaisimpia, ja immunisoida eläintä sitten näillä pelkillä proteiinin osasilla. Tämä kuitenkin saa eläimen tuottamaan myös vasta-ainemolekyylejä, joita se ei tuottaisi kokonaista proteiinia vastaan. Kun proteiinista käytetään palasta, paljastuu osia ja epitooppeja, joita B-solujen reseptorit/vasta-aineet eivät huomaisi normaalitilanteessa. Palasella immunisoitu elimistö alkaa tuottaa vasta-aineita näille epitoopeille. Tällaisten vasta-aineiden affiniteetti natiivia (luonnollisessa tilassa olevaa) proteiinia kohtaan on heikko, mutta ne voivat reagoida ristiin joidenkin tutkittavassa näytteessä olevien makromolekyylien kanssa. Polyklonaalisen vasta-
aineen tapauksessa ongelmaan auttaa affiniteettipuhdistus (menetelmästä enemmän kohdassa 2.4). Monoklonaalisessa tuotannossa voidaan yksinkertaisesti valita se solulinja, joka tuottaa vasta-ainetta, joka tarttuu sekä proteiinin osaseen että natiiviin proteiiniin.
Melko yleisesti tutkimustyöhön käytettäviä vasta-ainevalmisteita ei ole puhdistettu, jolloin monoklonaalinen vasta-ainevalmiste on soluviljelyliuosta tai askitesnestettä, polyklonaalinen valmiste yleensä veriseerumia. (Kun polyklonaalista vasta-ainetta tuotetaan kananmunassa, on vasta-aineen puhdistus keltuaisesta tarpeen, mutta IgY:n puhdistus spesifisemmäksi on vaihtoehtoinen askel.) Näin on mm. tässä tutkimuksessa tarkasteltujen vasta-aineiden laita.
Kuten yleensä, valmisteet on kylmäkuivattu säilyvyyden parantamiseksi.
Puhdistamattomassa valmisteessa on mukana kaikkea muutakin kuin haluttuja vasta- ainemolekyylejä. Veriseerumin ja askitesnesteen muiden komponenttien ohella mukana ovat kaikki eläimen sillä hetkellä tuottamat vasta-aineet. Ei-haluttuja vasta-aineita on suhteellisesti enemmän antiseerumissa kuin monoklonaalista vasta-ainetta sisältävässä askiteksessa (Boenisch 2009). Mikäli tuotantoon on käytetty soluviljelmää, mukana ei ole ylimääräisiä vasta-aineita.
Jotta muut komponentit haittaisivat tutkimusta, niiden pitäisi joko estää vasta-aineen tarttumista kohteeseensa, tai aiheuttaa väärää signaalia. Ensimmäistä asiaa ei ilmeisesti ole havaittu tapahtuvan. Tämä on myös loogista, koska olisi elimistön toiminnan kannalta epätarkoituksenmukaista, että se tuottaisi molekyylejä, jotka haittaisivat vasta-aineiden toimintaa. (Toisaalta, jos tuotantojärjestelminä aletaan käyttää muita kuin eläinsoluja, ei tämä ehkä ole enää niin ilmeistä.) Jälkimmäinen edellyttäisi sitä, että näytteessä olisi ei-haluttuja vasta-aineita, jotka löytäisivät tutkittavasta näytteestä sopivia epitooppeja.
Tämä vaara on merkittävämpi polyklonaalisten valmisteiden kohdalla. Sitä voidaan torjua estämällä eläintä joutumasta kosketuksiin sellaisten antigeenien kanssa, joita on tutkittavassa näytteessä. Tätä on mahdollista toteuttaa pitkälle kasvatettaessa laboratorioeläimiä, joiden ympäristö yleensä on yksipuolinen ja tiukasti kontrolloitu. Toisaalta, tutkittavan näytteen molekyyleissä voi sattumalta olla samankaltaisia epitooppeja kuin eläimen elinympäristössä, vaikka näillä molekyyleillä ei muuten olisi mitään tekemistä eläimen kohtaamien antigeenien kanssa. Tämä ei kuitenkaan liene erityisen todennäköistä. Joka tapauksessa, onnistuneen immunisaation jälkeen antiseerumissakin haluttua antigeeniä vastaan tuotetun vasta-aineen osuus on verraten suuri (vaikka edustaakin vain pientä osaa kokonais-IgG:stä, Ale Närväsen tiedonanto), koska eläimen sisälle ruiskutettu antigeeni (jonka mukana eläin usein saa immuunireaktiota tehostavaa adjuvanttia) yleensä aiheuttaa voimakkaamman immuunireaktion kuin etupäässä pintaepiteelien kanssa kosketuksiin pääsevät ympäristön antigeenit.
Joka tapauksessa, sen lisäksi, että vasta-aineiden tuotannossa tähdätään spesifisyyteen, myös
vasta-aineita hyödyntävissä immunologisissa tutkimusmenetelmissä käytetään kontrolleja, joiden avulla virheellisen positiivisen tuloksen mahdollisuutta pyritään minimoimaan.
2.1.6. Vasta-aineella paikantaminen biotieteellisessä tutkimuksessa
Fysikaalis-kemiallisilla olosuhteilla on vaikutuksensa niin vasta-aineisiin kuin antigeeneihinkin.
Niinpä erilaisille tutkimuksellisille, diagnostisille ja terapeuttisille menetelmille on omat vasta-ainevalmisteensa. Biotieteellisen tutkimustyön sovellutuksissa vasta-aineen tehtävä on usein auttaa paikallistamaan näytteestä antigeeni. Tällöin vasta-aineeseen saadaan jotain kautta liittymään signaalia tuottava komponentti, joka auttaa paikannuksessa. Ennen signaalin paikallistamista ylimääräiset, sitoutumattomat vasta-aineet ja signaalia tuottavat komponentit huuhdellaan pois.
Signaalin tuottamiseen käytetty komponentti vaihtelee jonkin verran sovellutuksen mukaan.
Yksi usein käytetty komponentti on entsyymi, joka saa aikaan jollain tavalla havaittavan signaalin katalysoimansa reaktion kautta.
Entsyymi voidaan liittää Fc-domeeniin kovalentisti suoraan esim. glutaraldehydin avulla.
Entsyymi ja/tai vasta-aine voi kuitenkin menettää tällöin tehoaan. Hellävaraisemmin liitos saadaan aikaan hyödyntämällä biotiinia ja streptavidiinia.
Biotiini tunnetaan myös B7-vitamiinina. Streptavidiini on Streptomyces avidini –bakteerista eristetty proteiini, jolla on neljä biotiinia sitovaa domeenia, joista kukin pystyy sitomaan yhden biotiinimolekyylin (Polak ja van Noorden 1987).
Streptavidiini on yksi avidiiniperheen proteiineista, joita esiintyy myös muissa eliöissä.
Toinen immunologiassa yleisesti käytetty avidiini löytyy kananmunan valkuaisesta. Kaikki tunnetut avidiiniproteiinit sitovat biotiinimolekyylejä hyvin lujasti. Streptavidiinin etu kananmunan avidiiniin nähden on, ettei sillä ole sähköistä varausta eikä hiilihydraattiryhmiä.
Varauksettomuuden ansiosta se ei sitoudu epäspesifisesti sähköstaattisilla vuorovaikutuksilla, eivätkä näytteen lektiiniproteiinit pysty sitoutumaan streptavidiiniin hiilihydraattiryhmien puuttuessa.
Biotinyloimalla vasta-aineen häntä siihen saadaan sitoutumaan avidiinimolekyylejä (joiden kaikkia biotiininsidontapaikkoja ei ole täytetty), joihin on konjugoitu entsyymejä.
Biotinyloituun häntään mahtuu kiinnittymään useita avidiineja, ja biotiini-avidiinimenetelmällä on yleensä saavutettu parempi herkkyys kuin glutaraldehydikiinnityksellä. Avidiinin ja biotiinin
kompleksoitumista hyödyntäviä menetelmiä kutsutaan ABC-menetelmiksi (Avidin-Biotin Complex).
Osassa menetelmiä käytetään paikannukseen entsyymien sijasta fluorokromeja eli fluorensoivia yhdisteitä. Niistä ainakin FITC (Fluorescein IsoThioCyanate) kiinnittyy vasta-aineeseen emäksisissä olosuhteissa ilman muita reagensseja (mekanismina on FITCin tapauksessa tioureasidoksen muodostuminen vasta-aineiden primaaristen amiinien kanssa).
Signaalia tuottavaa komponenttia ei yleisesti liitetä suoraan siihen vasta-aineeseen, joka liittyy paikallistettavaan antigeeniin, eli primaarivasta-aineeseen. Sen signaalia tuottava komponentti liitetään yleisimmin sekundaarivasta-aineeseen, joka löytää primaarivasta-aineen Fc-domeenin.
Tällä tavalla leimatun sekundaarivasta-aineen käyttöä kutsutaan epäsuoraksi menetelmäksi (ks.
kuva 8, kohta (b) 1, jossa yksinkertainen esimerkki).
Immunohistokemiassa (kudosten mikroskooppinen tutkimus, jossa kiinnostuksen kohteena oleva antigeeni paikallistetaan vasta-aineella) on ollut myös käytössä kolmikerroksinen PAP-menetelmä (Peroxidase Anti-Peroxidase käytetyn entsyymin mukaan, ks. kuva 8, kohta (b) 2). Siinä sekundaarivasta-aine tarttuu toisella antigeeninsidontadomeenillaan primaarivasta-aineeseen, toisella tertiäärivasta-aineeseen. Primaari- ja tertiäärivasta-aine ovat siis samasta ja sekundaarivasta-aine toisesta lajista. Tertiäärivasta-aine sitoo entsyymin.
Avidiini-biotiinimenetelmä on yksinkertaisempana kuitenkin melko pitkälti syrjäyttänyt PAP- menetelmän.
Epäsuoran menetelmän käytölle on kaksi perustetta, joista molempiin liittyy kustannusten vähentäminen. Ensinnäkin, jos leima liitettäisiin suoraan primaarivasta-aineeseen, leima tai biotiiniryhmät pitäisi liittää kaikkiin erilaisiin primaarivasta-aineisiin. Käytettäessä sekundaarivasta-ainetta täytyy käsitellä pienempi joukko erilaisia vasta-aineita. Esimerkiksi hiiren IgG-vasta-aineen vasta-ainetta (sekundaarivasta-aine) voi käyttää kaikkien hiiren IgG- vasta-aineiden (primaarivasta-aine) kanssa.
Toiseksi epäsuora menetelmä on herkempi kuin suora. Primaarivasta-aine on symmetrinen molekyyli, jolla on kaksi kappaletta kutakin epitooppia. Niinpä monoklonaalisen sekundaarivasta-aineen käyttö kaksinkertaistaa signaalin. Polyklonaalinen sekundaarivasta- aine kasvattaa signaalia vielä enemmän. Herkkyyden takia epäsuorissa menetelmissä voidaan käyttää pienempiä primaarivasta-ainekonsentraatioita kuin suorassa menetelmässä.
2.2. Vasta-aineita hyödyntäviä molekyylibiologisia menetelmiä
2.2.1. ELISA
ELISA-menetelmää käytetään näytteessä esiintyvän antigeenin tai vasta-aineen määrän mittaamiseen (Paulie ym. 2006). ELISAn yleisimmin käytetty muoto on nk. ”sandwich” (kuva 6; ks. myös Abbas ym 2010, s. 526). Sandwichiä käytetään yleisimmin jonkin antigeenin määrittämiseen. Tällöin kuoppalevyn kuoppaan kiinnitetään tutkittavalle antigeenille spesifistä monoklonaalista vasta-ainetta vakioitu määrä niin, että antigeeniensidontadomeeneja jää vapaaksi. Sitten tutkittavaa näytettä pipetoidaan kuoppaan. (Vaihtoehtoisesti kyse voi olla pohjaan kiinnitettävän vasta-aineen detektoinnista, jolloin antigeenin määrä on tunnettu.) Näytteen sisältämät antigeenimolekyylit tarttuvat vasta-ainemolekyylien antigeeninsidontadomeeneihin.
Seuraavaksi kuoppaan lisätään toista kyseiselle antigeenille spesifistä mutta toiseen epitooppiin liittyvää monoklonaalista vasta-ainetta, joka myös sitoutuu antigeenimolekyyliin. Joko näiden tai erillisten sekundaarivasta-aineiden Fc-domeeneihin on liitetty tai liittyy entsyymi.
Entsyymi katalysoi reaktion, jossa näytteeseen lisättävä substraatti muuttuu aineeksi, jolla on alkuperäisestä poikkeava absorptiospektri. ELISAsta on olemassa myös mm. fluoresenssiin ja radioaktiivisiin leimoihin perustuvia muunnelmia.
Yleisimmin ELISAssa käytetyt entsyymit ovat emäksinen fosfataasi (alkaline phosphatase), piparjuuriperoksidaasi (horseradish peroxidase) ja β-galaktosidaasi. Ennen entsyymien substraatin lisäystä sitoutumaton entsyymi huuhdotaan pois. Sitten entsyymien aikaansaamasta värjäytymästä voidaan standardien perusteella määrittää spektrofotometrin avulla entsyymien, sitä kautta vasta-ainemolekyylien ja sitä kautta antigeenimolekyylien konsentraatio näytteessä.
Kuva 6. ”Sandwich”-ELISA
1. Pohjustusvasta-ainetta on kiinnitetty kuopan pohjalle. 2. Kuoppaan lisätään tutkittavaa näytettä, jonka antigeenistä osa tarttuu vasta-aineisiin. 3. Ylimääräinen antigeeni on huuhdottu pois. 4. Kuoppaan on lisätty vasta-ainetta, johon on liitetty tai liittyy entsyymejä. Ylimääräisen entsyymilinkatun vasta-aineen poishuuhtelu on tässä ohitettu. Yleistä myös on, ettei entsyymejä liitetä suoraan näihin vasta-aineisiin, vaan käytetään vielä sekundaarivasta-ainekerrosta. 5.
Entsyymit tuottavat liuokseen väriainetta substraattien lisäyksen jälkeen.
1 2 3 4 5
Sandwichin lisäksi ELISAsta on muita variantteja, joista kuvassa 7 on esitelty epäsuoraa ELISA-menetelmää (Thermo Fisher Scientific 2013). Suora menetelmä on muuten samanlainen, mutta entsyymi on linkattuna ensimmäiseen vasta-ainekerrokseen. Epäsuora menetelmä, jossa käytetään sekundaarivasta-ainetta, on näistä kahdesta yleisempi (kohdassa 2.1.6 käsitellyistä syistä). Menetelmää voidaan käyttää näytteen sisältämän antigeenin osoitukseen, jolloin näytettä kiinnitetään epäspesifisesti pohjaan. Vaihtoehtoisesti voidaan määrittää liuoksessa olevaa vasta-ainetta, jolloin tutkittava vasta-aine on ensimmäinen vasta-ainekerros. Näin tehtiin tässä tutkimuksessa.
2.2.2. Western blot
Western blotissa näytteen proteiinit erotellaan ensin polyakryyliamidigeelielektroforeesilla eli PAGE:lla (Boyer 2000). Proteiinit voivat olla natiivikonformaatiossa, jolloin muutkin tekijät kuin molekyylipaino vaikuttavat proteiinien geelille sijoittumiseen, tai ne voidaan denaturoida ja varata negatiivisesti SDS:n (Sodium Dodecyl Sulfate) avulla (SDS-PAGE).
Natiivikonformaatiossa olevat proteiinit voidaan erotella geelille isoelektrisen fokusoinnin avulla. Isoelektrisessa fokusoinnissa geelille aikaansaadaan pH-gradientti. Geeliin kohdistettu sähkökenttä saa proteiinit liikkumaan, kunnes ne osuvat pH-alueelle, jolla niiden kokonaisvaraus on neutraali; tätä kohtaa geelillä kutsutaan isoelektriseksi pisteeksi.
SDS on negatiivisesti varautunut yhdiste, joka päällystää proteiinit ei-kovalenttisesti. Kun myös huolehditaan proteiineissa mahdollisesti esiintyvien, tertiäärirakennetta ylläpitävien disulfidisidosten poistamisesta pelkistämällä ne esim. merkaptoetanolin avulla, SDS saa
1 2 3 4 5
Kuva 7. Epäsuora ELISA
1. Antigeeniä on kiinnitetty kuopan pohjalle. 2. Kuoppaan lisätään vasta-ainetta, josta osa tarttuu antigeeniin. 3. Ylimääräinen vasta-aine on huuhdottu pois. 4. Kuoppaan on lisätty sekundaarivasta-aineet, joihin on liitetty tai liittyy entsyymejä. Ylimääräisen sekundaarivasta- aineen poishuuhtelu on tässä ohitettu. 5. Entsyymit tuottavat liuokseen väriainetta substraattien lisäyksen jälkeen. Piirros tehty Wikimedia Commonsin kuvan pohjalta, jonka on tehnyt nimimerkki Cawang.
proteiinit oikenemaan polypeptidiketjuiksi, niin että sekundaari-, tertiääri ja kvartäärirakenteet häviävät. SDS myös tekee proteiinien väliset luontaiset varauserot merkityksettömiksi.
Proteiinien liike sähkökentässä perustuu SDS:n varaukseen, ja pidemmät polypeptidiketjut liikkuvat geelissä hitaammin. Tällöin proteiinit asettuvat geelille molekyylipainonsa mukaiseen järjestykseen. Molekyylipainoja voidaan arvioida ajamalla samoissa olosuhteissa molekyylejä joiden molekyylipainot tunnetaan, ja tarkastelemalla näiden kulkemia matkoja (”ladder”).
Koeasetelmassa on otettava huomioon, että ei-kovalentisti tai disulfidisidoksin (mikäli nämä poistetaan) toisiinsa kiinnittyvät alayksiköt irtoavat toisistaan, ja päätyvät geelille eri kohtiin, mikäli niillä on eri molekyylipainot.
SDS:ää hyödynnettäessä valmistetaan usein erikseen ylä- ja alageeli. Geeliliuskat ovat toimivassa kokoonpanossa pystyssä ja ylägeeli alageelin yläpuolella. Ylägeelin (stacking gel) polyakryyliamidi on harvempaa, ja siinä on matalampi pH ja erilainen ionikoostumus kuin alageelissä (resolving gelissä). Ylägeeliin valetaan kaivot, joihin proteiinit pipetoidaan.
Kaivojen välinen geeli estää näytteiden sekoittumista toisiinsa. Elektroforeesin käynnistyttyä proteiinit kuitenkin siirtyvät ylägeelissä nopeasti ylä- ja alageelin väliselle rajapinnalle, jonne proteiinit keskittyvät vaakasuuntaisiksi muodostelmiksi samalle lähtöviivalle. Erottelu tapahtuu alageelissä, jonka tiheämpi polyakryyliamidi vastustaa molekyylien kulkua enemmän. Ns.
gradienttigeeliä käytettäessä erillistä ylägeeliä ei tarvita.
Elektroforeesin jälkeen proteiinit siirretään geelistä kalvolle, jossa proteiinit säilyvät kuivumisen jälkeen hyvin, ja josta niitä voidaan paikallistaa vasta-aineiden avulla. Kalvomateriaalina käytetään joko nitroselluloosaa, PVDF:ää (polyvinyylidifluoridia) tai nylonia, joista kullakin on hyvät ja huonot puolensa, ja joista nitroselluloosaa käytetään yleisimmin. Tässä tutkimuksessa käytettiin PVDF:ää. Käytetyt kalvot sitovat proteiineja epäspesifisesti vesipakoisuuteen perustuen (Boyer 2000, s. 322). Proteiinit siirretään geelistä kalvolle kapillaari-ilmiön tai yleisimmin sähkökentän avulla. Kapillaari-ilmiötä voidaan käyttää, jos ei käytetä SDS:ää; jos SDS on käytössä, käytetään sähkökenttää, jolloin vaihe sujuu nopeammin.
Molekyylipaino ja isoelektrinen piste ovat proteiinien ominaisuuksia, joita voidaan hyödyntää niiden tunnistamisessa. Reaktiivisuus tietyn vasta-aineen kanssa on kolmas ominaisuus.
Yhdistämällä molekyylipaino tai isoelektrinen piste immunologiseen tunnistukseen saadaan pienennettyä virheellisen positiivisen tuloksen todennäköisyyttä. Western blot siis itsessään sisältää jonkinasteisen kontrollin vasta-aineen spesifisyydelle.
Jotta kalvosta voitaisiin luodata vasta-aineella tiettyä proteiinia, kalvon polymeerejä täytyy estää sitomasta lisää proteiineja, joita vasta-aineetkin ovat. Tämä onnistuu käsittelemällä kalvo proteiininsiirron jälkeen jollain valmisteella, joka sitoutuu polymeereihin vieden näin epäspesifiset sitoutumispaikat vasta-aineilta. Tähän käytetään naudan veren albumiinia (bovine
serum albumin, BSA) tai rasvatonta maitojauhetta, joka sisältää paljon erilaisia proteiineja.
Tämän käsittelyn jälkeen kalvoa inkuboidaan primaarivasta-aineen kanssa. Pesun (joka poistaa sitoutumattomat vasta-ainemolekyylit) jälkeen kalvoa inkuboidaan sekundaarivasta-aineen kanssa.
Western blotissa on perinteisesti visualisoitu proteiinin sijainti kalvolla hyödyntämällä värillisiä saostumia tuottavia reaktioita. Tällaisia saadaan aikaan esim. piparjuuriperoksidaasi- entsyymin avulla sopivia substraatteja käyttäen. Myös autoradiografisia menetelmiä, joissa vasta-aine leimataan radioaktiivisella isotoopilla, on käytetty. Muiden menetelmien kehityttyä autoradiografiasta on melko pitkälti luovuttu, sillä sen käyttämistä monimutkaistavat säteilyturvallisuusnäkökohdat.
Uudempi ja väriä tuottavia menetelmiä paljon, jopa tuhat kertaa, herkempi tapa signaalin tuottamiseen on peroksidaasin katalysoima kemiluminenssi (Boyer 2000, s. 324).
Kemiluminesenssia hyödynnettiin tämänkin tutkimuksen Western blotissa. Tässä tutkimuksessa käytetty kemiluminesenssin muoto on seuraavanlainen (Miura ym. 1998). Immuunikomplekseihin kiinnittynyt piparjuuriperoksidaasi katalysoi reaktion, jossa vetyperoksidi hapettaa luminolin.
Luminolista hapettunut yhdiste muokkautuu edelleen reaktiossa jodofenolin kanssa, minkä jälkeen siitä irtoaa 3-aminoftalaatti-ioni ja valoa, jota emittoituu voimakkaimmin 5 – 20 min siitä, kun reagenssit on saatettu yhteen.
Vaihtoehtoisesti sekundaarivasta-aineeseen voidaan liittää fluorokromeja ja saada signaali niiden fluoresenssista. Menetelmän herkkyys on perinteisesti ollut pienempi kuin kemiluminesenssin, mutta signaalin vahvuus on lineaarisemmassa suhteessa proteiinin määrään. Valmistaja Licor kertoo verkkosivuillaan uuden near infrared fluorescence –kuvantamismenetelmän pärjäävän kemiluminesenssille herkkyytensäkin puolesta. Fluorokromien käytön ongelmana on tiettyjen biomolekyylien autofluoresenssi, joka antaa taustaa.
Natiivi-Westernin avulla on mahdollista arvioida vasta-aineen spesifisyyttä sovellutuksissa, joissa proteiinin natiivimuoto säilyy. Vasta-aineen oikea toiminta voidaan kontrolloida sen tunnistaman proteiinin isoelektrisen pisteen perusteella. Koska SDS-western denaturoi näytteen proteiinit, sen antamat tulokset vasta-aineen spesifisyydestä eivät ole yleistettävissä muihin olosuhteisiin.
On hyvä varmistaa, aiheuttaako Western blotissa käytetty sekundaarivasta-aine epäspesifistä signaalia. Tämä saadaan selville tekemällä koe ilman primaarivasta-ainetta. Jos tällöin ilmenee vyöhykkeitä, niiden takana on sekundaarivasta-aineen sitoutuminen näytteessä oleviin proteiineihin. Voimakas tausta kertoo luultavasti sekundaarivasta-aineen sitoutumisesta kalvon
polymeereihin, jolloin sen blokkaus BSA:lla tai maitoproteiinilla ei ole onnistunut täydellisesti.
2.3. Immunohistokemialliset menetelmät
Immunohistokemian (Kroese 2001, Naish 1989) avulla voidaan saada näkyviin, missä osissa mikroskopoitavaa kudosleikettä on tiettyjä antigeenejä. Immunohistokemian tutkimuskohteena ovat kudosnäytteet, joissa kudoksen organisaatio on säilynyt, toisin kuin immunosytokemiassa.
Immunosytokemiassa solut ovat viljeltyjä, tai näytteestä on tarkoituksellisesti poistettu muita komponentteja, tai solut on otettu tutkittavasta eliöstä tavalla, joka poistaa kudoksen luontaisen organisaation. Molemmissa menetelmissä voidaan havainnoida, miten tutkittava molekyyli lokalisoituu solunsisäisesti. Kuten edellisetkin menetelmät, immunohistokemia perustuu signaalia tuottavan leiman ja antigeenin löytävän vasta-aineen yhdistämiseen toisiinsa.
Immunohistokemialliseen protokollaan vaikuttaa paljon se, minkä tyyppistä kudosta tutkitaan.
2.3.1. Menetelmien perusteoria
Kudoksesta höylätään leikkeitä mikrotomilla, joka on kiskojen varassa liikkuva, hyvin terävä terä. Kudoksesta voi leikata ohuempia leikkeitä, jos sen jäykistää ensin korvaamalla veden parafiinilla tai jäädyttämällä. Tässä tutkimuksessa käytettiin suhteellisen paksuja (50 μm) leikkeitä, joten jäykistämiseen ei ollut tarvetta. Värjäyksen aikana näytteet voivat olla kiinni objektiivilasissa tai kellua vapaina nesteessä. Jälkimmäinen vapaaksi kelluvien leikkeiden tekniikaksi kutsuttu menetelmä mahdollistaa reagenssien tunkeutumisen leikkeeseen sen molemmilta puolilta, mikä on hyödyllistä käytettäessä suhteellisen paksuja leikkeitä. Niinpä menetelmää käytettiin tässä tutkimuksessa.
Primaarinen, sekundaarinen tai tertiäärinen vasta-aine merkitään niin, että syntyy mikroskoopilla näkyvä signaali (kuva 8). Lisäksi on kehitetty menetelmiä, joissa leima ei liity vasta-aineeseen, vaan polymeeriin, johon on kiinnitetty vasta-aineita.
2.3.2. Leimat ja signaalin havaitseminen
Immunohistokemiassa käytetään leimoina entsyymejä, fluorokromeja tai kultapartikkeleita.
Entsyymin tapauksessa signaali perustuu entsyymin katalysoimaan värjäävään reaktioon, jonka lopputulosta tarkastellaan tavallisella valomikroskoopilla. Fluorokromien rakenteet taas synnyttävät fluoresenssia, jonka näkemiseen tarvitaan fluoresenssi- tai konfokaalimikroskooppi.
1. Leima kiinnitetty suoraan
sekundaarivasta-aineeseen 2. Entsyymi-antientsyymi, esim.
peroksidaasi-antiperoksidaasi (PAP)
3. Avidiini-biotiinimenetelmät (i) Leimattu avidiini (Labelled
Avidin eli LAB), kaksi askelta Leimattu avidiini-biotiinikompleksi
(Avidin-Biotin Complex eli ABC)
4. Polymeeripohjainen, esim. EnVision
(ii) LAB, kolme askelta
Primaari-
vasta-aine Kudosantigeeni
Polymeerirunko Avidiini Biotiini Sekundaari-
vasta-aine
Leima Vasta-aineen sisältämä epitooppi
Kuva 8. Immunohistokemiallisen värjäyksen menetelmät.
Leima voidaan kiinnittää vasta-aineeseen suoraan tai se voi olla siinä kiinni polymeerirangan välityksellä (vähemmän yleistä). Kuva muokattu lähteessä Kroese 2001 olevasta kuvasta Elsevierin luvalla.
1. Leima primaarivasta-aineessa
(a) Suora immunohistokemiallinen värjäys
(b) Epäsuora immunohistokemiallinen värjäys
2. Enhanced Polymer One-Step (EPOS) -systeemi
