4. MATERIAALIT JA MENETELMÄT 1. Materiaalit
5.3 Immunohistokemiallisen värjäyksen tulokset
Kuvassa 13 on merkitty rotan aivoleikkeeseen ne anatomiset termit, joita käytetään seuraavassa immunohistokemiallisten värjäystulosten tarkastelussa. Negatiivikontrollit eivät antaneet värjäytyvyyttä. Kun tarkastellaan yleisesti aivojen makroanatomista tasoa (kuva 14), voidaan todeta seuraavaa. Puhdistuksesta saatu epäpuhtausfraktio tuottaa melko tasaisen värjäystuloksen
ilman suuria kontrastieroja. Alkuperäinen kalretiniinin antiseerumi ja puhdistuksesta saatu spesifinen fraktio värjäävät leikkeen aika lailla samoin, mutta puhdistetun fraktion kontrasti on hieman parempi. Kontrastieroa voi aiheuttaa myös ero vasta-ainekonsentraatiossa.
Vaalea aine, johon kuuluvat mm. aivokurkiainen (aivopuolikot toisiinsa liittävä hermosyykimppu), cingulum (cingulate gyruksen ja entorinaalisen aivokuoren liittävä kimppu) ja fimbria (hippokampusta muuhun limbiseen järjestelmään yhdistävä kimppu), värjäytyy kaikilla fraktioilla harmaata heikommin, mutta ero on epäpuhtausfraktiolla pienempi.
Alkuperäinen kalretiniinin antiseerumi ja spesifinen fraktio molemmat värjäävät mediaalisesta aivokuoresta syvällä sijaitsevan alueen, jonka arvioidaan olevan mantelitumake eli amygdala.
ABA (Allen Brain Atlas) näyttää samaa. Aivokuoren ulkorajapinta värjäytyy kaikilla fraktioilla melko vahvasti - koska vastaavaa ei näy ABA:ssa, kyseessä voi olla artefakta.
Talamuksesta värjäytyy alkuperäisellä ja spesifisellä fraktiolla vahvimmin dorsaali- ja lateraalirajapinta. Vastaavaa ei näy epäspesifisellä fraktiolla, mutta ei toisaalta ABA:ssakaan.
Hypotalamuksen rajapinta talamuksen ja keskiaivojen kanssa sekä kolmannen aivokammion ympäristö värjäytyvät vahvasti alkuperäisellä ja spesifisellä, epäspesifisellä vastaavaa valikoivuutta ei ole. ABA vahvistaa tämän tuloksen.
Hippokampus (kuvat 15 ja 16) värjäytyy epäspesifisellä fraktiolla suunnilleen yhtä vahvasti kuin neokorteksi ja talamus; alkuperäinen ja spesifinen värjäävät hippokampuksen ja dorsaalisen neokorteksin hailakammin. Voimakkaimmin alkuperäinen ja spesifinen värjäävät pihtipoimun jyvässolukerroksen reunat, spesifinen fraktio jonkin verran vahvemmin. Pyramidaalisolukerros kohdissa alueilla CA1 (Cornu Ammonis) ja CA2 värjäytyy näillä myös, spesifisellä fraktiolla alkuperäistä vahvemmin. CA3:n pyramidaalisolukerros puolestaan värjäytyy molemmilla heikommin. ABA:ssa hippokampus visualisoituu samaan tapaan.
Epäpuhtausfraktio värjää hippokampuksen tasaisemmin. Pihtipoimun jyvässolualueen reunat ja CA1:n, CA2:n ja CA3:n pyramidaalisolukerrokset värjäytyvät kaikki ympäristöään vahvemmin, keskenään suunnilleen yhtä vahvasti.
Hippokampuksen 120x-suurennustakin tarkasteltaessa alkuperäisen ja puhdistetun kalretiniinin antiseerumin värjäysjälki näyttää melko samanlaiselta (kuva 16). Ne ovat molemmat värjänneet hippokampuksesta neuroneita, jotka vaikuttaisivat olevan morfologisesti samaa tyyppiä.
Epäpuhtausfraktiolla tulee esiin pieniä pallosia ja pitkulaisia vaaleita alueita. Ensimmäiset lienevät solujen soomia ja jälkimmäiset myelinoituja hermosyitä.
Kuva 13. Rotan koronaalinen aivoleike, Nissl-värjäys
Anatominen referenssi. Merkinnät ovat suuntaa-antavia. Muokattu www.brainmaps.org -kuvasta.
hippokampus
pihtipoimun jyvässolukerros
CA3:n
pyramidaali-solukerros CA2:n pyramidaali-solukerros
CA1:n pyramidaali-solukerros
fimbria aivokurkiainen
neokorteksi
mantelitumake
3. aivokammio cingulum
hypotalamus keskiaivoa
talamus
A.
Kuva 14. Aivojen koronaalileikkeitä
A - C rotasta, 10x-suurennos. A on värjätty alkuperäisellä anti-kalretiniinilla, B puhdistuksesta jääneillä epäpuhtauksilla ja C puhdistuksesta saadulla spesifisellä fraktiolla. Viivaimen pituus 1 mm. D on hiiren aivojen ISH (ei mittakaavassa) Allen Brain Atlaksesta.
B.
C. D.
A.
B.
C.
D.
Kuva 15. Suurennos hippokampuksesta
Leikkeet samat kuin edellä. Suurennos rotan leikkeillä A - C on 50x. A värjätty alkupe räisellä anti-kalreti-niinilla, B epäpuhtauksilla ja C spesifisellä fraktiolla. Viivaimen pituus 1 mm. D hiiren ISH Allen Brain Atlaksesta (ei mittakaavassa).
Kuva 16. 120x-suurennos hippokampuksesta Aakkostus kuten edellä, viivaimen pituus 1 mm.
A.
B.
C.
6. POHDINTA
Ennen tutkimuksiin ryhtymistä etsittiin tuote-esitteistä tietoja siitä, miten tutkittavien immunohistokemiassa käytettävien vasta-aineiden spesifisyyttä oli testattu. Kaikissa esitteissä viitattiin julkaistuihin tutkimuksiin, joissa vasta-aineita oli käytetty. Tutkimuksista monet olivat kuitenkin sen verran vanhoja, ettei niihin päässyt tietokantojen kautta käsiksi. Lisäksi se, että vasta-ainetta on käytetty jossain julkaistussa tutkimuksessa, ei toki vielä osoita, että vasta-aine on spesifinen, joskin sen, että tuloksia ei ole myöhemmin todettu virheelliseksi, voinee katsoa puhuvan spesifisyyden puolesta.
Osassa esitteistä kerrottiin myös jotain spesifisyyden testaamisesta. Milliporen somatostatiinin vasta-aineen esitteessä kerrotaan, että vasta-aine ei ristiinreagoi enkefaliinien, muiden endorfiinien, substanssi P:n eikä CGRP:n (calcitonin gene-related peptiden) kanssa. Osaan somatostatiinin fragmenteista vasta-aine oli reagoinut. Valmistajan web-sivujen mukaan haimasta ja aivoista on onnistuneesti havaittu somatostatiinia sisältäviä rakenteita.
Milliporen DBH:n vasta-aineesta kerrotaan valmistajan web-sivuilla, että värjättäessä rotan selkäydintä tällä vasta-aineella värjääntyvät eniten spinaaligangliot (englanniksi dorsal root ganglion), missä DBH:ta kuuluu ollakin.
SWANTin kalbindiini D28:n vasta-aineen spesifisyyttä ja affiniteettia on tuote-esitteen mukaan arvioitu immunohistokemiallisesti, immunoblotein ja radioimmunoanalyysillä (englanniksi radioimmunoassay). Vasta-aineen todetaan reagoivan kudoksessa spesifisesti. Lisäksi löytyy maininta, ettei se ristiinreagoi kalretiniinin tai muiden kalsiumia sitovien proteiinien kanssa.
Vasta-aineen kerrotaan antavan molekyylipainon ja isoelektrisen pisteen perusteella spesifisen signaalin 2D-elektroforeesissa. 2D-elektroforeesissa käytetään denaturoivaa SDS:ää, ja vasta-aine vaikuttaisi toimineen melko spesifisesti myös tämän gradun yhteydessä tehdyssä SDS-Westernissä. Radioimmunoanalyysistä on saatu herkkyydelle tulokseksi 10 ng/assay ja affiniteetille 1.6 x 1012 L/M.
SWANTin kalretiniinin vasta-aineen spesifisyyttä ja tehoa (“potency”) on esitteen mukaan arvioitu immunohistokemian ja immunoblottauksen keinoin. SWANTin parvalbumiinin vasta-aineen esitteessä ei selosteta, miten laatu on varmistettu.
Milliporen ja SWANTin asiakaspalveluun oltiin yhteydessä. Tiedustelujen antama lisätieto oli, että kaikki SWANTin vasta-aineet (myös parvalbumiinin) on kontrolloitu immunohistokemialla ja SDS-Westernillä. Referenssiartikkelien hankkimisessa asiakaspalvelut eivät pystyneet auttamaan.
Näiden selvittelyjen jälkeen tuli päättää, millä keinoilla spesifisyyttä kontrolloitaisiin tässä tutkimuksessa. Sopivia vaihtoehtoisia vasta-ainevalmisteita oli tarjolla huonosti, joten spesifisyyden kontrollointiin etsittiin muita keinoja. Yliopiston tutkijoille esitettiin tiedusteluja siitä, voisivatko he auttaa in situ –hybridisaation teossa. Vastausten perusteella tämä olisi luultavasti onnistunut. Sopivan in situ –hybridisaatioprotokollan löytäminen olisi mahdollisesti vaatinut jonkin verran hakemista; mistään aivan pienitöisestä hommasta ei ehkä olisi ollut kyse.
Ohjaajien kanssa päädyttiin siihen, että in situ –hybridisaatio mahdollisesti tehtäisiin helpommin toteutettavissa olevien tutkimusten jälkeen, mikäli tarvetta lisätutkimukselle vielä koettaisiin.
Yhtenä mahdollisuutena mieleen tuli Western blot, joka on suhteellisen yksinkertainen ja edullinen menetelmä. Valmistajat olivat tätä menetelmää käyttäneetkin, mutta voisihan tutkimuksen toistaa, ja näin tehtiin. Vasta jälkeenpäin mieleen tuli, että proteiinien erottelun olisi voinut yrittää tehdä isoelektrisen pisteen perusteella, jolloin proteiinien denaturoituminen olisi ehkä voitu välttää, ja blottauksesta saatava tieto olisi voinut olla sovelluskelpoisempaa. Toki on mahdollista, että tällaisessakin menetelmässä tapahtuisi denaturoitumista; ainakin proteiinit joutuisivat siinä vaihteleville pH-vyöhykkeille. Esim. siirrostuspuskuri, jossa proteiinit ovat immunoblottauskalvolle siirron aikana, saattaisi myös olla denaturoiva. Tiedonhakuyritysten perusteella IEF-Western on olemassa oleva menetelmä. Siitä vaikuttaa kuitenkin olevan saatavilla tietoa melko niukasti (yliopistollemme avoimien tietokantojen kautta artikkeleihin ei päässyt käsiksi), eikä sitä ilmeisesti ainakaan vakiintuneesti käytetä spesifisyystutkimuksiin.
Joka tapauksessa mahdollisuutta ei tullut mieleen selvittää suunnitteluvaiheessa, ja niinpä päädyttiin SDS-Westernin pariin, joka on hyvin laajassa käytössä.
Tulosten perusteella todettiin, että käytetyt primaarivasta-aineet toimivat SDS-Westernissä melko epäspesifisesti. Kaikki vasta-aineet eivät mahdollisesti edes löytäneet epitooppiaan.
Signaali oikealla kohdalla molekyylipainoladderin suhteen ei tietysti sekään välttämättä johdu antigeeniproteiiniin sitoutumisesta, voivathan kahden tai useamman eri proteiinin molekyylipainot olla melko lähellä toisiaan. Antigeeniproteiiniinkin sitoutuminen voi denaturoivissa oloissa tapahtua jonkin muun kuin alkuperäisen epitoopin perusteella, mikä vähentäisi vertailukelpoisuutta. Mitä epäspesifisempi tulos on (useita signaalivyöhykkeitä, joista mikään ei ole merkittävästi muita vahvempi), sitä todennäköisempää on, että oikeallakin kohtaa molekyylipainoasteikkoa oleva signaali on syntynyt epäspesifisesti.
Western blotissa paras signaali-taustasuhde vaikuttaisi olevan kalbindiini D28:n vasta-aineella, joka on monoklonaalinen. Seuraavana tulee kalretiniinin vasta-aine, joka on polyklonaalinen.
Lopuilla vasta-aineilla signaali-taustasuhde on niin matala, että spesifisyydestä SDS-Westernin oloissa tuskin voi puhua.
Jotta natiivimuotoista proteiinia vastaan tuotettu vasta-ainemolekyyli voisi tunnistaa SDS-Westernissä denaturoituneen (oienneen) proteiinin, epitoopin täytyy sijaita peptidisekvenssissä yhtenäisenä ja lineaarisena. Jos näet epitooppi koostuu useammasta ”lenkistä”, jolloin osia epitoopista on peptidisekvenssissä epäjatkuvasti, epitooppi häviää proteiinin denaturoituessa.
Koska polyklonaalinen vasta-aine koostuu eri epitooppeja tunnistavista komponenteista, sen pitäisi monoklonaalista todennäköisemmin tunnistaa myös denaturoituneita proteiineja.
Nimittäin, jos tunnistettavia epitooppeja on useita, on todennäköisempää, että jokin niistä sijoittuu peptidisekvenssiin yhtenäisesti ja lineaarisesti.
Tässä tutkimuksessa SDS-Westernissä spesifisyyden tai signaali-tausta-suhteen ja mono- tai polyklonaalisuuden välillä ei kuitenkaan ollut selkeää suhdetta. Mahdollisesti suuremmalla otoksella erilaisia vasta-ainevalmisteita tällainen suhde olisi voitu havaita – tässä tutkimuksessahan erilaisia vasta-aineita oli viisi.
Western blotien teon jälkeen alettiin miettiä, mitä vasta-aineita affiniteettipuhdistettaisiin jatkotutkimuksia varten. Tätä varten tarvittiin vasta-aineiden antigeenejä. Näitä saattoi olla markkinoilla periaatteessa kahdessa muodossa: alkuperäisestä kudoksesta puhdistettuina tai rekombinanttimuodossa. Näitä ryhdyttiin etsimään yritysten web-sivuilta. Tarjonnan ja hintatason perusteella rajaaminen lopulta jätti jäljelle rekombinantti-kalretiniinin.
Eniten olisi haluttu testata DBH:n vasta-ainetta, koska lehti, johon Riitta Miettisen tutkimusryhmä oli lähettänyt artikkelin, oli edellyttänyt sen spesifisyyden osoittamista. DBH:n affiniteettipuhdistukseen sopivaa proteiinia ei kuitenkaan onnistuttu markkinoilta löytämään.
Tarjolla oli vain osittainen peptidi, joka ei välttämättä olisi sisältänyt vasta-aineen epitooppia.
Lisäksi Milliporen anti-DBH on monoklonaalinen, joten affiniteettipuhdistuksen tuottama hyöty olisi todennäköisesti ollut vähäinen. Mahdollinen epäspesifinen aines luultavasti koostuu askitesnesteen muista vasta-aineista, joiden määrä kuitenkin luultavasti on pieni verrattuna valmisteen pääasialliseen vasta-aineiseen, jota eläimeen istutettu hybridooma tuottaa. Koska kalretiniinin spesifisyyden osoittaminen ei laboratorion kannalta ollut kovin tärkeää, todettiin samalla, ettei kyseisen vasta-aineen spesifisyyttä olisi tarpeen tutkia lisätutkimuksin, kuten in situ –hybridisaatiolla.
Rekombinantti-kalretiniinia löytyi niin rotta- kuin ihmissekvenssisenä. Rottasekvenssinen olisi ollut tutkimuksen kannalta optimaalisempi, koska Riitta Miettisen laboratoriossa vasta-ainetta käytetään rotan kudoksen tutkimiseen, mutta rottasekvenssinen oli huomattavasti
ihmissekvenssistä kalliimpaa. Koska Protein BLASTin1 mukaan rotan2 ja ihmisen3 kalretiniinien identiteetti on 268/271 (98 %), arvioitiin SWANTin valmistaman ihmissekvenssisen ajavan asian. (Kiinnostavana yksityiskohtana voidaan todeta, että SWANTin kalretiniinin antiseerumi on tuotettu rekombinanttia ihmissekvenssistä kalretiniinia vastaan, joka saattaa hyvin olla juuri tämä SWANTin itsensä kauppaama valmiste.)
Seuraavaksi piti selvittää, paljonko rekombinantti-kalretiniinia tarvittaisiin. Ale Närvänen kertoi, että 1 mg olisi hyvä minimi. Kustannussyistä päädyttiin tilaamaan 100 µg, jonka Närvänen arveli vielä toimivan. Loppujen lopuksi putkeen otettiin tästä vain osa (periaatteella ”ei kaikkia munia samaan koriin”), josta siitäkin saatiin sitoutumaan vain osa. ELISAn perusteella puhdistumista kuitenkin tapahtui.
Immunovärjäyksenkin tuloksissa puhdistuksesta saatu spesifiseksi tarkoitettu fraktio värjää rotan aivokudosta samalla lailla kuin alkuperäinen anti-kalretiniini, epäpuhtausfraktion taas värjätessä epäspesifisesti. Alkuperäisen ja spesifiseksi puhdistetun fraktion värjäystulos myös on monessa suhteessa samanlainen kuin Allen Brain Atlaksesta saatu hiiren geeniekspressiodata.
Yksi vasta-aineen testaamiseen sopiva tapa, jota tässä tutkimuksessa ei käytetty, olisi myös se, että vasta-aineella tehtäisiin immunohistokemiallinen värjäys jollekin histologiselle rakenteelle, josta jo tiedetään jotain muuta kautta, minkä osien pitäisi värjääntyä. Millipore on esimerkiksi testannut anti-somatostatiiniaan mm. haimaan, jossa somatostatiinia ilmentäviä soluja ennestään tiedetään olevan kudoksessa tietyllä tavalla organisoituina.
Lopullisena yhteenvetona voidaan todeta seuraavaa. Tutkittujen vasta-aineiden valmistajat eivät ole nähneet tarpeelliseksi affiniteettipuhdistaa kyseisiä tuotteitaan. Tämä prosessi aiheuttaa tietysti lisää kustannuksia ja vaivaa, eikä ole selvää, että siitä yleensä olisi immunohistokemian kannalta suurta hyötyä. Affiniteettipuhdistuksen anti lienee lähinnä, että se voi poistaa polyklonaalisesta seoksesta väärin reagoivia vasta-aineita, jos sellaisia siinä esiintyy. Jos immunisointiin on käytetty puhdasta, natiivimuotoista proteiinia, todennäköisyys tähän ei ehkä kokemuksen perusteella ole erityisen suuri, mutta ei kuitenkaan niin pieni, että se voitaisiin sivuuttaa.
SDS-Western vaikuttaa tulosten perusteella soveltuvan huonosti sen arviointiin, kuinka spesifisesti vasta-aine tunnistaa natiivimuodossa olevia proteiineja. Tämä ei ehkä ole yllättävää, mutta toisaalta valmistajatkin ovat käyttäneet denaturoivaa Western blotia yhtenä keinona vasta-aineiden spesifisyyden kontrollointiin. Isoelektriseen fokusointiin perustuva Western blot 1 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins&PROGRAM=blastp&BLA ST_PROGRAMS=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on
2 gi|1345670|sp|P47728.1|CALB2_RAT
3 gi|109940061|sp|P22676.2|CALB2_HUMAN
sen sijaan voisi olla tämän käyttötarkoituksen kannalta lisätutustumisen arvoinen menetelmä.
Mikäli vasta-aine on monoklonaalinen, ja saatavissa on monoklonaalinen rinnakkaisvalmiste, näiden tuottamien immunohistokemiallisten tulosten vertailu on hyväksyttävä tapa arvioida vasta-aineen spesifisyyttä. Tämän menetelmän etuna on, ettei se vaadi muuta osaamista ja varustusta kuin mitä immunohistokemiallisesta laboratoriosta itsestään löytyy. Olisikin kenties toivottavaa, että immunohistokemiaa varten valmistettaisiin enimmäkseen monoklonaalisia vasta-aineita, ja että rinnakkaistuotteita löytyisi. Monoklonaalisissa vasta-aineissa lisäksi on vähemmän mahdollisia epäspesifisyyden lähteitä kuin polyklonaalisissa.
Muita rinnakkaisia, yleisesti sovellettavissa menetelmiä immunohistokemiallisten tulosten vahvistamiseen ovat lähetti-RNA:n havaitsemiseen perustuvat. In situ –hybridisaatio tuottaa vertailukelpoisen visuaalisen kokonaiskuvan tutkittavasta anatomisesta rakenteesta, kudoksesta tai solutyypistä. In situ –hybridisaation vajavuus tässä käytössä on, että proteiini ja lähetti-RNA eivät kaikissa tapauksissa sijoitu soluun ja/tai kudokseen täysin yhtenevällä tavalla. Jokaista immunohistokemiallista värjäystä ei ole mielekästä lähteä varmistamaan rinnakkaisella in situ –hybridisaatiolla, mutta vasta-ainevalmisteella saatua tulosta jossain yleisluontoisessa värjäyksessä voidaan verrata vastaavaan in situ –hybridisaatioon. Tässä tutkimuksessa immunohistokemiallisen värjäyksen tulosta verrattiin julkaistuihin in situ – hybridisaatiotuloksiin hiiren aivoista. Mahdollisesti vertailukelpoisempia olisivat rotista saadut tulokset, joita ei kuitenkaan onnistuttu saamaan. Toisaalta rotan ja hiiren väliset erot ovat luultavasti keskimäärin pienempiä kuin jommankumman erot ihmiseen, jonka aivojen toiminnasta usein pyritään rakentamaan kuvaa koe-eläimillä toteutettujen tutkimusten pohjalta.
7. LÄHDELUETTELO
1. Science Gateway, 2012: Protein Molecular Weight Calculator. Verkkodokumentti.
Saatavilla: http://www.sciencegateway.org/tools/proteinmw.htm. Viitattu 18.5.2012.
2. Abbas AKR, Lichtman AH & Pillai S, 2010. Cellular and molecular immunology. 6. painos.
566 s. Saunders, Philadelphia.
3. Abcam, 2012. Polyclonal and monoclonal: a comparison. Verkkodokumentti. Saatavilla:
http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&rid=11269&pid=11287. Viitattu 19.5.2012.
4. Allen institute for brain science, 2012. Allen brain atlas. Verkkodokumentti. Saatavilla:
http://www.brain-map.org/.
5. Anderson JR, 1980. Cognitive psychology and its implications. 1. painos. 503 s. W. H.
Freeman and company, San Francisco.
6. Arie B, 2009. Calcium transport in strongly calcifying laying birds: Mechanisms and regulation. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol 152: 447-469.
7. Barker JL ja McKelvy F (toim.), 1983. Current methods in cellular neurobiology. 336 s.
John Wiley & Sons, New York.
8. Bear MF, Connors BW & Paradiso MA, 2007. Neuroscience: exploring the brain. 3. painos.
928 s. Lippincott Williams & Wilkins, Lontoo.
9. Bearzatto B, Servais L, Roussel C, Gall D, Baba-Aïssa F, Schurmans S, de Kerchove d’Exaerde A, Cheron G & Schiffmann SN, 2006. Targeted calretinin expression in granule cells of calretinin-null mice restores normal cerebellar functions. FASEB Journal 20: 380-382.
10. Boenisch T, 2009. Basic Immunohistochemistry. Teoksessa: Kumar GL ja Rudbeck L (toim.), Immunohistochemical staining methods, s. 11-13. 160 s. Dako North America, Carpinteria, Kalifornia.
11. Boyer R, 2000. Modern experimental biochemistry. 3. painos. 475 s. Benjamin/
Cummings, San Francisco.
12. Böcker W ja Buchwalow IB, 2010. Immunohistochemistry: basics and methods. 1. painos.
149 s. Springer.
13. Carter DS, Harrison AJ, Falenski KW, Blair RE & DeLorenzo RJ, 2008. Long-term decrease in calbindin-D28K expression in the hippocampus of epileptic rats following pilocarpine-induced status epilepticus. Epilepsy Res 79: 213-223.
14. Claudia C, Scott M, Panagiotidis A, Wenzel RJ, Nazabal A, & Zenobi R. Characterization of antibody–antigen interactions: Comparison between surface plasmon resonance
measurements and high-mass matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry.
Anal Biochem 375: 35-45.
15. Eriksson PS, Perfilieva E, Björk-Eriksson T, Alborn AM, Nordborg C, Peterson DA &
Gage FH, 1998. Neurogenesis in the adult human hippocampus. Nature Medicine 4: 1313-1317.
16. Fritschy JM, 2008. Is my antibody-staining specific? How to deal with pitfalls of immunohistochemistry. Eur J Neurosci 28: 2365-2370.
17. GE Healthcare, 2009. CNBr-activated Sepharose™ 4B. Käyttöohje. 11 s.
18. Girardeau G, Benchenane K, Wiener S, Buzsáki G, & Zugaro M, 2009. Selective suppression of hippocampal ripples impairs spatial memory. Nature Neuroscience 12: 1222-1223.
19. Hawkins J, 2004. On intelligence. 1. painos. 261 s. Times Books, New York.
20. Huovinen P, Hedman K, Heikkinen T, Järvinen A, Meri S & Vaara M (toim.), 2010.
Mikrobiologia: Mikrobiologia, immunologia ja infektiosairaudet, kirja 1. 736 s. Duodecim, Helsinki.
21. Jouvenceau A, Potier B, Poindessous-Jazat F, Dutar P, Slama A, Epelbaum J & Billard J, 2002. Decrease in calbindin content significantly alters LTP but not NMDA receptor and calcium channel properties. Neuropharmacology 42: 444-458.
22. Kalat J, 2009. Biological psychology. 10. painos. 549 s. Wadsworth, Kanada.
23. Katsetos CM, Jami MM, Krishna L, Jackson R, Patchefsky A S & Cooper HS, 1994.
Novel immunohistochemical localization of 28,000 molecular-weight (Mr) calcium binding protein (calbindin-D28k) in enterochromaffin cells of the human appendix and
neuroendocrine tumors (carcinoids and small-cell carcinomas) of the midgut and foregut.
Arch Pathol Lab Med 118: 633-9.
24. Kimball JW, 2010. Affinity. Verkkodokumentti. Päivitetty 20.12.2010. Saatavilla: http://
users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/A/Affinity.html. Viitattu 19.5.2012.
25. Klausberger T, Marton LF, O’Neill J, Huck JH, Dalezios Y, Fuentealba P, Suen WY, Papp E, Kaneko T, Watanabe M, Csicsvari J & Somogyi P, 2005. Complementary roles of cholecystokinin- and parvalbumin-expressing GABAergic neurons in hippocampal network oscillations. The Journal of Neuroscience 25: 9782 - 9793.
26. Kroese FG, Immunohistochemical detection of tissue and cellular antigens. Teoksessa Encyclopedia of Life Sciences. Verkkodokumentti. Päivitetty 19.4.2001. Saatavilla: www.els.
net. Viitattu 25.9.2007 .2001.
27. Lawrence YA, Kemper TL, Bauman ML & Blatt GJ, 2010. Parvalbumin-, calbindin-, and calretinin-immunoreactive hippocampal interneuron density in autism. Acta Neurol Scand 121: 99-108.
28. Liddell JE, 2005. Production of monoclonal antibodies. Teoksessa Encyclopedia of Life Sciences. Verkkodokumentti. Päivitetty 1.5.2005. Saatavilla: www.els.net. Viitattu 25.9.2007.
29. Lucotte G, 2001. Distribution of the CCR5 gene 32-basepair deletion in West Europe. A hypothesis about the possible dispersion of the mutation by the vikings in historical times.
Hum Immunol 62: 933-936.
30. Miettinen R, Gulyás AI, Baimbridge KG, Jacobowitz DM & Freund TF, 1992. Calretinin is present in non-pyramidal cells of the rat hippocampus—II. Co-existence with other calcium binding proteins and gaba. Neuroscience 48: 29-43.
31. Mistry Dy, 2001. The spatial and temporal expression of calretinin in developing rat molars (Rattus norvegicus). Archives of Oral Biology 46: 973 – 981.
32. Miura K, Tsuchiya T, Nagashima M, Imai C, 1998. Fundamentals of chemiluminescence detection. 8 s. Fuji Photo Film Co, Tokio.
33. Naish S J (toim.), 1989. Immunochemical staining methods. 41 s. DAKO Corporation, Kalifornia.
34. National Center for Biotechnology Information, 2012. Entrez Gene Ontology.
Verkkodokumentti. Saatavilla: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene. Viitattu 19.5.2012.
35. Nelson DL ja Cox MM, 2004. Lehninger Principles of Biochemistry. 4. painos. 1119 s. W.
H. Freeman, New York.
36. Newport J & Nemeroff C, 2003. Neurobiology of posttraumatic stress disorder. Focus 1:
313 - 321.
37. Nyitrai G, Kékesi KA, Emri Z, Szárics É, Juhász G & Kardos J, 2003. GABAB receptor antagonist CGP-36742 enhances somatostatin release in the rat hippocampus in vivo and in vitro. Eur J Pharmacol 478: 111-119.
38. Paulie S, Perlmann H, Perlmann P, 2006. Enzyme-linked immunosorbent assay. Teoksessa Encyclopedia of Life Sciences. Verkkodokumentti. Päivitetty 1.1.2006. Saatavilla: www.els.
net. Viitattu 25.9.2007.
39. Polak JM & van Noorden S, 1987. An introduction to immunocytochemistry: current techniques and problems. 2. painos. Oxford University Press, USA.
40. Prior H, Schwarz A & Güntürkün O, 2008. Mirror-induced behavior in the magpie (Pica pica): evidence of self-recognition. PLoS Biol 6: 1642-1650.
41. Rhodes KJ & Trimmer JS, 2006. Antibodies as valuable neuroscience research tools versus reagents of mass distraction. The Journal of Neuroscience 26: 8017.
42. Rush R & Geffen L, 1980. Dopamine beta-hydroxylase in health and disease. Crit Rev Clin Lab Sci 12: 241-277.
43. Squire LR, Berg D, Bloom F, du Lac S & Ghosh A, 2008. Fundamental neuroscience. 3.
painos. 1256 s. Academic Press, Kanada.
44. Taylor Hy, 1999. Phytoestrogens alter hypothalamic calbindin-D28k levels during prenatal development. Developmental Brain Research 114: 277-281.
45. Tini M, Jewell UR, Camenisch G, Chilov D & Gassmann M, 2002. Generation and
application of chicken egg-yolk antibodies. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol 131:
569-574.
46. Thermo Fisher Scientific, 2013. Overview of ELISA. Verkkodokumentti. Saatavilla:
http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=F88ADEC9-1B43-4585-922E-836FE09D8403.
Viitattu 16.3.2013.
47. Vongvatcharanon Uy, 2006. Up-regulation of parvalbumin expression in newborn and adult rat heart. Acta Histochemica 108: 447-454.
48. Weckbecker G, Lewis I, Albert R, Schmid HA, Hoyer D & Bruns C, 2003. Opportunities in somatostatin research: biological, chemical and therapeutic aspects. Nat Rev Drug Discov 2: 999-1017.
49. Zhu Ly, 2005. Production of human monoclonal antibody in eggs of chimeric chickens.
Nat. Biotechnol. 23: 1159-1169.