Vasta-aineiden spesifisyyden kontrollointi

Western blotissa proteiini tunnistetaan yhtä aikaa immunologisesti ja molekyylipainonsa tai isoelektrisen pisteensä perusteella. Tällöin koeasetelma itsessään testaa vasta-aineen spesifisyyttä, joskin lisävarmistukset voivat joskus tulla tarpeeseen. Immunohistokemiallisessa tutkimuksessa puolestaan menetelmään itseensä ei ole rakennettu rinnakkaista vahvistusmekanismia immunologiselle signaalille, joten vasta-aineen spesifisyys on aina testattava erikseen.

Rhodes ja Trimmer (2006) käsittelevät artikkelissaan ”Antibodies as Valuable Neuroscience Research Tools versus Reagents of Mass Distraction” hermoston immunohistokemiaan tarkoitettujen kaupallisten vasta-aineiden spesifisyyttä ja keinoja sen testaamiseen. Heidän mukaansa monien tällaisten valmisteiden spesifisyys jättää toivomisen varaa, ja neurotieteellinen julkaisukenttä yhä useammin vaatii tutkijaa kertomaan tutkimusartikkelissaan, miten tämän käyttämien vasta-aineiden spesifisyys on testattu.

Primaarivasta-ainevalmisteen epäspesifisyys voi johtua kahdesta seikasta.

1. Kuten kohdassa ”2.1.5. Vasta-aineiden affiniteetti ja spesifisyys…” esitettiin, valmisteessa voi olla mukana vasta-aineita, jotka eivät reagoi tarkoitettuun antigeeniin, mutta reagoivat joidenkin tutkittavan kudoksen makromolekyylien kanssa. Ongelma on merkittävin polyklonaalisilla valmisteilla, ja ainakaan soluviljelmässä tuotetuilla monoklonaalisilla valmisteilla sitä ei pitäisi esiintyä. Ongelman todennäköisyys pienenee, jos immunisointiin käytetty antigeeni on puhdasta ja natiivissa konformaatiossa. Valmisteen affiniteettipuhdistus myös auttaa asiaa.

2. Valmisteen ne vasta-aineet, jotka reagoivat antigeenin kanssa, saattavat tarttua muihinkin kohteisiin, jos niistä löytyvät epitoopit ovat riittävän samankaltaisia. Natiivimuotoista antigeeniä käytettäessä vaara on pienempi.

On myös hyvä huomioida, että fysikaalis-kemiallisilla olosuhteilla on vaikutusta siihen, mihin vasta-ainemolekyyli tarttuu. Niinpä spesifisyys on jossain määrin olosuhdekohtaista ja voidaan poistaa olosuhteita muuttamalla.

Syystä 1 johtuvaa epäspesifisyyttä on siis aiheellisinta kontrolloida polyklonaalisten vasta-aineiden kohdalla. Kontrollointi onnistuu aukottomasti ns. preabsorborption avulla.

Preabsorptiossa valmisteesta poistetaan ne vasta-ainemolekyylit, jotka tarttuvat puhtaaseen antigeeniin. Tämä tapahtuu käytännössä affiniteettipuhdistuksella, jossa ligandina käytetään antigeeniä. Jos preabsorboidulla vasta-aineella saadaan värjättyä kudosta, todistetaan syystä 1 johtuvaa vasta-aineen epäspesifisyyttä.

Yksinkertaisempi ja yleisempi tapa testata, aiheuttavatko polyklonaalisen vasta-ainevalmisteen ylimääräiset vasta-aineet signaalia, on kuitenkin immunisoimattoman eläimen seerumin käyttö vasta-ainevalmisteen tilalla. Ideaalisinta olisi käyttää ei-immuunisen seerumin lähteenä samaa yksilöä, jota käytetään vasta-aineiden lähteenä, mutta tämä on käytännössä hankalaa. On todettu, että mikäli ei-immuuninen seerumi on peräisin samassa ympäristössä kasvatetusta samasta eläinkannasta, se todennäköisesti sisältää samat ylimääräiset vasta-aineet mitä preabsorboitu vasta-ainekin, mikäli itse immunisaatio ei ole synnyttänyt ylimääräisiä vasta-aineita.

Barkerin ja McKelvyn toimittamassa teoksessa Current Methods in Cellular Neurobiology (1983) esitetään preabsorptiosta seuraavanlainen versio, joka sopii syystä 2 johtuvan epäspesifisyyden erittelyyn ja, tietyin varauksin, toteamiseen. Vasta-ainevalmistetta jaetaan fraktioihin, joista yhtä inkuboidaan tarkoitetun antigeenin kanssa, muita tälle homologisten molekyylien kanssa.

Tämän jälkeen fraktioita käytetään rinnakkaisiin värjäyksiin, joiden lopputuloksia verrataan keskenään. Mitä enemmän vasta-ainetta on kiinnittynyt inkuboitaessa siihen molekyyliin, jonka kanssa vasta-ainetta on inkuboitu, sitä heikompi on värjäystulos. Näin voidaan selvittää, reagoiko vasta-aine ristiin tiettyjen tarkoitetulle antigeenille homologisten molekyylien kanssa. Toisaalta, menetelmä ei kerro, reagoiko vasta-aine ristiin muiden kuin tutkittujen antigeenien kanssa.

Lisäksi olosuhteet, joissa vasta-aineita inkuboidaan antigeenille homologisten molekyylien kanssa, eivät ole samat kuin ne, joissa vasta-aineet toimivat histologisessa tutkimuksessa.

Jos halutaan vain selvittää, toimiiko vasta-ainevalmiste spesifisesti, ilman sen erittelyä, onko takana syy 1 vai 2, on joukko erilaisia vaihtoehtoja. Koska monoklonaalisten vasta-aineiden mahdollinen epäspesifisyys luultavasti johtuu syystä 2, voidaan niiden kohdalla edetä suoraan yleisluontoiseen menetelmään.

Epäspesifisyys yleensä voidaan periaatteessa kontrolloida pitävästi negatiivisella näytteellä - kudosnäytteellä, josta olisi jollain keinolla poistettu vasta-aineen virallinen antigeeni, mutta jossa olisi tallella kaikki muu. Jos tällainen näyte värjäytyisi, vasta-aine olisi epäspesifistä.

Käytännössä tällaisen näytteen saaminen voi olla hankalaa.

Rhodes ja Trimmer (2006) esittävät yhdeksi mahdollisuudeksi geenimuunnellun eläimen kudoksen käytön. Joissain tapauksissa on mahdollista tuottaa eläin, jonka tutkittavassa kudoksessa ei ole vasta-aineen antigeeniä. Knockout-eläin, jolla proteiinin valmistukseen tarvittava geeni ei toimi ollenkaan, kuitenkin kehittyy usein epänormaalisti tai kuolee kesken kehityksen. Jos proteiinia tarvitaan normaalin yksilönkehityksen läpikäymiseen, mutta aikuinen yksilö pystyy toimimaan ilman sitä ainakin jonkin aikaa, ongelma on periaatteessa mahdollista kiertää Cre-Lox-rekombinaatiolla tai RNA-interferenssillä. Näiden menetelmien avulla proteiinin ilmentyminen voidaan pysäyttää missä vaiheessa tahansa, antaen eläimen kuitenkin kehittyä normaalisti siihen saakka.

Jos sopivanlainen geenimuunneltu eläinkanta tai RNA-interferenssiprotokolla on jo käytössä ennestään, näitä voi olla perusteltua hyödyntää spesifisyyden testauksessa. Siirtogeenisen eläimen tuottaminen ja RNA-interferenssi tuntuvat kuitenkin melko raskailta menetelmiltä, jos ne otetaan käyttöön pelkästään vasta-aineen spesifisyyden selvittämistä varten. Lisäksi elimistö voi kompensoida jonkin proteiinin puutetta tuottamalla lisää toista, homologista proteiinia, mikä voisi sotkea tuloksia (Fritschy 2008).

Teoreettinen mahdollisuus olisi homogenoida kudosnäyte, poistaa siitä tutkittavan vasta-aineen antigeeniproteiini ja tutkia sitten riittävän herkällä menetelmällä, esim. ELISAlla, sitoutuuko vasta-aine johonkin jäljellä olevassa fraktiossa. Lähemmin tarkasteltuna tämä ajatus ei kuitenkaan vaikuta kovin toimivalta.

Antigeeniä voitaisiin monoklonaalista vasta-ainetta testattaessa periaatteessa affiniteettipuhdistaa homogenaatista rinnakkaisella monoklonaalisella valmisteella (joiden saatavuus tosin ei ole taattu, ks. alempana). Monoklonaalinen rinnakkaisvalmiste poistaisi homogenaatista ehkä myös jotain muuta kuin tarkoitettua antigeeniään, mutta todennäköisyys sille, että tämä jokin muu olisi jotain sellaista, johon tutkittava monoklonaalinen vasta-aine sitoutuisi, olisi erittäin pieni. Tutkittavan vasta-aineen ollessa polyklonaalinen ristiinreagoimisten todennäköisyys on suurempi, joten voisi ajatella, ettei menetelmä sopisi polyklonaalisille vasta-aineille.

Monoklonaalisillekaan vasta-aineille menetelmää ei loppujen lopuksi varmaan kannattaisi käyttää, sillä joka tapauksessa olisi käytännöllisempää yksinkertaisesti värjätä toinen samanlainen leike toisella monoklonaalisella valmisteella.

Homogenaatista voitaisiin ainakin joissain tapauksissa poistaa antigeeniä myös ei-immunologisilla menetelmillä. Osa proteiineista sitoutuu vahvasti spesifisiin ligandeihin, joita voitaisiin hyödyntää affiniteettipuhdistuksessa. Jokaiselle proteiinille ei kuitenkaan ole sopivaa ligandia, sekä luonnon että reagenssimarkkinoiden asettamien rajoitusten vuoksi. Lisäksi, vaikka proteiinin puhdistaminen homogenaatista on biokemiassa rutiininomainen menetelmä, puhdistus on yleensä monivaiheinen prosessi, jonka eri vaiheissa näytteen makromolekyylejä voi denaturoitua (Nelson ja Cox 2004, s. 92). Homogenaatissa olosuhteet ovat yleensäkin monin tavoin erilaiset kuin histologisessa preparaatissa. Puhdistukseen kuuluva asia on myös hukka, mikä tarkoittaa käänteisesti ajatellen sitä, että antigeeniproteiinia saattaisi jäädä homogenaattiin häiritsevän paljon.

Rhodes ja Trimmer (2006) toteavat, että mikäli primaarivasta-aine on monoklonaalista, sen spesifisyyden puolesta antaa riittävän voimakasta näyttöä se, että toisen valmistajan monoklonaalinen vasta-ainevalmiste värjää näytteen samalla tavalla. Ajatuksena on, että koska näillä monoklonaalisilla vasta-aineilla on todennäköisimmin eri epitoopit, olisi

epätodennäköistä, että niiden ristiinreagointi olisi samanlaista, jolloin yhtenevät värjäystulokset osoittaisivat, että ristiinreagointia ei olisi tapahtunut. Voi olla, että ajatus ei sovellu täysin ainakaan tilanteeseen, jossa antigeeni on hyvin pieni molekyyli. Polyklonaalista valmistetta testattaessa on joka tapauksessa todennäköisempää, että ristiinreagoinnissa on päällekkäisyyttä, joten menetelmä ei ole polyklonaalisen valmisteen tapauksessa luotettava. Monoklonaalistenkin vasta-aineiden tapauksessa rinnakkaiset valmisteet voi joutua teettämään tilaustyönä tai tekemään itse. Tässä tutkimuksessa tarkastelluille vasta-aineille oli vaikea löytää markkinoilta immunohistokemialliseen käyttöön suunnattuja rinnakkaistuotteita.

Melko hyvältä tavalta testata vasta-aineiden spesifisyyttä vaikuttaisi Western blot, jossa proteiineja ei denaturoitaisi SDS:llä, vaan eroteltaisiin toisistaan isoelektrisen fokusoinnin avulla, jolloin immunologisen tunnistuksen vahvistaisi vyöhykkeen oikea isoelektrinen piste. Tässäkään Western blotin muodossa olosuhteet eivät toki ole samat kuin histologisessa tutkimuksessa. Tutkimukseen ryhdyttäessä mieleen ei kuitenkaan ilmeisesti tullut kartoittaa tätä mahdollisuutta, vaan päädyttiin käyttämään SDS-Westerniä, joka on yleisemmin käytetty menetelmä.

Proteiinin immunologista paikannusta on mahdollista verifioida myös etsimällä vastaavanlaisesta kudosleikkeestä proteiinia vastaavaa lähetti-RNA:ta in situ -hybridisaatiolla. Etsimiseen käytetään lähetti-RNA:lle komplementaarista, fluorensoivaksi leimattua RNA-pätkää. In situ-hybridisaatiosta ja immunohistokemiasta saatujen kuvioiden yhteneväisyys antaisi näyttöä vasta-aineen spesifisyyden puolesta. Menetelmää käytettäessä tulisi ottaa huomioon, että lähetti-RNA ja proteiini voivat sijaita soluanatomisella tasolla eri paikoissa.

Ilmaiseksi käytettävissä oleva internetin Allen Brain Atlas –tietokokanta voi ehkä tarjota oikotien in situ –hybridisaation tekemiselle. Atlaksesta löytyy hiiren aivoista leikekuvia, joissa tietyn geenin lähetti-RNA:ta on paikallistettu in situ-hybridisaatiolla. Tässä tutkimuksessa käytettiin rottia, jotka ovat suhteellisen läheistä sukua hiirille, mutta lajienväliset erot geeniekspressiossa ovat toki mahdollisia, ja jonkinasteiset neuroanatomiset erot tuovat vertailuun lisähaastetta.

Joka tapauksessa tietokannasta löytyi in situ –hybridisaatiokuvia kaikkiin niihin proteiineihin liittyen, joihin kohdistettuja vasta-aineita tässä tutkimuksessa tutkittiin.

Ei varmaankaan ole mielekästä pyrkiä vahvistamaan jokaista immunohistokemiallista tutkimusta erillisellä in situ –hybridisaatiolla. Tällöinhän olisi monissa tapauksissa sama hylätä immunohistokemia kokonaan ja turvautua pelkästään in situ –hybridisaatioon. In situ –hybridisaatiolla lienee järkevintä kontrolloida vasta-aineen spesifisyys jossain kohtalaisen yleisluontoisessa asetelmassa ja yleistää tästä spesifimpiin asetelmiin.

Fritschyn (2008) esittämä yksi tapa vahvistaa immunohistokemiallisen värjäyksen tulos on,

että etsittyä makromolekyyliä pyrittäisiin eristämään kudosleikkeestä ja tunnistamaan jollain biokemiallisella menetelmällä. Fritschy ei kuvaa tarkemmin, mikä tämä tunnistusmenetelmä voisi olla. Haluttaessa varmistaa proteiinin immunohistokemiallista tunnistusta voisi kyseeseen tulla vastaavan lähetti-RNA:n toteaminen käänteistranskription jälkeisellä kvantitatiivisella PCR:llä (Q-PCR), mikä on yleisesti käytetty menetelmä geeniekspression tutkintaan. Joka tapauksessa, tämän tutkimuksen puitteissa tätä mahdollisuutta ei koettu mielekkääksi lähteä selvittämään.

Sekundaarivasta-aineen spesifisyyttä tutkitaan immunohistokemiallisen tutkimuksen yhteydessä rutiininomaisesti toteuttamalla protokolla ilman primaarivasta-ainetta. Tällöin kudosleikkeen ei pitäisi värjäytyä.

2.4. Affiniteettipuhdistus

Affiniteettipuhdistuksessa sidotaan kovalentisti yhdisteitä lopullisessa muodossaan inerttiin (käyttöolosuhteissa kemiallisesti reagoimattomaan) hartsiin (Boyer 2000). Sitotuneeseen yhdisteeseen tarttuu ei-kovalentisti makromolekyylejä puhdistettavasta näytteestä. Loput näytteestä huuhdotaan pois hartsista. Tällä tavoin voidaan näytteestä joko poistaa tai eristää haluttu makromolekyyli. Jälkimmäisessä tapauksessa huuhdonnan jälkeen muutetaan hartsissa vallitsevia kemiallisia olosuhteita niin, että ei-kovalentit sidokset heikkenevät ja kiinnostuksen kohteena oleva makromolekyyli irtoaa. pH:n muuttaminen on yleinen tapa, jota sovellettiin myös tässä työssä.

Tässä työssä käytettiin CNBr-activated Sepharose 4B -hartsia. Sefaroosi on kovalentein, lysiinipohjaisin ristisidoksin jyväsiksi sidottua agaroosia, ja agaroosi on puolestaan polysakkaridia, jota saadaan tiettyjen punalevien soluseinistä.

Syanogeenibromidilla aktivoitu sefaroosi on syanaattiesteri, joka muodostaa kovalentteja sidoksia amiiniryhmien kanssa, tehokkaimmin emäksisessä pH:ssa. Kun halutun yhdisteen on annettu sitoutua kovalentisti CNBr-aktivoidun sefaroosin reaktiivisiin ryhmiin, loput näistä ryhmistä blokataan (GE Healthcare 2009). Tämä saadaan aikaan ilman lisäreagensseja jatkamalla hartsin pitoa emäksisessä pH:ssa, jolloin ylimääräiset ryhmät hydrolysoituvat.

Blokkaus kuitenkin tehostuu, jos liuoksessa on molekyylikooltaan pientä primaarista amiinia, kuten Tris-HCl:ää, etanoliaminiinia tai glysiiniä, jotka kondensoituvat ylimääräisiin ryhmiin.

2.5. Hippokampus