4. MATERIAALIT JA MENETELMÄT 1. Materiaalit
4.2.3. Kalretiniinin vasta-aineen affiniteettipuhdistus
Kalretiniinin vasta-ainetta affiniteettipuhdistettiin syanogeenibromidiaktivoituun sefaroosiin (CNBr-activated Sepharose 4B, GE Healthcare) sidotulla, bakteerien tuottamalla rekombinantti-kalretiniinilla (valmistaja SWANT), jonka sekvenssi oli peräisin ihmiseltä.
Rekombinantti-kalretiniini kiinnitettiin sefaroosiin seuraavasti.
1. Proteiini liuotettiin 5 ml:aan sidontapuskuria (englanniksi coupling buffer, 0,1 M NaHCO3, 0,5 M NaCl, pH 8,3), joka sitten valutettiin 50 ml:n putkessa olevan CNBr-sefaroosin päälle.
2. CNBr-sefaroosia pyöritettiin putkessaan rotaattorilla 1 t huoneenlämpötilassa.
Sitten CNBr-sefaroosi siirrettiin PD10–pylvääseen, jossa affiniteettipuhdistus tapahtui. Pylvästä pestiin 5 x 5 ml:lla sidontapuskuria.
CNBr-sefaroosin reagoimattomat kohdat blokattiin lisäämällä pylvääseen 5 ml 0,1 M Tris-HCl pH 8.0 –puskuria ja sekoittamalla huoneenlämmössä 2 t. Sitten pylväs pestiin seuraavasti.
1. 5 x 3,5 ml:lla asetaattipuskuria (pH 4).
2. 5 x 3,5 ml:lla Tris-HCl-puskuria (pH 8).
3. 5 x 3,5 ml:lla asetaattipuskuria.
4. 5 x 3,5 ml:lla Tris-HCl-puskuria.
5. 5 x 3,5 ml:lla asetaattipuskuria.
6. 5 x 3,5 ml:lla Tris-HCl-puskuria.
7. 15 ml:lla 1x-PBS:ää.
Säilytystä varten sisään laitettiin sitten 5 ml 1x-PBS:ää. Affiniteettipuhdistus tapahtui seuraavasti.
1. Pylvääseen lisättiin puhdistettava vasta-aine.
2. Pylvääseen lisättiin 2 ml 1x-PBS:ää. Pylvästä sekoitettiin (rotaattorilla) 30 min huoneenlämpötilassa. Nestefaasi valutettiin fraktioon 1 (epäspesifinen fraktio, jossa pitäisi olla niiden vasta-ainemolekyylien, jotka eivät sitoutuneet kalretiniiniin).
3. Pylvääseen lisättiin 2 ml 1x-PBS:ää. Nestefaasi valutettiin fraktioon 1.
4. Pylvääseen lisättiin 2 ml 0,1 M AcOH-puskuria, ja pylvästä sekoitettiin 2 min huoneenlämpötilassa. (Nyt siis alettiin laskea hartsin pH:ta, jotta vasta-ainemolekyylit irtoaisivat hartsiin sidotusta rekombinanttiproteiinista.) Nestefaasi valutettiin fraktioon 2 (spesifinen fraktio, jossa pitäisi olla kalretiniiniin sitoutuneita vasta-ainemolekyylejä).
5. Pylvääseen lisättiin 5 ml 0,1 M AcOH-puskuria, ja pylvästä sekoitettiin 5 min huoneenlämpötilassa. Nestefaasi valutettiin fraktioon 2.
6. Pylvääseen lisättiin 2 ml 0,1 M AcOH-puskuria. Nestefaasi valutettiin fraktioon 2.
7. Pylväs huuhdottiin 15 ml:lla 1x-PBS-T:tä. Lisättiin säilytystä varten 5 ml 1x-PBS-T:tä (PBS-T sisältää Tween-pesuainetta, joka parantaa säilyvyyttä).
Fraktioon lisättiin 2 1 ml 10x-PBS:ää, tarkoituksena neutraloida pH.
Fraktiot konsentroitiin ja samalla myös fraktion 2 puskuriksi vaihdettiin 1x-PBS seuraavasti.
1. Fraktiota 2 sentrifugoitiin (4000 rpm, huoneenlämpötila) Vivaspin 100 000 – putkessa, kunnes kokonaistilavuus oli 50 µl; sitten putkeen laitettiin vielä 1 ml 1x-PBS:ää, ja sentrifugoitiin, kunnes kokonaistilavuus oli 50 µl. (Vivaspin 100 000 –putkessa on suodatin, jonka läpi neste poistuu sentrifugoitaessa alkuperäisestä osastostaan putken alaosaan, proteiinien jäädessä alkuperäiseen osastoon.)
2. Vivaspin-putkeen lisättiin 450 µl 1x-PBS:ää ja sekoitettiin varovasti. Liuos siirrettiin Eppendorf-putkeen.
3. Vivaspiniin siirrettiin vielä 500 µl 1x-PBS:ää, ja kokonaisuutta sekoitettiin varovasti.
Sitten sisältö siirrettiin edellisessä kohdassa mainittuun Eppendor-putkeen. Näin pyrittiin saamaan talteen Vivaspiniin mahdollisesti jäänyt vasta-aine.
4.2.4. ELISA
ELISAlla tutkittiin, millaiset olivat affiniteettipuhdistuksesta saadun spesifisen ja epäspesifisen fraktion proteiinipitoisuudet verrattuna puhdistamattoman vasta-aineen proteiinipitoisuuteen.
ELISA siten antoi tietoa puhdistusprosessin onnistumisesta ja saatujen vasta-aineliuosten vahvuuksista. Jälkimmäinen tieto oli tarpeen mietittäessä, kuinka suuria määriä näitä liuoksia käytettäisiin immunohistokemiallisiin värjäyksiin tutkittaessa niiden värjäysjälkeä. Kuoppien pohjille kiinnitettiin samaa rekombinantti-kalretiniinia, jota käytettiin vasta-aineiden affiniteettipuhdistukseen.
1. Kalretiniiniliuos laimennettiin pitoisuuteen 1:2 PU5-puskuriin. Kalretininin tarkkaa pitoisuutta tässä liuoksessa on vaikea arvioida seuraavasta syystä. Ajatus ELISA:n käytöstä puhdistusprosessin arviointiin tuli vasta siinä vaiheessa, kun kaikki käytössä oleva rekombinanttiproteiini oli jo laitettu pylvääseen. Rekombinanttiproteiinista osa
kuitenkin jäi sitoutumatta pylvääseen ja tuli läpi, mikä todennettiin spektrofotometrillä (Cecil CE1010). Tätä läpi tullutta rekombinanttiproteiinia sitten hyödynnettiin ELISA:ssa, mutta sen tarkasta määrästä ei ole tietoa. Tämän ja PU5:n seosta kuitenkin pipetoiin 100 µl/kuoppa EB-kuoppalevylle. Levyä inkuboitiin huoneenlämmössä yön yli liimalapulla peitettynä (haihtumisen estämiseksi) pimeässä.
2. Kuopat pestiin PBS-T:llä, 3 x 250 µl.
3. Kuopat blokattiin 1 % BSA:lla (PBS-T:ssä), 150 µl/kuoppa. Inkuboitiin 1 t huoneenlämpötilassa.
4. Kuopat pestiin 3 x 250 µl:lla PBS-T:tä.
5. Seerumi ja vasta-ainefraktiot laimennettiin 1 % BSA:lla (PBS-T:ssä), pipetoitiin 100 µl/
kuoppa. Kuoppalevyä inkuboitiin 30 min huoneenlämpötilassa.
6. Kuopat pestiin 3 x 250 µl:lla PBS-T:tä.
7. Anti-rabbit-IgG-HRP laimennettiin 1:10000-osaan PBS-T:hen, jossa 1 % BSA, ja pipetoitiin 100 µl/kuoppa. Kuoppalevyä inkuboitiin 30 min huoneenlämmössä.
8. Kuopat pestiin 3 x 250 µl:lla PBS-T:tä.
9. PU28-puskuri laimennettiin 1:50-suhteessa PU27-puskuriin, ja laimennosta pipetoitiin 100 µl/kuoppa. Kuoppalevyä inkuboitiin 15 min huoneenlämmössä.
10. Kuhunkin kuoppaan lisättiin 2M rikkihappoa 50 µl ja mitattiin absorbanssit 450 nm:n aallonpituudella (laitteella Labsystem Multiskan RC).
4.2.5. Immunohistokemiallinen värjäys
Käytetty immunohistokemiallinen menetelmä oli epäsuora. Sekundaarivasta-aine oli biotinyloitu, ja siihen liitettiin viimeisessä vaiheessa avidiini-biotiinikompleksi, jossa biotiini oli leimattu piparjuuriperoksidaasilla. Näytteet olivat protokollan suorituksen aikana pienissä lasipurkeissa tasoravistelijalla. Värjäyksiä tehtiin viisi rinnakkaista:
1. Alkuperäinen kalretiniinin antiseerumi.
2. Affiniteettipuhdistuksesta saatu kalretiniinin antiseerumin spesifinen fraktio.
3. Affiniteettipuhdistuksesta saatu kalretiniinin antiseerumin epäspesifinen fraktio.
4. Negatiivikontrolli – ei mitään vasta-aineita.
5. Negatiivikontrolli – alkuperäinen kalretiniinin antiseerumi, mutta ei sekundaarivasta-ainetta.
Värjäys eteni seuraavasti:
1. Leikkeet pestiin 0,1 M PBS-puskurilla (Phosphate-Buffered Saline), jonka pH oli 7,4, 3 x 20 min.
2. Leikkeitä inkuboitiin TBS-liuoksessa, jossa Trisin konsentraatio oli 0,05 M ja pH 7,4, 2 x 20 min. TBS on lyhenne nimikkeestä Tris-Buffered Saline eli trishydroksimetyyliaminometaani-puskuroitu suolaliuos.
3. Leikkeitä inkuboitiin 10% normaaliseerumia (vuohesta, Biowestin) ja 0,5% Triton X-100:a sisältävässä TBS-liuoksessa 40 min. (Normaaliseerumi tarkoittaa seerumia, joka on peräisin immunisoitumattomasta yksilöstä. Tässä yhteydessä kyseessä oli siis seerumi yksilöstä, jota ei ollut altistettu antigeenille, jota kudoksesta etsittiin. Normaaliseerumin tarkoitus on peittää näytteestä kohtia, joihin immunohistokemialliset reagenssit voisivat sitoutua epäspesifisesti. Se on peräisin samasta lajista kuin sekundaarivasta-aineet, jotta nämä eivät reagoisi sen kanssa. Triton X-100 on pinta-aktiivinen yhdiste, joka tekee solun kalvorakenteisiin aukkoja, joiden kautta vasta-aineet pääsevät solun sisältämien proteiinien luo. Toinen immunohistokemiassa käytetty pinta-aktiivinen yhdiste on saponiini. Saponiini ei riko solukalvoa pysyvästi, joten sitä käytettäessä solujen rakenne säilyy paremmin.
Saponiinin käyttöä hermoston immunohistokemiassa kuitenkin rajoittaa se, ettei sen teho riitä hermosyiden myeliinituppien rei’ittämiseen.)
4. Leikkeitä inkuboitiin 1% normaaliseerumia ja 0,5% Triton-X-100:a sisältävässä TBS-liuoksessa 15 min.
5. Leikkeitä inkuboitiin primaarivasta-aineen kanssa 1% normaaliseerumia ja 0,5% Triton X-100:a sisältävässä TBS-liuoksessa yön yli huoneenlämpötilassa. Primaarivasta-aineen konsentraatiot olivat seuraavat:
1. Alkuperäinen kalretiniinin antiseerumi: 1:10000.
2. Affiniteettipuhdistuksesta saatu kalretiniinin antiseerumin spesifinen fraktio: 1:100 (käyttiin vahvempaa konsentraatiota affiniteettipuhdistuksen aiheuttaman hävikin takia; hävikkiä arvioi Ale Närvänen ELISA-tuloksesta).
3. Affiniteettipuhdistuksesta saatu kalretiniinin antiseerumin epäspesifinen fraktio:
1:100 (sama syy vahvempaan konsentraatioon).
6. Leikkeitä huuhdeltiin ylimääräisen sitoutumattoman primaarivasta-aineen poistamiseksi 1% normaaliseerumia ja 0,5% Triton-X-100:aa sisältävässä TBS-liuoksessa 3 x 30 min.
7. Leikkeitä huuhdeltiin biotinyloidun sekundaarivasta-aineen (kanin IgG:n vasta-aine, markkinanimi Vector BA-1000, erä RO720) kanssa 1% normaaliseerumia ja 0,5% Triton X-100:aa sisältävässä liuoksessa yön yli (noin 16 tuntia) + 4 ºC:ssa. Sekundaarivasta-aineen pitoisuus oli 1:300.
8. Leikkeitä huuhdeltiin 1% seerumia ja 0,5% Triton X-100:aa sisältävässä TBS-liuoksessa 3 x 30 min.
9. Avidiini-biotiinikompleksit muodostettiin inkuboimalla leikkeitä 3 tuntia huoneenlämmössä TBS-liuoksessa, jossa oli 1:500 Vector PK-4000-reagenssia, 1 % seerumia ja 0,5
% Triton X-100:aa. (Vector PK-4000-reagenssissa on avidiinia ja biotynyloitua piparjuuriperoksidaasia; nämä toimitaan erillisinä reagensseina, jotka käyttäjä yhdistää.) 10. Leikkeitä huuhdeltiin TBS-liuoksessa 3 x 20 min.
11. Leikkeitä huuhdeltiin 0,05 M Tris-liuoksessa, jonka pH oli 7,6, 2 x 10 min.
1.1. Sitten niitä inkuboitiin 20 min 0,05 % (w/v) DABia sisältävässä, 0,05-molaarisessa Tris-liuoksessa, jonka pH oli 7,6.
1.2. Jokaiseen leikeastiaan annosteltiin sen verran vetyperoksidia (20 µl), että vetyperoksidin pitoisuudeksi (tilavuuden suhteen) tuli 10-7 %, ja leikkeiden värjäytymistä seurattiin.
11. Leikkeitä huuhdeltiin 0,05-molaarisessa Tris-puskuroidussa (ilman NaCl:ia, joka voisi muodostaa kiteitä) liuoksessa, jonka pH oli 7,6, 3 x 30 min. Tämän vaiheen tarkoitus oli lopettaa värjäytyminen huuhtomalla pois värjäysreagensseja sisältävä liuos.
Sitten leikkeitä huuhdeltiin 0,1 M PB-liuoksessa, vaihdettiin tilalle uusi PB-liuos, ja jätettiin säilytykseen yön yli. Sitten laborantti kiinnitti leikkeet objektiivilaseille ja dehydroi ja päällysti ne Depexillä ja peitinlaseilla mikroskopointia varten.
5. TULOKSET