m.3243A>G mutaation vaikutus hermoston kehitykseen
Toni Juntunen
Lääketieteen koulutusohjelma Itä-Suomen yliopisto
Terveystieteiden tiedekunta Lääketieteen laitos / Neurotieteet Lokakuu 2021
1 ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, Terveystieteiden tiedekunta
Lääketieteen laitos
Lääketieteen koulutusohjelma
JUNTUNEN, TONI M.: m.3243A>G mutaation vaikutus hermoston kehitykseen Opinnäytetutkielma, 34 sivua, 1 liite (2 sivua)
Tutkielman ohjaajat, dosentti FT Riikka Martikainen, FM Sanna Ryytty Lokakuu 2021
Asiasanat: mitokondrio, mtDNA, MELAS, neuroni
Mitokondriaalisen DNA:n m.3243A>G mutaatio aiheuttaa 80 % MELAS syndroomista.
MELAS on oireyhtymä, jonka oirekuva vaihtelee huomattavasti yksilöiden välillä.
Oirekuvaan vaikuttaa oleellisesti yksilön mutaatiokuorma, eli kuinka suuri osa ihmisen koko mtDNA:sta sisältää mutaation. Oireyhtymän oirekuvaan kuuluvat mm. erilaiset endokrinologiset häiriöt, hypertrofinen kardiomyopatia sekä suorituskyvyn aleneminen.
Oirekuvaan kuuluvat edellä mainittujen lisäksi moninaiset neurologiset oireet, kuten migreenikohtaukset, epileptiset kohtaukset, sensorineuraaliset ongelmat sekä kognition aleneminen. Sairauteen ei ole olemassa parantavaa hoitoa, vaan hoito on oireen mukaista.
Yhtenä suurena ongelmana sairauden hoidon kannalta on puutteelliset tiedot oireiden syntymekanismista. Sairauden syntymekanismeista on esitetty useampia teorioita, joihin kuuluvat mm. mitokondrioiden toiminnan häiriytymisen seurauksena syntynyt energiavaje, happiradikaalien muodostuminen sekä energiavajeen aiheuttamat sekundaariset vaikutukset esimerkiksi verisuonten toimintaan. Mitokondrioiden toimintahäiriöille kaikkein alttiimpia on arvioitu olevan hyvin energiariippuvaiset elinjärjestelmät, kuten luurankolihakset, sydän ja keskushermosto.
Tämän lääketieteen syventävien opintojen opinnäytetyön tavoitteena on tutkia tarkemmin mtDNA m.3243A>G mutaation vaikutusta hermoston kehitykseen ja erityisesti neuriittien muodostukseen. Opinnäytetyö koostuu neljästä osakokonaisuudesta; neuronien erilaistamisesta kantasoluista, erilaistuksen onnistumisen varmistamisesta IF-värjäyksellä, RNA-sekvensointitulosten käsittelystä sekä neuriittien muodostuksen arvioimisesta time- lapse-kuvauksen avulla.
Tutkimuksessa käytetty solujen erilaistamisprotokolla toimi suunnitellusti ja solut ilmensivät neuronispesifistä merkkiainetta. Soluista suoritettu RNA-sekvensointituloksissa tarkasteltiin erityisesti hermoston muodostukseen liittyviä geenejä, joissa havaittiin alenemista solun tukirankaan linkittyvissä geeneissä, joilla voi olla merkitystä mm.
soluorganellien kulkeutumisen häiriintymiseen solun sisällä, joka voi puolestaan häiritä esimerkiksi neuriittien muodostusta. Kuvantamistutkimuksessa suuria eroja neuriittien muodostuksessa kontrollilinjojen ja suuren mutaatiokuorman linjojen välillä ei havaittu neuriittien kokonaispituudessa. Kontrollilinjoissa pidempien neuriittien suhteellinen osuus on mahdollisesti suurempi suuremman mutaatiokuorman linjoihin verrattuna.
2 UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND, Faculty of Health Sciences
School of Medicine Medicine
JUNTUNEN, TONI M.: Effect of m.3243A>G mutation to neuronal development Thesis, 34 pages, 1 appendix (2 pages)
Tutors: Martikainen Riikka, Ph. D docent, Ryytty Sanna M.Sc.
October 2021
Keywords: mitochondrion, mtDNA, MELAS, neuron
MELAS is a syndrome most commonly caused by m.3243A>G mutation in mtDNA. Mutation load, meaning the percentage of mutated mtDNA, and also the distribution of mutated DNA affects how severe the disease is and the spectrum of symptoms an individual manifests. Typical symptoms include endocrinological defects, hypertrophic cardiomyopathy and fatigue among others. Neurological symptoms are one of the main features in MELAS and include migraine, epileptic seizures and cognitive dysfunctions. Cure for MELAS does not exist. Treatment is symptomatic.
Full picture of pathophysiological mechanisms of the disease remains unknown. Hypothesis include mitochondrial dysfunction leading to energy deficiency and increased ROS formation and also secondary effects in blood circulation leading to reduced oxygen in certain tissues. Most vulnerable to mitochondrial dysfunction are tissues with high energy demand such as skeletal muscle, heart and neuronal system.
Purpose of this thesis was to have more information of how mtDNA m.3243A>G mutation affects neuronal development and specifically neurite growth. Experimental part consists of four different parts. First neuronal cells were derived from patient stem cells with high and low mtDNA mutation load. The second goal was to confirm that the derived cells were neuronal by using neuron specific IF-staining. The third goal was to analyze RNAsequencing data and in the fourth part neurite growth was studied using real-time imaging.
IF-staining results showed that the protocol used in neuronal differentiation was successful and the cells expressed the neuron specific marker gene. From the RNAsequencing data genes linked to neuronal development were studied. Results showed decreased expression in actin cytoskeleton genes. Cellular cytoskeleton is needed for example for intracellular transportation of cell organelles. Theoretically deficiency in cells transport system could lead to malfunction in neurite formation. Real-time imaging study did not show major differences between cells of high or low mutation load when studying total neurite length.
However, the study showed that cells with low mutation load tend to create longer neurites compared to cells with high mutation load.
3
Sisällys
Kirjallisuuskatsaus ... 6
Mitokondrio ... 6
Rakenne ja toiminta ... 6
Tehtävät... 8
MELAS ...11
Yleisyys ...11
Patogeneesi...11
Kliininen kuva...12
Diagnoosi ...13
Hoito...14
Ennuste ...14
Tutkimus...15
Tausta...15
Materiaalit ja menetelmät...17
iPS-solulinjat ...17
Solujen erilaistaminen ja soluviljely ...17
Solujen yksisoluistaminen...17
Immunofluoresenssivärjäys ...18
RNA-sekvensointi ...19
Cell-IQ-kuvantaminen ...19
Tulokset ...20
Immunofluoresenssivärjäys ...20
RNA-sekvensointi ...21
Cell-IQ -kuvantaminen ...25
Pohdinta ...30
4 Lyhenteet
mtDNA mitokondriaalinen DNA
mRNA siirtäjä RNA (eng. messenger RNA)
DNA deoksiribonukleiinihappo (eng. deoxyribonucleic acid) RNA ribonukleiinihappo (eng. ribonucleic acid)
ETC elektroninsiirtoketju (eng. electron transport chain)
ADP adenosiinidifosfaatti
ATP adenosiinitrifosfaatti
ROS reaktiiviset happiyhdisteet (eng. reactive oxygen species) AIF apoptoosia indusoiva tekijä (eng. apoptosis inducin factor)
Glu glutamaatti
GABA gamma-amino-voihappo (eng. gamma-aminobutyric acid) MELAS eng. Mitochondrial Encephalomyopathy, lactic acidosis and
stroke-like episodes
GI-kanava ruoansulatuskanava (eng. gastro-intestinal track) NPC esihermosolu (eng. neural progenitor cell).
ctrl kontrollilinja, alhaisen mutaatiokuorman solulinja
mut suuren mutaatiokuorman solulinja
iPSc indusoitu pluripotentti kantasolu (eng. induced pluripotent stem cell)
ULA eng. ultra-low attachment
IF Immunofluoresenssi
FA Formaldehydi
PBS eng. Phosphate buffered saline
5
BB eng. Blocking buffer
rRNA ribosomaalinen RNA
PORN polyornitiini
MG matrigeeli
6
Kirjallisuuskatsaus Mitokondrio
Rakenne ja toiminta
Mitokondrio on soluelin, joka koostuu kahdesta sisäkkäisestä kalvosta (Kuva 1.) Tämä kaksoiskalvorakenne kuvattiin ensimmäistä kertaa elektronimikroskoopilla 1950-luvulla (Palade 1953). Ulkokalvon tehtävänä on päästää sisään ja ulos metaboliitteja sisäkalvon ja soluliman välillä ja toisaalta estää haitallisia reaktiivisia yhdisteitä pääsemästä mitokondrion sisältä ulos. Sisäkalvo on voimakkaasti poimuttunut ja sillä sijaitsevat soluhengitysketjun proteiinit (Bartolák-Suki ym. 2017). Sisäkalvon sisäpuolella on mitokondrion matriksi.
KUVA 1. Mitokondrion rakenne. Mitokondrio koostuu kahdesta sisäkkäisestä kalvosta, sisimmän kalvon sisällä on mitokondrion matriksi, jossa sijaitsee myös mtDNA (Kuva: Jackson ym. 2018)
Mitokondriolla on oma mitokondriaalinen DNA (mtDNA) (Kuva 2.), joka sijaitsee mitokondrion matriksissa. Poiketen nukleaarisesta DNA:sta, mtDNA ei sisällä histoneita (Bartolák-Suki ym. 2017, Sharma ja Sampath 2019). Nykykäsityksen mukaan mtDNA ainoastaan periytyy äidin kautta. Viitteitä mahdollisesta isän kautta periytyvästä mtDNA:sta on myös esitetty, mutta nämä katsotaan poikkeustapauksiksi (Luo ym. 2018).
mtDNA on kaksijuosteinen sirkulaarinen DNA, joka koostuu 16 569 emäsparista.
Mitokondrion sisäkalvolla olevista proteiineista 13 oksidatiivisen fosforylaation proteiinia
7 koodataan mtDNA:sta. Näihin proteiineihin kuuluu kompleksien I, III, IV ja V alayksiköitä.
Näiden alayksiköiden lisäksi mtDNA koodaa 22 siirtäjä-RNA:ta (eng. transfer RNA, tRNA) sekä kaksi ribosomaalista RNA:ta. Mitokondrioissa on lisäksi suuri määrä muita proteiineja, jotka koodataan nukleaarisesta DNA:sta (Sharma ja Sampath 2019).
Yhdessä mitokondriossa on useita mtDNA juosteita ja yhdessä solulla lukuisia mitokondrioita. Yhdessä solussa voi laskennallisesti olla useita tuhansia mtDNA juosteita, ja tämä niin kutsuttu mtDNA kopioluku vaihtelee rajusti eri solutyyppien välillä. mtDNA juosteet voivat olla ns. terveitä, sisältää periytyviä mutaatioita tai mutaatiot voivat syntyä ajan kanssa eri mekanismeilla. Edellä mainittua yksilön mtDNA juosteiden välistä vaihtelua kutsutaan heteroplasmiaksi. Mitokondriaalisen DNA:n mutaatiot on yhdistetty useisiin tautiprosesseihin. Puhkeavien sairauksien kannalta merkityksellistä on mutatoituneen mtDNA:n osuus solujen kokonais mtDNAsta eli mutaatiokuorma (Stefano ym 2017).
KUVA 2. mtDNA ja sen osuus hengitysketjun kompleksien muodostuksessa. Ihmisen mtDNA koostuu 16 569 emäsparista. Suuri osa mtDNA:n geneettisestä koodista osallistuu hengitysketjun kompleksin I proteiinien muodostamiseen. Näiden lisäksi se muodostaa osan kompleksien III, IV sekä V proteiineista. (Kuva: Chocron ym. 2019)
8 Mitokondrioiden määrää säädellään fuusion ja fission avulla. Fission ja fuusion välillä uskotaan vallitsevan tarkoin koordinoitu tasapaino. Fuusioon osallistuu pääasiassa kolme geeniä, Mfn1 ja Mfn2 osallistuvat ulkokalvon fuusioon, kun taas sisäkalvon fuusiota säätelee OPA1. Sisäkalvon fuusio on riippumaton oksidatiivisesta fosforylaatiosta, mutta OPA1 tarvitsee korkean solukalvopotentiaalin toimiakseen. Samat geenit osallistuvat myös mitokondrioiden fissioon. Fissio vaatii lisäksi endoplasmakalvoston kontaktin (English ja Voelz 2013). Fuusion ja fission lisäksi mitokondrioiden määrää voidaan lisätä mitokondrioiden uudismuodostuksen, eli biogeneesin avulla tai niitä hajottamalla, eli mitofagialla. Biogeneesiin tarvitaan sekä tuman, että mitokondrion toimintaa (Sharma ja Sampath 2019).
Tehtävät
Mitokondriot ovat solun sisäisiä organelleja, joiden tunnetuin tehtävä on solujen energiantuotanto. Krebs ja Johnson tutkivat 1930-luvulla hiilihydraattien oksidatiivista hajoamista ja tulivat löytäneeksi sitruunahappokierron, joka nykyään tunnetaan myös nimellä Krebsin sykli (Krebs ja Johnson 1937). Syklissä glukoosin pilkkoutuessa elektroneja siirretään elektroninsiirtoketjuun (eng. electron transport chain, ETC) NADH:n ja FADH2:n välityksellä, jossa muodostetaan solujen käyttöön energiaa ATP:n muodossa (Change ja Williams 1956, Patel ja Roche 1990).
9 KUVA 3. Krebsin sykli. Kaaviokuva sitruunahappokiertoon osallistuvista entsyymeistä sekä sitruunahappokierron aikana syntyvistä välituotteista ja lopputuotteista (Kuva Lecturio: Citric Acid Cycle 2020).
ATP:n muodostusta ETC:ssa kutsutaan oksidatiiviseksi fosforylaatioksi (Kuva 4).
Oksidatiiviseen fosforylaatioon osallistuu yhteensä viisi entsyymikompleksia. Kompleksit I- IV muodostavat soluhengitysketjun. Soluhengitysketjussa muodostetaan protonigradientti mitokondrion sisäkalvolle ja kompleksi V eli ATPsyntaasi muodostaa lopulta adenosiinidifosfaatista (ADP) adenosiinitrifosfaattia (ATP) tämän protonigradientin avulla (Lobo-Jarne ja Ugalde 2019).
KUVA 4. Elektroninsiirtoketjun kompleksit mitokondrion sisäkalvolla. Mitokondrion sisäkalvon kompleksit I, III ja IV muodostavat protonigradientin pumppaamalla matriksista protoneja sisäkalvon ulkopuolelle.
Proteiinigradienttia hyödynnetään kompleksin V eli ATP syntaasin käyttövoimana, kun ADP:sta muodostetaan ATP:ta (Kuva: Jackson ym. 2018)
Vaikka solujen energiantuotanto on mitokondrioiden yksi tärkeimmistä tehtävistä, se ei kuitenkaan ole niiden ainoa tehtävä. ATP:n tuotannon sivutuotteena syntyy reaktiivisia happiyhdisteitä (eng. Reactive oxygen species, ROS), joita ovat mm. vetyperoksidi sekä happiradikaalit. Näiden tuotantoon osallistuu erityisesti hengitysketjun kompleksit I ja III.
ROS:t on yhdistetty mm. ikääntymiseen ja neurodegeneraatioon sekä eräisiin sairauksiin
10 (mm. Leberin perinnölliseen optiseen neuropatiaan), mutta toisaalta ne vaikuttavat myös positiivisessa mielessä eri signalointireitteihin, jotka kontrolloivat mm. solujen erilaistumista. Mitokondriaalisen ROS:n tuotanto on lisäksi yhdistetty apoptoosin induktioon (Nunnari ja Suomalainen 2012).
Mitokondriot osallistuvat myös kalsiumaineenvaihdunnan säätelyyn kalsiumkanavien avulla. Kalsiumilla on lukuisia tehtäviä solusta riippuen. Kalsium voi vaikuttaa joko erilaisten entsyymien ja kaskadien toimintaan tai solujen sähkökemialliseen tasapainoon. Liian suuret pitoisuudet voivat aiheuttaa solutuhoa joko hajottavien entsyymien liiallisen aktivaation kautta tai vaikuttamalla suoraan proteiinien ja nukleiinihappojen rakenteeseen (Gunter ja Pfeiffer 1990). Kalsiumaineenvaihdunnan lisäksi mitokondriot osallistuvat myös raudan aineenvaihduntaan syntetisoimalla hemiä ja Fe-S rykelmiä, jotka ovat osa hemoglobiinia (Nunnari ja Suomalainen 2012).
Mitokondrioilla on lisäksi keskeinen rooli sisäisen mekanismin käynnistämässä apoptoosissa. Mitokondriossa on apoptoosia indusoivaa tekijää (eng. apoptosis inducin factor, AIF) sekä sytokromi C:tä, joka on keskeinen komponentti myös soluhengitysketjussa. Sekä AIF, että sytokromi c, kykenevät aktivoimaan kaspaaseja, joka puolestaan johtaa apoptoosiin. Näiden proteiinien eritys ja siirtyminen solulimaan tapahtuu apoptoottisten ärsykkeiden vaikutuksesta ja molempien toimintaa solu pyrkii hillitsemään Bcl-2-proteiinin avulla, joka estää sekä AIF:n että cyt c:n siirtymistä solulimaan (Wang C ja Youle RJ 2009).
Mitokondrioilla on myös oma roolinsa pyrimidiinien, rasvahappojen ja monien entsyymien synteesissä. Rasvahappo synteesissä mitokondriot osallistuvat Beeta-oksidaatioketjuun, kun taas entsyymien kohdalla mitokondrioiden funktio on aminohappojen, ko-faktorien ja metaboliittien pitoisuuksien säätely. Lipidisynteesillä on suuri merkitys solujen kasvun kannalta. Esimerkiksi neuronien kasvu vaatii runsaasti uutta kaksoiskalvon muodostusta aksonien kasvaessa (Mayr ym. 2011). Lisäksi energian muodostuksen sivutuotteena syntetisoidaan gamma-aminovoihappoa (eng. Gamma-amino-butyricacid, GABA) ja glutamaattia (eng. glutamate, Glu), jotka ovat hermoston tärkeimmät inhibitoriset ja eksitatoriset välittäjäaineet (Nunnari ja Suomalainen 2012).
11 KUVA 5. Mitokondrion merkityksestä solujen aineenvaihdunnan kannalta. Mitokondriot osallistuvat energiantuotannon lisäksi myös nukleotidien, lipidien sekä aminohappojen synteesiin. (Altman ym. 2017)
MELAS
Yleisyys
MELAS (eng. Mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis and stroke like-episodes) on mtDNA:n mutaatiosta johtuva oireyhtymä. Noin 80 % tapauksista on seurausta m.3243 A>G mutaatiosta.
M.3243 A>G geenimutaation prevalenssi vaihtelee huomattavasti maittain. Japanissa arvioidaan tapauksia olevan 0,2:100 000, kun taas Australiassa on Manwaringin tutkimuksessa vuodelta 2007 arvioitu olevan jopa 236:100 000 (Yatsuga ym. 2012, Manwaring ym. 2007). Suomessa esiintyvyys on arvioiden mukaan 16-18:100 000 (Majamaa ym. 1998, Uusimaa ym. 2007).
Patogeneesi
MELAS syndrooman patogeneesiä ei täydellisesti tunneta. Todennäköisesti patologisia mekanismeja on useampia (El-Hattab ym. 2015). Tiedetään kuitenkin, että adeniinin vaihtuminen guaniiniksi mitokondriaalisen DNA:n kohdassa 3243 johtaa MT-TL1 geenin muutokseen. MT-TL1 geeni koodaa leusiinia kuljettavaa tRNA:a. Mutaation seurauksena kaikkien mitokondrioissa tuotettavien aminohappojen linkittyminen epäonnistuu ja mitokondrion proteiinien tuotanto häiriintyy. Tämä johtaa mitokondrion energiantuotannon vajavuuteen energiantuotannosta vastaavien ETC:n alayksiköiden
12 toiminnanhäiriön tai puutteen vuoksi. Toiminnan vajausta on todettu ainakin hengitysketjun komplekseissa I, III ja IV (Gunnewiek ym. 2020).
Ongelmat energiantuotannossa johtavat solutason toiminnanvajauteen, edelleen aiheuttaen kohde-elimen toiminnan vajavuutta. Häiriö esimerkiksi verisuonten sileiden lihasten ja endoteelin toiminnassa voi johtaa perfuusiohäiriöön pienissä verisuonissa, joka puolestaan voi aiheuttaa kaskadimaisesti reaktioita seuraavassa elinjärjestelmässä, kuten keskushermostossa (El-Hattab ym. 2015).
Kliininen kuva
Potilaiden kliininen kuva vaihtelee suuresti riippuen mutaatioiden määrästä suhteessa koko DNA:han (eng. mutation load) tietyssä kudoksessa. Mutaatiokuorman ollessa noin 30% havaitaan diabetesta joko yhdessä tai ilman kuulon alenemista. Toisaalta kun yli puolet mtDNA:sta on mutanttivarianttia, myopatioita, kardiomyopatioita ja neurologisia oireita esiintyy runsaammin (Gunnewiek ym. 2020).
Tyypillisiä ensioireita ovat aivoverenkiertohäiriön kaltaiset kohtaukset (eng. stroke-like episode), päänsäryt, lihasheikkous, näköhäiriöt, oksentelu sekä lyhytkasvuisuus. Näitä esiintyy yli 25% MELAS potilaista. Tajunnantasonmuutoksia, diabetesta (tyyppi 1 tai 2) tai kuulo-oireita esiintyy ensioireena 10-24 % potilaista. Yli 90 % MELAS-potilaista esiintyy muistiongelmia, aivoverenkiertohäiriön kaltaisia kohtauksia, maitohappoasidoosia ja epileptisiä kohtauksia jossain vaiheessa elämänsä aikana.
Muutoin oirekuva on hyvin laaja ja vaihtelua eri oireiden esiintymisessä kullakin potilaalla on runsaasti. Potilaan oirekuvaan voi kuulua erilaisia endokrinologisia häiriöitä, kuten diabetesta, lyhytkasvuisuutta ja/tai kilpirauhasen sekä lisäkilpirauhasen toiminnan häiriöitä (Maassen ym. 2004, Yorifuji ym. 1996, El-Hattab ym. 2015). Kardiologisia ongelmia ovat mm. dilatoiva ja hypertrofinen kardiomyopatia sekä Wolff-Parkinson-White oireyhtymä (WPW), ruoansulatuskanavan (eng. Gastro-Intestinal-track, GI-kanava) oireita ovat mm.
oksentelu, suoliston toiminnan muutokset sekä haimatulehdus. Munuaisongelmat, erilaiset ihottumat sekä verenkuvamuutokset (anemia) ovat myös mahdollisia (Kubota ym.
1999, Hotta ym. 2001, Finster 2011).
13 Diagnoosi
Oireyhtymän diagnoosi perustuu kliinisiin löydöksiin sekä mutaation osoittamiseen mtDNA:sta. MELAS diagnoosia tukevista löydöksistä on tehty kaksi erillistä suositusta vuosina 1992 ja uudempi vuodelta 2012 (Taulukko 1). Näiden kliinisten löydösten jälkeen diagnoosi varmistetaan geenitestillä.
TAULUKKO 1. MELAS diagnoosia tukevien löydösten suositukset.
Tyypillisesti geenitestaus suoritetaan leukosyyteistä, mutta heteroplasmian vuoksi voidaan joutua suorittamaan testaus muustakin kudoksesta, joista luotettavin on luurankolihasbiopsia. Diagnoosi voidaan varmistaa kohdennetulla geenitestillä, jolloin tyypillisesti kartoitetaan MT-TL1 geenin yleisin patologinen variantti m.3243A>G.
Löydöksen ollessa negatiivinen, testataan saman geenin variantit m.3271T>C sekä m.3252A>G ja lisäksi seuraavaksi yleisimmän geenin MT-ND5 patologinen variantti m.13513G>A. Toisaalta, mikäli taudinkuva on epätyypillinen ja potilaalla on useampaan perinnölliseen sairauteen viittaava oirekuva, voidaan hyödyntää muita sekvensointitekniikoita. Mikäli epäillään mtDNA:n aiheuttamaa sairautta, voidaan sekvensointi keskittää mtDNA:han tai laajentaa kattamaan myös tuman genomia joko eksoneihin tai koko genomiin.
Hirano ym. 1992 Yatsuga ym. 2012
Seuraavista kaikki
• Stroke-like episodit ennen 40 ikävuotta
• Enkefalopatia, jossa kohtauksia ja/tai dementiaa
• Myopatia, jossa
maitohappoasidoosi ja/tai ragged red fibers lihasbiopsiassa
Vähintään kaksi seuraavista
• Päänsärkyjä, joiden yhteydessä oksentelua
• Kohtausoireita
• Hemiplegia
• Kortikaalinen näönmenetys
• Akuutit paikalliset leesiot neurokuvantamisessa
Vähintään kaksi seuraavista
• Normaali varhainen
psykomotorinen kehitys
• Toistuvat päänsäryt
• Toistuvat oksentelukohtaukset
Vähintään kaksi seuraavista
• Korkea plasman tai aivo- selkäydinnesteen laktaattipitoisuus
• Lihasbiopsiassa epänormaalit mitokondriaaliset löydökset
• Patogeeninen variantti.
14 Hoito
MELAS syndroomaan ei ole parantavaa hoitoa. Arginiinia suositellaan käytettäväksi stroke- like episodien ennaltaehkäisyssä ja akuutissa kohtauksessa (El-Hattab ym 2015). CoQ10, L- karnitiini ja/tai kreatiini auttaa osalla potilaista ja niitä voidaan koettaa. Muutoin hoito keskittyy oirekuvan mukaiseen tavanomaiseen hoitoon. Esimerkiksi diabeteksessa käytetään ruokavaliohoitoa, insuliineja sekä oraalisia diabeteslääkkeitä, migreenikohtauksissa tavanomaisia kipulääkkeitä ja epileptisissä kohtauksissa epilepsialääkkeitä (Maassen ym 2004, Koening ym. 2016, El-Hattab ym. 2017).
Suosituksissa on kuitenkin erinäisiä poikkeuksia, esimerkiksi metformiinia ei tulisi käyttää maitohappoasidoosin lisääntyneen riskin vuoksi ja valproaattia ei suositella käytettäväksi kohtausten hoidossa mitokondriotoksisuuden vuoksi (Sproule ja Kaufmann 2008, Lin ja Thajeb 2007).
Ennuste
Sairaus on luonteeltaan etenevä. Oirekuva pahenee ikääntymisen myötä. Oireilevalla potilaalla on 17-kertainen riski menehtyä ennenaikaisesti sairauteen, kun verrataan vastaavaan oireettomaan kantajaan. Tyypillisesti potilaat kuolevat alle 17 vuoden kuluessa ensimmäisestä neurologisesta oireesta. Keskimääräinen elinikä MELAS-potilailla on alle 35 vuotta, mutta vaihtelua on runsaasti.
15
Tutkimus Tausta
Mitokondrioiden toiminnan häiriöt on yhdistetty useisiin hermostollisiin ja psykiatrisiin sairauksiin, kuten Parkinsonin tautiin, Alzheimerin tautiin ja skitsofreniaan. MELAS on mtDNA:n mutaation seurauksena syntyvä oireyhtymä, joka johtaa laajaan kirjoon erilaisia oireita. 80% MELAS syndroomista aiheutuu mtDNA:n m.3243A>G mutaatiosta Yksi merkittävistä oireluokista on sen aiheuttamat neurologiset oireet, joihin kuuluvat mm.
kognition ongelmat, epileptiset kohtaukset ja migreeni. Mutaation vaikutuksesta hermoston kehitykseen on olemassa vain vähän tutkittua tietoa.
Neuronien kehitys kokonaisuudessaan, sisältäen solujen migraation, aksonien kasvun ja oikean sijainnin löytämisen, on riippuvainen solun tukirangan dynamiikan, solukalvoliikenteen ja signalointiproteiinien toiminnasta (Wojnacki ja Galli 2016).
Neuronien ja erityisesti aksonien kasvu vaatii runsaasti rakennusmateriaaleja, toimivan solunsisäisen kuljetusjärjestelmän ja paljon energiaa edellä mainittujen toteuttamiseen, sillä erityisesti pitkissä neuroneissa rakennusmateriaalia vaaditaan paljon ja lopulta myös välimatkat ovat pitkiä (Vaarmann ym. 2016). Energian muodostukseen tarvitaan uusia mitokondrioita, sillä jo olemassa olevat eivät riitä kattamaan kiihtyvää energiantarvetta.
Solun soluelinten, myös mitokondrioiden, sisäinen liikenne suoritetaan solussa pääosin kinesiinin ja dyneiinin avulla. Aksoneissa on polarisoituja mikrotubuluksia, joissa +-napa on aksonien kärjessä ja - -napa on solun soomaosassa. Pienet mitokondriot liikkuvat mahdollisesti suuria herkemmin, joskaan tätä ei ole kyetty aukottomasti todistamaan.
Mitokondrioiden liikkumiseen solussa vaikuttaa lisäksi soluliman kalsiumpitoisuus. Suurilla kalsiumpitoisuuksilla mitokondriot eivät liiku, jolloin niiden kalsiumpuskurivaikutusta voidaan hyödyntää alueella (Schwarz 2013).
Mitokondrioiden vähäinen määrä tai vääränlainen sijoittuminen aksonien muodostuksen aikana tai sitä ennen estävät aksonien muodostuksen (Vaarmann ym. 2016). Myös vähäinen mitokondrioiden määrä aksonin eri osissa johtaa heikentyneeseen soluelinten kulkeutumiseen ja toimimattomiin synapseihin. Lisäksi mitokondrioiden kyky vaikuttaa solun sisäiseen Ca2+-pitoisuuteen, vaikuttaa mm. hermovälittäjäaineiden vapautumiseen (Nunnari ja Suomalainen 2012).
16 Aikaisemmissa tutkimusryhmän suorittamissa julkaisemattomissa pilottitutkimuksissa havaittiin suuren mutaatiokuorman linjojen neuriittien muodostuksen häiriintyneen, kun verrattiin niitä saman potilaan isogeenisiin kontrollilinjoihin (Kuva 6). Pilottitutkimuksessa kontrollilinjat näyttivät muodostavan suorempia, pidempiä ja järjestäytyneempiä aksoniverkostoja kun niitä verrattiin suuren mutaatiokuorman linjoihin.
KUVA 6. Pilottitutkimuksen immunofluoresenssivärjäys. Kontrollilinjoille (Ctrl) muodostuneen neuriitit ovat suorempia ja järjestäytyneempiä verrattuna suuren mutaatiokuorman (Mut) linjoihin
Tämän lääketieteen syventävien opintojen opinnäytetyön tavoitteena on tutkia tarkemmin mtDNA m.3243A>G mutaation vaikutusta hermoston kehitykseen ja erityisesti neuriittien muodostukseen. Opinnäytetyö koostuu yhteensä neljästä osakokonaisuudesta.
Tutkimuksen ensimmäinen vaihe on erilaistaa pluripotenteista kantasoluista (eng. induced pluripotent stemcells, iPSc) esihermosoluja (eng. neural progenitor cells, NPC).
Tutkimuksen seuraava vaihe oli todistaa erilaistetut solut neuronaaliseksi immunofluoresenssivärjäyksellä. Hermosoluilla suoritettiin kaksi erilaista koejärjestelyä tutkimuksen aikana. NPC:sta eristettiin RNA ja näytteet lähetettiin Helsinkiin (Biomedicum Functional Genomics Unit, FuGu) RNA-sekvensointia varten ja tuloksia analysoitiin osana syventävien opintojen opinnäytetyötä. RNA-sekvensoinnin lisäksi suoritettiin koejärjestely Cell-IQ-kuvantamislaitteistolla. Koejärjestelyssä pyrittiin tarkkailemaan solujen neuriittien muodostusta time-lapse-kuvantamisella.
Ctrl Mut
17
Materiaalit ja menetelmät
iPS-solulinjat
iPS-solulinjat ovat peräisin yhdeltä potilaalta. Potilaalla on todettu mtDNA mutaatio m.3243A>G. Kudospaloista solut on uudelleen ohjelmoitu iPSc-solulinjoiksi Helsingissä ennen tutkimuksen aloittamista (Hämäläinen ym. 2013).
Tutkimuksessa hyödynnetään saman potilaan isogeenistä kontrollia. Potilaan kudoksista on uudelleenohjelmoitu linjoja, joissa on suuri mutaatiokuorma (n. 90 %, mut) sekä alhaisen mutaatiokuorman (ctrl, mutaatiokuorma alle 3%) solulinjoja. Potilaan solulinjoista on valittu neljä linjaa opinnäytetyön tutkimuksia varten. Kaksi solulinjoista on ctrl-linjoja ja kaksi mut-linjoja.
Solujen erilaistaminen ja soluviljely
Solut on erilaistettu liitteessä 1 kuvatun menetelmän mukaisesti. Protokollasta on poikettu soluja nostettaessa sfeereiksi (eng. sphere). Rosetteja ei ole eroteltu, vaan kaikki solut on nostettu ULA-maljoille suspensiokasvatukseen (eng. Ultra-Low Attachment).
Sfeereinä soluja kasvatettiin, kunnes solut ovat 6 viikon – 4 kuukauden ikäisiä. Sfreerit ovat pallon tai soikion muotoisissa rykelmissä kasvavia soluja. Yhdessä sfeerissä on tyypillisesti 25 000 – 50 000 solua riippuen sfeerien koosta. Solujen käyttämä media vaihdettiin 3 kertaa viikossa ja sfeerejä leikattiin kerran viikossa suuremman solumäärän saamiseksi ja solukuolemien ehkäisemiseksi. Leikkauksen yhteydessä suoritettiin laadunvalvontaa ja kaikki poikkeavan ulkomuodon omaavat sfeerit poistettiin joko osittain tai kokonaan. 6 viikon jälkeen soluja yksisoluistettiin solujen maturaatiota varten.
Solujen yksisoluistaminen
Tutkimusta varten solut tuli yksisoluistaa akkutaasi-entsyymi käsittelyllä. Sfeerejä kerättiin koetta varten tarvittava määrä 15 ml putkiin 1 ml:ssa mediaa. Sfeerit sentrifugoitiin (1000 rpm, 1 min) putken pohjalle, jonka jälkeen keräämisen yhteydessä sfeerien kanssa siirtynyt media poistettiin ja putkiin lisättiin 200 µl akkutaasia. Akkutaasissa sfeerejä inkuboitiin 8 min +37 C:ssa, jonka jälkeen putkiin lisättiin kasvatuksessa käytettyä elatusliuosta siten että lopputilavuudeksi saatiin 1 ml. Sfeerit hajotettiin mekaanisesti pipetoimalla. Hajottamisen jälkeen solususpensiosta otettiin 10 µl näyte solulaskentalevylle, jonka avulla määritettiin arvio solumäärästä yhtä milllilitraa kohden. Määrityksen jälkeen tai aikana solut
18 sentrifugoitiin (1200 rpm, 3 min), akkutaasia sisältävä media poistettiin ja lisättiin tarvittava määrä elatusliuosta, jotta saatiin solususpension pitoisuudeksi 1 000 000 solua/ml.
Immunofluoresenssivärjäys
Immunofluoresenssivärjäyksen (IF) avulla pyrittiin varmistumaan, että tutkittavat solut ovat neuroprogeniittorisoluja.
IF-värjäystä varten sfeerit hajoitettiin edellä kuvatulla menetelmällä. Maturointia varten valmistettiin 48-kuoppalevy, jonka kuoppien pohjille oli asetettu halkaisijaltaan 9 mm olevat lasit. Lasit pinnoitettiin matrigeeli (MG) kerroksella. Laskennallisesti jokaista kuoppaa kohden lisättiin 100 000 solua. Soluja maturoitiin eli kypsytettiin levyllä viikon ajan.
Maturaatiovaiheen jälkeen solut kiinnitettiin laseille käyttäen 4 % formaldehydiä (FA), jonka jälkeen soluja säilytettiin + 4C yön yli PBS-liuoksessa (eng. Phosphate buffered saline).
Värjäys aloitettiin solujen permeabilisoinnilla ja peittämällä epäspesifiset vasta-aineiden tartuntakohdat ns. Blokkaus puskurin (eng. blocking buffer, BB) avulla. BB:n avulla värjäyksestä saatiin spesifinen. BB sisältää 0,1% TritonX-100 sekä 10% sian seerumia sekoitettuna PBS:iin. Soluja pidettiin BB:ssa 1 tunnin ajan huoneenlämmössä.
BB-käsittelyn jälkeen soluille lisättiin laimennettu primaarivasta-aine. Primaarivasta- aineena käytettiin 1:1000 laimennettua Tuj1-vastainetta, joka on neuronispesifinen luokan III β-tubuliini-vasta-aine. Tuj1-vasta-aine oli tuotettu hiiressä (BioLegend, Cat. 801202).
Primaarivasta-aineet laimennettiin 1:10 PBS:iin laimennetulla BB:lla. Vasta-aineen annettiin sitoutua yön yli + 4 C:ssa. Seuraavana päivänä kuopat pestiin kolmasti 1 % sian seerumilla PBS:ssa. Ja lisättiin primaarivasta-aineita vastaavat sekundaarivasta-aineet, eli Anti-mouse-vasta-aineet 1:300 laimennoksella, joita inkuboitiin huoneenlämmössä 2 tunnin ajan. Sekundaarivasta-ainekäsittelyn jälkeen solut pestiin 1 % sian seerumia sisältävällä PBS:lla 3 kertaa. Värjäykset visualisoitiin mikroskoopin avulla.
19 RNA-sekvensointi
Sekvensointia varten sfeerejä yksisoluistettiin MG-päällystetyille 6-kuoppalevyille ja maturoitiin viikon ajan. Käytetty solumäärä oli tutkimuksessa 1 000 000 solua/kuoppa.
Tämän jälkeen solut kerättiin ja soluista erilaistettiin RNA kitin avulla (RNeasy Mini, Qiagen). Eristetty RNA lähetetiin Helsinkiin missä sekvensoinnin suoritti erillinen yliopiston alaisuudessa toimiva yksikkö FuGu (Biomedicum Functional Genomics Unit). FuGu:n suorittamasta sekvensoinnista saatiin esikäsitellyt tulokset, joista tarkasteltiin erityisesti aksonien kehitykseen liittyvien geenien ilmentymistä. RNA-sekvensointitulosten käsittelyssä hyödynnettiin Microsoft Excel-ohjelmistoa, sekä verkkopohjaista Reactome pathway analysis-ohjelmistoa.
Cell-IQ-kuvantaminen
Cell-IQ-kuvantamista varten sfeerit yksisoluistettiin akkutaasi-käsittelyllä ja viljeltiin MG päällystetyille kuopille. 24-kuoppalevyn kuoppiin lisättiin laskennallisesti 100 000 solua/kuoppa. Solujen annettiin laskeutua ja kiinnittyä kuopan pohjalle noin 1 tunnin ajan, säilyttäen 24-kuoppalevyä inkubaattorissa. Tunnin kuluttua 24-kuoppalevyn kuopat huuhdottiin käyttämällä viljelmissä käytettyä mediaa, jotta päästiin eroon solujen hajottamisesta syntyneistä rikkoutuneista solujäämistä.
Solut siirrettiin kuvantamislaitteelle 1-2 tunnin kuluessa kuopille viljelemisestä, jonka jälkeen kuvaus käynnistettiin. Jokaiselta kuopalta kuvia otettiin neljästä eri kohdasta.
Kuvaus suoritettiin 2 tunnin välein ja yhden kuvauksen kesto analyysiä varten oli vähintään 4 vuorokautta.
Kuvat analysoitiin laitteen oman Cell-IQ analyzer -ohjelmiston avulla. Ohjelmisto analysoi kuvista solumäärää ja muodostuneiden neuriittien pituutta mikrometreinä. Analyysiä varten tutkittavat parametrit tuli optimoida, esimerkkikuvien avulla. Ohjelmiston antaman analyysin lisäksi tarkasteltiin solujen muodostamia neuriitteja ja niiden muodostamia haarakohtia.
20
Tulokset
Immunofluoresenssivärjäys
KUVA 7. Immunofluoresenssivärjäys tulokset. Neuronispesifinen luokan III β-tubuliini-vasta-aine Tuj1 ilmentyy kaikissa tutkituissa linjoissa. Pilottitutkimuksessa havaittua selkeää eroa isogeenisten kontrollien (Ctrl1 ja Ctrl2) ja suuren mutaatiokuorman linjojen (Mut1 ja Mut2) välillä neuriittien järjestäytymisessä ei havaittu.
Tutkimuksen ensimmäinen vaihe oli suorittaa iPSc linjojen erilaistus esihermosoluiksi.
Erilaistuksen onnistuminen varmistettiin immunofluoresenssivärjäyksellä. Jokainen tutkituista solulinjoista ilmensi Tuj1:sta (Kuva 7). Solulinjojen neuriittien muodostuksesta ja järjestäytyneisyydestä ei kyetty immunofluoresenssivärjäyksen perusteella toteamaan eroavaisuutta Ctrl ja Mut -linjojen välillä. Värjäyksen perusteella voitiin kuitenkin todeta erilaistuksessa muodostuneiden solujen olevan neuronaalisia ja erilaistusprotokollan olleen tutkimukseen soveltuva.
Ctrl1 Ctrl2
Mut1 Mut2
21 RNA-sekvensointi
RNA-sekvensointituloksia tarkasteltaessa Reactome-tietokannasta haettiin yhteensä 1374 nimikettä Ensemble gene ID:llä. Näistä tietokanta tunnisti yhteensä 752 geeniä.
Tietokannan hierarkian mukaisesti suurin määrä tuloksista osui signaalinvälitykseen (236), immuunipuolustukseen (175) ja metaboliaan (143). 88 löydetyistä geenistä osallistuivat kehitysbiologisiin prosesseihin. Näistä geeneistä 49 osallistui hermoston kehitykseen. Tässä opinnäytetyössä tarkasteltiin näitä hermoston kehitykseen liittyviä geenejä.
TAULUKKO 2. Hermoston kehitykseen assosioituneet geenit Reactome -tietokannassa. 49 geenistä suurin osa liittyy aksonien ohjautumiseen. Suurin osa näistä liittyivät puolestaan ROBO-reseptorisignalointiin ja L1CAM-vuorovaikutuksiin.
Event hierarchy No. hits/total genes
Nervous System development 49/620
Axon guidance 44/584
Semaphorin interactions 3/70
NCAM signaling for neurite out-growth 2/70
Netrin-1 signaling 6/59
Signaling by ROBO receptors 13/235
L1CAM interactions 13/130
EPH-Ephrin signaling 6/101
RET signaling 5/43
Reelin signalling pathway 0
EGR2 and SOX10-mediated initiation of Scwann cell myelination 5/39
Suurin osa löydetyistä hermoston kehitykseen liittyvistä geeneistä liittyi aksonien ohjautumiseen liittyviin geeneihin (Taulukko 2). Aksonien ohjautumiseen liittyvistä geeneistä puolestaan suurin osa liittyivät joko L1CAM-vuorovaikutukseen tai ROBO- reseptorisignalointiin. Myös RET, Netrin-1 ja EPH-Ephrin-signalointi olivat edustettuina muuttuneiden geenien joukossa.
L1CAM on neuronien erilaistumisen ja migraation kannalta olennainen aksonaalinen glykoproteiini, joka kuuluu immunoglobuliinien geeniperheeseen (GeneCards: L1CAM).
ROBO-reseptorit osallistuvat erityisesti solujen migraatioon ja aksonien navigointiin hermoston kehityksen aikana (GeneCards: ROBO1). Efriinit ovat EPH-reseptoreihin sitoutuvia proteiineja. EPH-reseptorit ovat tyrosiinikinaasireseptoreita (GeneCards:
EPHA1). Efriinien ja EPH-reseptorien vaikutuksesta vierekkäiset solut kommunikoivat keskenään ja aksonien ohjautumista tapahtuu soluvälitteisesti. RET on myös
22 tyrosiinikinaasireseptori, jonka ligandina toimii mm. GDNF (glial cell derived neurotrophic factor), joka vaikuttaa mm. solujen erilaistumiseen, kasvuun, liikkumiseen ja solujen selviytymiseen (GeneCards: RET). Netriinien, yhdessä muiden reseptorien kanssa, on arvioitu joko vetävän aksoneja tai soluja puoleensa tai hylkivän niitä, riippuen reseptorista (GeneCards: NTN1). Kokonaisuudessaan netriinin merkitystä solujen toiminnan kannalta ei ole vielä kyetty selvittämään.
KUVA 8. Heatmap hermoston kehitykseen assosioituneista geeneistä. Suurimmassa osassa löydetyistä geeneistä ilmentyminen oli korkeammalla (sininen väri) tasolla Ctrl-linjoissa. Yhteensä 11 geenin kohdalla tilanne oli päinvastainen. Vertailtaessa linjoja havaittiin mut1-linjan poikkeavan enemmän useammissa löydetyissä geeneissä.
Näistä geeneistä suurimmalla osalla geenien ilmentyminen on alentunut mut-linjoissa verrattuna ctrl-linjoihin (Kuva 8). Yhteensä 11 geenin ilmentyminen oli alhaisempaa ctrl- linjoissa. Mut1-linjassa poikkeamat olivat pääsääntöisesti suurempia verrattuna mut2- linjaan. Ctrl-linjoissa vaihtelu oli tasaisempaa.
23 Taulukko 3. Hermoston kehitykseen liittyvien geenien Log2FoldChange (l2fc), t-score ja p-arvot. Osa geeneistä liittyivät useampaan eri signalointireittiin hermoston kehityksessä.
external_gene_name l2fc t-score p
Semaphorin interactions
SEMA4D 1,150334 57,14851 0,11219
PLXNC1 -0,79697 -106,561 0,081167
ITGA1 -0,72671 -13,0437 0,243539
NCAM signaling for neurite out-growth
COL9A1 0,807317 46,1975 0,035452
SPTBN43 0,4857 59,18599 0,13991
Netrin-1 signaling
ABLIM1 1,212652 126,2228 0,11737
TRPC3 1,011061 16,49993 0,093888
SLIT11 0,554926 109,9952 0,214402
RGMB -0,32281 -71,2922 0,13365
DSCAML1 -0,72366 -79,0028 0,022463
NTN4 -1,90095 -49,4953 0,204252
Signaling by ROBO receptors
CAP2 0,890702 68,5081 0,180196
LHX2 0,780911 71,41471 0,229863
NELL2 0,700211 130,093 0,095254
PSMB10 0,646745 7,514764 0,238029
SLIT11 0,554926 109,9952 0,214402
PAK6 0,553338 44,50916 0,099324
RPL36A 0,397676 25,41695 0,035351
ROBO3 -0,45999 -31,9898 0,204565
ROBO2 -0,99789 -152,093 0,049622
L1CAM interactions
SH3GL2 1,381216 60,18403 0,221662
ANK3 1,137236 77,80981 0,149039
ANK1 0,945115 28,98705 0,158754
SCN9A 0,88466 25,96099 0,046895
DNM12 0,580022 89,59293 0,079599
SCN3B 0,505021 44,01967 0,16215
SPTBN43 0,4857 59,18599 0,13991
SCN2A 0,462532 41,33134 0,142107
ITGA2B 0,378875 17,45382 0,249833
KIF4A -0,43613 -31,1851 0,202562
DCX -0,68401 -215,363 0,23751
EPH-Ephrin signaling
EPHA7 1,606599 59,08229 0,114951
EPHA10 1,080182 21,83976 0,226215
DNM12 0,580022 89,59293 0,079599
GRIN1 0,481122 42,66018 0,06688
EFNB1 -0,3842 -89,1823 0,066146
TIAM1 -0,61425 -38,8724 0,202738
RET signaling
PIK3CD 1,056831 68,07615 0,026729
DOK6 0,873222 54,05777 0,180246
PDLIM7 0,57955 65,12393 0,239749
PIK3R1 0,417636 106,8444 0,168665
SHC1 0,376028 36,04261 0,226821
EGR2 and SOX10 mediated initiation of schwann cell myelination
PMP22 0,635895 84,56696 0,042959
PRX 0,348638 16,5586 0,174058
24 Taulukossa 3 on esitetty kaikki tutkimuksessa havaitut hermoston kehitykseen liittyvät geenit. L1CAM-vuorovaikutuksiin liittyviä geenejä oli kokonaisuudessaan 11. Näiden geenien joukossa olivat geenit ankyriini 1 ja 3, jotka molemmat ilmentyivät runsaammin ctrl-linjoissa. Ankyriinit ovat solukalvon proteiineja, jotka kiinnittyvät solun tukirankaan ja vaikuttavat mm. solun liikkumiseen (GeneCards: ANK1). Ankyriinien lisäksi L1CAM- vuorovaikutuksissa oli kolme eri Na-kanavien alayksikköä (SCN9A, SCN3B, SCN2A), jotka myös ilmentyivät vahvemmin ctrl-linjoissa. Suurin muutos L1CAM-vuorovaikutuksissa oli SH3GL2-geenin kohdalla (l2fc 1,381216). Kyseinen geeni vaaditaan BDNF-riippuvaiseen dendriittien kasvuun (GeneCards: SH3GL2). Tutkittujen geenien joukossa olivat myös geenit ROBO2 ja ROBO3. Näiden molempien geenien ilmentyminen oli alhaisempaa Ctrl- linjoissa. Toisaalta SLIT1 geenin ilmentyminen oli vahvempaa kontrollilinjoissa. SLIT1 on ROBO-reseptorien ligandi (GeneCards: SLIT1). EPH-Efriini-signalointiin liittyvissä geeneistä kaksi koodaa EPHA-reseptoreita (EPHA7 ja EPHA10) ja näistä EPHA7-geenillä oli suurin l2fc- arvo (l2fc 1,606599) tutkituista geeneistä. Pienin arvo tutkituista puolestaan oli NTN4- geenillä (l2fc -1,90095), joka kuuluu netriini-perheeseen. Netrin-1 signalointiin liittyvistä geeneistä suurin eroavaisuus oli havaittavissa ABLIM1-geenillä, joka sitoo sytoplasmassa olevan kohteen aktiinifilamenttiin (GeneCard: ABLIM1).
Tutkituista geeneistä SLIT1 oli osallisena sekä ROBO-reseptorisignalointiin että Netrin-1 signalointiin. DNM1 osallistuu sekä EPH-Efriini -signalointiin, että L1CAM- vuorovaikutuksiin. Proteiini tuottaa voimaa solun sisäisten vesikkeleiden kuljetusta varten sitoutuen mm. aktiiniin (GeneCard: DNM1). NCAM-signalointiin ja L1CAM vuorovaikutuksiin osallistuva SPTBN4 on proteiini, joka yhdistää plasmakalvoston aktiiniseen solun tukirankaan (GeneCards: SPTBN4).
25 Cell-IQ -kuvantaminen
Tätä opinnäytetyötä varten kuvantamistutkimuksia suoritettiin yhteensä kolme kappaletta.
Jokaisella tutkimuskerralla kutakin solulinjaa oli viljelty kahdelle er i kuopille. Kuopilta valittiin 2-4 kappaletta kuvattavia alueita. Tutkimuksen aikana analysoitiin 35 kpl ctrl- linjojen alueita (Ctrl1 17 kpl ja Ctrl2 18 kpl) ja 35 kpl mut-linjojen alueita (Mut1 17 kpl ja Mut2 18 kpl).
KUVA 9. Cell-IQ analyzer -ohjelmiston antama esimerkkikuva Ctrl- ja Mut-linjasta tunnistetuista neuriiteista (siniset viivat) ja lasketuista soluista (punaiset pisteet).
Cell-IQ analyzer -ohjelmistoa varten tuli optimoida kuvien analysointiparametrit, jotta voitiin mahdollisimman tarkasti ja luotettavasti arvioida neuriittien muodostumista suhteessa solujen lukumäärään (Kuva 9.). Parametreja optimoidessa parhaan neuriittien erotuskyvyn saamiseksi tuli hyväksyä pieni taustalla oleva kohina, joka otettiin huomioon tuloksia analysoitaessa. Tulosten analyysin ensimmäisessä vaiheessa taustakohina otettiin huomioon asettamalla 0-tasoksi pienin ohjelmiston antama neuriittien lukumäärä.
Solulaskennassa arvioitiin solujen kokoa ja muotoa. Optimoiduilla parametreilla ei kyetä täydelliseen solujen erotteluun, mutta saavutettiin kuitenkin paras mahdollinen laskentakyky. Solulaskurin avulla ei kyetty erottelemaan mahdollisia solujen hajottamisesta syntyneitä virhelähteitä. Ohjelmistossa itsessään on tekoälyyn perustuva kuvanvarainen luokittelujärjestelmä, joka ei kuitenkaan kyennyt erottelemaan soluja hajonneiden solujen osista. Analyysissä turvauduttiin visuaaliseen tarkasteluun arvioitaessa solujäämien aiheuttamaa virhettä. Kuvauksen alussa virhelähteitä oli runsaasti, mutta analyysiä varten tarkastellussa ajanjaksossa solujäämien määrä oli vähäinen ja solujäämien määrään pyrittiin lisäksi vaikuttamaan etsimällä optimaalinen kuvauskohta, jossa solujäämiä oli mahdollisimman pieni määrä.
Ctrl Mut
26 Kuvaaja 1. Neuriittien keskimääräinen pituuskasvu solua kohden. Tarkasteltaessa 70 tunnin ajanjaksoa neuriittien kasvun alusta linjojen välillä ei havaittu tilastollisesti merkittävää eroa ctrl- ja mut-linjojen välillä (A). Pieni ero linjojen välillä oli mahdollisesti havaittavissa, kun neuriittien kasvun alusta oli kulunut 50 h. Kun tarkasteltiin erikseen nopean pituuskasvun vaihetta (B) niin kasvunopeudessa ei ollut havaittavissa selkeää eroa. Hitaan kasvun vaiheessa (C) mut-linjojen keskimääräinen kasvunopeus hieman suurempaa ctrl-linjoihin nähden, joskin hajonta oli myös suurempaa.
Neuriittien kasvu noudatti sekä ctrl- että mut-linjoilla samaa kasvutapaa (kuvaaja 1).
Ensimmäisen 10 tunnin aikana neuriittien kasvun alkamisen oli nopean kasvun vaihe (kuvaajassa Fast growth phase), tätä seurasi hitaampi, tasaisen kasvun vaihe (kuvaajassa Standard growth phase). Suurta, tilastollisesti merkitsevää eroa ei linjojen välillä solua kohden muodostuneiden neuriittien pituuksissa havaittu tutkimuksen aikana. Noin 50 h neuriittien kasvun alkamisesta lähtien mut-ryhmän neuriitit olivat keskimäärin pidempiä solua kohden ctrl-ryhmän tuloksiin verrattuna. Tilastollista merkitsevyyttä ei kuitenkaan saavutettu.
Fast growth phase
0 2 4 6 8
0 10 20
30 ctrl
Mut
Time [h]
Neurite length/cell
Standard growth phase
10 20 30 40 50 60 70
0 20 40
60 ctrl
mut
Time [h]
Neurite length/cell
Neurite growth
0 10 20 30 40 50 60 70
0 10 20
30 Ctrl
Mut
Time [h]
Neurite length [µm]/cell
A
B C
27 Kun tarkasteltiin ainoastaan nopean kasvun vaihetta (Kuvaaja 1, B), keskimääräinen kasvunopeus oli lähes identtinen molemmissa ryhmissä (ctrl 1,4110±0,0941 µm/solu/h vs mut 1,3610±0,1018 µm/solu/h). Suurta eroa ei myöskään hajonnoissa eri aikapisteissä esiintynyt. 2h neuriittien kasvun alkamisesta variaatiokerroin ctrl-ryhmässä oli 14 % suurempi, mutta kolmessa seuraavassa aikapisteessä keskimäärin 6% pienempi, verrattuna mut-ryhmään.
Keskimääräinen kasvu tasaisen kasvun vaiheessa (Kuvaaja 1, C) oli mut-linjoilla suurempaa ctrl-linjoihin verrattuna (ctrl 0,1458±0,104 µm/solu/h vs mut 0,1942±0,0160 µm/solu/h).
Tuloksia tarkasteltaessa tulee kuitenkin huomioida mut-linjojen suurempi hajonta. Ctrl- linjoilla keskimääräinen keskihajonta koko ajanjakson aikana oli 6,0930 µm/solu/h, kun taas mut-linjoilla vastaava hajonta oli 11,9972 µm/solu/h. Hajonnat kasvoivat molemmissa ryhmissä mittausajan edetessä 10 h mittauksen alkamisesta keskihajonta ctrl-ryhmässä oli 4,6462 µm/solu/h kun taas ctrl-ryhmässä vastaava hajonta oli 6,7144 µm/solu/h. 70 h mittausjakson aloituksesta hajonta oli ctrl-ryhmässä 6,1940 µm/solu/h, kun taas mut- ryhmässä hajonta oli 11,9972 µm/solu/h. Tarkasteltaessa viimeistä ajankohtaa 70 h mittauksen aloituksesta mut-ryhmän analyyseistä 12/35 neuriittien pituus oli <15 µm/solu ja puolestaan >25 µm/solu sai 16/35 analysoiduista mittauksista. Vastaavat luvut ctrl- ryhmälle olivat <15 µm/solu 7/34 ja >25 µm/solu 10/34.
28 KUVAAJA 2. Pitkien neuriittien suhde lyhyisiin sekä neuriittien lukumäärä laskettua solua kohden. Mitattuje n tulosten perusteella ctrl-linjoissa on taipumus muodostaa pidempiä neuriitteja verrattuna mutanttilinjoihin (A). Tämä ei kuitenkaan ole säännönmukaista, mutta ctrl-linjoilla pidemmät neuriitit havaittiin suuremmassa osassa mitatuista kuvista (B). Neuriittien lukumäärä solua kohden ei kuitenkaan poikennut tilastollisesti merkitsevästi kummallakaan ryhmällä (C). Mut1 -solulinjalla hajontaa esiintyi muista poikkeavasti, mutta keskimäärin neuriitteja muodostui lukumäärällisesti yhtä suuret määrät (D).
Havaittiin tilastollisesti merkitsevä ero pitkien neuriittien lukumäärään suhteessa lyhyisii n neuriitteihin yhtä kuvaa kohden tarkasteltuna, kun vertailtiin kaikkia ctrl-linjoista analysoituja kuvia kaikkiin mut-linjojen analysoituihin kuviin (Kuvaaja 2, A, ctrl 0,7432±0,1005 vs. mut 0,4771±0,05911, p-arvo 0,0256). Kun tarkasteltiin kaikkia linjoja erikseen (Kuvaaja 2, B), havaittiin suurempaa hajontaa Ctrl-linjoissa. Kaikkein suurinta hajonta oli Ctrl1-linjassa, jossa havaittiin selkeästi kaksi erillistä populaatiota. Toisessa populaatiossa suhdelukujen keskiarvo oli huomattavasti suurempi (1,6916±0,0725). Suurin osa kaikkien linjojen mitattujen neuriittien pituuksien suhteista oli <0,5. Muiden linjojen kohdalla näin selkeää kahden eri populaation hajontaa ei havaittu. Kaikkia linjoja verratessa keskenään käyttäen Bonferronin testiä ainoastaan linjojen ctrl1 ja mut2 välillä havaittiin tilastollisesti merkitsevä ero.
Pitkien neuriittien suhde lyhyisiin neuriitteihin (yhdistetty)
Ctrl
Mut 0.0
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
Pitkien lkm/Lyhyiden lkm
Neuriittien keskimääräinen lukumäärä solua kohden (yhdistetty)
Ctrl
Mut 0.0
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
Neuriittien lkm/solu
Pitkien neuriittien suhde lyhyisiin neuriitteihin
Ctrl1
Ctrl2
Mut1
Mut2 0.0
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
Pitkien lkm/Lyhyiden lkm
Neuriittien keskimääräinen lukumäärä solua kohden
Ctrl1
Ctrl2
Mut1
Mut2 0.0
0.2 0.4 0.6 0.8
Neuriittien lkm/solu
A
B
C
D
29 Tarkasteltaessa neuriittien lukumäärää yhtä solua kohden (Kuvaaja 2, C), ctrl-ryhmässä neuriitteja muodostui 0,0196 neuriittia/solu enemmän. Hajonnan vuoksi tilastollisesti merkitsevää eroa mut- ja ctrl-ryhmän välillä ei havaittu (ctrl 0,4460±0,0180 neuriittia/solu vs. 0,4264±0,0304 neuriittia/solu). Linjoja keskenään verrattaessa ei myöskään kyetty havaitsemaan tilastollisesti merkitsevää eroa. Ctrl-linjoilla hajonta oli keskimäärin hieman pienempää mut-linjoihin verrattuna (keskihajonnat Ctrl1 0.1315, Ctrl2 0.0794, Mut1 0.1739, Mut2 0.1050), mutta tilastollista merkitsevyyttä ei linjojen välillä esiintynyt.
KUVAAJA 3. Neuriittien pituus mikrometreinä yhtä neuriittia kohden sekä yhtä solua kohden muodostuvien neuriittien keskimääräinen kokonaispituus. Tilastollisesti merkitsevää eroa ei havaittu ryhmien välillä neuriittien keskimääräisiä pituuksia tarkasteltaessa neuriittia kohden (A) tai solua kohden tarkasteltuna (C).
Linjojen sisällä vaihtelua oli Mut1-linjaa lukuun ottamatta vähän vaihtelua molemmilla tavoin tarkasteltuna (B ja D).
Neuriittien keskimääräinen pituus (yhdistetty)
ctrl
mut 0
20 40 60 80
Neuriittien pituus [µm]/Neuriitti
Neuriittien keskimääräinen pituus solua kohden (yhdistetty)
Ctrl
Mut 0
10 20 30
Neuriittien pituus [µm]/solu
Keskimääräinen neuriittien pituus
Ctrl1
Ctrl2
Mut1
Mut2 0
50 100 150
Neuriitin pituus [µm]/Neuriitti
Neuriittien keskimääräinen pituus solua kohden
Ctrl1
Ctrl2
Mut1
Mut2 0
20 40 60
Neuriittien pituus [µm]/solu
A
B
C
D
30 Neuriittien pituus oli mut-ryhmässä keskimäärin 4,577 µm pidempi ctrl-ryhmään verrattuna (ctrl 55,12 ± 2,924 µm vs. mut 59,69 ± 3,901 µm). Sekä ctrl- että mut- ryhmissä hajonnan suuruudesta johtuen tilastollisesti merkittävää eroa ei keskimääräiselle neuriittien pituudelle saatu (Kuvaaja 3, A). Kun tarkasteltiin linjoja erikseen (Kuvaaja 3, B), havaittiin, että Ctrl1 ja Mut1 linjojen tuloksissa oli havaittavissa suurempaa hajontaa verrattuna Ctr2- ja Mut2-linjoihin, ja suuresta hajonnasta johtuen Mut1-linjan keskimääräinen tulos poikkesi tilastollisesti merkitsevästi kaikista muista linjoista paitsi Ctrl1 linjasta, kun eroa arvioitiin Bonferronin testillä.
Neuriittien pituus solua kohden oli ctrl-ryhmässä 1,583 µm lyhyempi verrattuna mut- ryhmään (ctrl 23,79 µm ± 1,278 µm vs. mut 25,37 µm ± 2,146 µm) (Kuvaaja 3, C). T-testin perusteella tilastollisesti merkitsevää eroa ei kuitenkaan havaittu. Tilastollisesti merkitsevää eroa ei havaittu myöskään solulinjojen yksilöllisen tarkastelun jälkeen (Kuvaaja 3, D). Mut1-linja poikkesi myös neuriittien pituudessa solua kohti muista linjoista. Hajontaa oli merkittävästi enemmän verrattuna muihin linjoihin. Keskihajonta oli suurempaa mut- linjoissa (Ctrl 8,345 ja 6,972 vs. mut 15,46 ja 9,086). Tilastollisesti merkitsevää eroa ei statististen testien perusteella solulinjojen välillä ollut havaittavissa.
Pohdinta
MELAS-syndrooman neurologisten oireiden syytä ei ole kyetty selittämään vielä tähän päivään saakka. Vallitsevat teoriat ovat viitanneet aivojen energia-aineenvaihdunnan häiriöön tai mikrovaskulaarihäiriöihin. Tämän tutkimuksen avulla pyrittiin selvittämään mahdollisia taustatekijöitä spesifimmin juuri hermoston kehityksen kannalta.
Solujen erilaistus onnistui suunnitellusti ja kaikki käytössä olleet solulinjat ilmensivät Tuj1:sta, joka on neurospesifinen merkkiaine. Näin ollen voidaan todeta solujen erilaistukseen käytetyn protokollan olleen toimiva ja käytössä olleiden solujen olleen neuronaalisia.
Kun tarkasteltiin hermoston kehitykseen liittyvien geenien ilmentymistä RNAseq tuloksissa, havaittiin että ctrl-linjoissa useat geenit ilmenivät vahvemmin verrattuna mut-linjoihin.
Monet muuttuneista geeneistä liittyivät solujen sisäiseen aktiiniseen tukirankaan liittymiseen, joka puolestaan voi liittyä esimerkiksi soluorganellien kulkeutumiseen solun sisällä. Näiden linkkiproteiinien alentunut ilmentyminen voi haitata aksonien
31 muodostuksen kannalta tärkeää mitokondrioiden liikettä aksonia pitkin ja häiritä näin ollen neuriittien muodostusta.
Reaaliaikaisessa kuvantamisessa suuria eroja neuriittien muodostuksessa ei havaittu. Sekä nopean, että vakaan kasvun vaiheessa aksonien kasvunopeus olivat sekä ctrl että mut- ryhmässä samaa suuruusluokkaa. Ainoa mitattu ero kokeessa havaittiin neuriittien pituudessa. Ctrl-linja näyttää muodostavan enemmän pitkiä neuriitteja verrattuna mut- linjoihin.
Tässä tutkimuksessa saatujen tietojen perusteella ei voida vielä varmuudella sanoa vaikuttaako mtDNA:n m.3243A>G mutaatio hermoston kehitykseen. Yhdeltä potilaalta analysoidut RNA-sekvensointitulokset, antavat alustavaa arviota mahdollisista patofysiologisista mekanismeista. Tuloksia tulee analysoida vielä useammalta kuin yhdeltä potilaalta suuremman varmuuden saamiseksi. Reaaliaikaisessa kuvantamistutkimuksessa hajonnat olivat suuruusluokaltaan sen verran isoja ja toistojen määrä liian pieni, että varmuudella ei voida vielä todeta tulosten paikkansapitävyyttä. Varmuuden saamiseksi koe tulisi toistaa sekä samoilla soluilla, että useamman eri potilaan soluilla.
