Prosessoinnin vaikutukset luonnonmarjafraktioiden antimikrobisiin ominaisuuksiin

PROSESSOINNIN VAIKUTUKSET

LUONNONMARJAFRAKTIOIDEN ANTIMIKROBISIIN OMINAISUUKSIIN

Hirvonen Anni Pro gradu -tutkielma Ravitsemustiede Lääketieteen laitos Terveystieteiden tiedekunta Itä-Suomen yliopisto Maaliskuu 2020

Itä-Suomen yliopisto, Terveystieteiden tiedekunta

Kansanterveystieteen ja kliinisen ravitsemustieteen yksikkö Ravitsemustiede

HIRVONEN ANNI M: Prosessoinnin vaikutukset luonnonmarjafraktioiden antimikrobisiin ominaisuuksiin

Pro gradu -tutkielma, 55 sivua, 4 liitettä (3 sivua)

Ohjaajat: FT Anna Kårlund, TtM Kati Riekkinen ja Satu Hongell Maaliskuu 2020

Avainsanat: marjat, antimikrobiset yhdisteet, prosessointi

PROSESSOINNIN VAIKUTUKSET LUONNONMARJAFRAKTIOIDEN ANTIMIKROBISIIN OMINAISUUKSIIN

Marjojen myönteisten terveysvaikutusten lisäksi niillä on osoitettu olevan antimikrobisia, eli mikrobien kasvua estäviä ja hidastavia vaikutuksia. Marjojen antimikrobisten ominaisuuksien ajatellaan johtuvan muun muassa marjojen sisältämistä fenolisista yhdisteistä. Marjat voivat mahdollisesti estää patogeenisten ja elintarvikkeiden pilaajamikrobien kasvua. Marjatuotteiden prosessointi voi vaikuttaa fenolisten yhdisteiden pitoisuuksiin ja sitä kautta antimikrobisiin ominaisuuksiin. Tämän tutkielman tavoitteena oli selvittää, onko luonnonmarjafraktioilla antimikrobisia ominaisuuksia ja vaikuttaako prosessointi näihin ominaisuuksiin.

Tutkittavat tuotteet olivat kokonaiset marjat: mustikka (Vaccinium myrtillus), variksenmarja (Empetrum nigrum) ja mustaherukka (Ribes nigrum). Lisäksi tutkittiin mustikkamehun, mustikkatiivisteen, tuoreen ja kuivatun mustikkapuristekakun, bioaktiivisen mustikkahillokkeen sekä mustikka-antosyaaniuutteen antimikrobisia ominaisuuksia.

Tutkimuksissa käytetyt mikrobit olivat Listeria monocytogenes ATCC 7644, Salmonella Typhimurium ATCC 13311 ja Candida albicans ATCC 90029. Kiinteät tuotteet uutettiin etanoliin ja saatujen uutteiden sekä muiden tuotteiden kokonaisfenolipitoisuudet määritettiin Folin-Ciocalteu-menetelmällä. Antimikrobisuuskokeet toteutettiin Bioscreen C -laitteella.

Tuloksista laskettiin inhibitioprosentit, joita tarkasteltiin tilastollisesti. Tummia näytteitä laimennettiin, jotta ne soveltuisivat Bioscreen-testeihin. Tämän vuoksi tiivisteen ja antosyaaniuutteen antimikrobisuutta tutkittiin Bioscreenin lisäksi altistamalla mikrobeja laimentamattomille näytteille putkissa. Putkissa altistuksen jälkeen näytteistä valmistettiin pintaviljelyt maljoille. Maljattujen näytteiden mikrobitiheydet ja inhibitioprosentit laskettiin.

Antosyaaniuute, tiiviste ja hilloke antoivat viitteitä antimikrobisista ominaisuuksista listeria- ja salmonellakantoja vastaan, mutta tilastollisesti merkitseviä eroja ei bioaktiivista hilloketta lukuun ottamatta saatu. Hilloke esti tilastollisesti merkitsevästi listeriakannan kasvua verrattuna nollakontrolliin fenolipitoisuudella 2,5 mg/ml 24 h (p < 0,05) sekä 48 h (p < 0,05) inkuboinnin jälkeen. Näytteiden kokonaisfenolipitoisuus korreloi antimikrobisuustehon kasvun kanssa.

Tuotteiden välillä ei ollut selkeitä eroja, kun niitä tarkasteltiin samoilla fenolipitoisuuksilla, mikä viittaa siihen, että tuotteen kokonaisfenolipitoisuus vaikuttaa antimikrobisuuteen tuotetta tai sen prosessointia enemmän. Tulokseksi saatiin suuriakin inhibitioprosentteja, mutta pienen aineiston ja suurten keskihajontojen takia tilastollisesti merkitseviä tuloksia ei saatu, joten lisää tutkimusta aiheesta tarvitaan.

University of Eastern Finland, Faculty of Health Sciences School of Public Health and Clinical Nutrition

Nutrition

HIRVONEN ANNI M: The Effects of Processing on Antimicrobial Properties of Berry Fractions

Master’s Thesis, 55 p. and 4 attachments (3 pages)

Supervisors: PhD Anna Kårlund, MHS Kati Riekkinen and Satu Hongell March 2020

Keywords: berries, antimicrobial compounds, processing

THE EFFECTS OF PROCESSING ON ANTIMICROBIAL PROPERTIES OF BERRY FRACTIONS

In addition to their health effects, berries have antimicrobial properties towards many spoilage and pathogenic microbes. Antimicrobial properties have been suggested to originate from phenolic compounds of berries. However, processing of berry products may have considerable effects on phenolic compounds and therefore antimicrobial properties. The aim of this master’s thesis was to assess the antimicrobial properties of selected berry fractions and to discuss whether processing affects these properties.

Antimicrobial properties of bilberry (Vaccinium myrtillus), crowberry (Empetrum nigrum) and black currant (Ribes nigrum) were assessed. In addition, bilberry juice, bilberry concentrate, fresh and dried bilberry press cake, bioactive bilberry jam and bilberry-anthocyanin extract were analysed. Solid berry fractions were extracted with ethanol and total phenolic contents were analysed from the extracts and liquid fractions using Folin-Ciocalteu method.

Antimicrobial analysis was conducted with Bioscreen C equipment and the tested microbes were Listeria monocytogenes ATCC 7644, Salmonella Typhimurium ATCC 13311 and Candida albicans ATCC 90029. Inhibition percentages were calculated from the results and statistical analysis was performed. In addition to Bioscreen tests, antimicrobial properties of the darkest coloured berry fractions (concentrate and anthocyanin extract) were assessed by exposing microbes to non-diluted fractions in test tubes. After the exposure, samples were plate cultured and microbe densities and inhibition percentages were calculated.

Anthocyanin extract and bilberry concentrate had antimicrobial properties towards listeria and salmonella strains with relatively high inhibition percentages, but the results were not statistically significant. Bioactive jam inhibited the growth of listeria strain with total phenolic concentration of 2,5 mg/ml at timepoints 24 h (p < 0,05) and 48 h (p < 0,05) after incubation.

The concentration of total phenolics in different samples correlated with the increase of inhibition efficiency. Apart from bioactive jam, there were no clear differences between fractions within same phenolic concentrations. The results suggest that total phenolic concentration affects more on antimicrobial properties than processing of the berry product.

Because of the limited data and substantial standard deviations, more research is needed in order to get statistically significant results.

SISÄLTÖ

1 JOHDANTO ... 6

I KIRJALLISUUSKATSAUS ... 8

2 MARJOJEN BIOAKTIIVISET YHDISTEET ... 8

2.1 Kasvien sekundaarimetabolia ... 8

2.2 Polyfenolit ... 8

2.2.1 Fenolihapot ... 10

2.2.2 Antosyaanit ... 11

2.2.3 Flavonolit ja flavanolit... 12

2.2.4 Lignaanit ja tanniinit ... 13

2.2.5 Polyfenolipitoisuuteen ja -koostumukseen vaikuttavat tekijät ... 14

2.3 Terpeenit ja terpenoidit ... 15

3 MARJOJEN ANTIMIKROBISET OMINAISUUDET ... 16

3.1 Marjojen antimikrobiset vaikutukset patogeeneihin ja suoliston hyötymikrobeihin... 16

3.2 Vaikutusmekanismit ... 20

4 MARJATUOTTEIDEN PROSESSOINTI JA SEN VAIKUTUKSET FENOLISIIN YHDISTEISIIN ... 21

4.1 Murskaus ja puristus ... 21

4.2 Lämpö- ja entsymaattinen käsittely ... 21

4.3 Kuivaus ja varastointi ... 23

4.4 Polyfenolien eristäminen ... 25

II KOKEELLINEN OSA ... 26

5 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET ... 26

6 MATERIAALIT JA MENETELMÄT ... 26

6.1 Marjatuotteet ... 26

6.2 Mikrobit ... 27

6.3 Uutteiden valmistus ... 28

6.4 Kokonaisfenolipitoisuuden määrittäminen ... 28

6.5 Antimikrobisuuskokeet Bioscreen C -laitteen avulla ... 29

6.6 Antimikrobisuuskokeet maljauksen avulla ... 32

7 TULOKSET ... 33

7.1 Marjafraktioiden kokonaisfenolipitoisuudet ... 33

7.2 Antimikrobisuuskokeet Bioscreen C -laitteen avulla ... 34

7.2.1 Listeria monocytogenes ... 34

7.2.2 Salmonella Typhimurium ... 36

7.2.3 Candida albicans ... 38

7.3 Antimikrobisuuskokeet putkialtistuksen avulla ... 40

8 POHDINTA ... 41

8.1 Kokonaisfenolipitoisuudet ... 41

8.2 Antimikrobisuuskokeet Bioscreen C -laitteella ... 42

8.3 Antimikrobisuuskokeet putkialtistuksen avulla ... 45

8.4 Prosessoinnin vaikutukset antimikrobisiin ominaisuuksiin ... 46

8.5 Jatkotoimenpiteet ja sovellutukset ... 47

9 JOHTOPÄÄTÖKSET ... 48

LÄHTEET ... 50

LIITTEET ... 56

Liite 1. Näytteiden antimikrobisuus Bioscreen-testeissä. ... 56

Liite 2. Puhdasaineiden antimikrobisuus Bioscreen-testeissä. ... 57

Liite 3. Kokonaisfenolipitoisuuden korrelaatio antimikrobisuuden kanssa. ... 58

Liite 4. Aikapisteiden 24 h ja 48 h väliset erot inhibitiotehokkuudessa. ... 58

1 JOHDANTO

Marjat ovat tärkeä osa pohjoismaista ruokavaliota. Tärkeimpiä luonnonvaraisia marjoja pohjoismaissa ovat puolukka (Vaccinium vitis-idaea), mustikka (Vaccinium myrtillus), vadelma (Rubus idaeus), lakka (Rubus chamaemorus), karpalo (Vaccinium oxycoccos), tyrni (Hippophae rhamnoidesja) ja variksenmarja (Empetrum nigrum) (Puupponen-Pimiä ym.

2005a). Marjoissa on runsaasti kuitua, vitamiineja, mineraaleja, fenolisia yhdisteitä ja orgaanisia happoja. Marjoilla on monia myönteisiä terveysvaikutuksia, joiden ajatellaan johtuvan osittain fenolisista yhdisteistä (Puupponen-Pimiä ym. 2005a). Esimerkiksi mustikalla on osoitettu olevan muun muassa sydän- ja verisuonitaudeilta suojaavia, anti-inflammatorisia sekä hypoglykeemisiä ominaisuuksia (Smeriglio ym. 2014).

Tunnettujen terveysvaikutusten lisäksi marjoilla on osoitettu olevan antimikrobisia, eli mikrobien kasvua estäviä ominaisuuksia (Smeriglio ym. 2014). Monet kasvit tuottavat antimikrobisia yhdisteitä suojautuakseen haitallisia patogeenisiä bakteereita, viruksia ja sieniä vastaan (González-Lamothe ym. 2009). Nämä bioaktiiviset yhdisteet estävät kasville haitallisten mikrobien kasvua. Marjojen bioaktiivisilla yhdisteillä, kuten fenoleilla ja orgaanisilla hapoilla, on osoitettu olevan antimikrobisia vaikutuksia kasveille haitallisten mikrobien lisäksi myös moniin ihmisen patogeeneihin (Puupponen-Pimiä ym. 2005a). Marjat sisältävät usein paljon enemmän bioaktiivisia yhdisteitä kuin vihannekset ja muut hedelmät (Häkkinen ym. 1999; Koponen ym. 2007). Marjojen antimikrobisia ominaisuuksia voitaisiin hyödyntää moniin elintarvike-, luontaistuote- ja lääketeollisuuden sovellutuksiin, esimerkiksi parantamaan säilyvyyttä.

Suomen metsissä kasvaa yli 500 miljoona kg metsämarjoja joka vuosi, mutta vain 3−10 % niistä poimitaan (Arktiset aromit 2018). Suomen metsissä on siis paljon hyödyntämättömiä polyfenoleita ja muita bioaktiivisia yhdisteitä. Lisäksi marjamehujen puristuksessa syntyy sivuvirtana suuret määrät puristekakkua, joka sisältää suurimman osan marjojen polyfenoleista ja kuidusta (Klavins ym. 2018). Metsämarjojen ja puristekakun tehokkaammalla hyödyntämisellä voitaisiin kehittää terveyttä edistävien tuotteiden lisäksi uusia marjojen antimikrobisia ominaisuuksia hyödyntäviä sovellutuksia.

Tämän pro gradu -tutkielman tavoitteena oli selvittää, onko luonnonmarjafraktioilla antimikrobisia ominaisuuksia sekä sitä, vaikuttaako tuotteiden prosessointi näihin ominaisuuksiin. Kirjallisuuskatsauksessa tarkasteltiin marjojen bioaktiivisia yhdisteitä ja niiden

antimikrobisia ominaisuuksia sekä prosessoinnin vaikutuksia niihin keskittyen etenkin mustikkaan, mustaherukkaan ja variksenmarjaan. Kokeellisessa osassa tarkasteltiin valittujen mikrobien kasvua marjatuotteille altistuksen jälkeen in vitro. Tutkielma toteutettiin yhteistyössä Extrx oy:n kanssa.

I KIRJALLISUUSKATSAUS

2 MARJOJEN BIOAKTIIVISET YHDISTEET

2.1 Kasvien sekundaarimetabolia

Kasvit tuottavat sekundaarisia aineenvaihdunnan tuotteita suojautuakseen tauteja ja tuholaisia vastaan, ja nämä yhdisteet voivat toimia myös muun muassa signaalien välittäjinä (Verpoorte ja Alfermann 2000). Sekundaariset aineenvaihdunnan tuotteet eivät ole välttämättömiä kasvien elinkelpoisuuden kannalta, mutta niitä tarvitaan muun muassa kasvin ja ympäristön väliseen vuorovaikutukseen. Tämä parantaa kasvin selviytymismahdollisuuksia ekosysteemissä (Verpoorte ja Alfermann 2000). Lisäksi sekundaariset aineenvaihdunnan tuotteet vaikuttavat hedelmien kypsymiseen (Karppinen ym. 2016a). Tärkeimpiin sekundaarisiin aineenvaihdunnan tuotteisiin kuuluvat yhdisteet ovat terpenoidit, alkaloidit (Verpoorte ja Alfermann 2000) ja polyfenolit (Gutiérrez-Del-Río ym. 2018).

2.2 Polyfenolit

Polyfenolit ovat kasvien sekundaarisia aineenvaihdunnan tuotteita, ja ne koostuvat vähintään yhdestä fenolisesta hiilirenkaasta ja vähintään yhdestä hydroksyyliryhmästä (Gutiérrez-Del- Río ym. 2018). Niihin kuuluu yli 10 000 erilaista yhdistettä, joilla monilla on osoitettu olevan antimikrobisia ominaisuuksia. Polyfenolit voidaan jakaa kemiallisen rakenteen perusteella fenolihappoihin, flavonoideihin, stilbeeneihin, lignaaneihin, kumariineihin ja tanniineihin (Kuva 1). Flavonoidit muodostavat 60 % polyfenoleista ja ne voidaan jakaa edelleen pienempiin alaryhmiin, joita ovat antosyanidiinit, flavonolit, flavonit, flavanonit, flavanolit ja isoflavonoidit (Gutiérrez-Del-Río ym. 2018). Marjat sisältävät polyfenoleista erityisen runsaasti flavonoideja, fenolihappoja, lignaaneja ja tanniineja (Puupponen-Pimiä ym. 2005a).

Kuvassa 1 on esitetty esimerkkejä marjoissa esiintyvistä polyfenoleista. Aikaisempien tutkimusten mukaan tuoreen mustikan kokonaisfenolipitoisuus on noin 400−600 mg/100 g (Mikulic‐Petkovsek 2012; Karcheva-Bahchevanska ym. 2017; Tian ym. 2017), variksenmarjan noin 430−450 mg/100 g (Dudonné ym. 2015; Tian ym. 2017) ja mustaherukan noin 90−170 mg/100 g (Mikulic‐Petkovsek 2012; Nour ym. 2013).

Kuva 1. Polyfenolien luokittelu ja esimerkkejä marjoissa esiintyvistä polyfenoleista (muokattu Puupponen-Pimiä ym. 2005a; Gutiérrez-Del-Río ym. 2018).

Polyfenolit

Lignaanit

- Sekoiso- larisiresinoli:

Stilbeenit Flavonoidit

Antosyanidiinit

- Pelargonidiini - Delfinidiini - Peonidiini - Petunidiini - Malvidiini - Syanidiini:

Flavonolit

- Myrisetiini - Kemferoli - Kversetiini:

Flavanolit

- Gallokatekiini - Epigallokatekiini - (-)-epikatekiini - (+)-katekiini:

Flavonit Flavanonit Isoflavonoidit

Kumariinit Tanniinit

Gallotanniinit Ellagitanniinit:

- Kasuariktiini Proantosyanidiinit:

- Trimeerinen prosyanidiini:

Fenolihapot Hydroksi- kanelihapot:

- Kahvihappo -p-kumaari- happo

- Ferulahappo Hydroksi- bentsoehapot:

-p-hydroksi- bentsoehappo - Gallushappo:

2.2.1 Fenolihapot

Fenolihapot voidaan jakaa hydroksikanelihappoihin ja hydroksibentsoehappoihin (Mattila ym.

2006; Kuva 2). Neljä yleisintä hydroksikanelihappoa ovat p-kumaarihappo, kahvihappo, ferulahappo ja sinappihappo. Vastaavasti neljä yleisintä hydroksibentsoehappoa ovat p-hydroksibentsoehappo, protokatekiinihappo, vaniljahappo ja syringihappo. Fenolihapot esiintyvät yleensä sitoutuneessa muodossa: hydroksikanelihapot usein kiinihappoon tai glukoosiin sitoutuneina estereinä ja hydroksibentsoehapot glukoosiin sitoutuneena (Mattila ym.

2006).

(a)

(b)

Kuva 2. (a) Hydroksibentsoehappojen ja (b) hydroksikanelihappojen kemialliset rakenteet (muokattu Häkkinen ja Törrönen 2000).

Mustikka sisältää fenolihapoista eniten syringihappoa ja kahvihappoa, variksenmarja syringihappoa ja p-kumaarihappoa sekä mustaherukka p-kumaarihappoa ja protokatekiinihappoa (Mattila ym. 2006; Taulukko 1). Mustikassa on gallushappoa noin 1,5−3,2 mg/100 g, syringihappoa 13,9−15,2 mg/100 g, p-kumaarihappoa 6,1−8,1 mg/100 g, kahvihappoa 9,5−10,6 mg/100 g, vaniljahappoa 6,0−6,9 mg/100 g ja ferulahappoa 1,1−1,2 mg/100 g riippuen kasvuvuodesta. Mustikka sisältää enemmän kahvihappoa, vaniljahappoa ja p-kumaarihappoa kuin variksenmarja, mustaherukka ja puolukka.

Mustaherukka ja puolukka taas sisältävät enemmän gallushappoa ja p-hydroksibentsoehappoa kuin mustikka ja variksenmarja (Mattila ym. 2006). Häkkisen ja Törrösen (2000) tutkimuksessa saatiin pienempiä fenolihappopitoisuuksia mustikalle: p-kumaarihapon pitoisuus mustikassa oli noin 2,4 mg/100 g ja kahvihapon noin 0,4 mg/100 g.

Hydroksibentsoehappo R1 R2 p-hydroksi-

bentsoehappo

H H

Gallushappo OH OH

Hydroksikanelihappo R1 p-kumaarihappo H

Kahvihappo OH

Ferulahappo OCH3

Taulukko 1. Marjojen fenolihappopitoisuuksia (mg/100 g per tuorepaino) (muokattu Mattila ym. 2006).

Mustikka 2003 Mustikka 2005 Variksenmarja Mustaherukka Puolukka KAH 9,5 ± 0,45 10,6 ± 0,35 2,8 ± 0,20 3,5 ± 0,22 4,5 ± 0,35 FER 1,1 ± 0,12 1,2 ± 0,21 0,5 ± 0,02 1,3 ± 0,07 1,5 ± 0,12

SIN 0,3 ± 0,04 0,5 ± 0,07 ND 1,2 ± 0,03 0,3 ± 0,02

PRO ND 7,4 ± 0,07 4,4 ± 0,22 4,5 ± 0,41 4,4 ± 0,04

VAN 6,0 ± 0,25 6,9 ± 0 3,3 ± 0,21 0,7 ± 0,04 0,9 ± 0,08

P-KUM 6,1 ± 0,40 8,1 ± 0,64 6,1 ± 0,26 4,7 ± 0,29 3,5 ± 0,26

P-OHB ND ND ND 1,4 ± 0,13 1,3 ± 0,09

SYR 13,9 ± 0,60 15,2 ± 0,92 14,2 ± 0,49 ND ND

KAN ND ND ND ND 3,6 ± 0,36

GAL 3,2 ± 0,35 1,53 ± 0,02 1,5 ± 0,06 5,5 ± 0,43 4,4 ± 0,35 KAH = kahvihappo, FER = ferulahappo, SIN = sinappihappo, PRO = protokateniikihappo, VAN = vaniljahappo, P-KUM = p-kumaarihappo, P-OHB = p-hydroksibentsoehappo, SYR = syringihappo, KAN = kanelihappo, GA = gallushappo, ND = ei havaittu.

2.2.2 Antosyaanit

Antosyaanit ovat flavonoideihin kuuluva alaryhmä, joita tummat marjat sisältävät paljon (Puupponen-Pimiä ym. 2005a). Antosyaanit ovat konjugoituneita antosyanidiineja, joita kasveissa esiintyy kuusi kappaletta: pelargonidiini, syanidiini, delfinidiini, peonidiini, petunidiini ja malvidiini (Del Rio ym. 2010; Kuva 3). Antosyaani muodostuu antosyanidiinista ja konjugoituneesta sokeriosasta, kuten glukoosista, soforoosista, rutinoosista, ramnoosista, galaktoosista, arabinoosista tai xyloosista (Del Rio ym. 2010). Antosyaaneja on tutkittu marjojen sisältämistä yhdisteistä eniten ja niiden ajatellaan osittain selittävän marjojen lukuisia terveysvaikutuksia (Smeriglio ym. 2014). Ne saavat aikaan etenkin marjojen sinisen ja violetin värin.

Kuva 3. Antosyanidiinien kemiallinen rakenne (muokattu Del Rio ym. 2010).

Mustikat sisältävät erityisen runsaasti antosyaaneja verrattuna muihin marjoihin (Smeriglio ym.

2014). Antosyaanien kokonaismäärä mustikassa on noin 300−700 mg/100 g tuorepainoa kohti (Smeriglio ym. 2014) ja ne muodostavat 95 % mustikan kokonaisfenolien määrästä (Tian ym.

Antosyanidiini R1 R2 Väri

Pelargonidiini H H Puna-oranssi

Syanidiini OH H Punainen

Delfinidiini OH OH Vaaleanpunainen Peonidiini OCH3 H Sini-violetti Petunidiini OCH3 OH Violetti Malvidiini OCH3 OCH3 Puna-violetti

2017). Koposen ym. (2007) tutkimuksessa mustikassa oli antosyaaneja 516−611 mg/100 g, variksenmarjassa 360 mg/100 g ja mustaherukassa 201 mg/100 g. Mustikat sisältävät useita eri antosyaaneja, joista tärkeimpiä ovat delfinidiinin ja syanidiinin glykosidit (Koponen ym. 2007;

Tian ym. 2017). Näiden lisäksi mustikka sisältää pienempiä määriä malvidiinin, petunidiinin ja peonidiinin glykosideja. Esimerkiksi Müllerin ym. (2012) tutkimuksessa tuoreen mustikan, mustikkamehun ja mustikkanektarin merkittävimmät antosyaanit olivat delfinidiini-3-O- glukopyranosidi, delfinidiini-3-O-galaktopyranosidi ja syanidiini-3-O-arabinopyranosidi.

Variksenmarja sisältää antosyaaneista eniten malvidiinin ja delfinidiinin gykosideja, seuraavaksi eniten syanidiinin glykosideja sekä pienempiä määriä peonidiinin ja petunidiinin glykosideja (Koponen ym. 2007). Mustaherukka sisältää antosyaaneista vain lähinnä delfinidiinin ja syanidiinin glykosideja. Punaiset marjat sisältävät paljon vähemmän antosyaaneja kuin tummat marjat, esimerkiksi puolukka vain noin 78 mg/100 g ja mansikka noin 35 mg/100 g (Koponen ym. 2007).

2.2.3 Flavonolit ja flavanolit

Marjojen tyypillisimpiä flavonoleja ovat myrisetiini, kversetiini ja kemferoli (Del Rio ym.

2010; Kuva 4). Flavonolit esiintyvät ruoassa usein O-glukosidi-muodossa, eli sokeritähteeseen kiinnittyneinä. Tyypillisin sokeritähde on D-glukoosi. Mustikka sisälsi Häkkisen ym. (1999) tutkimuksessa vähemmän flavonoleja kuin mustaherukka ja variksenmarja. Tutkimuksen mukaan mustaherukassa on yhteensä noin 11,5 mg/100 g flavonoleja, joista kversetiiniä 4,4 ja myrisetiiniä 7,1 mg/100 g. Mustikassa on yhteensä flavonoleja 4,3−5,1 mg/100 g riippuen kasvuvuodesta, joista kversetiiniä noin 3 mg/100 g ja myrisetiiniä 1,4−2,1 mg/100 g.

Variksenmarjassa puolestaan on flavonoleja 10,2 mg/100 g, joista kversetiiniä 5,3 ja myrisetiiniä 4,9 mg/100 g (Häkkinen ym. 1999). Kokonaisfenolien määrään verrattuna mustikka sisältää suhteellisen vähän flavonoleja.

Kuva 4. Flavonolien kemiallinen rakenne (muokattu Häkkinen ja Törrönen 2000).

Flavonoli R1 R2

Kversetiini OH H

Myrisetiini OH OH

Kemferoli H H

Marjoissa esiintyviä flavanoleja ovat muun muassa allokatekiini, epigallokatekiini, (-)-epikatekiini ja (+)-katekiini (Puupponen-Pimiä ym. 2005a). Esimerkkejä katekiinien kemiallisesta rakenteesta on esitetty kuvassa 5. Flavanolit muodostavat yhteen sitoutuneina polymeerisiä proantosyanidiineja eli kondensoituneita tanniineja, mutta niitä esiintyy marjoissa jonkin verran myös monomeerisessä muodossa (Del Rio ym. 2010). Flavanoleja on marjoissa kuitenkin vain pieniä pitoisuuksia ja esimerkiksi vihreä tee ja kaakao sisältävät niitä paljon runsaammin (Del Rio ym. 2010).

Kuva 5. Flavanolien (katekiinien) kemiallinen rakenne (muokattu Puupponen-Pimiä ym. 2001)

2.2.4 Lignaanit ja tanniinit

Tanniinit ovat monimutkaisia fenolisia polymeerejä, jotka muodostuvat useista flavonoideista tai fenolihapoista (Puupponen-Pimiä ym. 2005a). Tanniinit voidaan jakaa hydrolysoituviin ja kondensoituihin tanniineihin. Gallotanniini ja ellagitanniini kuuluvat hydrolysoituviin tanniineihin. Vadelma, tyrni ja lakka sisältävät tummia marjoja enemmän tanniineja, erityisesti ellagitanniineja. Kondensoituneita tanniineja kutsutaan proantosyanidiineiksi ja ne saavat aikaan karvaan maun (Puupponen-Pimiä ym. 2005a). Esimerkiksi puolukka ja karpalo sisältävät paljon proantosyanidiineja (Kylli ym. 2011). Proantosyanidiinit koostuvat pääasiassa flavanoleista: katekiinista, epikatekiinista, gallokatekiinista tai epigallokatekiinista.

Esimerkiksi kuvasta 1 nähdään, että trimeerinen proantosyanidiini koostuu kolmesta katekiinimolekyylistä. Tanniineilla ja proantosyanidiineilla ajatellaan olevan voimakkaat antimikrobiset vaikutukset (Puupponen-Pimiä ym. 2005a).

Lignaanit muodostuvat tyypillisesti kahdesta kanelihapon tähteestä (Smeds ym. 2012).

Tyypillisiä lignaanin lähteitä ovat esimerkiksi seesaminsiemenet, linssit, pähkinät ja viljatuotteet, mutta niitä esiintyy myös pieniä määriä marjoissa. Mansikka, puolukka, karpalo ja karhunvatukka sisältävät marjoista eniten lignaaneja (Mazur ym. 2000). Mustikka sisälsi lignaaneja Smedsin ym. (2012) tutkimuksessa 2,8 mg/100 g ja mustikan siemen 13,8 mg/100 g

Flavanolit R1 R2

(+)-katekiini OH H

(-)-epigallokatekiini OH OH

kuivapainoa kohti. Mustaherukassa taas oli 1,0 mg/g ja sen siemenissä 2,3 mg/100 g lignaaneja kuivapainoa kohti. Mustikka sisälsi lignaaneista eniten syringaresinolia, kun taas mustaherukka ei sisältänyt sitä lainkaan. Seuraavaksi eniten mustikassa esiintyi medioresinolia, larisiresinolin seskvilignaaneja ja sekoisolarisiresinolia. Mustaherukka sisälsi eniten sekoisolarisiresinolia ja pienemmän määrän muita lignaaneja (Smeds ym. 2012).

2.2.5 Polyfenolipitoisuuteen ja -koostumukseen vaikuttavat tekijät

Antosyaanien määrä vaihtelee merkittävästi riippuen lajikkeesta, kasvuolosuhteista ja marjan kypsyydestä (Smeriglio ym. 2014). Tämä vaikeuttaa eri maissa ja alueilla kasvaneiden marjojen vertailua eri tutkimuksissa. Mitä kypsempi mustikka, sitä suurempi on sen antosyaanipitoisuus (Smeriglio ym. 2014). Raaka mustikka sisältää kypsää enemmän karotenoideja, proantosyanidiineja, flavonoleja ja hydroksikanelihappoja, kun taas marjan kypsyessä niiden pitoisuudet laskevat ja antosyaanien määrä nousee (Karppinen ym. 2016a). Luonnonmukaisesti ja tavanomaisesti tuotettujen marjojen polyfenolikoostumusten ei ole havaittu eroavan toisistaan (Häkkinen ja Törrönen 2000; Sablani ym. 2010). Luomuvadelmat ja -pensasmustikat eivät eronneet polyfenolipitoisuudeltaan tai -koostumukseltaan tavanomaisesti tuotetuista (Sablani ym. 2010). Luomumansikat eivät myöskään eronneet flavonoli- ja fenolihappokoostumukseltaan tavanomaisesti tuotetuista (Häkkinen ja Törrönen 2000).

Kasvuvuosi, kasvupaikan sijainti, lämpötila ja valon määrä vaikuttavat merkittävästi marjojen polyfenoleihin (Karppinen ym. 2016a). Antosyaanien määrä mustikassa on sitä suurempi, mitä korkeammalla merenpinnasta kasvupaikka sijaitsee (Zoratti ym. 2015) ja mitä pohjoisimmille leveyspiireille mennään (Åkerström ym. 2010). Marjojen antosyaanien (Lätti ym. 2008) sekä flavonolien ja fenolihappojen (Häkkinen ja Törrönen 2000) määrä ja laatu vaihtelevat eri puolilla Suomea. Pohjois-Suomen mustikoissa on enemmän antosyaaneja, ja ne sisältävät antosyaaneista eniten delfinidiinin glykosideja, kun taas Etelä-Suomen mustikoissa on vähemmän antosyaaneja ja niiden tavallisimmat antosyaanit ovat syanidiinin glykosidit (Lätti ym. 2008). Kuitenkin Etelä-Suomessa viljeltyjen pensasmustikoiden flavonoli- ja fenolihappopitoisuudet olivat suurempia kuin Itä-Suomessa viljeltyjen (Häkkinen ja Törrönen 2000).

Matalampi kasvulämpötila saattaa lisätä antosyaanien määrää (Hyvärinen 2001). Kuitenkin Ulebergin (2012) tutkimuksessa korkeampi kasvulämpötila (18 °C) sai aikaan suuremmat antosyaanipitoisuudet mustikassa kuin matalampi lämpötila (12 °C), mutta kokonaisfenolien

määrään lämpötilalla ei ollut vaikutusta. Tutkimuksessa matalampi kasvulämpötila sai aikaan suuremmat pitoisuudet flavonoleja ja hydroksikanelihappoja kuin korkeampi lämpötila, kun taas korkeammassa kasvulämpötilassa kiinihapon pitoisuus oli mustikassa suurempi kuin matalassa lämpötilassa. Suurempi valon määrä ja pidempi aika valoa lisäävät mustikan antosyaanien, flavonolien, hydroksikanelihappojen ja kokonaisfenolien määriä (Karppinen ym.

2016a). Antosyaanien ja muiden polyfenolien määrät marjoissa siis vaihtelevat eri vuosien välillä kasvuolosuhteiden mukaan.

2.3 Terpeenit ja terpenoidit

Kasvit tuottavat aromaattisia, eteerisiä öljyjä, jotka saavat aikaan kasvin tuoksun (Gutiérrez- Del-Río ym. 2018). Eteeristen öljyjen tehtävänä on houkutella pölyttäjiä ja karkottaa kasvia syöviä eläimiä sekä toimia kasvun säätelijöinä ja signaalien välittäjinä. Ne koostuvat 20−60 eri yhdisteestä, jotka kuuluvat pääosin terpeeneihin ja terpenoideihin. Monoterpeenit muodostavat 90 % eteerisistä öljyistä. Terpeenit muodostuvat isopreeniyksiköistä, esimerkiksi monoterpeeni kahdesta isopreenistä ja triterpeeni kuudesta isopreenistä. Kasveissa esiintyviä terpeenejä ovat esimerkiksi karvakroli, sitraali, linaloli ja geranioli. Toisin kuin terpeenit, terpenoidit koostuvat isopreeniyksiköiden lisäksi muistakin alkuaineista kuin hiilestä ja vedystä (Gutiérrez-Del-Río ym. 2018). Triterpenoideja esiintyy kasveissa vapaina, esteröityneinä sekä happoina (Szakiel ym. 2012). Lisäksi esimerkiksi kasvisterolit kuuluvat triterpenoideihin. Eteerisillä öljyillä on osoitettu olevan antimikrobisia ominaisuuksia useita mikrobeja vastaan (Gutiérrez-Del-Río ym.

2018).

Marjat sisältävät fenolisten yhdisteiden lisäksi muitakin bioaktiivisia yhdisteitä, kuten terpenoideihin kuuluvia karotenoideja (Karppinen ym. 2016b). Mustikka sisälsi Karppisen ym.

(2016b) tutkimuksessa karotenoideja yhteensä 359 μg/100 g tuorepainoa kohti, joista suurin osa oli luteiinia (184 μg/100 g) ja β-karoteenia (47 μg/100 g). Kuitenkin mustikan kypsyessä karotenoidien määrä vähenee ja raaka marja sisältää karotenoideja paljon kypsää enemmän.

Mustikan triterpenoidikoostumus määritettiin Szakielin ym. (2012) tutkimuksessa. Mustikan lehdistä ja marjoista määritettiin kymmeniä triterpenoideja, joista eniten havaittiin β-amyriiniä, oleanolihappoa, ursolihappoa ja sitosterolia. Mustikka sisälsi triterpenoideja yhteensä 4,7 mg/g kuivapainoa kohti, joista suurin osa oli triterpeenihappoja. Mustikan lehden ja mustikan marjojen triterpenoidikoostumukset poikkesivat jonkin verran toisistaan. Vaihtelua esiintyi myös suomalaisten ja puolalaisten mustikoiden välillä (Szakiel ym. 2012). Suurin osa marjoilla tehdyistä tutkimuksista keskittyy kuitenkin fenolisiin yhdisteisiin, erityisesti antosyaaneihin ja

tietoa marjojen muista bioaktiivisista yhdisteistä on rajallisesti (Karppinen ym. 2016a).

Terpenoidien ja muiden bioaktiivisten yhdisteiden määrät marjoissa ovat lisäksi usein pienempiä verrattuna polyfenolien määrään ja tutkimustieto niiden merkityksestä on vähäistä.

3 MARJOJEN ANTIMIKROBISET OMINAISUUDET

3.1 Marjojen antimikrobiset vaikutukset patogeeneihin ja suoliston hyötymikrobeihin

Marjojen antimikrobisia ominaisuuksia on tutkittu esimerkiksi suomalaisella mustikalla, puolukalla, vadelmalla, mustaherukalla, mansikalla, tyrnillä ja lakalla (Puupponen-Pimiä ym.

2001; Taulukko 2). Tutkimuksessa marjajakeet estivät gram-negatiivisten Escherichia coli -kantojen ja Salmonella enterica -bakteerin kasvua, mutta eivät gram-positiivisten laktobasillien kasvua. Samojen tekijöiden toisessa tutkimuksessa eri marjajakeet estivät parhaiten stafylokokki- ja salmonellakantojen kasvua, mutta eivät laktobasillien kasvua (Puupponen-Pimiä ym. 2005b; Taulukko 2). Karpalo oli tutkimuksen ainoa marja, joka esti gram-positiivisten listeriakantojen kasvua. Pacheco‐Ordazin ym. (2018) tutkimuksessa saatiin samankaltaiset tulokset: fenoliset puhdasaineet estivät elintarvikepatogeenien kasvua, mutta eivät probioottisten laktobasillien kasvua. Tutkimuksessa oli käytetty patogeenisina bakteereina E. coli- ja Salmonella Typhimurium -bakteereita sekä probioottisina bakteereina Lactobacillus rhamnosus GG- ja Lactobacillus acidophilus -bakteeria, joita oli altistettu katekiinille, gallushapolle, vaniljahapolle, ferulahapolle ja protokatekiinihapolle (Pacheco‐Ordaz ym.

2018). Näiden tutkimustulosten perusteella marjat voivat estää monien patogeenisten mikrobien kasvua, mutta eivät terveydelle edullisten suolistomikrobien, kuten laktobasillien kasvua.

Suomalaisessa tutkimuksessa tarkasteltiin eri marjajakeiden antimikrobisia ominaisuuksia tyypillisiä ruokamyrkytyksen aiheuttajia ja patogeeneja, kuten Candida albicans-, Escherichia coli-, Micrococcus luteus- ja Staphylococcus aureus -mikrobeita vastaan (Rauha ym. 2000;

Taulukko 2). Voimakkaimmat antimikrobiset vaikutukset olivat lakalla ja vadelmalla, minkä ajateltiin johtuvan niiden runsaasti sisältämistä ellagitanniineista. Mustikka ja variksenmarja estivät myös kohtalaisen hyvin M. luteus -bakteerin kasvua ja variksenmarja Bacillus substilis -bakteerin kasvua (Rauha ym. 2000). Toisessa tutkimuksessa mustikka esti hyvin Bacillus cereus-, Clostridium perfringens-, Helicobacter pyroli- ja Staphylococcus aureus -bakteerien kasvua (Nohynek ym. 2006; Taulukko 2). Puolukka esti B. cereus- ja Staphylococcus epidermis -bakteerien kasvua. Variksenmarja esti puolestaan vain B. cereus -bakteerin kasvua.

Taulukko 2. Marjojen antimikrobisuusaktiivisuuksia eri mikrobikantoja vastaan.

Mustikan, pensasmustikan sekä niiden kuorien antimikrobisten ominaisuuksien eroja on vertailtu käyttäen agar-diffuusiomenetelmää (Burdulis ym. 2009). Menetelmässä maljalle levitetään mikrobisuspensiota ja maljaan porattuihin kuoppiin pipetoidaan marjauutetta.

Inkuboinnin jälkeen kuoppien ympärille muodostuneiden estokehien halkaisijat mitataan.

Selkeitä eroja pensas- ja metsämustikan välille ei kuitenkaan tutkimuksessa saatu eikä eroja kokonaisten marjojen ja niiden kuorien välille. Yleisesti ottaen kaikilla näytteillä oli kohtalainen tai hyvä antimikrobinen teho käytettyjä mikrobeja vastaan, joista herkimpiä olivat Citrobacter freundii ja Enterococcus faecalis. Kahdeksan tutkittua hiivakantaa, kuten Candida parapsilosis, olivat kaikista vastustuskykyisimpiä mustikka- ja pensasmustikkauutteille ja

Mustikka Mustaherukka Variksenmarja Puolukka

Bacillus cereus −¹

++++³

++++³ +++++⁶

+++¹ ++++³

−¹ ++++³

Bacillus subtilis +² +²

++++⁶

++² +²

Bifidobacterium lactis −⁵ −⁵ −⁵

Candida albicans +²

−³ −^2,3 −^2,3 −^2,3

Campylobacter jejuni −³ −³ −³ −³

Clostridium perfringens +++³ +³ −³ −³

Enterococcus faecalis −⁵ −⁵ −⁵

Escherichia coli ++^1,5

+² +++⁵

−^2,5 ++⁵

++++/+++++⁶ ++¹ +²

++^1,5

−² ++++⁵

Helicobacter pyroli +++++³ +++++³

Laktobasillit (L. rhamnosus, L. reuteri, L. paracasei, L. johnsonii, L. crispatus, L. plantarum)

−⁵ −⁵ −⁵

Listeria monocytogenes +++¹

−⁴ −⁴ +++¹

−⁴ ++++¹

−⁴

Micrococcus luteus +++² ++² +++² +²

Salmonella Typhimurium −^1,4,5 −⁴ ++⁵

+++¹ +++^1,5

−⁴

Salmonella Infantis −⁴ −⁴ −⁴

Staphylococcus aureus ++¹

+² +++³

−⁴

+² +++³ ++++⁴

+++¹ +²

++++^1,4

−²

Staphylococcus epidermis +² −² +² −²

++++³

1(Tian ym. 2018), ²(Rauha ym. 2000), ³(Nohynek ym. 2006), ⁴ (Puupponen-Pimiä, R. ym. 2005b),

5(Puupponen-Pimiä, R. ym. 2001), ⁶(Krisch ym. 2008), − ei inhibitiota, + heikko inhibitioteho, ++

selvä inhibitioteho, +++ vahva inhibitioteho, ++++ erittäin vahva inhibitioteho, +++++ viljelmän kuolema.

suurimmalla osalla marjauutteista ei ollut mitään vaikutusta hiivakantojen kasvuun (Burdulis ym. 2009).

Eri vuosina poimittujen ja eri mustaherukkalajikkeiden antimikrobisuutta on tutkittu MIC- testillä (Minimum Inhibitory Concentration), jossa määritetään pienin pitoisuus näytettä, joka estää näkyvästi mikrobin kasvun (Miladinović ym. 2014). Mustaherukka esti monien elintarvikepatogeenien kasvua, ja herkimpiä olivat Listeria monocytogenes sekä Pseudomonas aeruginosa. Kaikista vastustuskykyisin mikrobi oli yksisoluisiin sieniin kuuluva Aspergillus niger, kun taas C. albicans -hiivaa vastaan mustaherukka oli kohtalaisen tehokas.

Gram-positiivisten ja -negatiivisten bakteereiden inhibitiotehojen välillä ei ollut eroa. Eri mustaherukkalajikkeet erosivat myös hieman antimikrobisilta ominaisuuksilta toisistaan (Miladinović ym. 2014). Toisessa tutkimuksessa mustaherukkamehu oli bakterisidinen, eli bakteerit tappava, B. cereus- ja E. coli -kantoja vastaan sekä voimakkaasti B. subtilis -kannan kasvua hidastava (Krisch ym. 2008; Taulukko 2). Mustaherukalla oli 21 tutkitusta hedelmästä ja marjasta kaikkein tehokkaimmat antimikrobiset ominaisuudet.

Marjojen lehdillä ja oksilla on myös osoitettu olevan antimikrobisia ominaisuuksia (Tian ym.

2018). Tutkimuksessa puolukan, tyrnin ja marjatuomipihlajan lehtiuutteet estivät voimakkaasti S. aureus-, L. monocytogenes-, ja B. cereus -bakteerien kasvua. Mustaherukkapuristekakulla oli tutkimuksessa voimakkaat antimikrobiset vaikutukset E. coli-, S. aureus-, L.

monocytogenes- ja B. cereus -bakteereita vastaan. Puolukka, mustikka ja variksenmarja estivät hyvin L. monocytogenes -bakteerin kasvua, mutta vain kohtalaisesti E. coli -bakteerin kasvua.

Puolukka ja variksenmarja estivät hyvin S. Typhimurium- ja S. aureus -bakteerien kasvua.

Puolukka ja mustikka eivät inhiboineet B. cereus -bakteerin kasvua toisin kuin variksenmarja.

Marjojen lehdillä oli yleisesti ottaen paremmat antimikrobiset vaikutukset ja suuremmat fenolipitoisuudet kuin marjoilla. Tutkimuksen mukaan flavonoidien kokonaispitoisuus korreloi lisääntyneen antimikrobisuuden kanssa. Etenkin S. aureus- ja B. cereus -bakteerien kasvun esto oli suoraan yhteydessä marjojen kokonaisfenoli- ja ellagitanniinipitoisuuksien kasvuun (Tian ym. 2018).

Marjamehujen antimikrobisia ominaisuuksia on tutkittu Streptococcus pneumoniae -bakteeria vastaan, joka aiheuttaa ihmisellä muun muassa keuhkokuumetta, aivokalvon tulehdusta ja korvatulehdusta (Huttunen ym. 2011). Tutkimuksessa tarkasteltiin estävätkö karpalo-, mustikka- ja variksenmarjamehu bakteerin kiinnittymistä ihmisen keuhkosoluviljelmiin.

Karpalomehu esti lähes 90 % inhibitiotehokkuudella bakteerin kiinnittymistä

mehupitoisuudella 8,7 mg/g ja karpalomehu oli bakterisidinen pitoisuudella ~86 mg/g. Myös mustikka ja variksenmarja estivät S. pneumoniae -bakteerin kasvua ja adheesiota, mutta eivät yhtä tehokkaasti kuin karpalomehu (Huttunen ym. 2011).

Musikka- ja mustaherukkamehun antimikrobisuutta tutkittiin Asaia lannensis ja Asaia bogorensis -bakteereita vastaan Antolakin ym. (2016) tutkimuksessa. Asaia-bakteereita on löydetty esimerkiksi Puolasta pilaantuneesta pullotetusta makuvedestä (Kregiel ym. 2012).

Tutkimuksessa sekä mustikka-, että mustaherukkamehu vähensivät voimakkaasti etenkin A. bogorensis -bakteerin adheesiota ja kasvua (Antolak ym. 2016).

Marjojen antimikrobisia ominaisuuksia on tutkittu bakteereiden ja yksisoluisten sienten lisäksi alkueliöillä (Anthony ym. 2011) ja viruksilla (Nikolaeva-Glomb ym. 2014). Anthonyn ym.

(2011) tutkimuksessa tarkasteltiin Giardia duodenalis -alkueliötä, joka aiheuttaa ihmiselle suolistoinfektiota. Mansikan, mesimarjan, karhunvatukan ja lakan uutteet tappoivat alkueliön yhtä tehokkaasti kuin suolistoinfektion hoitoon käytetty lääke, minkä ajateltiin osittain selittyvän tutkittujen marjojen korkeilla ellagitanniinipitoisuuksilla. Myös mustikka ja mustaherukka estivät voimakkaasti alkueliön kasvua (Anthony ym. 2011). Nikolaeva-Glombin ym. (2014) tutkimuksessa mustikka-, puolukka-, mansikka- ja vadelmauutteet inhiboivat tehokkaasti enteroviruksen (coxsackievirus B1) ja influenssavirus A:n (A/H3N2) replikoitumista, mutta eivät poliovirus 1:n (PV-1). Mustikkauute oli ainoa marjauute, joka inhiboi hengitystieinfektioita aiheuttavan RS-viruksen (HRSV-A2) replikoitumista (Nikolaeva- Glomb ym. 2014). Marjoilla ja niiden uutteilla voi siis olla antimikrobisia vaikutuksia yksisoluisten bakteereiden ja sienten lisäksi viruksiin ja monisoluisiin alkueliöihin.

Puhtaiden antosyaanien antimikrobisia vaikutuksia on tutkittu vain vähän. Puupponen-Pimiän ym. (2001) tutkimuksessa pelargonidiini, delfinidiini, syanidiini ja syanidiini-3-glukosidi inhiboivat ainoastaan E. coli CM871 -bakteerin kasvua. Antosyaaneilla ei ollut vaikutusta S.

enterica-, E. faecalis- eikä probioottisten bakteerien kasvuun. Kokonaisilla marjoilla oli pääasiassa voimakkaammat antimikrobiset vaikutukset mikrobeihin kuin millään käytetyllä antosyaanilla. Mustaherukasta eristetyt antosyaanit eivät inhiboineet minkään mikrobin kasvua Werleinin ym. (2005) tutkimuksessa. Tutkimuksessa käytetyt mustaherukkatiivisteet puolestaan inhiboivat S. aureus- ja E. faecium -bakteerien kasvua.

3.2 Vaikutusmekanismit

Kasvien antimikrobisilla yhdisteillä on havaittu olevan useita vaikutusmekanismeja (Negi 2012). Antimikrobiset yhdisteet voivat vaikuttaa mikrobin soluseinään, solukalvoon, proteiinisynteesiin, metaboliaan tai metabolisiin entsyymeihin johtaen mikrobin kasvun estoon tai kuolemaan. Polyfenolit voivat esimerkiksi hajottaa bakteerin solukalvoa, mistä seuraa solun sisällön vuotaminen tai siirtää solukalvon elektroneja, mikä häiritsee mikrobin energiantuotantoa (Bouarab Chibane ym. 2018). Kuitenkaan kasvien antimikrobisten yhdisteiden tarkkoja vaikutuskohtia ja -mekanismeja ei tiedetä, ja antimikrobiset vaikutukset ovat usein monien yhtäaikaisten reaktioiden summa (Negi 2012).

Kiinalaisen juolukan antosyaanien vaikutusmekanismeja elintarvikepatogeeneja vastaan on tutkittu (Sun ym. 2018). Tarkastellut mikrobit olivat L. monocytogenes, S. aureus, S. enteritidis ja V. parahaemolyticus. Tutkimuksessa havaittiin, että juolukan antosyaanit johtivat mikrobien nukleiinihappojen ja proteiinien vapautumiseen, mikä viittaa mikrobien solukalvon hajoamiseen. Juolukkauutteelle altistuksen jälkeen mikrobien proteiinien määrä ja entsyymien aktiivisuus laskivat. Lisäksi havaittiin, että mikrobien sitruunahappokierto vähentyi altistuksen jälkeen, mikä viittaa mikrobien energiantuotannon ja solujakautumisen vähenemiseen.

Yleisesti ottaen gram-negatiivisten bakteerien ajatellaan olevan vastustuskykyisempiä antimikrobisille yhdisteille gram-positiivisiin verrattuna (Nohynek ym. 2006). Tämä johtuu gram-negatiivisten bakteerien solukalvoa ympäröivästä paksusta ulkokalvosta, joka sisältää lipopolysakkarideja, jotka suojaavat solua ulkoisilta tekijöiltä. Nohynekin ym. (2006) tutkimuksessa lakan ja vadelman fenoliuutteet hajottivat gram-negatiivisen S. Typhimurium -bakteerin ulkokalvoa, mikä todettiin fluoresoivan merkkiaineen kertymisenä bakteerisoluun ja ulkokalvon lipopolysakkaridien vapautumisena. Kuitenkaan puhtailla ellagitanniini- ja antosyaaniuutteilla ei ollut samanlaisia salmonellakannan solukalvoa hajottavaa vaikutusta kuin polyfenoliuuttella. Puupponen-Pimiän ym. (2005b) tutkimuksessa havaittiin, että marjojen fenolit inhiboivat vain osittain patogeenisten bakteerien kasvua, ja osa marjojen inhibitiotehosta voi selittyä muilla antimikrobisilla yhdisteillä, kuten orgaanisilla hapoilla. Tutkimustulokset antavat viitteitä siitä, että marjojen antimikrobiset vaikutukset johtuvat polyfenoleiden ja muiden bioaktiivisten yhdisteiden yhteisvaikutuksista, ei yksittäisistä yhdisteistä.

4 MARJATUOTTEIDEN PROSESSOINTI JA SEN VAIKUTUKSET FENOLISIIN YHDISTEISIIN

4.1 Murskaus ja puristus

Marjoja voidaan prosessoida murskaamalla, puristamalla, kuumentamalla, kirkastamalla, kuivaamalla, fermentoimalla sekä käsittelemällä entsymaattisesti ja paineen avulla (Kårlund ym. 2014). Prosessointi voi vaikuttaa merkittävästi elintarvikkeen ulkonäköön, koostumukseen, ravitsemukselliseen sisältöön ja aistinvaraisiin ominaisuuksiin (Nayak ym. 2015). Prosessointi voi vähentää marjojen bioaktiivisten yhdisteiden määrää tai inaktivoida niitä, minkä seurauksena antimikrobinen aktiivisuus voi laskea (Nayak ym. 2015).

Marjatuotteiden prosessointi alkaa usein murskaamisella (Kårlund ym. 2014). Murskaaminen voi joko vähentää tai lisätä kokonaisfenolien määrää riippuen käytetystä marjasta ja menetelmästä. Murskaus vähensi merkittävästi pensasmustikan kokonaisfenolien määrää Leen ym. (2002) tutkimuksessa. Woodwardin ym. (2011) tutkimuksessa prosessointi, kuten murskaaminen, ei vaikuttanut merkittävästi mustaherukan antosyaanien määrään mehun tuotannossa. Puolukan murskaaminen ja säilöminen omassa mehussaan ilman lämpökäsittelyä vähensi Häkkisen ym. (2000) tutkimuksessa 40 % kversetiinin määrää. Tämän ajateltiin johtuvan mekaanisen hajoamisen seurauksena vapautuvista solun sisäisistä entsyymeistä, joiden vaikutuksesta kversetiiniä hajosi.

Puristaminen on marjamehun tuotannossa käytetty menetelmä, jonka seurauksena jäljelle jää puristekakku (Puupponen-Pimiä ym. 2005a). Puristekakku koostuu pääasiassa marjojen siemenistä ja kuorista ja se sisältää suurimman osan marjojen fenolisista yhdisteistä sekä kuidusta (Kårlund ym. 2014). Puristaminen siis usein vähentää mehun fenolisten yhdisteiden määrää, koska suurin osa niistä jää puristekakkuun. Esimerkiksi kversetiinin on todettu suurimmaksi osaksi jäävän puristekakkuun (Hyvärinen 2001). Elintarviketeollisuus käyttää useita eri puristusmenetelmiä, painetta, puristusaikaa ja suodattimia mehun tuotannossa, joilla voi olla erilaisia vaikutuksia puristekakun ja mehun koostumuksiin.

4.2 Lämpö- ja entsymaattinen käsittely

Pääsääntöisesti lämpökäsittely vähentää marjojen antosyaanipitoisuutta ja matala prosessointilämpötila ja -aika on suositeltavaa (Smeriglio ym. 2014). Käsittelylämpötilat voivat

vaihdella 50−150 °C:n välillä. Esimerkiksi Verbeystin (2012) tutkimuksessa lämpökäsittely (20 min, 100−140 °C) vähensi merkitsevästi vadelman ja mansikan antosyaanien määriä ja ne olivat lähes kokonaan hajonneet 140 °C:n käsittelyn jälkeen. Kuitenkaan paineen nostaminen lämpökäsittelyn yhteydessä ei lisännyt antosyaanien hajoamista merkitsevästi. Sablanin ym.

(2010) tutkimuksessa vadelma ja pensasmustikka höyrytettiin 95 °C:ssa, jonka jälkeen marjat purkitettiin siirapin kanssa ja purkit pastöroitiin kiehuvassa vedessä, kunnes sisälämpötila nousi vähintään 88 °C:seen. Käsittely vähensi antosyaanien määrää jopa 44 %, mutta samaan aikaan polyfenolien kokonaismäärä nousi jopa 50 %. Lämpökäsittely hillon ja mehun valmistuksen yhteydessä vähensi myös Brownmillerin ym. (2008) tutkimuksessa pensasmustikoiden antosyaanien määrää 28−59 % riippuen käsittelystä.

Flavonolien määrä väheni Häkkisen ym. (2000) tutkimuksessa lämpökäsittelyn vaikutuksesta.

Mustikan keittäminen veden ja sokerin kanssa vähensi kversetiinin määrää jopa 40 %. Vain 15 % kversetiinistä ja 30 % myrisetiinistä säilyi mustaherukka- ja puolukkamehun valmistuksen seurauksena. Kversetiinin määrä oli noin kolme kertaa suurempi kylmäpuristetussa kuin höyrypuristetussa mustaherukkamehussa Lämpökäsittelyn lisäksi merkittävä syy flavonolien vähenemiseen mehun tuotannossa on se, että suuri osa flavonoleista jää puristekakkuun (Häkkinen ym. 2000).

Pensasmustikkamehun pastörointi lisäsi antosyaanipitoisuutta Leen ym. (2002) tutkimuksessa, mutta pastöroidun mustikan antosyaanien määrä oli kuitenkin matalampi verrattuna tuoreeseen mustikkaan. Woodwardin ym. (2011) tutkimuksessa mustaherukkamehun laboratoriomittakaavan pastörointi vähensi 22 % antosyaanien määrää, kun mehu pastöroitiin 100 °C:ssa ja annettiin jäähtyä 40 °C:seen, jolloin kokonaisuudessa aikaa kului 2,5 min.

Kuitenkaan tuotannon mustaherukkamehun pastörointi ei vähentänyt antosyaanien määrää tilastollisesti merkitsevästi, koska pastörointiaika oli tuotannossa vain 30 sekuntia (Woodward ym. 2011). Lämpötilan lisäksi pastörointiaika vaikuttaa siis merkitsevästi antosyaanien hajoamiseen ja lyhyellä pastörointiajalla voidaan välttää antosyaaninen liiallinen hajoaminen.

Lämpökäsittely voi hajottaa polyfenoleita (Patras ym. 2010). Polyfenolien hajotessa voi kuitenkin muodostua muita fenolisia tuotteita, joilla voi olla bioaktiivisia ominaisuuksia alkuperäisen yhdisteen lisäksi. Esimerkiksi antosyaanien hajotessa voi muodostua hydroksibentsoehappoja ja protokatekiinihappoa (Patras ym. 2010). Gallotanniini taas muodostaa hajotessaan glukoosia ja gallushappoa sekä ellagitanniini glukoosia ja ellagihappoa (Puupponen-Pimiä ym. 2005a). Polyfenolien hajotessa tuotteen kokonaisfenolipitoisuus tai

bioaktiivisuus eivät siis välttämättä laske (Patras ym. 2010). Tämä voi osaltaan selittää vaihtelevat tulokset prosessoinnin vaikutuksista fenolisiin yhdisteisiin.

Pektiiniä hajottavia entsyymejä käytetään mehun puristuksessa parantamaan mehun saantoa, väriä ja stabiiliutta (Kårlund ym. 2014). Entsyymikäsittely hajottaa marjasolujen soluseinää, jolloin myös soluseinän sisältä saattaa vapautuu polyfenoleita. Koposen ym. (2008) tutkimuksessa mustikka- ja mustaherukkamurskan entsyymikäsittely lisäsi flavonolien määrää mehussa ja vähensi sitä puristekakussa verrattuna entsyymikäsittelemättömän murskan mehustukseen. Flavonolien kokonaismäärä ei vähentynyt entsyymikäsittelyn seurauksena.

Myöskään Häkkisen ym. (2000) tutkimuksessa variksenmarjan pektinaasikäsittely ei vähentänyt flavonolien määrää verrattuna entsyymikäsittelemättömään marjaan. Woodwardin ym. (2011) tutkimuksessa mustaherukkamurskan entsyymikäsittely pektinaasilla ei vähentänyt merkitsevästi antosyaanien määrää mehun tuotannossa verrattuna entsyymikäsittelemättömään mehuun.

Entsymaattinen käsittely voi myös parantaa mustikan antimikrobisia ominaisuuksia (Puupponen-Pimiä ym. 2008). Tutkimuksessa mustikkamurskan entsyymikäsittely pektiiniä hajottavilla entsyymeillä paransi niin murskan, mehun kuin puristekakunkin antimikrobista tehoa Salmonella Typhimurium ja Staphylococcus aureus -bakteereita vastaan. Lisääntynyt inhibitioteho perustui tutkijoiden mukaan polyfenolien vapautumiseen soluseinästä entsyymikäsittelyn vaikutuksesta. Murskan entsyymikäsittely lisäsi tutkimuksessa fenolien määrää jopa 40 % (Puupponen-Pimiä ym. 2008).

Korkea pH voi hajottaa fenolisia yhdisteitä (Friedman ja Jürgens 2000). Etenkin kahvihappo, klorogeenihappo ja gallushappo hajoavat herkästi korkeassa pH:ssa ja muutokset ovat irreversiibeleitä. Ferulahappo, trans-kanelihappo, (-)-katekiini sekä (-)-epigallokatekiini ovat vastustuskykyisempiä korkealle pH:lle. Emäksistä käsittelyä voidaan käyttää elintarvikkeiden prosessoinnissa, mutta sillä voi olla polyfenoleita hajottava vaikutus (Friedman ja Jürgens 2000).

4.3 Kuivaus ja varastointi

Marjoja voidaan kuivata monella eri tavalla. Edullinen kuivausmenetelmä on kuumailmakuivaus (Zielinska ja Michalska 2016). Kuumailmakuivaus saattaa kuitenkin muuttaa merkittävästi marjojen ominaisuuksia, kuten väriä, rakennetta ja tilavuutta. Tämän

takia marjojen kuivaamisessa suositaan usein muita menetelmiä, kuten kylmäkuivausta, joka perustuu veden sublimoitumiseen jäädytetystä tuotteesta (Ratti 2001). Kylmäkuivauksen avulla marjojen ominaisuudet säilyvät parempana verrattuna kuumailmakuivaukseen. Menetelmä on kuitenkin huomattavasti kalliimpi verrattuna kuumailmakuivaukseen (Ratti 2001).

Mikroaaltokuivaus on nopeampi menetelmä verrattuna kuumailmakuivaukseen, mutta lämpötila voi nousta menetelmässä niin korkeaksi, että marjojen hyödylliset bioaktiiviset yhdisteet hajoavat (Yongsawatdigul ja Gunasekaran 1996). Ratkaisu ongelmaan on vakuumin käyttö mikroaaltokuivauksen yhteydessä, minkä ansiosta veden kiehumispiste alenee ja tuotteen lämpötila ei pääse nousemaan liian korkeaksi (Zielinska ja Michalska 2016).

Mikroaalto-vakuumikuivaus sopii erityisen hyvin marjoille, jotka ovat herkkiä lämpökäsittelylle. Esimerkiksi mikroaalto-vakuumikuivattujen hapankirsikoiden polyfenolipitoisuus oli paljon suurempi kuin kuumailmakuivattujen ja jopa suurempi kuin kylmäkuivattujen (Wojdyło ym. 2014). Mitä korkeampi kuivauslämpötila oli, sitä vähemmän antosyaaneja kuivauksen jälkeen oli jäljellä. Mikroaalto-vakuumikuivaus lisäsi hapankirsikoiden kversetiinin ja myrisetiinin määriä, kun taas muut kuivaustavat eivät (Wojdyło ym. 2014). Mikroaalto-vakuumikuivauksen avulla marjan ominaisuudet ja ravintoaineet säilyvät hyvinä (Ahrens ym. 2006). Verrattuna kylmäkuivaukseen, mikroaalto- vakuumikuivaus on menetelmänä nopeampi ja halvempi, mutta kalliimpi kuin kuumailmakuivaus.

Varastointi vähentää usein marjojen antosyaanien määrää (Howard ym. 2012). Esimerkiksi vuoden pakastesäilytys vähensi Nohynekin ym. (2006) tutkimuksessa marjojen fenolisten yhdisteiden määrää, mutta se ei kuitenkaan vaikuttanut merkittävästi marjojen antimikrobisiin ominaisuuksiin. Häkkisen ym. (2000) tutkimuksessa mansikan kversetiinipitoisuus nousi yhdeksän kuukauden pakastesäilytyksen aikana 35 %. Sama kversetiinipitoisuuden nousu havaittiin myös mansikkahillon säilytyksen aikana. Tutkijat pohtivat tämän mahdollisesti johtuvan marjan solurakenteen hajoamisesta ajan myötä, jolloin kversetiiniä vapautuu ja se on helpommin eristettävissä. Mustaherukan myrisetiinipitoisuudet taas laskivat pakastesäilytyksen aikana ja yhdeksän kuukauden jälkeen kaikki myrisetiini oli hajonnut. Mustaherukkamehun pakastesäilytyksessä myrisetiinipitoisuudet laskivat kokonaista marjaakin nopeammin.

Kokonaisten mustikoiden pakastesäilytys vähensi 40 % myrisetiinin määrää yhdeksän kuukauden aikana (Häkkinen ym. 2000). Brownmillerin ym. (2008) tutkimuksessa eri pensasmustikkamehujen ja purkitettujen soseiden antosyaanien määrät vähenivät 62−85 % kuuden kuukauden säilytyksen aikana 25 °C:n lämpötilassa.

4.4 Polyfenolien eristäminen

Marjojen fenolisten yhdisteiden eristämiseen käytetään yleensä orgaanisia liuottimia (Ignat ym.

2011). Liuottimena käytetään tyypillisimmin happamoitua metanolia, etanolia tai niiden sekoitusta (Smeriglio ym. 2014). Antosyaanit ovat polaarisia, joten ne liukenevat hyvin alkoholiin. Metanoli on tehokkain fenolisten yhdisteiden liuotin, mutta elintarviketeollisuudessa sitä ei suosita toksisuuden takia. Liian vahvoja happoja eristyksen apuaineina tulee välttää, koska ne voivat hajottaa antosyaaneja (Smeriglio ym. 2014). Lisäksi menetelmä polyfenolien eristämiseen tulee aina valita tapauskohtaisesti: optimaalisin menetelmä antosyaanien eristämiseen ei ole välttämättä sama kuin menetelmä kokonaispolyfenolien eristämiseen (Klavins ym. 2018).

Polyfenoleita voidaan eristää myös ylikriittisen nesteen avulla (Ignat ym. 2011). Eristys tapahtuu korkeassa paineessa, mutta kohtalaisessa lämpötilassa liuottimen kriittisen pisteen yläpuolella. Tyypillisin eristykseen käytetty neste on ylikriittinen hiilidioksidi, johon voidaan lisätä pieniä määriä esimerkiksi etanolia tai metanolia polaaristen polyfenolien uuton parantamiseksi. Menetelmän etuna on ympäristöystävällisyys, nopeus, tehokkuus, selektiivisyys ja se, että polyfenolien hajoaminen saadaan minimoitua. Lisäksi menetelmässä ei tarvitse käyttää myrkyllisiä liuottimia eikä korkeita lämpötiloja. Menetelmä ei kuitenkaan ole paras vaihtoehto antosyaanien eristämiseen, koska polaarisina aineina antosyaanit vaativat kohtalaisen suuren määrän orgaanista liuotinta ylikriittisen hiilidioksidin lisäksi sekä suuren paineen. Menetelmä soveltunee paremmin vähemmän polaaristen polyfenoleiden eristämiseen (Ignat ym. 2011).

II KOKEELLINEN OSA

5 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET

Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää prosessoinnin vaikutuksia luonnonmarjafraktioiden antimikrobisiin ominaisuuksiin. Tutkielma toteutettiin yritysyhteistyönä Extrx Oy:n kanssa.

Kokeellisessa osiossa eri mustikkafraktioiden antimikrobisia ominaisuuksia verrattiin kokonaisen, prosessoimattoman mustikan antimikrobisiin ominaisuuksiin. Lisäksi eri marjojen antimikrobisia ominaisuuksia verrattiin toisiinsa. Tavoitteiden pohjalta laadittiin tutkimuskysymykset:

- Onko eri marjoilla ja marjafraktioilla antimikrobisia ominaisuuksia elintarvikepatogeenisia mikrobeja vastaan?

- Vaikuttaako prosessointi luonnonmarjafraktioiden antimikrobisiin ominaisuuksiin?

6 MATERIAALIT JA MENETELMÄT

6.1 Marjatuotteet

Marjatuotteet saatiin Extrx Oy:lta, joka on sotkamolainen marja-alan yritys. Yritys valmistaa metsämarjoista korkealaatuisia antosyaaniuutteita, mehuja, hillokkeita sekä kuivattuja ja muita funktionaalisia marjatuotteita. Yritys toimii business-to-business -periaatteella, eli tuotteita ei mene suoraan kauppojen hyllyille vaan eri teollisuudenalojen käyttöön. Tutkittavia näytteitä oli yhdeksän: mustikka (Vaccinium myrtillus), variksenmarja (Empetrum nigrum), mustaherukka (Ribes nigrum), mustikkamehu, mustikkamehutiiviste, mustikka-antosyaaniuute, tuore mustikkapuristekakku, kuivattu mustikkapuristekakku ja bioaktiivinen mustikkahilloke.

Näytteet säilytettiin pakastettuna -20 °C:ssa lukuun ottamatta mustikkamehua, joka säilytettiin jääkaapissa +4 °C:ssa. Ennen kokeiden alkua pakastetut näytteet sulatettiin huoneenlämmössä, jaettiin pienempiin eriin ja pakastettiin uudestaan.

Mustikkamehun valmistuksessa marjan murskausvaiheessa on käytetty pektiiniä hajottavaa entsyymiä, jonka jälkeen mehu on kylmäpuristettu, suodatettu ja pastöroitu. Tiiviste on valmistettu mustikkamehusta haihduttamalla vettä niin, että liukoisen kuiva-aineen pitoisuus, eli Brix-arvo on noin 65 %. Antosyaaniuute valmistetaan pumppaamalla mustikkamehua hartsia sisältävän kolonnin läpi, jolloin antosyaanit tarttuvat hartsikiteisiin. Hartsi huuhdellaan tämän jälkeen vedellä, jotta mehun sisältämät sokerit ja hapot huuhtoutuvat pois. Tämän jälkeen

hartsi huuhdellaan etanolilla, joka irrottaa antosyaanit hartsikiteistä. Etanoli haihdutetaan etanoli-antosyaani-liuoksesta pois. Puristekakkua saadaan mustikkamehun puristuksen sivuvirtana ja se sisältää muun muassa marjojen kuoret ja siemenet. Kuivattua puristekakkua valmistetaan mikroaalto-vakuumikuivaamalla. Bioaktiivista hilloketta valmistetaan märkäjauhamalla puristekakkua 1−5 kertaa patentoidun menetelmän mukaan (Sibakov ym.

2013). Jauhamisen aikana puristekakkuun lisätään vettä niin, että lopulliseksi kuiva- ainepitoisuudeksi saadaan 5−30 %. Mekaaninen jauhaminen vapauttaa esimerkiksi mustikan siemenistä fenoleita, rasvahappoja ja rasvaliukoisia yhdisteitä (Sibakov ym. 2013).

6.2 Mikrobit

Antimikrobisuuskokeissa käytetyt mikrobit olivat Listeria monocytogenes ATCC 7644, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium ATCC 13311 ja Candida albicans ATCC 90029. Listeria monocytogenes on pieni, gram-positiivinen, fakultatiivisesti anaerobi bakteeri, joka aiheuttaa ihmiselle listerioosi-infektion (Labbé ja García 2013). Se on tyypillinen elintarvikepatogeeni, joka aiheuttaa elintarvikevälitteisistä infektioista eniten kuolemia maailmalla. Listerioosi voi oireilla monella tavalla ja aiheuttaa esimerkiksi yleisinfektion, aivokalvontulehduksen tai vatsataudin. Salmonella on gram-negatiivinen, fakultatiivisesti anaerobi sauvabakteeri. Salmonella Typhimurium -serotyyppi aiheuttaa ihmisellä suolistoinfektion ja sitä esiintyy elintarvikkeissa esimerkiksi kontaminoituneissa siipikarjatuotteissa (Labbé ja García 2013). Candida albicans on eukaryoottinen, yksisoluinen hiiva, joka on opportunistinen patogeeni ja voi esimerkiksi aiheuttaa ihmisellä infektioita iholla ja limakalvoilla (Fleet 2007). Hiivat voivat pilata elintarvikkeita tai aiheuttaa niihin aistinvaraisia muutoksia esimerkiksi alkoholikäymisen seurauksena (Fleet 2007). Tutkielmassa käytettiin siis gram-negatiivista ja gram-positiivista bakteeria sekä eukaryoottista hiivaa, jotta voitaisiin vertailla marjatuotteiden antimikrobisia vaikutuksia eri solutyypeille.

Mikrobikannat herätettiin syväjäästä, jonka jälkeen kantoja ylläpidettiin siirrostamalla yksi pesäke hajotusviljelmänä uusille kasvatusmaljoille kerran viikossa. Listeria- ja salmonellakantoja kasvatettiin tryptonisoija-agar (TSA) -maljoilla (Lab M, LAB011, Iso- Britannia) +37 °C:ssa, 24 h ja hiivakantaa Sabouraud-agar-maljoilla (Lab M, LAB009, Iso- Britannia) +30 °C:ssa, 24 h. Antimikrobisuuskokeisiin tarvittavat nestemäiset yön yli kasvatukset valmistettiin listeria- ja salmonellakannoille tryptoni-soija-kasvatusliemeen (TS- liemi, Lab M, LAB004, Iso-Britannia), ja hiivakannalle 2 % glukoosi- hiivauute -kasvatusliemeen.

6.3 Uutteiden valmistus

Kiinteät näytteet, eli mustikka, variksenmarja, mustaherukka, tuore puristekakku, kuivattu puristekakku ja hilloke uutettiin etanoliin kokonaisfenolimäärityksiä varten. Näytteet soseutettiin sauvasekoittajalla lukuun ottamatta kuivattua puristekakkua, joka hienonnettiin jauheeksi huhmareella. Uutteiden valmistukseen sovellettiin Klavinsin ym. (2018) julkaisun menetelmää. Uuttoa varten valmistettiin 57 % etanoliliuos (Etax Aa, Altia) tislattuun veteen, johon lisättiin 0,9 % trifluorietikkahappoa (TFA, Merck KGaA, Saksa) fenolien uuton parantamiseksi. 50 ml:n muovisiin kartioputkiin punnittiin 10 g soseutettua mustikkaa, variksenmarjaa, mustaherukkaa tai hilloketta, jonka jälkeen putkiin lisättiin 30 ml etanoli-TFA- liuosta. Tuore ja kuivattu puristekakku olivat niin kuivia, että niiden määrä puolitettiin uuttoihin. Molempia punnittiin 5 g 50 ml:n kartioputkiin ja lisättiin 30 ml etanoli-TFA-liuosta.

Putkia ravisteltiin vaaka-asennossa tasoravistelijalla (Orbital Shaker, Stuart Scientific, Iso- Britannia) 15 min. Uutteet suodatettiin suppilon ja kuitukankaan (Mölnlycke Health Care AB, Ruotsi) läpi uusiin 50 ml:n kartioputkiin. Uutot jaettiin pienempiin 1,5 ml:n mikrosentrifuugiputkiin ja pakastettiin -20 °C:seen. Jokaisen näytteen uutto tehtiin kolmena rinnakkaisena.

6.4 Kokonaisfenolipitoisuuden määrittäminen

Marjanäytteiden kokonaisfenolipitoisuudet määritettiin Folin-Ciocalteu-menetelmällä Everetten ym. (2010) julkaisua mukaillen. Mustikan, variksenmarjan, mustaherukan, tuoreen puristekakun ja hillokkeen uutteista sekä mehusta valmistettiin laimennokset 1:10, 1:20, 1:50 ja 1:100 tislattuun veteen. Kuivatun puristekakun uutteesta valmistettiin laimennokset 1:20, 1:50, 1:100 ja 1:200, antosyaaniuutteesta laimennokset 1:200, 1:400, 1:800 ja 1:3200 sekä tiivisteestä laimennokset 1:100, 1:200, 1:400 ja 1:800.

Gallushaposta (Merck KGaA, Fluka, Saksa) valmistettiin standardikantaliuos liuottamalla gallushappoa tislattuun veteen pitoisuuteen 1 mg/ml. Standardikantaliuoksesta valmistettiin laimennokset tislattuun veteen pitoisuuksilla 0,1 mg/ml, 0,07 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,03 mg/ml ja 0,01 mg/ml. Natriumkarbonaattijauheesta valmistettiin 7,5 % liuos tislattuun veteen. Folin- Ciocalteu-reagenssista (Merck KGaA, Saksa) valmistettiin 10 % laimennos tislattuun veteen.

Kolmeen rinnakkaiseen 2 ml:n mikrosentrifuugiputkeen pipetoitiin 200 µl näyte- tai gallushappolaimennosta, jonka jälkeen niihin pipetoitiin 1000 µl 10 %:sta Folin-Ciocalteu-