Polyfenolit ovat kasvien sekundaarisia aineenvaihdunnan tuotteita, ja ne koostuvat vähintään yhdestä fenolisesta hiilirenkaasta ja vähintään yhdestä hydroksyyliryhmästä (Gutiérrez-Del-Río ym. 2018). Niihin kuuluu yli 10 000 erilaista yhdistettä, joilla monilla on osoitettu olevan antimikrobisia ominaisuuksia. Polyfenolit voidaan jakaa kemiallisen rakenteen perusteella fenolihappoihin, flavonoideihin, stilbeeneihin, lignaaneihin, kumariineihin ja tanniineihin (Kuva 1). Flavonoidit muodostavat 60 % polyfenoleista ja ne voidaan jakaa edelleen pienempiin alaryhmiin, joita ovat antosyanidiinit, flavonolit, flavonit, flavanonit, flavanolit ja isoflavonoidit (Gutiérrez-Del-Río ym. 2018). Marjat sisältävät polyfenoleista erityisen runsaasti flavonoideja, fenolihappoja, lignaaneja ja tanniineja (Puupponen-Pimiä ym. 2005a).
Kuvassa 1 on esitetty esimerkkejä marjoissa esiintyvistä polyfenoleista. Aikaisempien tutkimusten mukaan tuoreen mustikan kokonaisfenolipitoisuus on noin 400−600 mg/100 g (Mikulic‐Petkovsek 2012; Karcheva-Bahchevanska ym. 2017; Tian ym. 2017), variksenmarjan noin 430−450 mg/100 g (Dudonné ym. 2015; Tian ym. 2017) ja mustaherukan noin 90−170 mg/100 g (Mikulic‐Petkovsek 2012; Nour ym. 2013).
Kuva 1. Polyfenolien luokittelu ja esimerkkejä marjoissa esiintyvistä polyfenoleista (muokattu Puupponen-Pimiä ym. 2005a; Gutiérrez-Del-Río
2.2.1 Fenolihapot
Fenolihapot voidaan jakaa hydroksikanelihappoihin ja hydroksibentsoehappoihin (Mattila ym.
2006; Kuva 2). Neljä yleisintä hydroksikanelihappoa ovat p-kumaarihappo, kahvihappo, ferulahappo ja sinappihappo. Vastaavasti neljä yleisintä hydroksibentsoehappoa ovat p-hydroksibentsoehappo, protokatekiinihappo, vaniljahappo ja syringihappo. Fenolihapot esiintyvät yleensä sitoutuneessa muodossa: hydroksikanelihapot usein kiinihappoon tai glukoosiin sitoutuneina estereinä ja hydroksibentsoehapot glukoosiin sitoutuneena (Mattila ym.
2006).
(a)
(b)
Kuva 2. (a) Hydroksibentsoehappojen ja (b) hydroksikanelihappojen kemialliset rakenteet (muokattu Häkkinen ja Törrönen 2000).
Mustikka sisältää fenolihapoista eniten syringihappoa ja kahvihappoa, variksenmarja syringihappoa ja p-kumaarihappoa sekä mustaherukka p-kumaarihappoa ja protokatekiinihappoa (Mattila ym. 2006; Taulukko 1). Mustikassa on gallushappoa noin 1,5−3,2 mg/100 g, syringihappoa 13,9−15,2 mg/100 g, p-kumaarihappoa 6,1−8,1 mg/100 g, kahvihappoa 9,5−10,6 mg/100 g, vaniljahappoa 6,0−6,9 mg/100 g ja ferulahappoa 1,1−1,2 mg/100 g riippuen kasvuvuodesta. Mustikka sisältää enemmän kahvihappoa, vaniljahappoa ja p-kumaarihappoa kuin variksenmarja, mustaherukka ja puolukka.
Mustaherukka ja puolukka taas sisältävät enemmän gallushappoa ja p-hydroksibentsoehappoa kuin mustikka ja variksenmarja (Mattila ym. 2006). Häkkisen ja Törrösen (2000) tutkimuksessa saatiin pienempiä fenolihappopitoisuuksia mustikalle: p-kumaarihapon pitoisuus mustikassa oli noin 2,4 mg/100 g ja kahvihapon noin 0,4 mg/100 g.
Hydroksibentsoehappo R1 R2
p-hydroksi-bentsoehappo
H H
Gallushappo OH OH
Hydroksikanelihappo R1 p-kumaarihappo H
Kahvihappo OH
Ferulahappo OCH3
Taulukko 1. Marjojen fenolihappopitoisuuksia (mg/100 g per tuorepaino) (muokattu Mattila ym. 2006).
Mustikka 2003 Mustikka 2005 Variksenmarja Mustaherukka Puolukka KAH 9,5 ± 0,45 10,6 ± 0,35 2,8 ± 0,20 3,5 ± 0,22 4,5 ± 0,35 KAH = kahvihappo, FER = ferulahappo, SIN = sinappihappo, PRO = protokateniikihappo, VAN = vaniljahappo, P-KUM = p-kumaarihappo, P-OHB = p-hydroksibentsoehappo, SYR = syringihappo, KAN = kanelihappo, GA = gallushappo, ND = ei havaittu.
2.2.2 Antosyaanit
Antosyaanit ovat flavonoideihin kuuluva alaryhmä, joita tummat marjat sisältävät paljon (Puupponen-Pimiä ym. 2005a). Antosyaanit ovat konjugoituneita antosyanidiineja, joita kasveissa esiintyy kuusi kappaletta: pelargonidiini, syanidiini, delfinidiini, peonidiini, petunidiini ja malvidiini (Del Rio ym. 2010; Kuva 3). Antosyaani muodostuu antosyanidiinista ja konjugoituneesta sokeriosasta, kuten glukoosista, soforoosista, rutinoosista, ramnoosista, galaktoosista, arabinoosista tai xyloosista (Del Rio ym. 2010). Antosyaaneja on tutkittu marjojen sisältämistä yhdisteistä eniten ja niiden ajatellaan osittain selittävän marjojen lukuisia terveysvaikutuksia (Smeriglio ym. 2014). Ne saavat aikaan etenkin marjojen sinisen ja violetin värin.
Kuva 3. Antosyanidiinien kemiallinen rakenne (muokattu Del Rio ym. 2010).
Mustikat sisältävät erityisen runsaasti antosyaaneja verrattuna muihin marjoihin (Smeriglio ym.
2014). Antosyaanien kokonaismäärä mustikassa on noin 300−700 mg/100 g tuorepainoa kohti (Smeriglio ym. 2014) ja ne muodostavat 95 % mustikan kokonaisfenolien määrästä (Tian ym.
Antosyanidiini R1 R2 Väri
Pelargonidiini H H Puna-oranssi
Syanidiini OH H Punainen
Delfinidiini OH OH Vaaleanpunainen Peonidiini OCH3 H Sini-violetti Petunidiini OCH3 OH Violetti Malvidiini OCH3 OCH3 Puna-violetti
2017). Koposen ym. (2007) tutkimuksessa mustikassa oli antosyaaneja 516−611 mg/100 g, variksenmarjassa 360 mg/100 g ja mustaherukassa 201 mg/100 g. Mustikat sisältävät useita eri antosyaaneja, joista tärkeimpiä ovat delfinidiinin ja syanidiinin glykosidit (Koponen ym. 2007;
Tian ym. 2017). Näiden lisäksi mustikka sisältää pienempiä määriä malvidiinin, petunidiinin ja peonidiinin glykosideja. Esimerkiksi Müllerin ym. (2012) tutkimuksessa tuoreen mustikan, mustikkamehun ja mustikkanektarin merkittävimmät antosyaanit olivat delfinidiini-3-O-glukopyranosidi, delfinidiini-3-O-galaktopyranosidi ja syanidiini-3-O-arabinopyranosidi.
Variksenmarja sisältää antosyaaneista eniten malvidiinin ja delfinidiinin gykosideja, seuraavaksi eniten syanidiinin glykosideja sekä pienempiä määriä peonidiinin ja petunidiinin glykosideja (Koponen ym. 2007). Mustaherukka sisältää antosyaaneista vain lähinnä delfinidiinin ja syanidiinin glykosideja. Punaiset marjat sisältävät paljon vähemmän antosyaaneja kuin tummat marjat, esimerkiksi puolukka vain noin 78 mg/100 g ja mansikka noin 35 mg/100 g (Koponen ym. 2007).
2.2.3 Flavonolit ja flavanolit
Marjojen tyypillisimpiä flavonoleja ovat myrisetiini, kversetiini ja kemferoli (Del Rio ym.
2010; Kuva 4). Flavonolit esiintyvät ruoassa usein O-glukosidi-muodossa, eli sokeritähteeseen kiinnittyneinä. Tyypillisin sokeritähde on D-glukoosi. Mustikka sisälsi Häkkisen ym. (1999) tutkimuksessa vähemmän flavonoleja kuin mustaherukka ja variksenmarja. Tutkimuksen mukaan mustaherukassa on yhteensä noin 11,5 mg/100 g flavonoleja, joista kversetiiniä 4,4 ja myrisetiiniä 7,1 mg/100 g. Mustikassa on yhteensä flavonoleja 4,3−5,1 mg/100 g riippuen kasvuvuodesta, joista kversetiiniä noin 3 mg/100 g ja myrisetiiniä 1,4−2,1 mg/100 g.
Variksenmarjassa puolestaan on flavonoleja 10,2 mg/100 g, joista kversetiiniä 5,3 ja myrisetiiniä 4,9 mg/100 g (Häkkinen ym. 1999). Kokonaisfenolien määrään verrattuna mustikka sisältää suhteellisen vähän flavonoleja.
Kuva 4. Flavonolien kemiallinen rakenne (muokattu Häkkinen ja Törrönen 2000).
Flavonoli R1 R2
Kversetiini OH H
Myrisetiini OH OH
Kemferoli H H
Marjoissa esiintyviä flavanoleja ovat muun muassa allokatekiini, epigallokatekiini, (-)-epikatekiini ja (+)-katekiini (Puupponen-Pimiä ym. 2005a). Esimerkkejä katekiinien kemiallisesta rakenteesta on esitetty kuvassa 5. Flavanolit muodostavat yhteen sitoutuneina polymeerisiä proantosyanidiineja eli kondensoituneita tanniineja, mutta niitä esiintyy marjoissa jonkin verran myös monomeerisessä muodossa (Del Rio ym. 2010). Flavanoleja on marjoissa kuitenkin vain pieniä pitoisuuksia ja esimerkiksi vihreä tee ja kaakao sisältävät niitä paljon runsaammin (Del Rio ym. 2010).
Kuva 5. Flavanolien (katekiinien) kemiallinen rakenne (muokattu Puupponen-Pimiä ym. 2001)
2.2.4 Lignaanit ja tanniinit
Tanniinit ovat monimutkaisia fenolisia polymeerejä, jotka muodostuvat useista flavonoideista tai fenolihapoista (Puupponen-Pimiä ym. 2005a). Tanniinit voidaan jakaa hydrolysoituviin ja kondensoituihin tanniineihin. Gallotanniini ja ellagitanniini kuuluvat hydrolysoituviin tanniineihin. Vadelma, tyrni ja lakka sisältävät tummia marjoja enemmän tanniineja, erityisesti ellagitanniineja. Kondensoituneita tanniineja kutsutaan proantosyanidiineiksi ja ne saavat aikaan karvaan maun (Puupponen-Pimiä ym. 2005a). Esimerkiksi puolukka ja karpalo sisältävät paljon proantosyanidiineja (Kylli ym. 2011). Proantosyanidiinit koostuvat pääasiassa flavanoleista: katekiinista, epikatekiinista, gallokatekiinista tai epigallokatekiinista.
Esimerkiksi kuvasta 1 nähdään, että trimeerinen proantosyanidiini koostuu kolmesta katekiinimolekyylistä. Tanniineilla ja proantosyanidiineilla ajatellaan olevan voimakkaat antimikrobiset vaikutukset (Puupponen-Pimiä ym. 2005a).
Lignaanit muodostuvat tyypillisesti kahdesta kanelihapon tähteestä (Smeds ym. 2012).
Tyypillisiä lignaanin lähteitä ovat esimerkiksi seesaminsiemenet, linssit, pähkinät ja viljatuotteet, mutta niitä esiintyy myös pieniä määriä marjoissa. Mansikka, puolukka, karpalo ja karhunvatukka sisältävät marjoista eniten lignaaneja (Mazur ym. 2000). Mustikka sisälsi lignaaneja Smedsin ym. (2012) tutkimuksessa 2,8 mg/100 g ja mustikan siemen 13,8 mg/100 g
Flavanolit R1 R2
(+)-katekiini OH H
(-)-epigallokatekiini OH OH
kuivapainoa kohti. Mustaherukassa taas oli 1,0 mg/g ja sen siemenissä 2,3 mg/100 g lignaaneja kuivapainoa kohti. Mustikka sisälsi lignaaneista eniten syringaresinolia, kun taas mustaherukka ei sisältänyt sitä lainkaan. Seuraavaksi eniten mustikassa esiintyi medioresinolia, larisiresinolin seskvilignaaneja ja sekoisolarisiresinolia. Mustaherukka sisälsi eniten sekoisolarisiresinolia ja pienemmän määrän muita lignaaneja (Smeds ym. 2012).
2.2.5 Polyfenolipitoisuuteen ja -koostumukseen vaikuttavat tekijät
Antosyaanien määrä vaihtelee merkittävästi riippuen lajikkeesta, kasvuolosuhteista ja marjan kypsyydestä (Smeriglio ym. 2014). Tämä vaikeuttaa eri maissa ja alueilla kasvaneiden marjojen vertailua eri tutkimuksissa. Mitä kypsempi mustikka, sitä suurempi on sen antosyaanipitoisuus (Smeriglio ym. 2014). Raaka mustikka sisältää kypsää enemmän karotenoideja, proantosyanidiineja, flavonoleja ja hydroksikanelihappoja, kun taas marjan kypsyessä niiden pitoisuudet laskevat ja antosyaanien määrä nousee (Karppinen ym. 2016a). Luonnonmukaisesti ja tavanomaisesti tuotettujen marjojen polyfenolikoostumusten ei ole havaittu eroavan toisistaan (Häkkinen ja Törrönen 2000; Sablani ym. 2010). Luomuvadelmat ja -pensasmustikat eivät eronneet polyfenolipitoisuudeltaan tai -koostumukseltaan tavanomaisesti tuotetuista (Sablani ym. 2010). Luomumansikat eivät myöskään eronneet flavonoli- ja fenolihappokoostumukseltaan tavanomaisesti tuotetuista (Häkkinen ja Törrönen 2000).
Kasvuvuosi, kasvupaikan sijainti, lämpötila ja valon määrä vaikuttavat merkittävästi marjojen polyfenoleihin (Karppinen ym. 2016a). Antosyaanien määrä mustikassa on sitä suurempi, mitä korkeammalla merenpinnasta kasvupaikka sijaitsee (Zoratti ym. 2015) ja mitä pohjoisimmille leveyspiireille mennään (Åkerström ym. 2010). Marjojen antosyaanien (Lätti ym. 2008) sekä flavonolien ja fenolihappojen (Häkkinen ja Törrönen 2000) määrä ja laatu vaihtelevat eri puolilla Suomea. Pohjois-Suomen mustikoissa on enemmän antosyaaneja, ja ne sisältävät antosyaaneista eniten delfinidiinin glykosideja, kun taas Etelä-Suomen mustikoissa on vähemmän antosyaaneja ja niiden tavallisimmat antosyaanit ovat syanidiinin glykosidit (Lätti ym. 2008). Kuitenkin Etelä-Suomessa viljeltyjen pensasmustikoiden flavonoli- ja fenolihappopitoisuudet olivat suurempia kuin Itä-Suomessa viljeltyjen (Häkkinen ja Törrönen 2000).
Matalampi kasvulämpötila saattaa lisätä antosyaanien määrää (Hyvärinen 2001). Kuitenkin Ulebergin (2012) tutkimuksessa korkeampi kasvulämpötila (18 °C) sai aikaan suuremmat antosyaanipitoisuudet mustikassa kuin matalampi lämpötila (12 °C), mutta kokonaisfenolien
määrään lämpötilalla ei ollut vaikutusta. Tutkimuksessa matalampi kasvulämpötila sai aikaan suuremmat pitoisuudet flavonoleja ja hydroksikanelihappoja kuin korkeampi lämpötila, kun taas korkeammassa kasvulämpötilassa kiinihapon pitoisuus oli mustikassa suurempi kuin matalassa lämpötilassa. Suurempi valon määrä ja pidempi aika valoa lisäävät mustikan antosyaanien, flavonolien, hydroksikanelihappojen ja kokonaisfenolien määriä (Karppinen ym.
2016a). Antosyaanien ja muiden polyfenolien määrät marjoissa siis vaihtelevat eri vuosien välillä kasvuolosuhteiden mukaan.