Bioaktiivinen hilloke esti tilastollisesti merkitsevästi listeriakannan kasvua fenolipitoisuudella 2,5 mg/ml (Kuva 3, Liite 1). Muita tilastollisesti merkitseviä tuloksia ei saatu, vaikka muutkin tuotteet antoivat viitteitä antimikrobisuudesta. Esimerkiksi antosyaaniuute esti listeriakannan kasvun 47,7 % fenolipitoisuudella 10 mg/ml ja aikapisteellä 48 h (Liite 1). Tiiviste esti salmonellakannan kasvun 50,2 % fenolipitoisuudella 10 mg/ml ja aikapisteellä 48 h. Suurin yksittäinen inhibitioprosentti saatiin tiivisteellä hiivakantaa vastaan pitoisuudella 10 mg/ml ja aikapisteellä 24 h; inhibitioprosentti oli 75,4 %. Yleisesti ottaen marjatuotteiden inhibitioprosentit listeriakantaa vastaan olivat suurempia kuin salmonella- ja hiivakantaa vastaan. Marjatuotteilla ei ollut antimikrobisia vaikutuksia hiivakantaa vastaan tiivistettä lukuun ottamatta.
Kokonaisten marjojen uutteet eivät estäneet minkään mikrobin kasvua (Liite 1), toisin kuin aikaisemmissa tutkimuksissa (Taulukko 2). Samaa Salmonella Typhimurium -kantaa (ATCC 13311) käytettiin myös Tianin ym. (2018) tutkimuksessa, jossa ei myöskään havaittu mustikka- eikä mustaherukkapuristekakku-uutteiden estävän kannan kasvua. Sen sijaan variksenmarjauutteen inhibitioprosentti salmonellakantaa vastaan oli 45−77 %. Lisäksi
tutkimuksessa mustikka-, variksenmarja- ja mustaherukkapuristekakku-uutteet inhiboivat hyvin Listeria monocytogenes -bakteerin kasvua (inhibitioprosentit 25−77 % mustikalle, 25−85
% variksenmarjalle ja 57−100 % mustaherukkapuristekakulla), mutta käytetty kanta oli eri kuin tässä tutkielmassa. Tianin ym. (2018) tutkimuksessa uutteiden kokonaisfenolipitoisuudet olivat moninkertaiset verrattuna tämän tutkielman uutteisiin. Uuttomenetelmä poikkesi kuitenkin tämän tutkielman menetelmästä: uuttamiseen oli esimerkiksi käytetty 70 % etanolia ja pidempää uuttoaikaa. Vaihtelevat tulokset antimikrobisissa ominaisuuksissa eri tutkimuksissa voivat johtua fenolien pitoisuuserojen ja vaihtelevien bakteerikantojen lisäksi menetelmällisistä eroista, kuten esimerkiksi siitä, että marjojen uuttamiseen käytettiin kohtuullisen pientä etanolipitoisuutta. Lisäksi uuttoaika oli suhteellisen lyhyt, 15 minuuttia, joten käytetyllä menetelmällä ei välttämättä saatu eristettyä kaikkia antimikrobisia yhdisteitä. Jos variksenmarjasta ja mustaherukasta valmistettuja polyfenolipitoisia tuotteita, kuten tiivisteitä, olisi tutkittu, eri marjojen antimikrobisia ominaisuuksia olisi luultavasti voinut verrata paremmin keskenään.
Mehu, antosyaaniuute ja tiiviste muodostivat pientä sakkaa Honeycomb-levyn kuoppien pohjalle, mikä saattoi häiritä absorbanssiarvojen mittausta. Tämä heikentää tulosten luotettavuutta ja voi osaltaan selittää toistojen väliset suuret keskihajonnat. Toisaalta etanoliin uutetut näytteet eivät sakanneet samalla tavalla Bioscreen-testeissä, joten sakkaaminen ei selitä uutettujen näytteiden tulosten suuria keskihajontoja. Lisäksi esimerkiksi antosyaaniuutteen pipetoinnin pienetkin erot vaikuttavat merkittävästi antimikrobisuustesteihin päätyviin kokonaisfenolipitoisuuksiin, koska antosyaaniuutteen kokonaisfenolipitoisuus on niin suuri.
Tiivistettä taas oli hankala pipetoida korkean viskositeetin vuoksi, jolloin eri toistoihin on todennäköisesti päätynyt hieman eri määrät tiivistettä, mikä heikentää myös tulosten luotettavuutta ja toistettavuutta.
Antimikrobisuuskokeiden tulokset Candida albicans -hiivaa vastaan olivat ristiriitaisia. Vaikka etanolikontrolli sisälsi saman verran etanolia kuin uutteet, etanolikontrolli vähensi hiivakannan kasvua enemmän uutteisiin verrattuna. Voidaan pohtia, onko esimerkiksi marjatuotteilla etanolin antimikrobisuutta vähentäviä yhteisvaikutuksia, jolloin puhdas etanoli inhiboi etanolikontrollissa hiivakannan kasvua marjauutteita enemmän. Tiiviste oli ainoa tuote, joka vähensi hiivakannan kasvua, mutta tulokset eivät olleet tilastollisesti merkitseviä.
Marjatuotteiden tyypillisiä pilaajamikrobeja ovat yksisoluisiin sieniin kuuluvat hiivat ja homeet (Tournas ja Katsoudas 2005), mikä saattaa selittää tämän tutkielman marjatuotteiden huonoja antimikrobisia vaikutuksia hiivakantaa vastaan. Marjojen matala pH edistää hiivojen ja
homeiden kasvua, koska useimmat bakteerit eivät kasva matalassa pH:ssa. Esimerkiksi Zhun ym. (2018) tutkimuksessa määritettiin pensasmustikkamehun pilaajamikrobeja. Pilaantuneissa mehuissa havaittiin yhdeksän mikrobisukua, joista neljä kuului hiivoihin, kolme muihin yksisoluisiin sieniin ja vain kaksi sukua bakteereihin. Hiivat ovat eukaryoottisoluja, jotka ovat toiminnaltaan monimutkaisempia ja kooltaan suurempia kuin bakteerisolut. Tämä voi osaltaan selittää sen, miksi testatuilla marjatuotteilla ei ollut antimikrobisia ominaisuuksia C. albicans -hiivaa vastaan. Tulokset ovat linjassa aiempien tutkimusten tulosten kanssa, joissa mustikkauutteet eivät estäneet eri hiivakantojen kasvua (Rauha ym. 2000; Nohynek ym. 2006;
Burdulis ym. 2009).
Gram-negatiivisten bakteerien on ajateltu olevan vastustuskykyisempiä antimikrobisille yhdisteille gram-positiivisiin verrattuna (Nohynek ym. 2006). Tässä tutkielmasta saatiin samankaltaisia tuloksia: gram-negatiivinen S. Typhimurium oli vastustuskykyisempi marjauutteille kuin gram-positiivinen L. monocytogenes. Toisin kuin tämän tutkielman tuloksissa, Puupponen-Pimiän ym. (2001) tutkimuksessa marjatuotteet estivät tehokkaammin gram-negatiivisten kuin gram-positiivisten bakteerien kasvua. Täytyy kuitenkin huomioida, että tutkimuksessa gram-positiivisina bakteereina oli käytetty probioottisia laktobasilleja ja bifidobakteereita. Marjatuotteiden antimikrobisista vaikutuksista patogeenisiin, gram-positiivisiin bakteereihin ei siis voida tutkimuksen perusteella tehdä johtopäätöksiä. Khalifan ym. (2015) tutkimuksessa marjatuotteiden antimikrobisuutta oli tutkittu sekä gram-positiivisilla että negatiivisilla patogeeneilla. Tulosten mukaan pensasmustikka esti sekä gram-positiivisten että gram-negatiivisten patogeenien kasvua. Vaihtelevien tutkimustulosten perusteella bakteerin herkkyyttä antimikrobisille marjatuotteille ei voida suoraan päätellä siitä, onko bakteeri gram-positiivinen vai gram-negatiivinen.
Listeriakannan osalta inhibitioprosentit olivat suurempia 24 h kuin 48 h inkuboinnin jälkeen (Liite 4). Tämä viittaa siihen, että marjatuotteet hidastavat aluksi listerian kasvua, mutta kasvu kiihtyy 48 h aikapisteeseen mentäessä. Antimikrobiset vaikutukset olivat siis alussa voimakkaammat listeriakannalle ja ne heikkenivät ajan kuluessa. Hiivakannan inhibitioprosentit taas olivat suurempia 48 h kuin 24 h inkuboinnin jälkeen ja salmonellakannan inhibitioprosenteissa ei ollut selkeitä eroja eri aikapisteiden välillä. Myös Puupponen-Pimiän ym. (2005b) tutkimuksessa havaittiin vaihtelua inhibitiotehossa eri inkubointiaikoina ja eri mikrobien välillä. Tutkimuksessa marjojen fenoliuutteiden inhibitiotehot S. Typhimurium -bakteeria vastaan olivat suuremmat inkuboinnin alussa, kun taas inkuboinnin lopussa bakteerin kasvu kiihtyi. Samanlaista vaikutusta ei havaittu muiden bakteerien osalta.
Tutkijat uskovat tämän johtuvan siitä, että fenoleilla on erilaiset toimintamekanismit eri mikrobien kasvun estossa, mutta tarkkoja toimintamekanismeja tiedetä (Puupponen-Pimiä ym.
2005b).
Etenkin gallushappo, mutta myös kversetiini hidastivat kaikkien mikrobien kasvua.
Gallushappo ja kversetiini voivat osittain selittää marjatuotteiden antimikrobisia ominaisuuksia. Kuitenkin mustikan kokonaisfenoleista suurin osa on antosyaaneja (Tian ym.
2017), ja testeissä käytettyjen puhdasaineiden pitoisuudet ovat mustikassa suhteellisen pienet (Häkkinen ym. 1999; Mattila ym. 2006), joten mustikan sisältämien puhdasaineiden osuudesta antimikrobisuuteen ei voida tehdä suoria johtopäätöksiä. Aikaisemmat tutkimustulokset puhdasaineiden antimikrobisuudesta ovat vaihtelevia: Rauhan ym. (2000) tutkimuksessa kversetiini esti monien gram-negatiivisten ja -positiivisten bakteerien kasvua, mutta gallushapolla ei havaittu antimikrobisuutta testattuja mikrobeja vastaan. Kversetiini ja gallushappo eivät estäneet C. albicans -hiivan kasvua (Rauha ym. 2000). Pacheco‐Ordazin ym.
(2018) tutkimuksessa gallushappo ja ferulahappo estivät muun muassa S. Typhimurium -bakterin kasvua pitoisuudella 20 mmol/l, kun taas tässä tutkimuksessa ferulahapolla ei havaittu antimikrobisia ominaisuuksia.
8.3 Antimikrobisuuskokeet putkialtistuksen avulla
Antosyaaniuute esti kokonaan salmonellakannan kasvun putkissa 24 h altistuksen jälkeen pitoisuudella 3,3 % (Taulukko 6). Toisaalta salmonellakanta ei ollut yhtä herkkä tiivisteelle, sillä tiiviste hidasti vain hieman kannan kasvua. Sekä tiiviste että antosyaaniuute hidastivat listeriakannan kasvua, mutta eivät estäneet sitä kokonaan.
Tummia näytteitä piti laimentaa moninkertaisesti Bioscreen-kokeisiin, jotta laite pystyi mittamaan absorbanssiarvot luotettavasti. Tämän takia Bioscreen ei välttämättä ole optimaalisin menetelmä tummien marjatuotteiden antimikrobisuuden määrittämiseen.
Bioscreen-testien perusteella ei voinut tehdä johtopäätöksiä laimentamattomien, alkuperäisten tummien näytteiden antimikrobisista ominaisuuksista. Myös agar-diffuusiotestiä kokeiltiin marjatuotteille, mutta huomattiin ettei se soveltunut tummille näytteille. Niinpä käytetyistä antimikrobisuustestien menetelmistä paras oli putkissa altistus ja maljaviljely. Kuitenkin menetelmä on erittäin työläs ja paljon käsityötä vaativa verrattuna esimerkiksi Bioscreen-testeihin, joten se ei ole kätevä suurien näytemäärien kanssa.
Kun vertaa putkikokeiden ja Bioscreen-testien tuloksia keskenään, tiiviste ei ollut sen tehokkaampi bakteereita vastaan putkitesteissä kuin Bioscreen-testeissä. Antosyaaniuute ei myöskään ollut tehokkaampi listeriakantaa vastaan putkitesteissä kuin Bioscreen-testeissä.
Tiivisteen suurin pitoisuus Bioscreen-testeissä kuoppalevyillä oli kokonaisfenolipitoisuudella 1,5 % ja antosyaaniuutteen 0,3 % kuopan kokonaistilavuudesta (Taulukko 3). Putkitesteissä molempien näytteiden pitoisuus oli paljon suurempi, 3,3 % kokonaistilavuudesta. Tulokset antavat viitteitä siitä, että etenkin tiivisteen maksimaalinen inhibitiotehokkuus saavutetaan jo pienemmällä pitoisuudella kuin 3,3 %. Bioscreen-testien ja putkitestien tuloksia ei kuitenkaan suoraan voi verrata keskenään, koska menetelmät poikkeavat toisistaan: Bioscreenilla tulokset perustuvat absorbanssiarvojen muodostaman käyrän pinta-alaan ja maljauksella määritetään mikrobitiheys pesäkkeiden lukumäärien avulla. Putkiteisteissä tiiviste esti suurella pitoisuudella (3,3 %) salmonellakannan kasvua vain 16 % (Taulukko 6), kun taas Bioscreen-testeissä tiiviste esti tätä pienemmällä pitoisuudella salmonellakannan kasvua noin 50 % (Kuva 5, Liite 1). Antimikrobisuustestien menetelmät erosivat kuitenkin niin paljon toisistaan, ettei inhibitioprosentteja voi vertailla täysin keskenään. Tuloksiin voi vaikuttaa esimerkiksi se, että toisin kuin Bioscreen-testeissä, putkitesteissä putkia ei ravisteltu inkuboinnin aikana.