LINNUNULOSTEEN POTENTIAALI BIOMONITORINA: METALLIEN ERITYS VIRTSAHAPOSSA JA RUOANTÄHTEESSÄ
Nelli Raivikko Linnunulosteen potentiaali biomonitorina:
metallien eritys virtsahapossa ja ruoantähteessä Pro Gradu -tutkielma Ympäristötiede Itä-Suomen yliopisto, Ympäristö- ja biotieteiden laitos Helmikuu 2020
ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, Luonnontieteiden ja metsätieteiden tiedekunta Ympäristötieteen pääaine
Nelli Raivikko: Linnunulosteen potentiaali biomonitorina: metallien eritys virtsahapossa ja ruoantähteessä
Pro Gradu -tutkielma 51 sivua, 1 liitettä (52 sivua) Tutkielman ohjaajat: Jouni Sorvari (FT)
Tapio Eeva (FT, DOS) Helmikuu 2020
________________________________________________________________________
avainsanat: (raskasmetalli, biomonitori, virtsahappo, ruoantähde) TIIVISTELMÄ
Harjavallassa sijaitsee yksi Suomen saastuneimmista alueista ja sen linnustosta on löytynyt korkeita metallipitoisuuksia. Linnuilla on tärkeä rooli biomonitoreina, koska niitä on helppo tarkkailla, ne ovat näkyviä ja yksi eniten tutkituista eliöryhmistä. Linnunuloste sopii hyvin biomonitorointiin, koska sitä on helppo kerätä lintua vahingoittamatta ja varpuslintujen ulosteen metallipitoisuuksien on todettu heijastavan ympäristön metallipitoisuuksia.
Linnunuloste jakaantuu munuaisista erittyneeseen virtsahappoon ja suoliston läpi kulkeneeseen ruoantähteeseen, joilla voisi olla eri metallipitoisuudet. Lintujen altistuminen metalleille aiheuttaa niille erilaista oireilua ja negatiivisia vaikutuksia muun muassa munan kuoren paksuuteen ja poikaiskuolleisuuteen.
Pro gradu -tutkielmani Linnunulosteen potentiaali biomonitorina: metallien eritys virtsahapossa ja ruoantähteessä tavoitteena oli selvittää, onko biomonitoroinnin kannalta linnunulosteen jaottelusta virtsahappoon ja ruoantähteeseen hyötyä. Työ tehtiin tutkimalla eroavatko metallipitoisuudet linnunulosteen virtsahapon ja ruoantähteen välillä, ja jos eroavat, niin kuinka paljon. Lisäksi tutkittiin, vaikuttaako eri metallien pitoisuudet linnunulosteessa linnunpoikasten selviytymistodennäköisyyteen munasta lentokykyiseksi.
Työssä otettiin ulostenäytteitä 40:ltä 6–11 vrk:n ikäiseltä kirjosiepon (Ficedula hypoleuca) poikaselta Harjavallan metallisulaton ympäristössä. Linnunuloste jaettiin virtsahappoon ja ruoantähteeseen, joista analysoitiin metallipitoisuudet ICP-MS -laitteella. Näytteistä analysoitiin kalsium, rauta, koboltti, nikkeli, kupari, sinkki, arseeni, kadmium ja lyijy. Lisäksi jokaisesta pesyeestä merkattiin kuolleiden poikasten ja kuoriutumattomien munien lukumäärä ylös.
Tuloksista oli havaittavissa, että kaikkien metallien määrät ruoantähteessä olivat yli kaksinkertaiset virtsahappoon verrattuna ja noin 75% kokonaismetallimäärästä löydettiin ruoantähteestä. Metallien saanti on siis ollut runsasta tai/ja metallit ovat olleet huonosti imeytyneessä muodossa. Virtsahapon pitoisuuksista käy ilmi, että metallit ovat olleet ympäristössä biosaatavassa muodossa ja niitä on päässyt lintujen verenkiertoon. Ulosteen lyijy-, arseeni- ja rautapitoisuudet olivat yhteydessä poikasten huonompaan selviytymistodennäköisyyteen.
Ruoantähdeosio ja virtsahappo antavat erilaista tietoa ympäristöstä, joten ulosteen jaottelu kannattaa. Linnunulosteesta kannattaa kerätä ruoantähdeosio koko ulosteen sijaan, mikäli tahdotaan tarkastella ympäristön kokonaismetallikuormitusta. Mikäli halutaan tarkastella ympäristön metallipitoisuutta, jolla on vaikutusta eläinten metaboliaan, kannattaa valita linnunulosteen virtsahappo. Raudan, arseenin ja lyijyn pitoisuudet linnunpoikasten ulosteessa antavat arviota siitä, kuinka moni poikanen selviää munasta lentoikäiseksi.
UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND, Faculty of Science and Forestry Environmental Science
Nelli Raivikko: Potential of bird feces as a biomonitor: metal excretion in uric acid and food residue
Master of Science thesis 51 pages, 1 appendix (52 pages) Supervisors: Jouni Sorvari (DP)
Tapio Eeva (DP, DOS) February 2020
________________________________________________________________________
Keywords: (heavy metal, biomonitor, uric acid, food residue) ABSTRACT
One of the most polluted areas in Finland is Harjavalta and there has been found high metal concentrations in bird. Birds have an important role as biomonitors because they are easy to observe, they are visible and one of the most studied group of organisms. Bird feces is suitable for biomonitoring because it is easy to collect without harming birds and feces of passerines reflects metal concentrations in environment. Bird feces is divided to uric acid, which comes from kidneys, and to food residue coming from intestine. Uric acid and food residue can have different metal concentrations. Birds exposure to metals is causing them different symptoms and has negative effects for example thickness of eggshells and mortality of nestlings.
The goal of my master thesis, Potential of bird feces as a biomonitor: metal excretion in uric acid and food residue, is to find out is it useful to divide bird feces to uric acid and food residue. This research was made by studying if there is a difference in metal concentrations between uric acid and food residue, and how big the difference is. I also studied does
concentrations of different metals in bird feces effect nestlings likelihood to survive from egg to fledgling.
The samples of feces were taken from 40 pied flycatcher (Ficedula hypoleuca) nestlings aged 6–11 days nearby area of smelter in Harjavalta. Feces were divided into white uric acid and brown food residue. Metal concentrations of calcium, iron, cobalt, nickel, copper, zinc, arsenic, cadmium, and lead were analyzed with ICP-MS -machine. Number of dead nestlings and not hatched eggs were recorded.
The results indicated that food residue contained over two times more all types of metals than uric acid. About 75% of all metals were found in food residue. It can be concluded that supply of metals has been abundant and/or metals have been in form that is not absorbed easily in intestine. The metal concentrations in uric acid indicates that some metals have been in biologically available form and have gotten into bloodstream of birds. Lead, arsenic, and iron concentrations of bird feces were connected to bigger death rate of nestlings.
In conclusion, it is useful to divide bird feces as food residue and uric acid yields different kind of environmental information. It is beneficial to collect food residue instead of whole feces, if the goal is to study total metal load of environment. If the goal is to study metal concentration of environment effecting organisms’ metabolism, it is better to choose uric acid.
Concentration of iron, arsenic, and lead in bird feces give hint how many nestlings survive from egg to fledgling.
ESIPUHE
Tämä Pro gradu -tutkielma käsittelee linnunulosteen sisältämän ruoantähteen ja virtsahapon metallipitoisuuksia ja niiden vaikutusta linnunpoikasten selviytymiseen munasta lentoikäiseksi.
Näytteet otin ja käsittelin vuonna 2018, jolloin tehtiin myös metallianalyysit. 2019–2020 tein tilastolliset analyysit ja kirjoitin tutkielman.
Haluan kiittää kannustavia ohjaajiani Jouni Sorvaria Itä-Suomen yliopistosta ja Tapio Eevaa Turun yliopistosta. Tapio oli mukana Harjavallassa näyttämässä missä pöntöt sijaitsevat ja perehdytti näytteenottoon. Jouni opasti Kuopiossa näytteenkäsittelyssä ja tilastollisten analyysien kanssa. Molemmat ovat lisäksi olleet suureksi avuksi antaessaan hyödyllistä palautetta tekstistäni, ja muistaneet kritiikin mukana myös kannustaa ja kiinnittää huomiota hyviin puoliin.
Isot kiitokset kuuluvat myös äidilleni ja siskolleni Minnalle jatkuvasta tsemppaamisesta ja uskosta tutkielman valmistumiseen.
Kuopiossa 19.2.2020 Nelli Raivikko
LYHENTEET JA MÄÄRITELMÄT
AFOS Alkalinen fosfataasi, maksasoluissa toimiva entsyymi, joka reagoi etenkin sapen erityksen häiriöihin.
ALT Alaniiniaminotransferaasi, maksassa esiintyvä entsyymi.
ASAT Aspartaattiaminotransferaasi. Maksassa, haimassa ja sydämessä oleva entsyymi, jonka pitoisuus nousee veressä näiden elinten kudostuhossa.
Bioindikaattori Eliö, eliön osa tai eliöryhmä, josta saadaan laadullista tietoa ympäristön tilasta.
Biomonitori Eliö, eliön osa tai eliöryhmä, josta saadaan määrällistä tietoa ympäristön tilasta
HCT Hematokriitti, eli punasolujen suhteellinen osuus koko verestä Hyperplasia Solumäärän kasvu jonkin ärsykkeen vasteena
Hyperkeratoosi Ihon sarveiskerroksen liiallinen paksuntuminen Kolestaattinen Sapen salpaukseen liittyvä
Korriini Aromaattinen heterosyklinen yhdiste
LD Laktaattidehydrogenaasi. Entsyymi, jota esiintyy runsaasti eri kudoksissa, kuten maksassa, ja jonka pitoisuus nousee
herkästi jo pienenkin elimen vaurioituessa.
Nekroosi Patologisten tekijöiden aiheuttama solukuolema
OTC Ornitiinitranskarbamylaasi, ureakiertoon osallistuva entsyymi Parenkyymi Perussolukko tai -kudos
Periportaalinen Lähempänä porttilaskimoa ja maksavaltimoa sijaitseva Pyrroli Viisirenkainen heterosyklinen aromaattinen amiini Sideroosi Tila, jossa kudoksiin on kertynyt ylimääräistä rautaa
SISÄLLYSLUETTELO
1. JOHDANTO ... 8
2. KIRJALLISUUSKATSAUS ... 10
2.1 Biomonitorit ... 10
2.2 Raskasmetallit ... 11
2.2.1 Rauta ... 11
2.2.1.1 Raudan vaikutukset linnuissa ... 12
2.2.2 Koboltti ... 13
2.2.2.1 Koboltin vaikutukset linnuissa ... 14
2.2.3 Nikkeli ... 15
2.2.3.1 Nikkelin vaikutukset linnuissa ... 16
2.2.4 Kupari ... 16
2.2.4.1 Kuparin vaikutukset linnuissa ... 17
2.2.5 Sinkki ... 18
2.2.5.1 Sinkin vaikutukset linnuissa ... 19
2.2.6 Arseeni ... 19
2.2.6.1 Arseenin vaikutukset linnuissa ... 21
2.2.7 Kadmium ... 22
2.2.7.1 Kadmiumin vaikutukset linnuissa ... 22
2.2.8 Lyijy ... 23
2.2.8.1 Lyijyn vaikutukset linnuissa ... 24
2.3 Lintujen ruoansulatus ... 26
2.3.1 Ruoantähteen muodostuminen... 26
2.3.2 Virtsahapon muodostuminen ... 27
3. TYÖN TAVOITTEET ... 28
4. AINEISTO JA MENETELMÄT ... 29
4.1 Linnut ... 29
4.2 Näytteiden keräys ... 29
4.3 Näytteiden käsittely ... 30
4.4 Tilastolliset analyysit ... 30
5. TULOKSET ... 32
5.1 Metallikonsentraatiot ruoantähteessä ja virtsahapossa ... 32
5.2. Metallipitoisuus suhteessa poikasten selviytymiseen ... 32
6. TULOSTEN TARKASTELU ... 36
6.1 Virtsahapon ja ruoantähteen metallipitoisuudet ... 36
6.2 Metallipitoisuudet ja poikasten selviytyminen ... 36
6.2.1 Rauta ... 36
6.2.2 Koboltti ... 37
6.2.3 Nikkeli ... 37
6.2.4 Kupari ... 37
6.2.5 Sinkki ... 37
6.2.3 Arseeni ... 38
6.2.4 Kadmium ... 38
6.2.5 Lyijy ... 38
6.2.6 Vaikutusten yhteenveto ... 39
6.3 Tuloksiin vaikuttavat tekijät ... 39
7. JOHTOPÄÄTÖKSET ... 41
1. JOHDANTO
Raskasmetallien vapautuminen ympäristöön ihmistoiminnan seurauksena on pysyvä ja maailmanlaajuinen uhka (Wang ym. 2005, Walker ym. 2001). Metallien tuotanto, sekä jätteiden ja fossiilisten polttoaineiden poltto vapauttavat metalleja ympäristöön, jossa ne päätyvät ilmakehään, maaperään, vesistöihin, kasveihin ja eliöihin mineraaleina, kaasuina, sekä veteen liuenneina ioneina ja suoloina. Ympäristön metallikontaminaatio on suurta etenkin pistemäisten lähteiden, kuten kaivosten ja metallisulattojen ympäristössä. Raskasmetallit laskeutuvat metallisulattojen lähialueille, kertyvät eliöihin ja voivat aiheuttaa muutoksia ekosysteemien rakenteissa. (Kiikkilä 2003.)
Harjavallassa sijaitsee yksi Suomen suurimmista ja tutkituimmista saastuneista alueista (Kiikkilä 2003, Uhlig ym. 2001, Kubin ym. 2000). Harjavallan suurteollisuuspuistossa toimii muun muassa rikkihappotehdas, kupari- ja nikkelisulatto, nikkelijalostamo, kemikaalitehdas, alumiinisuolatehdas, happi- ja vetytehtaat, happilaitos sekä voimalaitos.
Suurteollisuuspuistosta vapautuu ympäristöön muun muassa alumiinia, kuparia, nikkeliä, sinkkiä, lyijyä, arseenia ja kadmiumia. (Ramboll 2018.) Erilaisissa onnettomuuksissa Harjavallan vesistöihin on päässyt yli 50 000 litraa polttoöljyä ja 66t nikkeliä, kobolttia ja sulfaattia (Meritähti 2014, Laakso 2017). Korkeita metallipitoisuuksia löytyykin Harjavallan linnuista (Berglund ym. 2015), hyönteisistä (Eeva ym. 2004) ja maaperästä (Derome ja Nieminen 1998).
Lintuja on käytetty paljon biomonitoreina antamaan tietoa ympäristön tilasta (Dennemann ja Douben 1993, Sagehi ym. 2017). Linnut altistuvat metalleille ruoan, veden ja hengityksen kautta, sekä höyhenpukuaan puhdistaessa. Hyönteiset ovat tärkeä ravinnonlähde monille lintulajeille ja niiden välityksellä metallit siirtyvät ravintoketjussa trofiatasolta toiselle. (Dauwe ym. 2004.) Lintujen uloste jakaantuu valkeaan virtsahappo-osaan ja tummaan ruoantähdeosaan.
Aiemmissa tutkimuksissa on tarkasteltu koko ulostetta (Dauwe ym. 2000) tai virtsahappokiteitä yksittäin (Clapp ym. 2012) biomonitoreina. Tässä tutkimuksessa jaottelin linnun ulosteen virtsahappoon ja ruoantähteeseen ja vertailin näiden metallipitoisuuksia. Tämän pohjalta tarkastelin virtsahapon ja ruoantähteen puolia biomonitorina ja sitä, kannattaako linnun uloste jaotella osiin tutkittaessa ympäristön metallikuormaa.
Vaikka lintujen elimistö kykenee jonkin verran hankkiutumaan eroon raskasmetalleista (Evers ym. 2005), altistuvat jotkut yksilöt kuitenkin suuremmalle määrälle raskasmetalleja kuin mitä ne kykenevät käsittelemään (Evers ym. 2008). Eri raskasmetallit aiheuttavat linnuilla erilaista oireilua, ja niillä on monia negatiivisia vaikutuksia muun muassa munan kuoren paksuuteen, poikaiskuolleisuuteen, veriarvoihin ja aivopainoihin (Nyholm 1994, Nyholm 1998, Eeva ym.
2003). Tässä tutkimuksessa tarkastelin lisäksi, onko linnunpoikasten metallialtistuksella vaikutusta poikasten selviytymiseen.
2. KIRJALLISUUSKATSAUS
2.1 Biomonitorit
Bioindikaattori määritellään eliöksi, eliön osaksi tai eliöryhmäksi, josta saadaan laadullista tietoa ympäristön tilasta. Biomonitori puolestaan on eliö, eliön osa tai eliöryhmä, josta saadaan määrällistä informaatiota ympäristön tilasta. (Markert ym. 1999.) Kun bioindikaattoreita käytetään järjestelmällisesti, sitä kutsutaan biomonitoroinniksi, eli biologiseksi seurannaksi (Lodenius ym. 2010). Bioindikaattoreina tai biomonitoreina toimivat eliöt reagoivat saasteiden aiheuttamiin ympäristön muutoksiin havaittavilla tai mitattavissa olevilla läsnäolon, anatomian tai metabolian muutoksilla (Markert 1996). Biomonitorit antavat tietoa myös saastemääristä, jolle eliö on altistunut ja sitä kautta saadaan tietoa saasteen vaikutuksista eliöön tai ekosysteemiin (Markert ym. 1999).
Bioindikaattorille, eli myös biomonitorille, on asetettu kaksi kriteeriä. Bioindikaattorin pitää olla elävä tai kuollut eliö, ja sen pitää reagoida ympäristössä tapahtuvaan, yleensä ihmisen aiheuttamaan, muutokseen. Bioindikaattoria käytettäessä tutkitaan, esiintyykö lajia tietyllä alueella, kuinka runsaana se esiintyy ja missä kunnossa lajin yksilöt ovat. Bioindikaatio jaetaan reaktio- ja kertymäindikaatioon. Reaktioindikaatiossa etsitään muutoksia eliöyhteisöistä ja eliöistä. Kertymäindikaatiossa tutkitaan eliöihin kertyviä epäpuhtauksia. (Lodenius ym. 2010).
Tässä tutkimuksessa mitataan raskasmetallien kertymistä lintujen ulosteeseen, keskittyen siis kertymäindikaatioon.
Linnuilla on tärkeä rooli bioindikaattoreina ja biomonitoreina, koska niitä on helppo tarkkailla, ne ovat näkyviä ja yksi eniten tutkituista eliöryhmistä. Lukuisissa tutkimuksissa on käytetty lintuja biomonitoreina mutta suurin osa on keskittynyt aikuisiin peto- ja vesilintuihin (Dennemann ja Douben 1993, Jager ym. 1996, Sagehi ym. 2017). Etenkin trofiatasojen yläpäässä olevat petolinnut keräävät myrkyllisiä kemikaaleja ja raskasmetalleja, millä on negatiivinen vaikutus lintujen terveyteen ja lisääntymiseen. Pesiviä varpuslintuja on käytetty tutkimuksissa vähemmän, vaikka ne ovat hyviä biomonitoreja mitattaessa pistemäistä saastumista (Eens ym. 1999). Kun ympäristömyrkyt aiheuttavat lintujen kuolemia ja haittaavat lisääntymistä, pienenevät lintupopulaatiot, minkä on huomattu olevan aikainen varoitusmerkki ympäristönmuutoksesta. Lintuja käytetään kvalitatiivisena ja kvantitatiivisena ilmaisimena hyönteismyrkkyjen ja raskasmetallien kerääntymisestä, koska niistä saa helposti ja lintua
vahingoittamatta näytteitä, kuten munia, höyheniä ja ulostetta. Metallit ovat kertyneet muna-, höyhen- ja ulostenäytteisiin ja pitoisuudet ovat riippuvaisia altistusmääristä, mikä tekee linnuista erinomaisia biomonitoreja. (Markert ym. 2003.)
Varpuslintujen ulosteen metallipitoisuuksien on todettu heijastavan ympäristön metallipitoisuuksia (Dauwe ym. 2004, Morrisey ym. 2005). Morrisey ym. (2005) totesivat, että varpuslintujen ulosteiden ja ruoka-aineiden metallipitoisuuksien välillä oli selvä yhteys.
Metallikonsentraatio ulosteessa oli hieman korkeampi kuin ruoka-aineiden metallikonsentraatio. Dauwe ym. löysivät 2004 talitiaisten ulosteen ja perhosentoukkien metallipitoisuuksien väliltä selvän korrelaation. He kuitenkin huomasivat, että elimistölle välttämättömien metallien, eli kuparin, koboltin, nikkelin ja sinkin, pitoisuus ulosteessa ei korreloinut merkitsevästi lintujen ravinnon kanssa. Todennäköisesti, koska linnut säätelevät välttämättömien hivenaineiden absorptiota ja eritystä metabolisesti (Nybo ym. 1996).
2.2 Raskasmetallit
Raskasmetallit ovat tiheitä metalleja, jotka ovat myrkyllisiä jo matalilla pitoisuuksilla. Yleisesti hyväksytyn määritelmän mukaan raskasmetallien tiheys ylittää 5 g/cm3 (Koller ja Saleh 2018).
Lisäksi raskasmetalleilla on usein korkea atomiluku ja atomipaino, sekä ominaispaino yli 5,0 (Helmenstine 2018).
Tyypillisesti raskasmetalleja esiintyy maankuoressa alhaisilla pitoisuuksilla. Maankuoren rapautumisessa ja tulivuorten purkauksissa raskasmetallit vapautuvat luonnollisesti ympäristöön. Antropogeenisia lähteitä ovat metallien tuotantoprosessit ja jätteiden ja fossiilisten polttoaineiden poltto. (Evira 2017.) Raskasmetallipäästöt laskeutuvat metallisulattojen lähialueille ja kertyvät ravintoketjussa eliöihin. Ravintoketjun huipulla olevista petoeläimistä ja -linnuista on löytynyt erityisen suuria raskasmetallipitoisuuksia.
Kasveista erityisesti sammalet ja jäkälät keräävät raskasmetalleja, koska ne ovat pitkäikäisiä ja ottavat ravinteensa sade- ja sulamisvesistä. (Anon. 2019.)
2.2.1 Rauta
Rauta, tiheydeltään 7,9 g/cm3,on atomiluvultaan 26. alkuaine. 5% maankuoresta muodostuu raudasta ja se on yksi käytetyimmistä ja halvimmista metalleista. Maailmanlaajuisesti uutta rautaa tuotetaan vuosittain 500 miljoonaa tonnia ja kierrätetään 300 miljoonaa tonnia,
suurimpia tuottajamaita ovat Kiina, Brasilia ja Australia. Tärkeimpiä rautamalmeja ovat hematiitti (Fe2O3), magnetiitti (Fe3O4), limeniitti (FeO(OH)∙nH2O) ja sideriitti (FeCO3).
Rautaa vapautuu ympäristöön hiilen ja kalkkikiven mukana metallisulatoilta. Tavallisesti saatavilla oleva rauta sisältääkin hiiltä, joka on tarttunut siihen sulatuksen aikana koksista.
Rauta esiintyy useimmiten hapetusluvuilla +II ja +III mutta myös hapetuslukuja +IV ja +VI tavataan. (Encyclopaedia Britannica 2019a.) Kasvit eivät pysty käyttämään kolmenarvoista rautaa sellaisenaan, vaan märässä maassa kolmenarvoinen rauta muuntuu kahdenarvoiseksi.
Kasvit ottavat maaperässä olevat veteen liukenemattomat rautayhdisteet vapauttamalla vetyioneja, jolloin rauta liukenee. (Lenntech 2019.) Esimerkiksi sammaleet sisältävät todella paljon rautaa, jopa 20 kertaa enemmän kuin muut kasvit (Czarnowska ja Rejmont-Grochowska 2015).
Rauta on lähes kaikille eliöille välttämätön hivenaine, jota tarvitaan hapen ja elektronien kuljettamiseen, sekä DNA-synteesiin (Ponka ym. 2015). Suurin osa raudasta kuluu punasolujen hemoglobiiniin, jossa happimolekyylit sitoutuvat rauta-atomeihin. Osa raudasta käytetään kuitenkin solunsisäisissä hapettumista säätelevissä entsyymeissä. (Encyclopaedia Britannica 2019a.)
Rauta imeytyy pääasiassa pohjukaissuolesta ja ylemmästä tyhjäsuolesta (Muir ja Hopfer 1985).
Eliöiden ruoansulatuskanavasta imeytyy enemmän kahden-, kuin kolmenarvoista rautaa (Lenntech 2019). pH 7.4:ssä ja fysiologisen hapen läsnä ollessa, veteen liukeneva Fe2+ hapettuu kolmenarvoiseksi raudaksi, joka hydrolyysissä muodostaa liukenemattomia rauta(III)hydroksideja (Ponka ym. 2015). Rauta(III)hydroksidifosfaattikomplekseja tarvitaan elimistössä raudan varastointiin ferritiininä (Farrant 1954). Jos Fe3+-ionien konsentraatio vesiliuoksessa ylittää 10-17M, osa rautaioneista jää varastoimatta, jolloin ne saavat aikaan haitallisten happiradikaalien muodostumisen. Koska potentiaalisesti myrkyllistä ja liukenematonta rautaa täytyy käsitellä eliön elimistössä jatkuvasti, tarvitaan tietyt mekanismit ja molekyylit, jotta rautaa pystytään hankimaan, kuljettamaan ja säilömään mahdollisimman myrkyttömässä ja liukenevassa muodossa. (Ponka ym. 2015.)
2.2.1.1 Raudan vaikutukset linnuissa
McGhee ym. (1965) selvittivät raudan vaikutuksia broilereiden kasvuun syöttämällä linnuille 1600 ppm rautaa ja 5 ppm kuparia. He totesivat broilereiden kasvun hidastuneen mutta muita merkkejä myrkyllisyydestä ei ilmennyt.
Ward ym. (1988) puolestaan tutkivat lintujen rauta-altistuksen vaikutuksia maksaan Lontoossa kuolleista linnuista 1985–1986. Varpuslintujen (Passeriformes) maksoista löytyi rautaa jopa 230 µmol Fe /g, kun normaali määrä esimerkiksi jyrsijöille on 5,4 µmol Fe/g. Maksoissa, joissa oli korkeimmat rautapitoisuudet, löytyi samanlaisia morfologisia muutoksia kuin ihmisten idiopaattisessa hemokromatoosissa, jossa rautaa keräytyy liikaa elimistöön.
Säihkylinnuilta (Coraciiformes) löytyi vakavaa fibroosia jo 100 µmol Fe/g pitoisuuksilla mutta varpuslintujen maksoista ei löytynyt fibroosia tai näkyviä kudosvahinkoja edes maksoista, joissa oli kaikista korkeimmat rautapitoisuudet (230 µmol Fe/g). Elektronimikroskopoinnissa säihkylinnuilta löytyi vielä parenkyymin massiivista sytosideroosia, jossa ferritiinipartikkelit olivat hajaantuneet sytosoliin tai erottuneet lysosomeihin. Myös maksaentsyymien seerumipitoisuuksilla oli eroa lintulahkojen välillä. Varpus- ja haikaralinnuilla (Ciconiiformes) seerumin laktaattidehydrogenaasiarvot (LD) vastasivat toisiaan mutta muilla lintulahkoilla LD- arvot olivat noin 50% pienemmät. Alkalinen fosfataasi, eli AFOS oli yli viisinkertainen varpus- , haikara-, ja kanalinnuilla (Galliformes) verrattuna muihin lintulohkoihin. (Ward ym. 1988).
Rauta-altistuksen vaikutukset lintuun riippuvat niin lintulahkosta, kuin rautayhdisteen biosaatavuudesta. Rautayhdisteiden biosaatavuuden erot voi huomata rottien altistuskokeista.
Rauta-asetyyliasetonaatille (Fe(C5H7O2)3) LD50 on 1872 mg/kg mutta rautapentakarbonyylille (Fe(CO)5) LD50 on vain 25 mg/kg(Lenntech 2019).
2.2.2 Koboltti
Koboltti on atomiluvultaan 27. alkuaine ja sen tiheys on 8,9 g/cm3. Maankuoressa on kobolttia keskimäärin 0,001%. (Tuominen 1998.) Yli puolet maailman koboltista saadaan nikkeliä jalostettaessa. Kiina on maailman suurin koboltin tuottaja mutta 13 % maailman koboltista tuotetaan Suomessa, mikä on eniten koko EU-alueella. Harjavallassa toimiva Norilsk Nickel vastaa 3%:sta maailman koboltin jalostuksesta. (Cobalt institute 2017, Ahonen 2018.) Harjavallan lisäksi Suomessa jalostetaan kobolttia Keski-Pohjanmaalla (Ahonen 2018).
Koboltti saadaan 95-prosenttisesti muiden malmien louhinnan sivutuotteena (Ahonen 2018).
Tärkeimmät kobolttimineraalit ovat kobaltiitti (CoAsS), smaltiitti (CoAs2) ja erytriitti (Co3(AsO4)2 ∙8H2O). Pääasialliset antropogeeniset koboltin lähteet ilmastoon ovat kobolttia prosessoiva teollisuus, sekä fossiilisten polttoaineiden poltto, fosfaattilannoitteet ja kaivostoiminta. (Encyclopaedia Britannica 2017a.)
Kobolttiyhdisteiden tavallisimmat hapetusluvut ovat +II tai +III, joista +II on pysyvämpi.
(Lison 2014.) Myös hapetuslukuja +IV, +I, 0 ja -I on tavattu. Toksikologisesti merkittävimpiä koboltin muotoja ovat kobolttimetalli, kobolttioksidi ja tetraoksidi, sekä suolat, eli koboltti(II)kloridi, -sulfidi ja -sulfaatti. (Encyclopaedia Britannica 2017a.)
Märehtijöille koboltti on tärkeä hivenaineena ja se on välttämätön ravintoaine osana B12- vitamiinia eli kobalamiinia (syanokobalamiini) kaloille, linnuille ja nisäkkäille. Kobalmiinissa koboltti on kompleksina neljän pyrroli ytimen kanssa., liittyneenä korriinirenkaaseen. Eliöt eivät kykene syntetisoimaan B12-vitamiinia, vaan ovat riippuvaisia bakteerien tuottamasta vitamiinista. (Blust 2011.) Elimistössä tarvitaan B12-vitamiinia punasolujen kypsymisessä (Encyclopædia Britannica 2017), 1 µg B12-vitamiinia sisältää noin 0,04 µg kobolttia (TTL 2016).
Elimistössä koboltti stimuloi erytropoietiinin tuotantoa munuaisissa. (Fisher ja Langston 1967).
Co2+-ionit oletettavasti estävät hapesta riippuvaisia hydroksylaaseja (HIF-α), jotka ovat hypoksiaan reagoivia solun happisensoreita, hajoamasta ja siten indusoivat erytropoietiinigeenin transkriptiota (Jones ym. 2013). Epäorgaanisesta koboltista imeytyy ruoansulatuskanavan kautta 5–45 % yhdisteen liukoisuudesta riippuen (Lison 2014).
Kun kobolttia on ruokavaliossa paljon, erittyy suurin osa ulosteen kautta. Firrolo ym. (1999) syöttivät 344 rotalle 0,33 ja 33,3 mg:lle Co/kg kobolttinaftenaattia (Co(C11H10O2)2).
Pienemmälle annokselle altistuneilla rotilla koboltista erittyi ulosteeseen 42% ja virtsaan 31.8%. Suuremmalla annoksella ulosteeseen erittyi 73,1% ja virtsaan 26.3%. Tutkimuksessa ei pystytty erottelemaan, kuinka paljon kobolttia jäi imeytymättä ja kulki suoliston läpi suoraan ulosteeseen. Ruumiinavauksessa korkeimmat kobolttikonsentraatiot löytyivät maksasata ja munuaisista.
2.2.2.1 Koboltin vaikutukset linnuissa
Tutkittaessa koboltin vaikutuksia lintuihin, on yleensä keskitytty broilerinpoikasiin.
Broilerinpoikasten kasvun hidastuminen on selkein merkki koboltin liikasaannista. 250–1000 ppm ruokaan lisättyä kobolttia on riittänyt hidastamaan linnunpoikasten kasvua. (Southern ja Baker 1981, Abduljaleel 2016.)
Diaz ym. (1994) altistivat broilerinpoikasia 42 päivää koboltille lisäämällä poikasten ruokaan kobolttikloridia (CoCl2 ∙ 6H2O). Kokeen aikana 500 ppm:lle kobolttia altistuneiden poikasten
hemoglobiini nousi ja hematokriitti, sekä punasolujen määrä laski. Ruokahalu huononi ja kasvu hidastui koboltille altistuneissa ryhmissä. Korkeimmille kobolttimäärille altistuneissa ryhmissä osa kananpojista kuoli askiittiin, eli nesteen kertymiseen vatsaonteloon
Kobolttikloridille altistuneet ankanpojat kehittivät puolestaan suoliston ja lihasmahan lihasten nekroosia, joka oli samantapaista, kuin E-vitamiinin ja seleenin puutteen aiheuttamat muutokset (Van Vleet ym. 1981).
2.2.3 Nikkeli
Nikkelin tiheys on 8,9 g/cm3 ja se on atomiluvultaan 28. alkuaine. Nikkeliä on maankuoressa 0,007% ja sitä tavallisesti löytyy magmakivistä. Nikkelin vahvuus ja sitkeys muistuttavat rautaa mutta hapettumisen ja korroosion kestävyys enemmän kuparia. Kiina on maailman suurin nikkelintuottaja mutta myös Venäjä, Kanada, Itävalta ja Japani ovat suuria tuottajia.
(Encyclopaedia Britannica 2013.) Vuonna 2017 Harjavallassa toimiva venäläinen Norilsk Nickel tuotti 59 716 tonnia nikkeliä, kun koko maailmassa tuotantoa oli 2 145 200t (Laakso 2018). Harjavallassa tuotettiin siis 2,8% maailman nikkelistä, mikä nosti Suomen maailman 10.
suurimmaksi nikkelintuottajaksi (INSG 2018).
Luonnossa esiintyy viisi pysyvää nikkelin isotooppia, nikkeli-58, -60, -61, -62 ja nikkeli-64, joista yleisin on nikkeli-58, jota on 68,27% kaikesta nikkelistä. Luonnosta nikkeliä löytyy yleisimmin sitoutuneena arseeniin, antimoniin ja rikkiin. Yleisin hapetusluku on +II mutta myös hapetuslukuja −I, 0, +I, +III ja +IV esiintyy. (Encyclopaedia Britannica 2013.)
Suurin osa nikkelistä näyttäisi absorboituvan tyhjäsuolesta (Arnich ym. 2000) ja se eliminoituu elimistöstä pääasiassa virtsan kautta. Marzouk ja Sunderman (1985) sekä Merritt ym. (1989) injektoivat rottiin ja hamstereihin nikkelisuoloja ja tutkivat nikkelin erottumista virtsaan tai ulosteeseen. Merritt ym. totesivat, että nikkeli eliminoitui nopeasti virtsassa ja pitoisuudet elimissä olivat samanlaisia kuin kontrollihamstereilla. Marzouk ja Sunderman puolestaan saivat selville, että 24 tunnin sisällä nikkeli-injektiosta, vain <0,5% injektoidusta nikkelistä päätyi rottien ulosteeseen. Tutkijat totesivat, ettei nikkelin erittyminen ulosteeseen ole eliminaation kannalta tärkeää, vaan suurin osa erittyy virtsan kautta. Kuitenkin, kun Velantine ja Fisher (1984) altistivat ryhmän hiiriä nikkelille (63Ni3S2) henkitorven kautta, eliminoitui ulosteen kautta jopa 40% nikkelistä ja loput 60% virtsan mukana.
2.2.3.1 Nikkelin vaikutukset linnuissa
Eastin ja O’Shea (1981) antoivat 60 sinisorsalle (Anas platyrhynchos) nikkelisulfaattia 0–800 ppm 90 päivän ajan ruoan mukana. Veren hemoglobiini, HCT, triglyseriini, kolesteroli, sekä maksan toiminnasta kertova ALT ja munuaisten toiminnasta kertova OTC eivät poikenneet kontrolliryhmästä. Suurimmat nikkelipitoisuudet löytyivät sorsien munuaisista ja veren nikkelipitoisuus lisääntyi annoskoon kasvaessa. Tutkijat totesivat, että koska nikkeliä ei löytynyt akkumuloituneen kudoksiin, oli sen eritys selkeästi tehokasta.
Kun sinisorsien poikasille syötettiin 90 päivän ajan 1200 ppm nikkelisulfaattia, ne vapisivat ja näyttivät merkkejä halvauksista 14 päivän ikäisenä. 71% 1200 ppm saaneista linnuista kuoli ennen 60. päivää. 0–800 ppm saaneiden sorsanpoikasten painoissa ei ollut eroa vaikka 800 ppm saaneessa ryhmissä olkaluun paino/pituus-suhde oli selvästi matalampi (Cain ja Pafford 1981).
Weber ja Reid (1968) puolestaan totesivat kananpoikien kasvun huononneen merkittävästi yli 700 ppm:n annoksilla neljän viikon iässä.
2.2.4 Kupari
Atomiluvultaan 29. alkuaine on kupari, jonka tiheys on 8,9g/cm3. Kuparia on maaperässä keskimäärin 30 ppm (Tilley 2019) ja sitä tuotetaan eniten Chilessä mutta myös Peru, Kiina ja USA ovat suuria tuottajamaita (Encyclopaedia Britannica 2017b). Antropogeenisesti kuparia vapautuu ympäristöön metallien ja puun tuotannosta, jätteen, hiilen, öljyn ja kaasun poltosta, teollisuuden toiminnasta, fosfaattilannoitteiden tuotannosta ja raudattomien metallien louhinnasta (Georgopoulos ym. 2001).
Kupari esiintyy hapetusluvuilla 0, +I, +II ja +III. Cu(0) on hyvin pysyvä mutta +III ei selviä kuin muutaman sekunnin vesiliuoksessa. Yleisimpiä hapetuslukuja ovatkin +I ja +II ja ne esiintyvät yleensä muun muassa kuparioksidina, -kloridina ja -sulfidina. (Encyclopaedia Britannica 2017b). Luonnosta löytyvä kupari on kahden isotoopin sekoitus, kupari-63:a on 69,2% ja loput kupari-65:ä (Georgopoulos ym. 2001).
Kupari on elimistölle välttämätön hivenaine. Sitä käytetään laajasti mikro-organismien, kasvien ja eläinten keskuudessa monissa elektroninsiirtoentsyymeissä. Jotkut selkärangattomat käyttävät kuparia esimerkiksi hapen kuljetukseen hemosyaniinin avulla. Selkärankaiset tarvitsevat kuparia lukuisissa entsyymeissä, muun muassa amino-oksidaasissa, ferro- oksidaaseissa ja tyrosinaasissa. Elimistön monet proteiinit sitovat kuparia ja niitä ovat muun muassa metallotioniini ja albumiini. Veren kuparista albumiiniin on sitoutunut 5–18 % ja
albumiinilla on arveltu olevan merkitystä ylimääräisen kuparin sitomisessa verestä. Ilman kuparia ei esimerkiksi elimistön rautametabolia, sidekudoksen tai melaniini muodostuminen, myeliinin muodostuminen keskushermostossa tai kolesterolimetabolia toimisi kunnolla.
(Georgopoulos ym. 2001).
Kupari absorboituu mahasta ja ohutsuolesta, pääosin pohjukaissuolesta (van der Berghe ja Klomp 2009), ionisena kuparina tai sitoutuneena aminohappoihin. Imeytyminen aminohappojen mukana erotellaan kahteen prosessiin. Suurin osa kuparista imeytyy, kun kupari kuljetetaan ruoansulatuskanavan limakalvon absorboivalle pinnalle, josta se imeytyy ja sitoutuu metallotioniin tai muuhun sitoutumisproteiiniin. Pieni osa kuparista puolestaan imeytyy, kun kupari kuljetaan limakalvon läpi herakalvolle. (Evans ja LeBlanc 1976). Ulosteiden kuparipitoisuuden on todettu olevan noin kolminkertaiset ruoan kuparipitoisuuksiin verrattuna (Wen-Shyg Chiou ym. 1998). Wen-Shyg Chiou ym. (1998) altistuskokeessa 400 µg/g:ssa altistuneiden kanojen ulosteiden kuparipitoisuus oli 1173 µg/g ja 600 µg/g:ssa altistuneiden ulosteessa oli kuparia 1944 µg/g:ssa.
Vesiliukoisien kuparisuolojen, kuten kupari(II)sulfaatin ja kupari(II)oksidin, on todettu olevan myrkyllisempiä kuin liukenemattomien suolojen, kuten kupari(II)hydroksidin (EHC200 1998).
2.2.4.1 Kuparin vaikutukset linnuissa
Kuparin vaikutuksia linnuissa ei ole tutkittu paljoa. Wen-Shyg Chiou ym. (1998) lisäsivät kanojen ruokaan 400–600 µg/g kuparia ja totesivat lintujen ruokahalun ja munantuotannon huonontuvan annoksen noustessa. Hébert ym. (1993) taas tutkivat jyrsijöillä minkälaisia vaikutuksia eri määrillä kuparia on. Tutkijat syöttivät ja juottivat hiirille ja rotille 100–30000 ppm kupari(II)sulfaattia ja totesivat, että mitään oireita ei näkynyt juomaveden pitoisuuden pysyessä 300 ppm tai alle, mutta kaikki eläimet kuolivat kahden viikon sisällä pitoisuuden ylittäessä 3000 ppm. Sekä hiirille että rotille aiheutui hyperplasiaa ja hyperkeratoosia. Rotat todettiin hiiriä herkemmiksi, kun annoksen suurentuessa inflammaation määrä rottien maksoissa kasvoi ja maksasolujen vauriosta ja kolestaasista kielivät merkkiaineet nousivat.
Rotilla löytyi lisäksi munuaisten epiteelisestä solulimasta ja proksimaalisista tubuluksista eosinofiilisten proteiinipisaroiden lisääntynyttä määrää ja kokoa. Rotilla oli myös hematologisia ja histologisia merkkejä mikrosyyttisestä anemiasta. Tutkijat päättelivät tuloksista kupari(II)sulfaatin olevan veri- ja munuaismyrkky korkeilla annoksilla, sekä aiheuttavan anemiaa ainakin jyrsijöillä.
Pienistä määristä kuparia lintujen ruokavaliossa on todettu olevan hyötyä. Das ym. (2010) tutkivat ravinnon kuparilisän hyötyjä broilereilla. He jakoivat 200 broileria viiteen ryhmään, joista yksi oli kontrolli ja muut saivat sekä 200 mg, että 400 mg epäorgaanista ja orgaanista kuparia. Orgaanista kuparia saaneet linnut olivat aktiivisempia ja kerryttivät enemmän painoa kuin epäorgaanista kuparia saaneet ja vaikutukset lisääntyivät suuremmalla annoksella.
2.2.5 Sinkki
Atomiluvultaan 30. alkuaine, sinkki, on tiheydeltään 7,1 g/cm3 (Encyclopaedia Britannica 2018a). Sinkkiä on maankuoressa keskimäärin 70 mg/kg eli 0,02%, mikä tekee siitä 23.
yleisimmän alkuaineen (Kabata-Pendias 2010, Jackson 1989). Johtavia sinkintuottajamaita ovat Kiina, Australia ja Peru. (Encyclopaedia Britannica 2018a.) Antropogeenisesti sinkkiä vapautetaan ympäristöön sinkin, raudan ja teräksen tuotannosta, lannoitteiden ja hyönteismyrkkyjen käytöstä, sekä kaivostoiminnasta, galvanoitujen rakenteiden korroosiosta ja hiilen, polttoaineen ja jätteen poltosta (EHC221 2001).
Sinkillä esiintyy viisi pysyvää isotooppia; 64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn ja 70Zn ja 19 radioaktiivista isotooppia (EHC221 2001). Yhdisteissä sinkki on lähes aina hapetusluvulla +II, vaikka myös muutama sinkkiyhdiste +I on löydetty(Encyclopaedia Britannica 2018a).
Sinkki on välttämätöntä yli 200 entsyymin toiminnalle (Sandstead 1994). Sinkkiä tarvitaan DNA- ja proteiinisynteesissä, sekä solunjakautumisessa (Prasad 1995). Lisäksi sinkki on tarpeen haavojen parantumisessa (Lin ym. 2018), sekä immuunipuolustuksen (Prasad 1995) ja haju- ja makuaistien toiminnassa (Heyneman 1996). Suurin osa sinkistä (60%) imeytyy sykkyräsuolesta, loput pohjukais- ja tyhjäsuolesta (Antonson ym. 1979). Weigand ja Kirchgessner (1978) totesivat sinkin absorptiomäärän suolistossa riippuvan sinkin määrästä ravinnossa. Kun rotat olivat sinkittömällä ruokavaliolla, niiden sinkkiabsorptio suolistosta oli lähes 100% mutta se laski puoleen, kun ravinnon sinkkimäärää nostettiin. Vähäisellä sinkkiruokavaliolla rottien ulosteeseen jäi sinkkiä 0,1 mmol/d mutta kun sinkin määrä nousi ruokavaliossa, nousi imeytymättömän, ulosteessa erittyvän sinkin määrä 30 kertaiseksi. Sinkin määrää elimistössä säädeltiin pääasiassa vähentämällä tai lisäämällä absorptiota suolistosta.
Elimistöön imeytynyt sinkkiä erittyi pääasiassa virtsan kautta, sillä virtsaan sinkkiä erittyi ulostetta enemmän silloin, kun sinkkiä oli vähän ravinnossa. Tutkimuksessa ei pystytty erottelemaan oliko ulosteessa oleva sinkki jäänyt absorboitumatta suolistosta vai poistettu erittämällä.
2.2.5.1 Sinkin vaikutukset linnuissa
Jos sinkin saanti on liiallista ja homeostattiset mekanismit pettävät, voi linnulle kehittyä sinkkimyrkytys. Luonnossa sinkkimyrkytyksiä on tavattu muun muassa sorsilla (Zdziarski ym.
1994), kyyhkyillä (Vanderzee ym. 1985) ja eksoottisilla linnuilla, kuten panamankaklattajalla (Ortalis cinereiceps) (Droual ym. 1991). Sinkillä on suoria ja epäsuoria myrkyllisiä vaikutuksia ruoansulatuskanavaan, maksaan, munuaisiin, haimaan, punasoluihin ja aivoihin. Akuutissa myrkytyksessä ruonsulatuskanavan syöpymistä seuraa maksan, munuaisten ja haiman vauriot.
Sinkin on todettu aiheuttaneen linnuille haiman, verenkierron ja munuaisten pettämistä.
(Puschner ja Poppenga 2009). Sinkkimyrkytyksen merkkejä linnulla ovat masennus, kuivuus, löysyys, laihuus ja runsaat kirkkaan vihreät ulosteet. Kuvauksissa näkyy suoliston laajenemista ja verikokeissa heterofiilistä leukosytoosia, alhainen kalsiumtaso, korkea kreatiinikinaasi ja sappi- ja virtsahappo. (Romagnano ym. 1995.)
Kun Gasaway ja Buss (1972) syöttivät sinisorsille (Anas platyrhynchos) 3000–12000 ppm sinkkiä, ilmeni linnuilla selkeitä merkkejä myrkytyksestä. Ruokahalu ja paino laskivat sitä enemmän, mitä enemmän sinkkiä oli ruokavaliossa, ripulia ja halvauksia ilmeni. Haima ja sukurauhaset pienenivät ja lisämunuaiset ja munuaiset suurenivat. Vähäistä anemiaa löydettiin linnuilta 30. päivänä mutta 45. päivään mennessä anemia oli pahentunut äärimmäiseksi. 60.
päivään mennessä 24 sorsasta kaikki paitsi 2 oli kuollut. Korkeita sinkkikonsentraatioita löydettiin patologisissa tutkimuksissa maksasta, munuaisista, haimasta, sukusoluista ja rintalihaksesta.
Christopher ym. (2004) tutkivat sinisorsilla sinkin vaikutuksia punasoluihin. Sinkille altistuneilla sorsilla oli paljon epänormaalisuuksia polykromatofiilisissä, fusiformisissa, hypokromisissa punasoluissa, sekä punasolujen ytimissä. Myös keskimääräinen hematokriittitaso oli matalampi kuin kontrollisorsilla. Myös tässä tutkimuksessa huomattiin sinkille altistuneilla linnuilla ataksiaa, anoreksiaa, kalpeutta ja pahan hajuista tummaa ja kirkkaan vihreää ripulia.
2.2.6 Arseeni
Arseenin tiheys on 5,7 g/cm3 ja se on 33. alkuaine jaksollisessa järjestelmässä (Fowler ym.
2015). Arseenia on maankuoressa keskimäärin 5 g/1000kg ja se esiintyy useimmiten yhdisteenä muiden metallien kanssa esimerkiksi sulfideina ja arseeneina. Yleisimpiä arseenia sisältäviä
mineraaleja ovat arseenikiisu (FeAsS), realgaari (As4S4), auripigmentti (As2S3), löllingiitti (FeAs2) ja enargiitti (Cu3AsS4). Arseenia louhitaan sivutuotteena kupari-, lyijy-, koboltti- ja kultakaivoksilta. (Encyclopaedia Britannica 2019b.) Maailmalla tuotettiin 2014 vain 44 000 tonnia arseenia ja suurin osa siitä tuli Kiinasta, Chilestä ja Marokosta mutta myös Ruotsi on suuri tuottaja. Maailmanlaajuisesti arseenia tuotetaan tarkoituksenmukaisesti vähemmän, kuin sitä vapautuu fossiilisten polttoaineiden poltosta. (Hallanaro ja Loukola-Ruskeeniemi 2014).
Luonnossa esiintyy vain yhtä pysyvää arseenin isotooppia, arseeni 75:tä. (Encyclopaedia Britannica 2019b.) Arseeni esiintyy hapetusluvuilla +III, +V ja -III (Encyclopaedia Britannica 2019b, Hallanaro ja Loukola-Ruskeeniemi 2014). Viidenarvoinen arseeni on vähemmän haitallista kuin kolmenarvoinen (Hallanaro ja Loukola-Ruskeeniemi 2014).
Arseeni on myrkyllinen ja karsinogeeninen aine (Hallanaro ja Loukola-Ruskeeniemi 2014).
Myrkyllisyys vaihtelee erittäin myrkyllisestä arsiinista ja sen johdannaisista lähes reagoimattomaan metalliseen arseeniin (Encyclopaedia Britannica 2019b). Orgaaninen arseeni, mitä löytyy esimerkiksi merikaloista, on vähemmän haitallista kuin epäorgaaninen. Elimistö muuttaakin epäorgaanisen arseenin orgaanisiksi yhdisteiksi, mikä vähentää myrkyllisyyttä.
Arseenin myrkyllisyys elimistössä perustuu soluhengityksen salpaamiseen ja myrkyllisen vetyperoksidin tuotannon lisäämiseen. Toistuva altistus pienillekin arseenimäärille on haitallista ja annoksen ollessa tarpeeksi suuri, jopa tappavaa. Parhaiten arseenia sietäviä eliöitä ovat bakteerit mutta myös jotkin lierot voivat sopeutua elämään arseenipitoisessa ympäristössä.
Arseenilla ei ole merkittävää taipumusta kertyä eliöihin, toisin kuin esimerkiksi elohopealla.
(Hallanaro ja Loukola-Ruskeeniemi 2014.)
Hwang ja Schanker (1973) tutkivat orgaanisten arseeniyhdisteiden imeytymistä rotan suolistosta ja totesivat orgaanisen arseenin imeytymisen ohutsuolesta olevan yli satakertaisesti suoraan riippuvainen konsentraatiosta. Tutkijat totesivat orgaanisten metalliyhdisteiden imeytyvän yksikertaisella diffuusiolla. Yamauchi ja Yamamura (1985) totesivat, että hamstereille annetusta arseenista 60% imeytyi suolistosta, josta 49% erittyi virtsaan ja 11%
ulosteeseen.
Ympäristösaasteiden lääketieteellisten ja biologisten vaikutusten komitean (1977) mukaan Lanz ym. (1950) puolestaan tutki arseenin kulkua elimistössä injektoimalla arseeni-74:ää laboratorioeläinten, muun muassa kanojen lihakseen. Arseeni erittyi nopeasti virtsaan epäorgaanisina yhdisteinä ja 48h kuluttua vain alle 0,27% arseenista oli varastoitunut elimiin muun muassa marsuilla ja kanoilla. Albert ym. (2008a) puolestaan totesivat seeprapeippojen
(Taeniopygia guttata) erittävän 14 päivän aikana yli 90% ruoan mukana annostellusta arseenista.
2.2.6.1 Arseenin vaikutukset linnuissa
Arseeni aiheuttaa linnuilla lukuisia hematologisia ja histologisia muutoksia (Sharaf ym. 2013, Halder ym. 2009). Arseenille altistuneet linnut oireilevat painon ja ruokahalun menetyksenä, tylsyytenä, läähätyksenä, lisääntyneenä juomisena, pörhistyneinä höyheninä, heltan kalpeutena ja vetisenä ripulina (Sharaf ym. 2013). Halder ym. (2009) totesivat 5,5 ppm:lle arseenia altistetuilla kanoilla (Gallus domesticus) alentuneen hemoglobiinin ja hematokriitin, sekä vähentyneen punasolujen leukosyyttien, heterofiilien ja lymfosyyttien kokonaismäärän.
Vuonna 2008 Albert ym. tekivät kaksi tutkimusta (2008a, 2008b), jossa he altistivat seeprapeippoja (Taeniopygia guttata) MMA:lle (metyyliarsonihappo) 14 ja 20 päivän ajan. 20 päivän tutkimuksessa kaikki 72 μg/g ja 36 μg/g -altistetut linnunpoikaset kuolivat. 24 μg/g altistetuista linnunpoikasista yli puolet, ja 12 μg/g:n ryhmästä 11% kuoli. Lintujen sääriluiden ja siipien pituus todettiin lyhentyneeksi. (Albert ym. 2008b.) 14 päivän tutkimuksessa 24 ja 72 μg/g altistettujen seeprapeippojen paino pieneni 15%, jonka epäiltiin johtuvan ruoansulatuskanavan inflammaatiosta, mutta yksikään ei kuollut (Albert ym. 2008a).
Kummassakaan tutkimuksessa ei löydetty muutoksia lintujen hematokriitti- tai leukokriittipitoisuuksissa (Albert ym. 2008a, Albert ym. 2008b).
Kun Sánchez-Virosta ym. (2018) syöttivät talitiaisenpoikasille epäorgaanista arseenia 0,2 tai 1 μg/g/d, löytyi sitä lintujen ulosteesta 1,88 ja 4,92 μg/g (kuivapaino). Tutkijat huomasivat ulosteen arseenipitoisuuden korreloivan positiivisesti veren hematokriitin kanssa.
Matalammalle annokselle altistuminen näkyi poikasissa alentuneena siiven kasvuna ja korkeammalle annokselle altistuminen näkyi huonontuneena poikasten selviämistodennäköisyytenä. Kuolleisuuden perusteella tutkijat arvelivat, että LD50-annos talitiaisenpoikasille voisi olla välillä 2–8 µg/g.
Sharaf ym. puolestaan tekivät vuonna 2013 tutkimuksen, jossa he syöttivät broilerinpoikasille 50 mg/kg arseenia ja/tai 250 mg/kg C-vitamiinia. Arseenialtistettujen lintujen suolistosta ja pernasta löydettiin vakavia histopatologisia muutoksia, kuten pernan solunekroosia, ohutsuolen epiteelinukkalisäkkeiden kesimistä, mononukteotidien infiltraatiota eli kertymistä kudokseen ja nukkalisäkkeiden nekroosia. Keuhkoissa näkyi verentungosta ja -vuotoa ja henkitorvessa vaahtoavaa materiaalia. Munuaisissa todettiin muun muassa epiteelin irtoamista
munuaistiehyen tyvikalvosta, sekä hiussuonikeräisten atrofiaa ja verentungosta, maksassa näkyi verentungosta ja solujen vakuolien lisääntymistä. C-vitamiinilisä vähensi linnuilla arseenimyrkytyksen oireita.
2.2.7 Kadmium
Kadmiumin atomiluku on 48 ja tiheys 8,6 g/cm3 (Nordberg ym. 2015). Maankuoresta löytyy kadmiumia 0,2 g/1000kg. Suurin osa kadmiumista saadaan louhitun sinkin mukana, josta kadmiumin erottaminen alkaa pasutuksessa. Johtavat kadmiumia jalostavat maat olivat 2010- luvulla Kiina, Etelä-Korea, Japani, Kanada ja Kazakstan. Luonnosta löytyvässä kadmiumissa on 29% kadmium-114:ää ja pienempiä määriä seitsemää muuta isotooppia. Kadmium esiintyy lähes aina hapetusluvulla +II. Tärkeimmät kadmiumyhdisteet ovat kadmiumoksidi (CdO) ja - sulfidi (CdS). (Encyclopaedia Britannica 2014.)
Kadmiumilla on hyvin pitkä biologinen puoliintumisaika elimistössä, noin 20 vuotta (Nordberg 2003) ja se kertyy maksaan ja munuaisiin. Suuret määrät kadmiumia häiritsevät luukudoksen aineenvaihduntaa aiheuttaen luuston pehmenemistä ja haurastumista. (Tuomisto 2014.)
Suurin osa kadmiumista näyttäisi imeytyvän proksimaalisesta pohjukaissuolesta (Lind ja Anders 1997). Ruoansulatuskanavasta kadmium siirtyy plasmaan sitoutuneena metallotioniiniin (Sabolić ym. 2010). Rottien ruoansulatuskanavasta absorboituu noin 1%
nautitusta kadmiumista (Foulkes ja McMullen 1986) ja ihmisillä 5% (WHO 1992). Matalan raudan, kalsiumin ja sinkin määrän on todettu lisäävän kadmiumin absorptiota suolistosta (Andersen ym. 2004). Liu ja Klaassen (1995) totesivat, että kun hiirille syötetään kadmiumia 100-300 µmol/kg, löytyy kudoksista vielä viikon päästä 1-3% kadmiumista. Jos syötetty kadmiummäärä on pienempi, jää kudoksiin vain 0,1-0,3% nautitusta kadmiumista.
2.2.7.1 Kadmiumin vaikutukset linnuissa
Ruoan mukana saadulla kadmiumilla on lukuisia negatiivisia vaikutuksia lintuihin. Lintujen munantuotanto laskee ja munankuoret ohenevat (Leach ym. 1979, Olgun 2015), testiksissä ja munuaistiehyessä tapahtuu degeneraatiota (Richardson ym. 1974, Hughes ym. 2000 Marettová ym. 2013) ja välttämättömien mikroravinteiden metabolia häiriintyy (Jin-Long ym. 2013).
Lisäksi kroonisen kadmiumaltistuksen on todettu aiheuttavan oksidatiivista stressiä (Cinar ym.
2010).
Abduljaleel ja Shuhaimi-Othman (2013) selvittivät, että kun kananpoikasille (Gallus gallus domesticus) syötettiin 25–100 ppm kadmiumia, niiden lihasmahojen tai sydämien painoissa ei huomattu merkitsevää eroa kontrolleihin verrattuna, mutta maksat olivat merkitsevästi kontrollien maksoja kevyemmät neljä viikkoa kestäneen tutkimuksen loputtua. Maksoihin myös kertyi eniten kadmiumia. Kadmiumaltistuksella ei todettu olevan merkitsevää vaikutusta kananpoikasten kasvupainoihin, toisin kuin Sant’Ana ym. (2005) tekemässä tutkimuksessa japaninviiriäisillä.
Sant’Ana ym. (2005) tutkivat kadmiumin vaikutuksia japaninviiriäisten poikasissa (Coturnix coturnix japonica) syöttämällä linnuille 100 ppm kadmiumkloridia (CdCl2). Lintujen paino oli merkitsevästi alentunut vasta neljä viikkoa kestäneen kokeen loppuvaiheessa, jonka tutkijat epäilivät johtuvan metallotioniinin toimintaan liittyvästä kadmiumin kumulatiivisista vaikutuksista. Japaninviiriäisten verestä mitatut ASAT ja ALT olivat kohonneet, mikä kertoo maksan toiminnan muutoksista. Maksatoiminnan häiriintyminen on liitetty myös rottien kadmiumaltistukseen (Novelli ym. 1998). Viiriäisten veressä myös bilirubiinipitoisuus oli kohonnut, mikä kertoo kolestaattisesta vauriosta. Lintujen munuaisten toiminnassa ei havaittu muutoksia virtsahapon ja kreatiinin perusteella (Sant’Ana ym. 2005), vaikka nisäkkäillä (Squibb 1979) ja ankoilla (Hughes ym. 2000) kadmiumin on todettu aiheuttavan munuaisvaurioita. Hughesin ym. (2000) tehneessä tutkimuksessa ankat (Anas platyrhynchos domesticus) kehittivät munuaisiin inflammaatiota ja degeneroivia muutoksia altistuessaan 50 µg/g:lle kadmiumia. Metallotioniini-kadmium -kompleksien vapauduttua ääreisverenkierrosta, ne kulkevat munuaisten läpi vaurioittaen kuorikerrosta. (Squibb 1979.) On mahdollista, ettei Sant’Anan ym. tutkimat japaninviiriäiset altistuneet tarpeeksi korkeille pitoisuuksille kadmiumia, jotta metallotioniini-kadmium -komplekseja syntyisi, tai sitten metallotioiniinisynteesi on japaninviiriäisillä hitaampaa (Sant’Ana ym. 2005).
2.2.8 Lyijy
Lyijy on myrkyllinen ja karsinogeeninen luonnossa esiintyvä raskasmetalli, jonka tiheys on 11,34 g/cm3 ja atomiluku 82. Maankuoressa on 0,0013% lyijyä. (Anon. 2020a.) Luonnossa lyijyä tavataan useimmiten sulfidimineraaleissa, jossa se on yleensä yhdessä hopean ja sinkin kanssa (TTL 2016b). Lyijyntuotannossa tärkein mineraali onkin galeniitti, joka on lyijysulfidia (PbS). Suurin osa maailmalla käytetystä lyijystä tuotetaan Kiinassa, Australiassa, Yhdysvalloissa, Perussa ja Meksikossa. (Encyclopaedia Britannica 2018b.)
Lyijyllä on neljä pysyvää isotooppia. Luonnosta löytyvistä isotoopeista yli puolet on lyijy- 208:aa ja muita isotooppeja löytyy pienempiä määriä. Kaikki pysyvät isotoopit, paitsi lyijy- 204, ovat radioaktiivisen hajoamisen tulosta. Uraanin hajotessa muodostuu lyijy-206, toriumin hajotessa lyijy-208 ja aktiniumin hajotessa lyijy-207. Epäorgaanisissa yhdisteissä lyijy useimmiten esiintyy hapetusluvulla +II, ja joskus +IV. (Encyclopaedia Britannica 2018b.) Orgaaniset alkyylilyijy-yhdisteet imeytyvät tehokkaasti ihon läpi. Epäorgaaninen lyijy imeytyy höyrynä tai pölyn kautta hengityselimistöstä ja vähäisesti ruoansulatusjärjestelmästä.
Aineenvaihdunnassa lyijy seuraa kalsiumia siirtyen verestä luustoon. (TTL 2016b.) Luustoon siirtynyt lyijy voi pysyä siellä vuosia ja olla jäänne koko elämän aikaisesta altistuksesta (Pain 1996).
Yleensä lintujen lyijymyrkytys aiheutuu niiden syödessä lyijyammusten siruja ja hauleja (Fisher ym. 2006). Petolinnut myrkyttyvät riistalihaan koteloituneista hauleista, kun taas kyyhkyt ja kanalinnut syövät käytetyt haulit sorana, jota ne käyttävät ruoansulatuksen edistämiseen (Kendall ym. 1996). Suomessa lyijyhaulien käyttö on kielletty vesilintujen metsästyksessä vuodesta 1996 alkaen (Moksu 2019) mutta lyijymyrkytys on silti esimerkiksi merikotkien suurin yksittäinen kuolinsyy (Koskinen 2019). Nyt EU selvittää mahdollisuutta lyijyhaulien käytön kieltämiseen kaikessa metsästyksessä ja kalastuksessa. (Moksu 2019.) Vyas ym. 2000 totesi ensimmäisenä, että myös varpuslinnut saattavat myrkyttyä lyijyhauleista erehtyessään syömään ne siemeninä tai sorana
Kaivosten ja kaatopaikkojen läheisyydessä linnut altistuvat kroonisesti pienille määrille lyijyä, mutta tämä altistus on melko vähäistä verrattuna lyijyhauleista aiheutuviin myrkytyksiin (Fisher ym. 2006). Chapa-Vargas ym. (2010) tekemässä tutkimuksessa selvitettiin meksikolaisen kaivoksen ympäristön lintujen veren lyijypitoisuuksia. 17%:lla linnuista veren lyijypitoisuus oli 0,20–0,50 μg/mL, jonka on todettu aiheuttavan linnuille lieviä subletaaleja myrkytysoireita (Beyer ym. 1999, Krämer ja Redig 1997). Hyönteissyöjien veren lyijypitoisuudet olivat alhaisemmat kuin siemensyöjien, hedelmä-hyönteissyöjien, sekä kaikkiruokaisten.
2.2.8.1 Lyijyn vaikutukset linnuissa
Lyijyn subletaalit vaikutukset aiheuttavat linnuille fysiologisia ja biokemiallisia muutoksia hermostoon, munuaisiin ja verenkiertoon (Gough ja Sileo 1976, Carpenter ym. 2003).
Lyijymyrkytyksen oireita linnuilla ovat heikkous, anemia, ruokahalun menetys, ataksia, halvaukset, pahoinvointi ja käytöshäiriöt (Carpenter ym. 2003, Doneley 2009).
Kun Burger ja Gochfeld (2005) injektoivat harmaalokinpoikasiin (Larus argentatus) lyijyasetaattia määrän, jonka tarkoituksena oli vastata luonnossa elävien lokkien elimistössä olevaa lyijymäärää, he havaitsivat lintujen oppimiskyvyn, tarkkaavuuden ja motoristen taitojen kehityksen olevan selkeästi huonompaa kontrollipoikasiin verrattuna.
Ruiz ym. (2016) altistivat talitiaisenpoikaset (Parus major) 4 µg/g ja 1 µg/g:lle lyijyasetaattia tutkiessaan lyijyn vaikutusta vitamiinimetaboliaan. Lyijylle altistuneiden lintujen verestä löytyi kohonneita A-vitamiini- ja retinolipitoisuuksia. Retinolipitoisuudet myös korreloivat suoraan positiivisesti ulosteiden lyijypitoisuuksiin, suuremmalle lyijyannokselle (4 µg/g) altistuneiden talitiaisten ulosteessa oli keskimäärin 10,0 μg/g lyijyä, matalammalle annokselle (1 µg/g) altistuneiden ulosteessa oli puolestaan keskimäärin 5,8 μg/g lyijyä. Lyijyn vaikutus retinolipitoisuuksiin perustuu LRAT-entsyymin (lesitiini-retinoli asyylitransferaasi) aktiivisuuden häirintään. LRAT-entsyymi huolehtii retinolin esterisynteesistä. (Defo ym.
2014.) Ruiz ym. (2016) arvelivat, että lyijylle altistuneet linnut käyttävät kasvuun ja kehitykseen tarvittavia vitamiineja taistellakseen fysiologista stressiä vastaan, mikä vaarantaa niiden terveyden.
Berglund ym. (2010) seurasivat kirjosieppopoikasten veriarvoja lyijykaivoksen ympäristössä kaivoksen suljettua. Suurimmalla osalla poikasista yli puolet ALAD-entsyymin (delta- aminolevuliinihappo-dehydrataasi) toiminnasta oli estynyt, jolloin lyijyä oli veressä keskimäärin 0.41 ± 0.21 μg/g. ALAD-entsyymi on tärkeä hemoglobiinin tuotannolle ja immuunipuolustukselle, ja poikasilta löydettiinkin alentuneita hemoglobiini- ja hematokriittipitoisuuksia.
Lyijy vaikuttaa lintujen lisääntymiseen, Kendall ja Scanlon osoittivat vuonna 1981, että lyijyhaulin syönnistä aiheutui kyyhkyille testisten degeneraatiota. Edens ja Garlich (1983) taas osoittivat lyijymyrkytyksen laskevan merkittävästi munantuotantoa japaninviiriäisillä (Coturnix japonica).
2.3 Lintujen ruoansulatus
2.3.1 Ruoantähteen muodostuminen
Ruoansulatuskanavassa lintujen syömästä ruoasta otetaan ravintoaineet ja tähteet prosessoidaan ulosteeksi. Ravintoaineiden mukana voi imeytyä myös haitallisia aineita, kuten raskasmetalleja, jos niitä on nautitussa ravinnossa tai vedessä. Lintujen ruumiinpainon pitämiseksi alhaisena, on lintujen ruoansulatuskanava sopeutunut sulattamaan nopeasti energiapitoisen ruoan.
Stressaantuneilla, pehmeää ravintoa syövillä ja pienillä laululinnuilla, kuten kirjosiepoilla, ravinnon kulkeutuminen ruoansulatuskanavan läpi on nopeampaa kuin muilla linnuilla.
(Laakkonen 2016.)
Linnun syödessä lähtee ruoka nielusta ruokatorveen ja kupuun. Siemensyöjien kupu on parhaiten kehittynyt mutta monilla linnuilla, kuten hanhilla, se on vain pieni laajentuma ruokatorvessa. Mahan ensimmäisessä osassa, rauhasmahassa, ruoka viipyy vain hetken aikaa.
Hyönteissyöjillä on rauhasmahassa kitiiniä sulattavaa entsyymiä, jonka avulla ne voivat prosessoida hyönteisten kitiinistä koostuvan ulkoisen tukirangan. (Laakkonen 2016.) Metallipitoiset yhdisteet hajoavat mahan happamessa ympäristössä ja imeytyvät sen jälkeen nopeasti ruoansulatuskanavasta (Sullivan 2019).
Rauhasmahan jälkeen ruoansulatuskanava kaventuu ja kaventumaa (isthmus) seuraa lihasmaha, jossa pilkotaan vaikeasti sulava kasviravinto. Lihasmahan sisäpuolella on keltavihreä hankausta estävä kerros, kutikula, joka muodostuu hiilihydraatti-proteiini-yhdisteestä. Kutikula on tarpeen, koska lihasmahassa ravinto jauhaantuu linnun nielemien kivien avulla pienemmäksi.
Lihasmahasta ravintoa liikutetaan takaisin rauhasmahaan, jossa siihen sekoittuu lisää mahan eritteitä, sekä takaisin lihasmahaan ja ohutsuoleen. (Laakkonen 2016.)
Linnun ohutsuolessa ravinto sulatetaan ja ravinteet imeytetään verenkiertoon. Ohutsuoli jaetaan kolmeen osaan, pohjukais-, tyhjä- ja sykkyräsuoleen. Pohjukaissuolen nystymäisiin rakenteisiin, eli papilloihin, aukeaa haiman ja joillakin lintulajeilla sappirakon tiehyeiden laskukanavat. (Laakkonen 2016.) Sappirakko puuttuu joiltain lintulajeilta, muun muassa monilta kesykyyhkyiltä ja joiltain varpuslinnuilta, kuten tilheltä (Bombycilla garrulus) (Farner ja Ziswiler 1972). Pohjukaissuolessa tapahtuu vielä ruoan sulatusta, tyhjä- ja sykkyräsuolessa vapautuneet ravinteet imeytetään verenkiertoon (Jabob 2019). Tyhjäsuoli on linnun suoliston pisin osa ja sitä ei voida histologisesti erottaa sen jälkeen olevasta sykkyräsuolesta (Laakkonen 2016).
Ohutsuolesta ruokasula kulkeutuu paksusuoleen, jossa imeytyy vettä ja elektrolyyttejä.
Paksusuolessa on kiinni yleensä parilliset umpisuolet, jotka jaetaan kolmeen osaan, lyhyeen ja lihaksikkaaseen kaulaosaan, ohutseinäiseen ja pitkään ruoko-osaan ja lyhyeen kärkiosaan.
Umpisuolien tehtävä on säädellä nestetasapainoa, fermentoida ravinto, sekä tuottaa rasva- ja aminohappoja ja B-vitamiineja. Umpisuolien umpipussimaisen rakenteen takia ruokasula viipyy suolessa pidempään ja ravinnon saanti tehostuu. Linnuilla ei ole umpilisäkettä ja joiltain lintulajeilta, kuten undulaateilta, myös umpisuolet puuttuvat kokonaan. (Laakkonen 2016.) Linnuilla ei voida fysiologisesti erottaa peräsuolta paksusuolesta, vaan näistä puhutaan yleensä synonyymeinä. Peräsuolta seuraa viemärisuoli eli kloaakki, jossa virtsanjohtimista tuleva virtsahappo yhdistyy peräsuolesta tulevaan ruoansulatusjätteeseen. Supistuvat rengasmaiset poimut jakavat viemärisuolen kolmeen osaan. Ensimmäisessä osassa säilyy peräsuolesta tullut uloste. Toiseen osioon aukeaa virtsanjohdinten tiehyiden ja sukupuolitiehyiden aukot.
Kolmannessa osassa sijaitsee avoeritteisiä rauhasia ja kloaakin bursa, eli alaperänrauhanen, jossa lintujen B-solut kehittyvät. Kolmas osa viemärisuolesta toimii myös väliaikaisena eritteiden säilymispaikkana. Kloaakki päättyy voimakkaaseen sulkijalihakseen, joka sulkee ruumiinaukon. (Laakkonen 2016.)
2.3.2 Virtsahapon muodostuminen
Lintujen virtsanerityselimistö koostuu kahdesta munuaisesta ja virtsanjohtimista, jotka avautuvat kloaakkiin. Linnuilla ei ole munuaisallasta tai virtsarakkoa ja munuaisissa on muitakin erikoisuuksia. Henlen linko on lyhyt tai puuttuu, nefroneita on nisäkkäisiin verrattuna paljon ja ne sijaitsevat eri syvyyksissä, joten munuaisissa ei ole kuori- ja ydinkerrosta. 70-90%
lintujen nefroneista on matelijatyyppisiä ja 10-30% nisäkästyyppisiä. Elimistö käyttää erityyppisiä nefroneita sen mukaan, paljonko on vettä ja suoloja saatavilla. (Laakkonen 2016.) Lintujen munuaiskudoksesta virtsa liikkuu kokoojatiehyitä pitkin virtsanjohtimiin, joiden peristaattinen liike auttaa virtsahapon kuljettamisessa kloaakkiin. Virtsa on puolikiinteää, koska linnut erittävät typpiaineenvaihdunnan lopputuotteet kiteytyneenä virtsahappona. (Laakkonen 2016.) Virtsahappokiteet sisältävät raskasmetalleja (Clapp ym. 2012) ja niillä on ioneita sitovia ominaisuuksia. Virtsahappokiteet sisältävät 5 % seerumin albumiinia ja 65% virtsahappoa.
(McNabb ja McNabb 1980.)
3. TYÖN TAVOITTEET
Työni tavoitteena oli kehittää linnun ulosteen käyttöä biomonitorina selvittämällä, onko näytteen jaottelusta virtsahappoon ja ruoantähteeseen hyötyä tarkasteltaessa lintujen metallikuormitusta. Työssä selvitin myös, sopiiko biomonitorointiin paremmin virtsahappo- vai ruoantähdeosio. Työ tehtiin tutkimalla, eroavatko ruoantähteen ja virtsahapon metallipitoisuudet toisistaan ja kuinka paljon. Lisäksi tarkastelin, vaikuttavatko linnunpoikasten ulosteiden metallipitoisuudet niiden selviytymistodennäköisyyteen munasta lentokykyisiksi.
4. AINEISTO JA MENETELMÄT
4.1 Linnut
Kirjosieppo (Ficedula hypoleuca) on valoisien lehti- ja sekametsien kolopesijä, joka pesii mielellään linnunpöntöissä. Sen ruokavalio koostuu hyönteisistä ja hämähäkeistä. (Anon.
2020b.) Tutkimusten mukaan kirjosiepot syövät saastuneilla alueilla vähemmän yöperhosia ja hämähäkkejä mutta enemmän toukkia, kuin muiden alueiden yksilöt (Eeva ym. 2005). Talvisin kirjosiepot muuttavat trooppiseen Afrikkaan (Anon. 2020b).
Kirjosieppoon päädyttiin, koska se esiintyy runsaana, pesii usein pöntöissä ja sopivan ikäisiä poikasia oli tarpeeksi paljon saatavilla. Aineisto päätettiin kerätä linnunpoikasilta, koska linnunpoikaset ovat helppoja käsitellä ja saada kiinni. Poikaset ovat saaneet ravinnon pesäpöntön lähialueilta, toisin kuin aikuiset linnut, joilla elinpiiri ja mahdollinen altistusaika ovat suurempia, ja talvimuutto etelään on sekoittava tekijä.
4.2 Näytteiden keräys
Näytteiden keräys suoritettiin 13. ja 18. kesäkuuta 2018 Satakunnassa sijaitsevan Harjavallan metallisulaton ympäristössä. Metallisuolaton ympäristö on raskasmetallien ja rikkidioksidin saastuttamaa. Näytteitä otettiin 40:ltä 6–11 vuorokauden ikäiseltä kirjosiepon (Ficedula hypoleuca) poikaselta. Poikaset ulostivat suoraan kertakäyttölautaselle tai kädelle, josta ulosteen annettiin liukua lautaselle. Jokainen näyte jaettiin kertakäyttölusikalla kahtia valkoiseen virtsaan ja ruskeaan ruoantähteeseen. Ulosteessa oli ruoantähdettä yleensä virtsan sisällä, joka saatiin esiin painelemalla ulostetta lusikalla. Virtsaa ja ruoantähdettä ei saatu täydellisesti eroteltua toisistaan, vaan virtsan sisälle jäi aina hieman ruoantähdettä, tai ruoantähde sekoittui painellessa virtsaan.
Pesäpönttöjä käytiin yhteensä läpi 20, joista jokaisesta otettiin kahdelta poikaselta ulostenäyte (yhteensä 40 poikasta), joka jaettiin virtsaan ja ruoantähteeseen. Näytteitä tuli siis yhteensä 80.
Jokaiseen näyteputkeen merkittiin alueen ja pöntön numero nelinumeroiseksi sarjaksi, sekä jalkarenkaan kaksi viimeistä numeroa, eli esim. 0129 28, jossa 01 on alue, 29 on pönttö ja 28 on renkaan numeron loppuosa. Näyteputken kanteen merkittiin, onko kyse ruoka- (R) vai virtsa- (V) näytteestä. Ne poikaset, joita ei ollut rengastettu aiemmin, rengastettiin näytteiden keräyksen yhteydessä. Lisäksi pönttöjen poikasluku ja kuoriutumattomien munien määrä
laskettiin. Pöntön etäisyys kuparisulattoon oli mitattu aiemmin. Kun poikaset olivat lähteneet pesästä, varmistettiin lentoon lähteneiden poikasten määrä.
4.3 Näytteiden käsittely
Tuoreet näytteet säilytettiin kuljetuksen ajan kylmälaukussa ja muulloin pakastimessa. Näytteet ja pienoisputket punnittiin yhdessä Mettler toledo MX5 tarkkuusvaa’alla, jonka jälkeen niitä kuivattiin 3 vrk (3.-6.7.2018) 40°C:ssä pienoisputkien korkit auki. Kuivauksen jälkeen näytteet punnittiin erikseen ja pienoisputket erikseen, jolloin pienoisputkien paino voitiin vähentää tuorenäytepunnituksen painosta ja saatiin tuorenäytteiden paino.
Näytteet jauhetiin muovisauvalla, punnittiin muovisilla näytealustoilla ja kaadettiin jauhe hajotusputkiin. Hajotusputkiin jauhettujen näytteiden päälle pipetoitiin 8 ml typpihappoa (HNO3, 67–69%, valmistaja: Fisher Chemical) per näyte ja hajotusputket vietiin mikroaaltodigestiolaitteeseen (CEM Mars 6; Wave). Mikroaaltodigestiolaitteessa käytettiin 60 minuutin pituista Plant material -ohjelmaa, joka kuumensi näytteet 200 °C:een.
Hajotusputkien jäähdyttyä typpihappoon liotettu näyte kaadettiin merkattuihin sentrifugiputkiin. Sentrifugiputkiin lisättiin 12 ml Milli-Q -vettä siten, että nestepinta kohosi 20 ml:aan (8 ml HNO3 ja 12 ml H2O). Jos typpihappoa oli päässyt haihtumaan mikroaaltohajotuksen aikana ja nestepinta jäi alle 20 ml:n, lisättiin Milli-Q -vettä pipetillä niin paljon, että nestepinta ylsi 20 ml:aan. Näytteet jaettiin kolmelle päivälle (17.-19.7.18) työstettäviksi, 17. ja 18.7. käsiteltiin 34 näytettä päivässä ja 19.7. 12 näytettä. Kahden ensimmäisen päivän näyte-erään lisätiin referenssiainenäyte Bovine Liver 1577B ja 0-näyte 8 ml HNO3/20 ml. Viimeisen päivän erään lisättiin kaksi referenssianetta, Bovine Liver 1577B ja Tomato Leaves (Cd, Hg, Po) 1573D, sekä kaksi 0-näytettä, eli negatiivista kontrollia.
Näytteistä tehtiin laimennossarjat, joista ajettiin metallianalyysit ICP-MS -laitteella PerkinElmer NexIon 350D-AMS, jossa on erillinen näytteensyöttäjä ESI PREPFAST SC-2.
Näytteistä tutkittiin kalsium, rauta, koboltti, nikkeli, kupari, sinkki, arseeni, kadmium ja lyijy.
Konsentraatiot ilmaistiin µg/g kuivapaino.
4.4 Tilastolliset analyysit
Tilastollisia analyysejä varten tiedot käsiteltiin Microsoft Excel 2010 -ohjelmalla sopivaan muotoon. Tilastollisiin analyyseihin käytettiin IBM SPSS Statistics 25 -ohjelmaa Windowsille.
Lineaarisella sekamallilla tutkittiin, onko ruoantähteen ja virtsahapon metallipitoisuuksissa merkitsevää eroa. Mallia varten otettiin metallipitoisuuksista logaritmit, koska aineisto ei ollut normaalijakautunut. Random-tekijäksi asetettiin pöntön sisälle pesitetty poikanen. Kaikkien testien yhteydessä otetut keskiarvot olivat estimoituja marginaalikeskiarvoja 95%
luottamusvälillä.
Yleistetyllä lineaarisella mallilla arvioitiin, oliko metallipitoisuuksilla ja poikasten selviämisellä yhteyttä. Yleistettyä lineaarista mallia varten laskettiin kahden saman pöntön poikasen ruoantähteen ja virtsahapon metallipitoisuuksista yhteinen painotettu keskiarvo.
Analyysina oli logistinen regressioanalyysi. Events-muuttujaksi asetettiin lentoon lähteneiden poikasten määrä ja trials-muuttujaksi munaluku. Jäännösvaihtelun jakauma asetettiin binominaaliseksi ja malli logistiseksi. Muut asetukset pidettiin oletusasetuksina.
Tuloksista tehtiin lisäksi korrelaatiomatriisi, jonka avulla selvitettiin, ovatko eri metallien pitoisuudet riippuvaisia toisistaan. Korrelaatiomatriisin laskemisessa käytettiin Pearsonin korrelaatiokerrointa. Pearsonin korrelaatiokertoimella laskettujen arvojen pitää olla normaalijakautuneita. Painotetuilla keskiarvoilla laskettujen ulosteiden metallipitoisuuksien normaalijakautuminen tarkistettiin histogrammilla. Kupari-, arseeni- ja lyijypitoisuudet eivät olleet normaalijakautuneet, joten niistä otettiin kymmenkantainen logaritmi korrelaatiomatriisia varten.
