TEKNILLINEN KORKEAKOULU Kemian ja materiaaliteiteiden tiedekunta Puunj alostustekniikan koulutusohj elma
Hannes Orelma
LIGNOSELLOLYYTTISTEN ENTSYYMIEN ADSORPTIOTUTKIMUS QCM-D TEKNIIKALLA
Diplomityö, joka on jätetty opinnäytteenä tarkastettavaksi diplomi-insinöörin tutkintoa varten Espoossa 9.4.2008.
Valvoja Professori Janne Laine
Ohjaaja FT Susanna Holappa & FT Martina Andberg
TEKNILLINEN KORKEAKOULU Kemian ja materiaalitieteiden tiedekunta Puunjalostustekniikan koulutusohjelma
DIPLOMITYÖN TIIVISTELMÄ
Tekijä
Hannes Orelma
Diplomityön nimi
Lignosellolyyttisten entsyymien adsorptiotutkimus QCM-D tekniikalla
Tiivistelmä
Tämän diplomityön tarkoituksena oli tutkia QCM-D tekniikan soveltuvuutta entsyymien sitoutumistutkimukseen. Työn kirjallisuusosassa on tutustuttu sellulaasien ja lakkaasien sitoutumiseen ja rakenteeseen. Lisäksi kirjallisuusosassa on tutustuttu QCM-D tekniikkaan ja mallipintojen valmistukseen.
Työn kokeellisessa osassa tutkittiin Cel7A ja Cel7B sellulaasien sitoutumista LB- selluloosapinnalle. Cel7A sellulaasin havaittiin sitoutuvan erittäin nopeasti LB-selluloosapinnalle ja sitoutumisisotermin avulla arvioitiin maksimisitoutumismäärän olevan 7,9 ± 0,8 mg/m2. Cel7B sellulaasin havaittiin sitoutuvan ja hydrolysoivan tehokkaasti LB-selluloosapintaa. Hydrolyysin seurauksesta LB-selluloosapintaan pääsi vettä joka aiheutti pinnan turpoamista. Sitoutumismäärän arvioitiin sitoutumisisotermin avulla olevan 4,7 ± 0,8 mg/m2.
Lakkaasien sitoutumista tutkittiin Melanocarpus albomyces ja Trametes hirsuta lakkaasien avulla MWL-ligniini- ja LB-selluloosapinnalle. M. albomyces ja T. hirsuta lakkaasien havaittiin sitoutuvan MWL-ja LB-selluloosamallipinnoille.
Lakkaaseilla käsiteltyjä MWL-ligniini- ja LB-selluloosapintoja kuvattiin atomivoima- mikroskoopin avulla. Kuvissa havaittiin lakkaasien muuttavan erityisesti LB-selluloosapintoja merkittävästi.
Työn valvoja
Prof. Janne Laine
Työn ohjaaja
FT Susanna Holappa & FT Martina Andberg
Professuuri Koodi
Puunjalostuksen kemia Puu-19
HELSINKI UNIVERSITY OF ABSTRACT OF MASTER’S THESIS TECHNOLOGY
Faculty of Chemistry and Materials Sciences
Degree Programme of Forest Products Technology Author
Hannes Orelma
Title of Thesis
Binding studies of cellullases and laceases by using QCM-D technology
Abstract
The purpose of this work was to study how suitable QCM-D technology is to detect binding of enzymes. The structure and binding dynamics of cellulases and laceases are discussed in this works literature survey. In this section the QCM-D technology was also described as well as how to make amorphous cellulose and lignin model surfaces.
In the experimental part the binding of the cellulases Cel7A and Cel7B to the LB-cellulose model surface was studied. The binding of the Cel7A cellulase is very intensive. By using Langmuir’s extended binding isotherms the maximum binding amount of the Cel7A was calculated to 7.9 ± 0.8 mg/m2. Cel7B cellulase binds and hydrolyzes very efficiently the LB-cellulose. From the Langmuir's extended binding isotherm the maximum amount of bound Cel7B enzyme was found to be 4.7 ± 0.8 mg/m2.
Binding of laceases to lignin and cellulose model surfaces was also studied. The laceases used in this study were the Melanocarpus albomyces and the Trametes hirsuta. Both laceases binds to LB- cellulose and MWL-model surfaces.
Finally the LB and lignin model surfaces used atomic force microscope. The AFM pictures amorphous cellulose surfaces.
in the binding studies were visualized by using showed that the laceases modified especially
Supervisor
Prof. Janne Laine
Instructor
PhD Susanna Holappa & PhD Martina Andberg
Chair Chair code
Forest products chemistry Puu-19
Pages Language
ALKUSANAT
Suoritin diplomityöni VTTilIä Espoossa kesäkuun 2007 ja helmikuun 2008 välisenä aikana. Teoriaosan laadinta alkoi jo kesällä puukemian laboratorion tiloissa, joista syksyllä siirryin VTT:lle suorittamaan työn kokeellisen osan.
Haluan kiittää lämpimästi työni ohjaajia FT Martina Andbergia ja FT Susanna Ho- lappaa erinomaisesta ohjauksesta työn laadinnan aikana. Kristiina Kruusia ja Tarja Tammista haluan kiittää hyvistä neuvoista. Kiitän myös professori Janne Lainetta työni valvomisesta. Erityisesti kiitän kaikkia henkilöitä, jotka mahdollistivat minulle tämän erittäin mielenkiintoisen diplomityön aiheen.
Kiitän lämpimästi tutkimushenkilöstöä TKK:n puukemian ja VTT:n Espoon laborato
riossa, jotka auttoivat työni kokeiden suorituksessa. Erityisesti haluan kiittää Aila Rahkolaa LB-selluloosapintojen valmistuksen opettamisesta ja Terhi Saarista spin- coat ja QCM-D laitteiden käytön opettamisesta. Lisäksi haluan kiittää Ritva Kivelää pintojen AFM-kuvauksesta ja Birgit Hillebrandt-Chellaouia avustamisesta entsyymi- määrityksissä.
Lisäksi haluan kiittää vanhempiani, veljeäni ja ystäviäni tukemisesta opintojeni var
rella. Lopuksi haluan kiittää erityisesti avovaimoani Petraa, joka on jaksanut tukea ja ymmärtää minua.
SISÄLLYSLUETTELO
KIRJALLISUUSOSA... 1
1 JOHDANTO... 1
2 KIRJALLISUUSOSA...2
2.1 Entsyymit ja niiden adsorptiokinetiikka...2
2.1.1 Sellulaasit ja niiden toimintamekanismit... 2
2.1.2 Sellulaasien adsorptiokinetiikka... 6
2.1.3 Sellulaasien modulaarisen rakenteen vaikutus adsorptioon...8
2.1.4 Sellulaasien sitoutumistasapaino ja hydrolyysin estäminen... 9
2.1.5 Lakkaasit... 11
2.1.6 Lakkaasien toiminta ja rakenne... 12
2.2 QCM-D mallipinnat...15
2.2.1 Selluloosamallipinnat... 16
2.2.2 Ligniinimallipinnat...18
2.2.3 Spin-coat päällystysmenetelmä... 19
2.2.4 Langmuir-Blodgett (LB) tekniikka...20
2.3 QCM-D tekniikka...23
2.3.1 Resonanssitaajuuden muutos... 24
2.3.2 Värähtelyn vaimeneminen... 26
2.3.3 Proteiinien adsorptiotutkimus QCM-D laitteella... 29
2.3.4 Referenssimenetelmät QCM-D tekniikalle...30
KOKEELLINEN OSA...32
3 TYÖN TARKOITUS...32
4 KÄYTETYT MATERIAALIT JA MENETELMÄT...32
5 TULOKSET JA TULOSTEN TARKASTELU... 36
5.1 Määritykset tutkimuksessa käytetyistä entsyymeistä... 36
5.2 T. reesein Cel7A:n sitoutuminen mallipinnoille...37
5.3.1 Langmuirin sitoutumismalli ja pinnan täyttöaste... 43
5.3.2 Sellobioosin kyky inhiboida sellulaasien aktiivisuutta...45
5.4 T. reesein Cel7B:n sitoutuminen selluloosapinnalle... 49
5.4.1 Langmuirin adsorptiomalli...52
5.5 M. albomyces lakkaasin sitoutuminen mallipinnoille... 54
5.5.1 M. albomyces lakkaasin sitoutuminen MWL-ligniinipintaan... 55
5.5.2 M. albomyces lakkaasin sitoutuminen amorfiseen LB-selluloosapintaan.. 57
5.6 T. hirsuta lakkaasin sitoutuminen ligniini-ja selluloosapinnalle... 60
5.7 QCM-D tekniikan soveltuvuus entsyymien sitoutumistutkimukseen...63
5.7 Lakkaaseilla käsiteltyjen MWL-ja LB-selluloosapintojen AFM-kuvaus... 65
5.7.1 AFM-kuvat MWL-pinnoista... 65
5.7.2 AFM-kuvat LB-selluloosapinnoista...68
7 JATKOTUTKIMUSEHDOTUKSIA...75 LÄHDELUETTELO... 76
LYHENNELUETTELO
QCM-D CD
Quartz crystal microbalance with dissipation monitoring Catalytic domain
CBM Cellulose binding modulus
LB Langmuir-Blodgett
AFM Atomic force microscope
SDS-PAGE Natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi
KIRJ ALLISI! USOSA
1 JOHDANTO
Hydrolysoivat sellulaasientsyymit ovat olleet perinteisesti runsaan sitoutumistutki- muksen kohteena. Vastaavasti hapettavien lakkaasientsyymien sitoutumistutkimus on toistaiseksi ollut puutteellista. Perinteisesti lignosellolyyttisten entsyymien sitoutu
mistutkimus on suoritettu koeputkikokein. Tällöin sitoutuneen entsyymin havainnoin
ti tapahtuu epäsuorasti mittaamalla liuoksessa vapaana olevan entsyymin pitoisuutta tai aktiivisuutta. QCM-D -tekniikka mahdollistaa entsyymin sitoutumisen reaaliaikai
sen havainnoinnin käyttäen pietsosähköistä värähtelijää. Lisäksi QCM-D tekniikan avulla saadaan tietoa pintaan sitoutuneen kerroksen luonteesta dissipaation avulla.
Tässä diplomityössä keskityttiin selvittämään miten QCM-D teknologian avulla pys
tytään tutkimaan sellulaasien ja lakkaasi en sitoutumista. Työn kirjallisuusosassa pe
rehdyttiin aluksi lignosellulyyttisten entsyymien rakenteeseen, sitoutumiseen ja toi
mintaan. Toisena selvitettävänä asiana oli QCM-D tekniikan vaatimien mallipintojen valmistus. Kolmantena asiana selvitettiin itse QCM-D tekniikan toimintaa ja käyttö
mahdollisuuksia. Työn kokeellisessa osassa tutkittiin QCM-D tekniikalla sellulaasien ja lakkaasien sitoutumista selluloosan ja ligniinin mallipintaan.
2 KIRJALLISUUSOSA
Noin 50 % maapallon biomassasta on lignoselluloosaa. Lignoselluloosa koostuu pää
osin selluloosasta, hemiselluloosasta ja ligniinistä. Selluloosa on pitkä suoraketjuinen ß-D-glukoosimolekyyleistä koostuva polysakkaridi. Selluloosamolekyyli muodostaa helposti vetysidoksia naapurimolekyylien kanssa, joiden avulla syntyy selluloosan kuiturakenne. Puun selluloosa voi olla rakenteeltaan joko kiteistä tai amorfista, riip
puen sijainnistaan puussa. Hemiselluloosa on heteropolysakkaridi joka on rakenteel
taan usein haaroittunut. Hemiselluloosa muodostaa ristisidoksia selluloosan ja lignii
nin välille ja ne vaikuttavat soluseinän joustavuuteen. Puu sisältää selluloosan ja he- miselluloosan lisäksi ligniiniä, joka koostuu pääasiallisesti fenolisista aromaattisista rakenteista.
Useat eri mikro-organismit pystyvät hajottamaan puuta energiakseen. Tämä tapahtuu hydrolysoimalla selluloosamolekyyleja glukoosiksi, jota pystyy käyttämään energiak
seen. Hydrolysointiin mikro-organismit tuottavat ja erittyvät ympäristöönsä useita selluloosaa ja hemiselluloosaa hajottavia entsyymejä. Ligniinin hajotukseen puoles
taan osallistuvat erilaiset hapetus-pelkistys -entsyymit.
2.1 Entsyymit ja niiden adsorptiokinetiikka
2.1.1 Sellulaasit ja niiden toimintamekanismit
Sellulaasientsyymeiksi kutsutaan entsyymien ryhmää, jotka pystyvät hydrolysoimaan selluloosan 1,4-ß-glukosidisia sidoksia (Kuva 1). Entsymaattinen hydrolyysi on kompleksi ilmiö, jossa liuenneet sellulaasientsyymit hajottavat kiinteää selluloosaa.
Sellulaasientsyymejä on lukuisia ja ne toimivat yhdessä synergistisesti pilkkeessään selluloosaa.
Kuva 1. Selluloosan 1,4-ß-glukosidisten sidoksien entsymaattinen hydrolyysireaktio. /1/.
Sellobiohydrolaasit (EC 3.2.1.91), irrottavat sellobiooseja polysakkaridiketjujen päis
tä. Sellobiohydrolaasin uskotaan katkaisevan samaa selluloosaketjua useita kertoja peräkkäin ennen entsyymin dissosiaatiota. Useat erilaiset endoglukanaasit (EC 3.2.1.4) pilkkovat selluloosasäkeitä keskeltä sattumanvaraisesti, muodostaen uusia ketjunpäitä sellobiohydrolaaseille. ß-glukosidaasit (EC 3.2.1.21) katkaisevat sellobio- hydrolaasien ja endoglukanaasien liukoiset hydrolyysituotteet (pääasiallisesti disak- kariidit) glukoosimolekyyleiksi. 121.
Amorphous Crystalline Crystalline : Cellulose cellulose cellulose
Non-reducing end Reducing end
Sellulaasientsyymit hydrolysoivat selluloosan 1,4-ß-glukosidisia sidoksia. Kuitenkin puun selluloosaketjujen pilkkominen on huomattavasti vaikeampaa, kuin edellä esi
tetty yleismekanismi (Kuva 1) esittää. Selluloosa on hautautunut puun muiden hiili
hydraattien ja ligniinin sekaan. Lisäksi puun selluloosan polymerisaatioaste on erit
täin korkea (vähintään 15000) ja selluloosaketjut muodostavat kiderakenteita, joissa amorfisten ja kiteisten alueiden hydrolysointi eroaa toisistaan. /1/.
Rakenteeltaan useimmat sellulaasientsyymit ovat modulaarisia. Ne koostuvat kolmes
ta moduulista (Kuva 3), jotka ovat katalyyttinen alue (catalytic domain CD), selluloo
saan sitoutumisalue (cellulose binding module CBM) ja välittäjäalue (linker). Sellu- 1 aasien rakenteesta voi myös löytyä muita rakenteellisia elementtejä, kuten toinen ka
talyyttinen alue, jatkuva hydrofobinen sekvenssi jne. /3/.
Kuva 3. Modulaarinen sellulaasientsyymi. /1/.
Sellulaasien modulaarisesta rakenteesta johtuen voi muodostua kombinaatioita kata
lyyttisen alueen (CD) ja selluloosan sitoutumisalueen välillä (CBM). Tämä on aiheut
tanut sellulaasien suuren määrän ja samankaltaisuuden sellulaasien välillä. Eräät sel- lulaasit voivat esiintyvä myös ilman selluloosaan sitovaa CBM aluetta, jolloin ne koostuvat ainoastaan katalyyttisesta alueesta (CD). Jonkin sellulaasiperheen CBM voi kytkeytyä eri CD perheisiin ja vastaavasti jonkin perheen CD voi kytkeytyä eri CBM perheisiin. /4/.
Joissakin sellulaaseissa CBM voi linkittyä CD:n joko N- tai C-terminaaliseen päähän.
Tällöin voi syntyä kaksi eri variaatiota, jotka eroavat toisistaan. Sellulaasin CBM:hen voi myös liittyä kaksi katalyyttistä aluetta, jolloin muodostuu bifunktionaalinen ent
syymi. Kuten edellä on mainittu, voi sellulaasi lisäksi sisältää osia, joiden funktiota ei täysin tiedetä. /4/.
Yksi parhaiten tunnetuista selluloosaa hajottavista organismeista on Trichoderma ree- sez-home. Tämän rihmasienen tuottamat sellulaasit ovat bioteknisesti merkittäviä mm. tekstiili- ja paperiteollisuudelle. T. reesei-home kykenee tuottamaan solun ulko
puolelle suuria määriä sellulaasientsyymejä selluloosan hajottamiseen (Taulukko 1).
Taulukko 1. T. reesei sienen tuottamat sellulaasit. /5/.
Vanha nimi
Nykyinen nimi
Molekyylimassa (kDa)
Pi Osuus kaikista (%)
CBHI Cel7A 59-68 3,5-4,2 . 50-60
CBHII Cel6A 50-58 5,1-6,3 15-18
EG I Cel7B 50-55 4,6 12-15
EG II Cel5A 48 5,5 9-11
EG III Cell2A 25 7,4 0-3
EG IV Cel45A 37 - -
EG V CelólA 23 2,8-3,0 0-3
BGL I Cel3A 71 8,7 -
BGL II Cell A 114 4,8 -
T. reesei tuottamien sellulaasien rakenteita on tutkittu runsaasti. Näistä endoglu- kanaasilla on havaittu olevan muodoltaan uramainen aktiivinen keskus katalyyttisessä alueessaan (CD). Tämä mahdollistaa selluloosaketjujen hydrolysoinnin keskeltä ket
jua. Sellobiohydrolaasien aktiivinen alue on tunnelin muotoinen, joka mahdollistaa selluloosaketjun päätepilkkoutumisen. Tunnelin rakenne ratkaisee, pilkkoutuuko sel- luloosaketju pelkistävästä vai ei-pelkistävästä päästä. Esimerkiksi Cel7A pilkkoo sel
luloosaketjun pelkistävästä päästä alkaen ja Cel6A pilkkoo selluloosaketjun ei-
Sellulaasit jaotellaan tunnettuihin rakenteellisiin perheisiin, joita on vähintään 15.
Jotkin perheet järjestäytyvät lisäksi klaaneihin, koska niillä on huomattu olevan mer
kittäviä yhtäläisyyksiä kolmiulotteisissa rakenteissaan. Sellulaasit voidaan jaotella myös perheisiin selluloosan sitomisalueiden (CBM) perusteella. /3, 4/.
2.1.2 Sellulaasien adsorptiokinetiikka
Entsyymien adsorboituminen selluloosan pintaan on välttämättömyys, jotta hydro- lyyttinen prosessi voi tapahtua tehokkaasti. Adsorptioprosessin on oltava energeetti- sesti mahdollinen, jotta entsyymi kiinnittyisi substraatin pintaan (Yhtälö 1). Substraa
tin pinnalla olevien entsyymien ja liuoksessa vapaana olevien entsyymien välillä val
litsee tasapaino, Tasapaino vaihtelee sellulaasientsyymien välillä siten, että toiset sel
lulaasit kiinnittyvät substraatin pintaan tiukemmin kuin toiset /4/. Käytännössä tämä näkyy reversiibelinä ja irreversiibelinä entsyymien kiinnittymisenä substraatin pin
taan.
Adsorption ÅHAdsorption ^ Adsorption ( ^ )
Tyypillisesti entalpianmuutos (AH) proteiinin adsorptiotilanteessa on suhteellisen pieni ja entropian muutos (AS) on dominoiva adsorptiotapahtumassa. Yleisesti voi
daan sanoa, että entsyymien adsorptiota ajavina voimina ovat ioniset proteiini- pintavuorovaikutukset ja ei-ioniset pinta-proteiinivuorovaikutukset sekä entsyymi- liuotinvuorovaikutukset. /1/.
Ioniset pinta-proteiinivuorovaikutukset aiheutuvat proteiinin ja pinnan vastakkaisista varauksista, jotka vetävät toisiaan puoleensa. Vastaavasti samanmerkkiset varaukset hylkivät toisiaan, jolloin adsorptiota ei tapahdu. Ei-ioniset pinta- proteiinivuorovaikutukset ovat vuorovaikutuksia, jotka aiheutuvat esimerkiksi sellu-
laasin CBM:n tapauksessa aromaattisista ryhmistä. Aromaattiset ryhmät ovat hydro
fobisia ja omaavat korkean polaroituvuuden, joka aiheuttaa merkittävän van der Waals vuorovaikutuksen. Van der Waals vuorovaikutuksista johtuen energeettisesti sellulaasin CBM:n on parempi adsorboitua selluloosapintaan, kuin olla vapaana liu
oksessa. Entsyymien vuorovaikutukset väliaineen (nesteen) kanssa ovat myös merkit
täviä adsorption kannalta. Tällä tarkoitetaan entsyymien liukoisuutta väliaineeseen, joka vaikuttaa entsyymin halukkuuteen adsorboitua kiinteään pintaan. Liukoisuuden
ollessa väliaineeseen suuri, alenee entsyymin halukkuus adsorboitua pintoihin. /1/.
Adsorptio-olosuhteilla, kuten lämpötila, pH ja väliaineen ionivahvuus, on suuri mer
kitys entsyymien adsorptiomääriin ja aktiivisuuteen hydrolysoida selluloosaa. Läm
pötilan vaikutusta sellulaasien adsorptiomääriin on tutkittu käyttäen substraattina puhdistettua puuselluloosaa. Kokeissa lämpötilan nousun huomattiin kasvattavan T.
reesein Cel7B, Cel5A, ja Cell2A:n adsorptiomääriä, kun taas T. reesein Cel7A ei ad
sorboidu merkittävästi enemmän lämpötilan kasvaessa 111. Kuitenkin Palonen et ai.
ovat tutkineet T. reesein sellobiohydrolaasien sitoutumista ja huomanneet sellulaasien Cel7A ja Cel6A sitoutuvan parhaiten matalissa lämpötiloissa bakteeriseen mikrokris- talli selluloosaan (BMCC) /61.
pH:n ja liuoksen ionivahvuuden vaikutusta adsorptiomääriin on tutkittu käyttäen sub
straattina puhdistettua puuselluloosaa. pH:n kasvu alhaisessa 5 °C lämpötilassa alen
taa adsorboituneen entsyymin maksimimäärä T. reesein Cel7B, Cel5A ja Cell2A ja Cel7A:lla. Korkeammassa 50 °C lämpötilassa pH:n kasvu aiheuttaa vastaavan ilmiön paitsi Cel7B:lla, jonka adsorptiomäärä aluksi laskee kunnes pH 5:ssä sitoutunut mää
rä alkaa kasvaa uudelleen. Liuoksen ionivahvuuden kasvu vähentää Cel7B, Cel5A ja Cell2A:n adsorptiomääriä alhaisessa 5 °C lämpötilassa. Korkeammassa 50 °C lämpö
tilassa Cel7B:n adsorptiomäärä laskee ionivahvuuden kasvaessa. Cel5A ja Cell2A:n adsorptiomäärät alkavat kasvaa vasta kun liuoksen ionivahvuus on kasvanut riittävän
Lämpötilalla on vaikutusta sellulaasien entsymaattiseen aktiivisuuteen. Sen merkitys
tä on tutkittu T. reesein tuottamilla sellulaaseilla Cel7B, Cel7A ja Cel6A. Tutkimuk
sessa kaikkien näiden sellulaasien aktiivisuuden optimilämpötilaksi mitattiin 55 - 60
°C. Tämän alueen yli mentäessä kaikilla tutkituilla sellulaaseilla aktiivisuus laskee jyrkästi. Substraatteina kokeessa käytettiin mikrokiteistä selluloosaa (Avicel), kar- boksimetyyliselluloosaa (CMC) ja fosforihapolla turvotettua selluloosaa (PSC) ase- taattipuskurissa. /8/.
2.1.3 Sellulaasien modulaarisen rakenteen vaikutus adsorptioon
Sellulaasien modulaarisilla rakenneosilla on erilaiset roolit adsorption kannalta. Vuo
rovaikutukset selluloosapinnan kanssa tapahtuvat selluloosan sitomisalueen (CBM) ja katalyyttisenalueen (CD) välityksellä. Sitoutuminen substraatin pintaan voi tapahtua joko spesifisesti tai epäspesifisesti. Selluloosan sitomisalueella (CBM) on merkittävin rooli sellulaasin sitoutumisessa selluloosan pintaan ja toimintaan. Tämä on havaittu kiteisellä selluloosalla poistamalla kokonaisesta sellulaasista CBM, jolloin sellulaasin affiniteetti ja aktiivisuus ovat laskeneet merkittävästi /9/. Kuitenkin on huomattu myös, että sellulaasin katalyyttisellä alueella (CD) on joidenkin sellulaasien tapauk
sessa affiniteettia sitoutua selluloosan pintaan (Kuva 4). Kuitenkin mittauksista huo
mataan kokonaisen entsyymin omaavan suuremman affiniteetin sitoutua selluloosan pintaan kuin pelkällä CD ja CBM alueilla yhteensä. /5, 6/.
71000-
■o 500
Free enzyme [nM]
7 1ООО-
Free enzyme [nM]
Kuva 4. Trichoderma reesein Cel7A ja Cel6A sitoutumisisotermit bakteeriselluloosaan (BMCC) lämpötilassa 4 °C. (A) Cel7A. (B) Cel6A. Symbolit: □ Kokonainen entsyymi, Д CBM ja o CD. / 6/.
Lämpötilalla on vaikutusta T. reesein Cel7A ja CelóA CBM:n adsorptioon selluloo- sapinnalle. Tutkimuksissa on huomattu näiden eksoglukasinaasien CBM-alueiden sitoutuvan tehokkaimmin matalissa lämpötiloissa. Cel7A sellulaasin CBM:n adsorp- tiomäärä bakteeriselluloosaan kasvaa yli kaksinkertaiseksi lämpötilan laskiessa 30 asteesta neljään asteeseen 121. Cel6A:lla lämpötilan lasku 50 asteesta neljään astee
seen kasvattaa adsorptiomäärän noin kolminkertaiseksi /9/.
2.1.4 Sellulaasien sitoutumistasapaino ja hydrolyysin estäminen
Sellulaasit sitoutuvat selluloosan pintaan reversiibelisti tai irreversiibelisti, riippuen sellulaasista. Tämänhetkisen tietämyksen mukaan T. reesein Cel7A sitoutuu lähes täysin reversiibelisti selluloosan pintaan /6/. Tämä on havainnollistettu muodostamal
la sitoutumisisotermi puskurihuuhtelulla (Kuva 5A) käyttäen substraattina BMCC selluloosaa. Vastaava tulos on saatu T. reesein Cel7A:n pelkälle CBM:lle samalla substraatilla 121. T. reesein Cel7A:n on myös havaittu sitoutuvan epäspesifisesti lig- niinipintoihin, joskin adsorptiomäärät ovat pienempiä kuin selluloosalla /10/. T. ree
sein Cel6A:n sitoutumisen on havaittu olevan ainoastaan puolireversiibeliä selluloo
syymejä, näkyi hystereesiä eivätkä mittaukset palautuneet täysin sitoutumisisotermil- le. /6/.
-g 1000-
c 750-
dilulion
37 min
200 enzyme [nM]
Free enzyme [nM]
Kuva 5. Trichoderma reesei Cel7A (A) ja Cel6A (B) sitoutumisen reversibiilisyys huuhdeltaessa puskuriliuoksella 22 °C lämpötilassa. /6/.
Sellulaasien hydrolyysiä voidaan pyrkiä estämään käyttäen inhiboivia aineita, jotka estävät hydrolyysiä. Sellobioosi toimii inhibiittorina sellulaaseille. Erityisesti se sopii Cel7A sellulaasille, jonka toimintaa se pystyy estämään jo pienempinä annostuksina (Kuva 6) /11/. Tutkimusten mukaan kokonaisen Cel7A:n sitoutumiseen sellobioosin ei vaikuttaa, mutta se kasvattaa pelkän CD alueen sitoutumista. Sellobioosi pystyy myös inhiboimaan Cel6A sellulaasin hydrolyyttistä aktiivisuutta. T. reesein Cel6A:n sitoutumiseen sellobioosin on havaittu vaikuttavan sitoutumista vähentäen. Cel6A:n katalyyttisen alueen (CD) sitoutumismääriä sellobioosi kasvattaa merkittävästi. /6/.
Sellobioosin on havaittu myös inhiboivan endoglukanaasien aktiivisuutta (Kuva 6 B).
Tarvittavat konsentraatiot ovat kuitenkin huomattavasti suurempia kuin sellobiohyd- rolaaseilla. Endoglukanaaseilla sellobioosin vaikutus on sellulaasikohtainen. Cel7B:n ja Cel5A:n aktiivisuus laskee sellobioosin vaikutuksesta, kun taas Cell2A:n aktiivi
suus kasvaa sellobioosin vaikutuksesta. /11/.
5 2 •
CeUotoioM (тИ)
Kuva ó.Sellobioosin vaikutus Trichoderma reesein sellulaasien aktiivisuuksiin hydrolysoida sellu
loosaa. Symbolit: (A), (x) Cel7A substraattina |3H]-bakteeriselluloosa; (B), (□) Cel7B, (A) CelSA ja (o) CellZA substraattina amorfinen selluloosa. /11/.
2.1.5 Lakkaasit
Lakkaasi! (EC 1.10.3.2) ovat multikupariproteiineja jotka kuuluvat sini- kuparioksidaasi-perheeseen. Tähän perheeseen kuulu lakkaasien lisäksi askorbaatti- oksidaasi-, ceruloplasmiini-, Fet3-ja CueO-proteiinit /12/. Lakkaasin katalysoimassa hapetusreaktiossa tapahtuu samanaikaisesti kohdemolekyylin hapettuminen ja happi
molekyylin pelkistyminen vedeksi. Lakkaasit ovat luonnossa pääasiassa kehit
tyneimmissä kasveissa ja sienissä esiintyviä entsyymejä, mutta lakkaasi aktiivisuutta on osoitettu myös jossain hyönteisissä ja bakteereissa /13/. Sienissä lakkaasien on to
dettu olevan mukana useassa fysiologisessa tehtävässä, kuten sienten patogeneesissä, pigmentin muodostuksessa ja lignosellulolyyttisten materiaalin hajottamisessa /12/.
Lakkaasin käyttöä on tutkittu monissa teollisissa sovelluksissa, kuten sellun val
kaisussa, tekstiilivärinen värinpoistossa, jätevesien puhdistuksissa, pesuaine teolli
suudessa ja polttokennoissa /14/.
2.1.6 Lakkaasien toiminta ja rakenne
Lakkaasi! katalysoivat substraatin hapettumista siirtämällä yhden elektronin substraa
tista kuparin kautta molekylaariselle hapelle. Hapen pelkistyminen vedeksi tapahtuu neljän elektronin siirron avulla (Yhtälö 2) kolmiytimisessä kuparikeskuksessa. Kata
lyyttisen syklin toiminnasta ei ole täydellistä varmuutta toistaiseksi. /13, 15/.
4e~ + 4H+ + 02 2H20 (2)
Lakkaasit pystyvät hapettamaan useita orgaanisia yhdisteitä kuten difenoleja, poly- fenoleja, aromaattisia amiineja, bentseenitioleita ja joitakin epäorgaanisia yhdisteitä.
Yksinkertaiset difenyylit, kuten hydrokinoni ja katekoli, ovat hyviä substraatteja suu
rimmalle osalle lakkaaseista vaikka guajakoli ja 2,6-dimetoksifenoli ovat yleensä vie
lä parempia (Kuva 7) /16/.
OH
4^
il
OH
ABC D
Kuva 7. Joitakin lakkaasin tyypillisiä substraatteja (A) katekoli ja (B) p-hydrokinoni (C) guaja
koli (D) ja 2,6-dimetoksifenoli.
Lakkaasien toiminta perustuu kykyyn poistaa elektroni fenolisesta OH ryhmästä. Täl
löin syntyy vapaa radikaali, joka reagoi ei-entsymaattisesti (Kuva 8). Vapaa radikaali on yleensä epästabiili ja voi hapettua uudelleen entsyymin katalysoimana. Esimerkik
si monella substraatilla tämä tarkoittaa fenolin muuntumista kinoniksi. Vapaa radi-
kaali aiheuttaa substraatissa ei-entsymaattisia reaktioita, kuten hydrataatiota, dispro- portionaatiota ja polymerisaatiota. /16/.
\ /
PolymerizationKuva 8. Lakkaasin aiheuttama tyypillinen reaktio, jossa difenyyli (hydrokinoni) yhden elektro
nin hapetuksessa muodostaa vapaan radikaalin. Syntynyt välituote voi uudelleen hapettua tai reagoida jollakin muulla tavalla. /16/.
Lakkaasit ovat hapettavia entsyymejä, joiden toiminta perustuu kupariatomeihin. Ku
pariatomit mahdollistavat entsyymien suorittaa elektronien siirtoreaktioita vaihtele
malla kupariatomien hapetustilaa Cu+ ja Cu2+ välillä. Rakenteeltaan yksinkertaisimpia kuparia sisältäviä proteiineja ovat mm. kasvien plastosyaniinit ja bakteeriset ”azu- rins”, jotka tyypillisesti toimivat elektronien kuljettajina elektronienvaihtoketjussa.
Kehittyneempiä kupariproteiineja kutsutaan oksidoreduktaaseiksi, jotka pystyvät ka
talysoimaan hapetus-pelkistysreaktioita. Tähän ryhmään lakkaasikin kuuluu. Monella kehittyneemmällä kupariproteiinilla on useampia kupariatomeja aktiivisessa keskuk
sessaan. Tämä mahdollistaa entsyymin katalysoida reaktioita, jotka vaativat usean elektronin siirtoa kerrallaan. Multikuparioksidaasien aktiivinen keskus sisältää yleen
sä kaksi tai neljä kupariatomia proteiinimolekyyliä kohden. Tämä mahdollistaa ent
syymin katalysoiman hapetusreaktion, jossa substraattimolekyyleiltä poistetaan elekt
roneja. Nämä elektronit kuljetetaan hapen luokse, jolloin syntyy vettä tai vetyperok
sidia. /13/.
Lakkaasien yleinen rakenne koostuu kolmesta kupari-atomin omaavista alueista А, В ja C, jotka ovat kooltaan lähes yhtä suuria (Kuva 9). Näillä alueilla on jokaisella mer
kitys lakkaasin katalyyttisen aktiivisuuden kannalta. Lakkaasin toiminnan kannalta merkittävistä alueista on saatu tietoa, ja substraatin sitoutumisalueen on havaittu si
jaitsevan alueiden В ja C välisessä raossa. Yksiytiminen kuparikeskus sijaitsee alu
eessa C ja kolmiytiminen kuparikeskus sijaitsee alueiden A ja C rajapinnassa. Yk
siytiminen kuparikeskus sisältää yhden tyypin-1 (Tl) kupariatomin. Kolmiytiminen kuparikeskus sisältää yhden tyypin-2 (T2) kupariatomin ja parin tyypin-3 (T3) kupa
riatomeja. Kupariatomit on luokiteltu EPR tekniikan (elektronin paramagneettinen resonanssi) avulla saatujen ominaisuuksien perusteella tyyppeihin 1 - 3. Tyypin-1 ku
pariatomia kutsutaan myös siniseksi tyypiksi. Tyypin-2 kupariatomia kutsutaan nor
maaliksi ja tyypin-3 kupariatomia kytketyksi kaksiytimiseksi kuparikohdaksi. /13, 15, 17/.
Kuva 9. M. albomyces lakkaasin kolmiulotteinen rakenne. Alueet А, В ja C ovat esitetty eri vä reillä (punainen, vihreä ja sininen). Neljä kupariatomia on kuvassa esitetty keltaisina palloina js hiilihydraatit ovat esitetty harmaina tikkuina. /13/.
Lakkaasien sitoutumisesta selluloosaan ja ligniiniin on tehty joitakin tutkimuksia.
Kuitenkin varsinainen tuntemus lakkaasien sitoutumisesta on puutteellista. Sitoutumi
sen aiheuttavista vuorovaikutuksista ei ole tietoa saatavilla. Lakkaaseista M. albomy- ces lakkaasin on havaittu sitoutuvan merkittävästi suhteellisen puhtaaseen selluloo
saan (Avicel) ja höyryesikäsiteltyyn havupuukuituun (SPS). Samassa tutkimuksessa havaittiin sitoutumista tapahtuvan myös bakteeriselluloosaan (BMCC). Laimennus- kokeen avulla havaittiin sitoutumisen bakteeriselluloosaan olevan reversiibeliä. M.
albomyces lakkaasin ei havaittu sitoutuvan alkaliligniiniin. T. hirsuta lakkaasin on havaittu sitoutuvan bakteeriselluloosaan, mutta sitoutumisesta ligniiniin ei ole tietoa saatavissa. /18/.
2.2 QCM-D mal li pinnat
Puun kuitujen tutkimus on vaikeaa perustavanlaatuisella tasolla, johtuen niiden huo
koisesta ja epäsymmetrisestä rakenteesta. Tästä johtuen on mahdoton löytää kahta samanlaatuista kuitua, joilla voitaisiin suorittaa toistettavia kokeita. Lisäksi kuitujen perusraaka-aine selluloosa on sitoutunut ligniinin ja hemiselluloosan kanssa. Mittauk
set jotka kohdistetaan ainoataan yhteen edellä mainituista aineosista vääristyvät mui
den aineosien takia. Kuidun aineosat voidaan eristää toisistaan kemiallisesti, mutta tällöin muokataan myös haluttavan aineosan rakennetta tai jopa tuhotaan sitä. Tällöin mitattaessa eristettyä aineosaa saadaan mittaustuloksia, jotka eroavat todellisista tu
loksista. Edellä mainittujen syiden takia on alettu kehittää mallipintoja, jotka vastaisi
vat kemialliselta rakenteeltaan puhdasta selluloosaa tai ligniiniä. Lisäksi mallipintojen valmistuksen tulee olla hyvin toistettavaa.
2.2.1 Selluloosamallipinnat
Puhdas selluloosa on pitkäketjuinen lineaarinen polysakkaridi, joka koostuu glu- koosianhydridiyksiköistä (Kuva 10). Glukoosianhydridiyksiköt (CóHioOs) ovat liitty
neet toisiinsa ß-glykosidisilla 1 —» 4 sidoksilla ja kahden glukoosin muodostamaa pa
ria kutsutaan sellobioosiksi.
Reducing end group Anhydroglucosc
_ ОН
Kuva 10. Selluloosan molekyylirakenne. /19/.
Lineaariset selluloosaketjut muodostavat tehokkaasti vetysidoksia keskenään. Tällöin muodostuu alkeisfibrillejä, joissa joukko yhdensuuntaisia selluloosa-molekyyliketjuja muodostaa täysin järjestäytyneitä kiteisiä alueita eli kristalliittejä. Kristal liitit vaihte- levat vähemmän järjestäytyneiden ja järjestäytymättömien eli amorfisten alueiden kanssa. Selluloosakuidut koostuvat mikrofibrilleistä, jotka vuorostaan koostuvat yh
densuuntaisista alkeisfibrilleistä.
Selluloosasta tunnetaan neljä polymorfia, jotka ovat selluloosa I, II, III ja IV. Luon
nosta löytyvän natiivin selluloosan kidemuoto on selluloosa I. Selluloosa I:llä on al- lomorfit selluloosa Ia ja Iß. Vahvalla emäksellä uudelleenkiteytetyn selluloosan kide- muoto on selluloosa II, ja selluloosa IIIi ja П1ц saadaan käsittelemällä selluloosa I ja II nestemäisellä ammoniakilla. Kuumentamalla selluloosa III saadaan aikaan sellu
loosa IV./19/.
Selluloosan monipuolisesta rakenteesta johtuen käytettäessä mallipintaa on tiedostet
tava mitä selluloosan rakennetta se kuvastaa. Natiiville selluloosalle on kehitetty mal- lipinta mikrofibrilliselluloosasta (MFC) /20/. Lisäksi Gray et ai. ovat saaneet valmis
tettua kiteistä selluloosa I:tä mikrokiteisestä selluloosaliuoksesta spin-coat päällys- tysmenetelmällä /21/. Tämä eroaa natiivista selluloosa I:stä siten, että mallipinnan pinnassa olevien selluloosaketjujen noin joka kymmenes hydroksyylimetyyliryhmä on korvautunut sulfaattiesterillä /22/.
Amorfisia selluloosamallipintoja pystytään valmistamaan spin-coat päällystysmene- telmällä ja Langmuir-Blodgett (LB) kerrostusmenetelmällä. Edellisillä menetelmillä valmistetut mallipinnat eroavat toisistaan paksuuden suhteen. LB-menetelmällä saa
vutetaan helposti ohuita jopa kahden molekyylin paksuisia kerroksia, mutta päällys- tysproseduuri on erittäin hidas. Spin-coat päällystysmenetelmä taas menetelmänä on nopeampi LB-menetelmää, mutta sillä ei päästä yhtä ohuisiin kerroksiin kuin LB- tekniikalla.
Uutena tekniikkana ovat kehityksessä ns. avoimet selluloosafilmit. Yksinkertaisim
millaan valmistus tapahtuu spin-päällystystekniikalla, alentamalla pinnoittavan trime- tyylisilyyliselluloosaliuoksen (TMSC) konsentraatio riittävän alhaiseksi. Tällöin TMSC muodostaa saarekkeita, jotka voidaan happohydrolyysillä muuttaa selluloo
saksi. Saarekkeiden muotoa ja kokoa voidaan säädellä päällystävän liuoksen konsent- raatiolla. Avoin selluloosafilmi voidaan tehdä myös TMSC:n ja polystyreenin seok
sesta spin-päällystämällä. Muodostunut pinta voidaan hydrolysoida, jolloin saadaan muutettua TMSC selluloosaksi. Pinnasta voidaan liuottaa polystyreeni pois, jolloin jäljelle jää aaltomainen selluloosapinta. Tämä selluloosapinta on tutkimusten mukaan täysin peittänyt kantavan pinnan. /23, 24/.
2.2.2 Ligniinimallipinnat
Ligniini on amorfinen aine joka sitoo puukuidun selluloosan ja hemiselluloosan toi
siinsa. Sen perusyksikkönä ovat pääasiassa fenyylipropaaniyksiköt ja sen rakenne on sattumanvarainen. Ligniinin 3-ulotteinen rakenne on muodostunut eetteri- (C-O-C) ja hiili-hiilisidosten (C-C) välityksellä. Ligniinin biosynteesin perusraaka-aineet ovat p- kumaryyli-, koniferyyli-ja sinapyylialkoholi (Kuva 11).
CKjOM CM.OH CH,OH
CH CH
1
II II II
A
CHл
CHX
CH9 Ou.
OH CHjoV^OCHOH1 * 3
Kuva 11. Ligniinin perusrakenneyksiköt: (1) p-kumaryylialkoholi, (2) koniferyylialkoholi ja (3) sinapyylialkoholi. /25/.
Ligniin eristämiseen puusta tutkimuskäyttöön tapahtuu yleisesti Björkman-ligniini menetelmän avulla. Björkman-ligniinimetodista käytetään myös nimeä milled wood lignin (MWL). Menetelmässä ei-turvottavaan liuottimeen, kuten tolueeniin, suspen- doitua puujauhoa jauhetaan vibraatiokuulamyllyssä. Tällöin puun solurakenne murs
kautuu ja syntynyt suspensio voidaan uuttaa dioksaani-vesiseoksella, jolloin saadaan osa ligniinistä (maksimissaan 50 %) eristettyä. Eristetty MWL sisältää aina vähän hii
lihydraatteja. /26/.
Ligniinin mallipinnat on aikaisemmin valmistettu käyttäen LB-menetelmää. Lignii
neinä näissä on käytetty lukuisien eri kasvien ja puiden ligniineitä. Uutena tekniikka
na on valmistaa spin-coat päällystysmenetelmällä ligniinimallipintoja käyttäen raaka- aineena kraftligniiniä /27/ ja MWL:ä /28/, jota käytettiin tässä työssä mallipintana.
2.2.3 Spin-coat päällystysmenetelmä
Spin-coat päällystyksen (Kuva 12) avulla voidaan muodostaa ohuita filmejä kiintei
siin pintoihin. Spin-coat päällystys perustuu pyörimisliikkeeseen, jonka aiheuttama keskipakoisvoima ajaa nestepinnan sileäksi. Käytetyt filmin raaka-aineet ovat haih- tumattomia aineita, jotka ovat liuotettu johonkin haihtuvaan nesteeseen. Tässä työssä spin-coat päällystystä käytettiin ligniinipintojen valmistukseen, mutta menetelmällä voidaan valmistaa myös selluloosapintoja.
Päällystys tapahtuu pipetoimalla pinnan peittävä määrä filmin raaka-ainetta kiteen keskelle, ja tämän jälkeen kiihdyttäen pyörimisnopeus haluttuun arvoonsa (500 - 6000 rpm). Pyöritystä jatketaan säädetyn ajan, jonka jälkeen kide pysäytetään ja pääl- lystysprosessi voidaan aloittaa alusta haluttaessa lisää kerroksia kiteeseen. Päällystet
tävä kide pysyy paikoillaan istukassa (Kuva 12) alipaineen avulla, joka tuotetaan ali- painepumpun avulla. Kiteen keskitys hoidetaan silmämääräisesti pyöräyttämällä sitä muutamakierros, jolloin epäkeskisyys erottuu ja se voidaan korjata. /29/.
Kuva 12. Spin-coat päällystin: (1) kide, jonka alla on pyörivä istukka. (2) on roiskeiden keräyskotelo. /30/.
Muodostuneen pinnan ominaisuuksia, kuten paksuutta ja sileyttä, voidaan säädellä liuoksen konsentraatiolla liuottimen ominaisuuksilla, pyörityksen kiihdytyksellä, pyö
rimisnopeudella ja pyörimisajalla /29/. Monilla materiaaleilla syntyvän kerroksen paksuutta voidaan ennustaa yhtälön 3 avulla /31/. Kiteen pyörityksestä vastaavaa moottoria ohjataan elektronisesti, jolloin pyörimisnopeuden muutokset tapahtuvat esiohjelmoidun ohjelman mukaan. Tässä työssä käytettiin TKK:lla kehitettyä ohjel
maa MWL pinnalle. /28/.
hxcca> V2r¡1/3cL0 ’ (3)
jossa ш on pyöritysnopeus n on viskositeetti Co on alkukonsentraatio.
2.2.4
Langmuir-Blodgett
(LB) tekniikkaLangmuir-Blodgett (LB) filmien juuret ulottuvat 1900 luvun alkuun, jolloin Irwin Langmuir ensimmäisenä teki systemaattisia kokeita veden pinnalla kelluvien mole
kyylin paksuisten kerrosten kanssa (monokerros) /32/. Langmuirin tulosten perusteel
la jatkoi Katherine Blodgett kehittäen menetelmän siirtää edellä mainitun kerroksen toiseen pintaan /33/. Näiden kahden henkilön kehitystyön tuloksena syntynyttä y - suuntaista filminsiirtotekniikka kutsutaan kehittäjien nimien perusteella Langmuir- Blodgett-tekniikaksi tai LB-kerrostamiseksi. x -suuntaista kerrostamismenetelmää kutsutaan Langmuir-Shaefer tekniikaksi.
LB-tekniikka perustuu vedellä täytettyyn altaaseen, jonka pinta-alaa voidaan säätää.
Altaan pintaan muodostetaan monokerros, joka koostuu päällystävästä amfifiilisestä materiaalista. Amfifiilinen materiaali on liuotettu johonkin helposti haihtuvaan ja ve
teen liukenemattomaan nesteeseen, kuten heksaaniin, bentseeniin tai kloroformiin.
Liuottimelle asetetaan vaatimus, että sen levittymiskerroin veden pinnassa on oltava positiivinen. Amfifiilisen materiaalin liukoisuutta voidaan joissakin tilanteissa kasvat
taa lisäämällä polaarisuutta kasvattavaa metanolia pieni määrä. Muodostettu seos kaadetaan matalaan altaaseen, jolloin se levittyessään vedenpintaan muodostaa tasai
sen kerroksen. Liuottimen haihtuessa jää jäljelle veden pintaan monokerros päällystä
vää materiaalia. /34/.
Altaan pinta-alan avulla voidaan muuttaa veden pinnalla olevan pintakalvon ominai
suuksia. Säätö suoritetaan hydrofobisella portilla tai porteilla, joka / jotka liikkuvat lievästi ylitäytetyn altaan vedenpinnalla. Altaan seinät ja portit ovat moderneissa ver
sioissa materiaaliltaan polytetrafluoroetaania (PTFE) /34/. Pintakalvon pintajännitys mitataan käyttäen ns. Wilhelmy plate-menetelmää.
Pintakalvon pintajännityksen avulla voidaan säätää monokerroksen tiiveyttä altaan pinnassa. Altaan porttien pienentäessä altaan pinta-alaa, nousee kalvon pintapaine, jolloin molekyylit alkavat organisoitua filmiksi. Seuraamalla pintakalvon pintajänni
tystä, voidaan havaita koska altaan pinta on täysin peittynyt. Alla olevassa kuvassa on esitetty trimetyylisilyyliselluloosan (TMSC) isotermi veden pinnalla (Kuva 13).
60
Ala / molekyyli (Am)
Kuva 13. Tyypillinen TMSC:n Langmuir-isotermi vedessä. /29/.
Altaan pinnalla oleva monokerros saadaan siirrettyä kiteen pintaan yksinkertaisesti tuomalla kide monokerroksen kanssa kontaktiin (Kuva 14). Tällöin kerros kiinnittyy kiteen pintaan ja nostettaessa kiteen pintaan jää teoriassa kahden molekyylin paksui
nen kerros. Kerrostus prosessin aikana altaan pintapaine pidetään vakiona, jotta pin- nansiirtoprosessi tapahtuisi alla olevan kuvan mekanismin mukaisesti.
Kerrostusprosessin aikana seurataan myös aineensiirtosuhdetta, josta nähdään siirty
neen kerroksen siirron onnistuminen. Aineensiirtosuhde on määritetty altaanpinnalla olevan kerroksen pinta-alan muutoksen ja kiteeseen siirtyneen monokerroksen pinta- alan suhteena. Optimaalinen arvo x-suuntaiselle prosessille on 2, joka kertoo bi- kerroksen muodostumisesta. /29/.
a) Dipping
device
Kuva 14. Langmuir-Shaefer siirtoprosessin periaate. Nuolet osoittavat prosessin kulun. Ovaalit esittävät TMSC molekyylejä. Mustat pisteet ovat TMSC:n ja polystyreenin hydrofobisia kohtia.
/29/.
2.3 QCM-D tekniikka
Kvartsikidemikrovaa’an toiminta perustuu värähtelevään pietsosähköiseen kiteeseen (Kuva 15), jonka resonanssitaajuuden muutokset pystytään havaitsemaan. Yleisin käytetty pietsosähköinen materiaali on а-kvartsi, joka on piidioksidin erityinen kris- tallirakenne. QCM-laitteisto mahdollistaa ultrapienten adsorptiomäärien mittauksen, kuten vetyatomien muodostaman yhden molekyylin paksuisen kerroksen mittauksen.
/35/.
Kuva 15. QCM-D laitteen kultaelektrodinen kvartsikide. /36/.
Pietsosähköinen kide saadaan värähtelemään asettamalla sen läpi kulkemaan vaihtuva sähkökenttä. Tällöin värähtelyn suunta ja voimakkuus riippuvat suoraan asetetusta sähkökentästä ja sen suunnasta verrattuna kiteen kideakseliin. Useimmat QCM- sovellukset käyttävät AT-leikattua kvartsikidettä (Kuva 16), joka on 0.1 - 0.3 mm paksuja normaalisti halkaisijaltaan 0.5 - 1.5 cm leveä pyöreä kiekko. Kvartsikide on asetettu kahden metallielektrodin väliin, jotka yleensä ovat noin 50 nm paksuja kulta- renkaita. /35/.
Kuva 16. Kvartsikiteen AT-leikkaus. Oikea kuva on leikatun kiteen poikkileikkaus. /37/.
2.3.1 Resonanssitaajuuden muutos
Kvartsikiteen AT-leikkauksella varmistetaan, että sähkömagneettinen kenttä aiheuttaa mekaanisen kimmoisan leikkausmuodonmuutoksen kiteeseen. Asettamalla sähkö
kenttä oskilloimaan kiteen läpi, saadaan aikaan mekaanisia leikkausaaltoja kiteeseen.
kon paksuus on noin puolet indusoidun aallon kokonaisluvun aallonpituudesta. Ki
teen resonanssitaajuus saadaan laskettua yhtälön (4) avulla. /35/.
J =, v» = ”/o>
jossa n on värähtelyn kertaluku
on äänennopeus kvartsikiteessä on kvartsikiteen paksuus fo on perusresonanssitaajuus.
Resonanssitaajuutta jolloin n on 1, kutsutaan perusresonanssitaajuudeksi ja tästä eteenpäin n kertaluvun yliääniksi.
Kiteen massa pinta-alan funktiona (mq, kg/m2) voidaan lausua kiteen paksuuden ja tiheyden avulla (mq=tqpq). Sijoittamalla yhtälöön (4) mq ja derivoimalla se molem- minpuolin saadaan taajuuden muutokselle yhtälö (5).
df = -J-dmq (5)
m„
Kiteen pintaan kerrostuva materiaali laskee kiteen värähtelytaajuutta. Mikäli adsor
boituneen filmin oletetaan olevan jäykkä, tasaisesti kiinnittynyt, riittävän ohut ja ad
sorboituneen massan tulee olla riittävän pieni verrattuna kiteen massaan. Tällöin yhtä
lö 5 voidaan kirjoittaa
# = A/ = -
/
tqPq
2 / 1
A m = —n——A m = -n—Am,
V4P4 C (6)
jossa Af on resonanssitaajuuden muutos (Hz) Pq on kvartsikiteen spesifinentiheys (kg/m3)
lq on kvartsikiteen paksuus (m)
fo on kvartsikiteen perusvärähtelytaajuus (Hz) n on värähtelyn kertaluku.
C on kiteen herkkyysvakio.
Ratkaisemalla yhtälöstä 6 massan muutos saadaan Sauerbreyn yhtälö (7), jonka avul
la voidaan laskea adsorboituneen massan määrä resonanssitaajuuden muutoksen funktiona.
n (7)
2.3.2 Värähtelyn vaimeneminen
Mikäli kiteen pintaan adsorboitunut massa ei ole jäykkä vaan jokseenkin viskootti- nen, antaa yhtälö 5 filmin massaksi liian pienen arvon. Tämän aiheuttavat pääsääntöi
sesti oskilloivassa systeemissä esiintyvät massan dissipaatiohäviöt. Dissipaatiohävi- öiden suuruus ilmaistaan dissipaatiotekijän avulla, joka on Q - tekijän käänteisluku (Yhtälö 8). /35/.
J Dissipoitumt
2 nESitoutunut (8)
jossa E Dissipoitumt on yhden oskilaatioperiodin aikana hävinnyt energia ja Es,t0utumt on energia joka on sitoutunut oskilloivaan järjestelmään.
Mittausten suoritus nesteessä muuttaa värähtelyn vaimenemisen hyvin nopeaksi ver
rattuna ilmassa tapahtuvaan vaimenemiseen. Kuitenkin perusvärähtelyn on osoitettu olevan stabiilia nesteessä /38/. Värähtelyn vaimeneminen väliaineessa johtuu kiteen leikkausaaltojen siirtymisestä siihen. Nesteessä liikkuvat leikkausaallot vaimenevat nopeasti nesteen ilmaa suuremmasta viskositeetista johtuvan kitkan takia. Resonans- sitaajuuden ja dissipaatiovakion muutokset nesteessä voidaan laskea yhtälöiden 9 ja
10 avulla. /35/
(9)
(10)
Kokeellisesti dissipaatiovakio voidaan määrittä aikavakion г avulla. Katkaistaessa pietsosähköisestä kiteestä sähkökenttä, noudattaa värähtelyn amplitudin vaimenemi
nen eksponentiaalista yhtälöä
A{t) = A0e^sin(2 rft + (p),
jossa T on aikavakio
f on taajuus
Ф on vaihekulma
t määritetään katkaisemalla kiteen läpi menevä sähkökenttä ja seuraamalla amplitu
din muutosta ajan funktiona. Tällöin dissipaatiovakio saadaan numeerisesti sovitta
malla yhtälöä (11) mitattuun virta- tai jännite käyrään. Dissipaatiovakio saadaan las
kettua aikavakion г avulla yhtälöllä
я fx ' (12)
Rigid Viscoelastic
i ¡i h
!, ij i
Kuva 17. Värähtelyn vaimeneminen jäykällä ja viskoelastisella pinnalla. /39/.
Nesteen ominaisuudet vaikuttavat resonanssitaajuuden ja dissipaation muutokseen.
Esimerkiksi on havaittu resonanssitaaj uuden laskevan ja dissipaatiokertoimen kasva
van sakkaroosin konsentraation kasvaessa /39/. Tämän aiheuttaa nesteen sisäisen kit
kan kasvu, jolloin kide värähtelee alemmalla resonanssitaaj uudella. Dissipaatioker
toimen alenema on seurausta väliaineen muutoksesta viskoottisemmaksi, jolloin vä
rähtely vaimenee nopeammin kuin puhtaassa vedessä.
AF water AD
sucrose sucrose sucrose
water
QCM crystal
time time
Kuva 18. Sakkaroosin vaikutus QCM-kiteen resonanssitaajuuden ja dissipaation muutokseen.
Adsorptiota ei tapahdu sakkaroosin ja kiteen pinnan välillä. /39/.
2.3.3 Proteiinien adsorptiotutkimus QCM-D laitteella
QCM -laitteella voidaan tutkia reaaliaikaisesti proteiinien, kuten entsyymien, adsorp- tiotapahtumaa käyttäen mallipintoja. Proteiiniadsorptiomittaukset tapahtuvat neste- faasissa, jolloin adsorboitunut pinta ei ole rakenteeltaan välttämättä täysin jäykkä.
Tällöin aiheutuu tilanteita, joissa yhtälön 3 oletukset eivät tule täysin täytettyä. Prote
iinien jäykästä poikkeava luonne tosiasiallisesti aiheuttaa sen, että energian häviämi
nen systeemistä voi olla näennäistä. Lisäksi proteiinit saattavat sitoa vettä, joka mit
tauksissa näkyy lisääntyneenä adsorboituneen massan määränä. Edellä mainitut teki
jät vääristävät mittaustulosta, joka ei vastaakaan tällöin todellisuutta. Mittaamalla re- ferenssitaajuuden ja dissipaation muutos samanaikaisesti, saadaan dissipaatiokertoi- men avulla myös tietoa adsorboituneen proteiinipinnan rakenteesta ja pinnan kovuu
den muutoksista. /35/.
Pintaan sitoutuneen entsyymin teoreettiseen maksimimäärään vaikuttaa pinnan ent
syymille suotuisten sitoutumispaikkojen määrä, mikäli entsyymien oletetaan muodos
tavan ainoastaan monokerroksen. Tällöin on olemassa entsyymeille teoreettinen mak
simimäärä, jolloin pinta on täysin peittynyt. Teoreettista maksimiarvoa sitoutuneelle entsyymimäärälle voidaan arvioida käyttäen Langmuirin laajennettua sitoutumismal- lia (yhtälö 13) /40/. Yhtälö on yleisesti käytetty sellulaasien sitoutumisen kuvaami
seen. Malli eroaa perinteisestä Langmuirin isotermistä pinnassa olevien sellulaaseille suotuisia sitoutumispaikkojen määrän perusteella. Perinteisessä Langmuirin isoter- missä pinnassa on ainoastaan yhdenlaisia sellulaaseille suotuisia sitoutumispaikkoja, kun taas laajennetussa isotermissä on kahdenlaisia suotuisia sitoitumispaikkoja.
Am c c
max (13)
jossa Am,max on pintaan sitoutuneen entsyymin massa c on liuoksen vapaan entsyymin konsentraatio
Kdi ja Kd2 ovat sellulaasin pinnan ja liuoksen väliset jakaantumisvakiot nmaxi ja nmax2 ovat pinnassa olevien sitoutumispaikkojen maksimimäärä.
Laajennetun mallin maksimi sitoutumispaikkojen lukumäärä saadaan laskettua termi
en nmaxi ja nmax2 summana.
(14) Sellulaasien kokonaisjakaantumisvakio a vapaan ja sitoutuneen entsyymin välille, saadaan laskettua Langmuirin mallin jakaantumisvakioiden Kai ja K¿2 avulla. Koko- naisjakaantumisvakiolla ei ole fysikaalista merkitystä, koska sellulaasien sitoutumi
nen ei ole täysin reversiibeliä /40/.
2.3.4 Referenssimenetelmät QCM-D tekniikalle
QCM-D menetelmälle pyrittiin etsimään referenssimenetelmää, jolla pystyttäisiin varmentamaan mitattuja tuloksia. Mitattujen tulosten vertailua muihin menetelmiin vaikeuttaa QCM-D mittaustapa, jossa mitataan sitoutunutta massaa tiettyä pinta-alaa kohden. Perinteisissä koeputkissa suoritetuissa sitoutumismittauksissa mittaus suori
tetaan sitomalla entsyymejä tiettyä substraattimäärää kohden. Koeputkikokeiden tu
losten muunto vastaamaan QCM-D:llä saatuja tuloksia on erittäin vaikeaa tai jopa
mahdotonta. Periaatteessa yksinkertaisimmillaan substraatin ominaispinta-ala saadaan laskettua, kun tiedetään substraatin ominaispinta-alan ja massan suhde.
Todellisuudessa esimerkiksi selluloosan/lignoselluloosan huokoinen rakenne yhdis
tettynä taipumukseen turvota vedessä, tekevät sen ominaispinta-alan arvioinnista erit
täin vaikeaa. Selluloosan ominaispinta-alaa voidaan arvioida yhdistelemällä eri mitta
usmenetelmillä saatuja tuloksia. Turpoamista voidaan arvioida WRV (Water retention value) mittauksella, joka kuitenkin korkeilla kuidun turpoamismäärillä aliarvioi kui
dun turpoamisen /41/. Kuivan selluloosapinnan spesifistä ominaispinta-alaa voidaan suoraan arvioida typen tai jonkin muun selluloosan kanssa reagoimattoman kaasun adsorption avulla /42/. Selluloosapinnan sisäisten huokosten pinta-alaa voidaan arvi
oida elohopeaporosemetrian avulla, joka perustuu elohopean kykyyn olla kastelemat
ta kuitua tunkeutuessaan puukuidun huokosiin /43/. Edellisten mittausten tuloksia yh
distelemällä voidaan saada arvio selluloosan ominaispinta-alalle.
Sellulaasien sitoutumista selluloosaan pystytään myös seuraamaan käyttäen radioak- tiivisesti leimattua proteiinia. Tutkittava proteiini leimataan tritiumilla, jolloin sitou
tunut entsyymimäärä saadaan selvittyä mittaamalla säteilyn määrää.
KOKEELLINEN OSA
3 TYÖN TARKOITUS
Tämän työn tarkoituksena oli tutkia QCM-D tekniikan soveltuvuutta entsyymien si- toutumistutkimukseen. QCM-D tekniikka on kohtalaisen nuorta, joten sen soveltu
vuudesta entsyymien sitoutumistutkimukseen on saatavilla rajallisesti tietoa. Teknii
kan käyttöä entsyymien adsorptiotutkimukseen rajoittaa sopivien mallipintojen rajal
linen määrä. Tutkimuksessa käytetyiksi entsyymeiksi valittiin T. reesein sellulaaseista Cel7A ja Cel7B. Hapettavista entsyymeistä valittiin M. albomyces ja T. hirsuta lak- kaasit. Mallipinnoiksi tutkimukseen valittiin MWL-ja LB-selluloosamallipinta.
4 KÄYTETYT MATERIAALIT JA MENETELMÄT
QCM-D laite
Tutkimus suoritettiin QCM-D E4 laitteella (Q-Sense, Göteborg, Ruotsi). Laitteen toi
mintaperiaate on selitetty kirjallisuusosassa. Laitteella pystytään mittaamaan perus- resonanssitaajuuden lisäksi resonanssitaajuuksien kertaluvut 3, 5, 7, 9, 11 ja 13. Tu
losten esittämisen helpottamiseksi resonanssitaajuuden muutoskäyrät on muutettu Saurbreyn-massan muutoksiksi yhtälön (8) avulla, huolimatta pinnan dissipaation muutoksen suuruudesta.
QCM-kiteet
QCM-kiteet (QSX 305) jotka toimitti Q-Sense (Göteborg, Ruotsi). Kiteet olivat AT- leikkauksellisia kvartsikiteitä, joiden paksuus on 0,1 mm ja halkaisija 14 mm. Kitei
den perusresonanssitaajuus f o on 4,95 MHz ± 50 kHz ja herkkyysvakio C ~ 0,177 mgm2HzL. Kiteiden elektrodikerros oli 100 nm paksu kultakerros. Kiteet olivat val
miiksi spin-päällystetty polystyreenikerroksella, jonka paksuus on 30 nm. Polysty- reenipinta on hydrofobinen.
Selluloosapinnat
Amorfiset selluloosapinnat valmistettiin KSV instruments Oy:n valmistamalla Lang- muir-Blodgett monokerrostuslaitteella, jonka tyyppi oli K2000. TMSC selluloosa- monokerros muodostettiin hyvin puhtaan veden päälle. Ionivaihdettu vesi oli käsitelty MilliPore laiteella, joka käsittelee ionivaihdetun veden käänteisosmoosin ja UV:n avulla. TMSC monokerros siirrettiin horisontaalisella dippauksella QCM-kiteeseen.
Päällystetyt kiteet kuivattiin yön yli eksikaattorissa. Kuivuneen TMSC pinnan sily- lointi poistettiin ennen kiteiden turvotusta 10 % HC1 höyryllä. Turvotus tapahtui Na- asetaattipuskuriliuoksessa, jonka pH oli 5. Tutkittaessa sellulaaseja puskuriliuoksen vahvuus oli 50 mM ja lakkaasien tapauksessa 20 mM. TMSC oli valmistettu TKK:n puukemianlaboratoriossa. Amorfisten selluloosapintojen valmistusproseduuri on esi
tetty tarkemmin Tekla Tammelinin LB-selluloosapintojen valmistusta käsittelevässä artikkelissa /44/.
Ligniinipinnat
Ligniinipinnat valmistettiin spin-coat-menetelmällä, käyttäen Laurell Technologies yhtiön valmistamaa spin-coat-laittetta. Milled Wood ligniinin (MWL) oli toimittanut KCL (Espoo, Suomi). Ligniini oli liuotettu 1,4-dioksaaniin ja muodostettu seos seisoi 2 päivää ennen käyttöä. Ligniinillä päällystetyt QCM-kiteet laitettiin turpoamaan yön yli Na-asetaattipuskuriliuokseen. Liuoksen vahvuus oli tutkittaessa lakkaaseja 20 mM
Entsyymit
Tutkimuksessa selluloosa- ja ligniinipinnoille adsorboitiin puhdistettuja T. reesei ho
meen sellulaasientsyymejä. Sellulaaseista tutkimuksessa käytössä olivat Cel7A ja Cel7B. Cel7A:sta oli käytössä lisäksi kokonaisesta sellulaasista eristetty katalyyttinen alue. Lakkaaseista käytössä olivat T. hirsuta ja M. albomyces entsyymit. M. albomy- ces lakkaasi oli tuotettu T. reesein homeessa. Entsyymit oli tuotettu fermentoimalla ja puhdistettu kasvuliuoksistaan VTT:llä Espoossa. Entsyymien laimennus mittausliu- oksiksi tapahtui samalla puskuriliuoksella, jolla pinnat oli turvotettu ennen mittausta.
QCM-D kokeiden mittausolosuhteet
Mittausolosuhteet QCM kammiossa pyrittiin pitämään mahdollisimman vakiona.
Lämpötila pidettiin jokaisessa mittauksessa vakiona 25 °C. pH säädettiin natrium- asetaattipuskurin avulla pH:seen 5. Liuoksen ionivahvuus oli sellulaaseilla 50 mM ja lakkaaseilla 20 mM. Nesteen virtausnopeus oli 0,1 ml/min.
Proteiinien konsentraatioiden määritykset
Cel7A:n ja Cel7B:n proteiinikonsentraatiot määritettiin mittaamalla entsyymi liuoksen absorbanssi aallonpituudella 280 nm. Konsentraatiot saadaan laskettua Beerin ja Lambertin lain avulla, kun tiedetään proteiinin molaarinen absortiokertoimen 8 ja moolimassan M suuruus. Cel7A:n moolimassa on 52205,5 g/mol ja molaarinen ab- sorptiokerroin e on 83 000 l/(l/mol*cm). Cel7B:n moolimassa on 46 032,1 g/mol ja molaarinen absorptiokerroin 8 on 70 000 l/(Mcm). M. albomyces lakkaasin prote- iinikonsentraatio oli määritetty aminohappoanalyysillä. T. hirsuta lakkaasin prote- iinikonsentraatio määritettiin Bio-Rad DC menetelmällä. Määritys tapahtui Bio-Rad DC:n työohjeen mukaisesti.
Entsyymien aktiivisuus määritykset
Cel7A sellulaasin aktiivisuus määritettiin käyttäen substraattina 4-metyyli- umbiferyyli-ß-D-laktosidia. Menetelmässä Cel7A hydrolysoi substraattia muodostaen
metyyli-umbiferyylia, joka voidaan määrittää spektrofotometrisesti aallonpituudella 446 nm. Cel7A:n aktiivisuus saadaan vertailemalla standardisuoraan.
Cel7B:n aktiivisuus määritettiin käyttäen substraattina hydroksyetyyliselluloosaa (НЕС). HEC:n hydrolyysi aiheuttaa liuoksen värin muutoksen, joka havaitaan spekt
rofotometrisesti aallonpituudella 540 nm. Cel7B:n aktiivisuus saadaan vertaamalla standardisuoraan.
Lakkaasien aktiivisuudet määritettiin käyttäen ABTS (2,2'-atsino-bis(3- etyylibentsotiatsoli-6-rikkihappo) substraattina. Menetelmä perustuu lakkaasin ky
kyyn hapettaa ABTS tummanvihreäksi kationiradikaaliksi. ABTS konsentraatio mit- tausliuoksessa on 4,7 mM ja liuoksen pH säädetään 0,025 M sukkinaatti-puskurin avulla 4,5:ksi. Värin muodostumista seurataan aallonpituudella 436 nm tapahtuvan reaaliaikaisen absorbanssimittauksen avulla. Absorbanssin muutoksen avulla voidaan laskea lakkaasin aktiivisuus.
Entsyymien puhtaus ja kokomääritys
Kaikista työssä käytetyistä entsyymeistä määritettiin niiden puhtausaste SDS-PAGE eli natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesin avulla. Menetel
mässä proteiinit denaturoidaan kuumentamalla puskuriliuoksessa, joka sisältää anionisia surfaktantteja. Liuoksessa anionisia surfaktantteja ovat SDS (natriumdode- kyyli- eli natriumlauryylisulfaatti) ja tioliryhmiä pelkistävä ß-merkaptoetanoli. Kuu
mennuksen proteiiniketjut avautuvat ja niihin sitoutuu SDS:ää. Proteiini-SDS- kompleksit liikkuvat anioneina sähkökentässä siten, että niiden liikkuvuus on suoraan verrannollinen molekyylipainon logaritmiin. Entsyymien geelielektoforeesitulosten rinnalla ajetaan molekyylikokostandardi, jonka proteiinien molekyylipainot tunne
taan. Entsyymien molekyylipainot saadaan vertaamalla tuloksia molekyylikokostan- dardiin. Molekyylikokostandardina käytettiin Broad Range-standardia (Biorad, USA). Proteiinit visualisoitiin Coomassie Brilliant Blue R-250 värjäyksellä.
Pintojen tutkiminen AFMrllä
Atomivoimamikroskooppikuvaus tapahtui Nanoscope Ilia Multimode scanning probe microscope laitteella, jonka oli valmistanut Digital Instruments Inc (Santa Barbara, Kalifornia, USA). Kuvaus tapahtui käyttäen ”tapping” moodia.
5 TULOKSET JA TULOSTEN TARKASTELU
5.1 Määritykset tutkimuksessa käytetyistä entsyymeistä
Tutkimuksissa käytetyistä entsyymeistä {T. reesein Cel7A ja Cel7B, sekä M. almo- myces ja T. hirsuta lakkaasit) suoritettiin konsentraation, aktiivisuuden ja molekyyli- painon määritykset. Konsentraatioiden ja aktiivisuuksien arvot on esitetty alla taulu
kossa.
Taulukko 2. Tutkimuksessa käytettyjen entsyymien konsentraatiot ja aktiivisuudet.
Konsentraatio Aktiivisuus (ЦМ) (n ka t/m I)
MaL 95 2890
ThL 93 8708
Cel7A 12 2870
Cel7B 93 2595
Tutkimuksessa käytettyjen entsyymien puhtautta ja molekyylipainoa selvitettiin SDS- PAGE:n avulla. SDS-PAGE tulos kertoo näytteen molekyyIipainojakaumasta. Puh
kohtaan geelillä. Tuloksesta nähdään tutkimuksissa käytettyjen sellulasien olevan hy
vin puhtaita (Kuva 19), kun taas lakkaaseilla entsyymin lisäksi näytteessä on vähän muitakin proteiineja.
STD 1 1 2 2 3 3 4 Í
Kuva 19. SDS-PAGE-kuva tutkimuksissa käytetyistä entsyymeistä. Jokaisesta näytteestä on teh
ty rinnakkaiset mittaukset, jotka on numeroitu samalla numerolla. Sarakkeet vasemmalta oike
alle: (STD) molekyylipainostandardi, (1) Melanocarpus albomyces lakkaasi, (2) Trametes hirsuta lakkaasi, (3) T. reesei Cel7A ja (4) T. reesei Cel7B.
5.2 T. reesein Cel7A:n sitoutuminen mallipinnoille
Entsyymien sitoutumiskokeet aloitettiin tutkimalla T. reesei Cel7A entsyymin sitou
tumista LB- ja MWL-pinnalle. Cel7A entsyymistä oli käytettävissä kokonainen ent
syymi ja tämän katalyyttinen osa, jossa kokonaisesta entsyymistä oli CBM poistettu.
Cel7A entsyymin havaitaan sitoutuvan kummallakin mallipinnalla (Kuva 20) erittäin selvästi. Entsyymiliuoksen konsentraatio 0,12 pM on riittävä, jotta Cel7A sellulaasin sitoutuminen havaitaan kummallakin mallipinnalla. Sitoutumismäärä MWL pinnalle on selkeästi pienempää kuin LB-selluloosapinnalle. Kuvasta (Kuva 20) voidaan näh
pM käyrässä tasaantumisvaiheen jälkeisenä laskuna. Dissipaation muutos kummalla
kin mallipinnalla on pieni (alle 1).
4,00 -
—Cel7A 1,2 MM LB-selluloosa —Cel7A 0,12 yM LB-selluloosa
— Cel7A1,2 pM MWL_________ — Cel7A 0,12 pM MWL________
Kuva 20. Cel7A:n sitoutuminen amorfiselle selluloosa- ja MWL-pinnalle. Sauerbreyn-massat on laskettu taajuuden kertaluvun 3 avulla.
Cel7An katalyyttisen osan havaittiin myös sitoutuvan merkittävästi selluloosa- ja lig- niinipinnoille (Kuva 21). Sitoutunut määrä on vähäisempää verrattuna kokonaisen entsyymin sitoutumiseen. Esimerkiksi konsentraatiolla 1,2 pM saavutetaan noin 3,5 mg/m2 sitoutunut määrä, kun se kokonaisella entsyymillä on yli 5 mg/m2. Ero sitou
tuneen massan määrässä selittyy sellulaasin CBM:n merkityksellä sitoutumistapah- tumassa. Tämä on selitetty kirjallisuusosan kappaleessa 2.1.3. Sellulaasien katalyytti
sellä alueella on kuitenkin merkittävä rooli selluloosan sitoutumistapahtumassa. Dis
sipaation muutokset olivat sitoutumistapahtumassa pieniä (alle 1).
4,00 -,
3,50 - 3,00 -
_ 2,50 -
f 2,00 -
' 1,50 -
1,00 -
0,50 -
Aika (min)
— Cel7A Core 1,2 |iM LB-seiluloosa —Cel7A Core 0.12 pM LB-selluloosa
— СЫ7А Core 1,2 pM MWL_________ — Cel7A Core 0,12 pM MWL________
Kuva 21. Cel7A:n katalyyttisen alueen (Core) sitoutuminen selluloosa- ja MWL-pinnalle. Sauer-
¿ireyn-massat on laskettu taajuuden kertaluvun 3 avulla.
Cel7A sellulaasin sitoutumista LB-selluloosapinnalle tutkittiin syvällisemmin käyt
tämällä entsyymiä eri pitoisuuksilla 0,001 pM ja 50 pM välillä. Sitoutumismäärien mittaus tapahtui muuttaen entsyymin konsentraatiota ja pitäen liuoksen pH, lämpöti
la, pumppausnopeus ja ionivahvuus vakioina. Tällä tavoin pyrittiin minimoimaan ul
kopuolisten tekijöiden vaihtelun vaikutus mitattuihin käyriin.
Koe suoritettiin syöttämällä Cel7A sellulaasia LB-selluloosamallipinnalle. Entsyymi- pitoisuudella 0,1 pM havaitaan Sauerbreyn-massan kasvavan (Kuva 22) kunnes saa
vutetaan tasapaino sitoutuneen ja liuoksessa vapaana olevan entsyymin välille. Tämä näkyy käyrän kasvun tasaantumisena. Tasaantumisvaiheen jälkeen havaitaan käyrän alkavan laskea, joka johtuu selluloosaketjujen hydrolyysistä. Lopuksi pintaa huuhdel
tiin 50 mM natrium-asetaattipuskuriliuoksella, jolloin pintaan sitoutunut entsyymi irtoaa.
Aika (min)
Kuva 22. Cel7A entsyymin Sauerbreykäyrä. Entsyymin konsentraatin 0,1 цМ. Kuvassa viivoilla on erotettu mittauksen aikaiset tapahtumat toisistaan. (1) sitoutumisvaihe, (2) Hydrolyysi ja (3) puskurihuuhtelu. Sauerbreyn käyrä on piirretty resonanssitaajuuden kertaluvun 7 avulla.
Liuoksen entsyymipitoisuuden kasvaessa havaitaan pintaan sitoutuneen entsyymin määrään kasvavan epälineaarisesti (Kuva 23). Entsyymipitoisuudella 0,01 pM saavu
tetaan noin 3 mg/m2 sitoutunut entsyymi määrä. Pitoisuuden kasvaessa tästä sataker
taiseksi (1 pM) saavutetaan hiukan yli 5 mg/m2 adsorptiomäärä.
— 0,001 нМ
— 0,01 ИМ
— 0,1 нМ
— 1 мМ
— S цМ
— SOpM
Kuva 23. Cel7A:n adsorptio amorfiselle selluloosapinnalle eri entsyymipitoisuuksin. Käyrät on piirretty resonanssitaajuuden keraluvun 7 mukaan. Mittausten kertalukujen välillä ei ole merkittävää hajontaa. Sitoutumisvaiheen jälkeinen pinnan huuhtelun alkamiskohdat on merkitty kuvaan nuolilla.
Maksimi sitoutumismäärän määrittämistä QCM-D laitteella vaikeuttaa selluloosaket- jujen hydrolyysi, kuten teoriakappaleessa 2.1.4 on esitetty. Cel7A:n aiheuttama hyd- rolyysi on kuitenkin hidasta verrattuna sitoutumisvaiheeseen. Tästä syystä voitiin olettaa, ettei hydrolyysi ehdi vaikuttaa merkittävästi ennen kuin tasapaino sitoutuneen ja vapaan entsyymin välillä on syntynyt. Kuitenkin matalissa entsyymikonsentraati- oissa sitoutumisnopeus on merkittävästi hitaampaa mutta oletettavasti hydrolyysikin on tällöin hidasta.
Kokonaisen Cel7A sellulaasin sitoutuminen amorfiseen LB-selluloosapintaan on erit
täin nopeaa, minkä QCM-D kokeiden tulokset osoittavat. Liuoksen entsyymipitoi
suuden kuitenkin havaitaan vaikuttavan merkittävästi sitoutumistasapainon saavutta
miseen kuluvaan aikaan (Kuva 23). Alimmalla entsyymipitoisuudella (0,001 pM) ei ehditty saavuttaa sitoutumistasapainoa vaikka aikaa oli kulunut lähes kaksi tuntia.
Entsyymipitoisuuden kasvaessa 0,1 pM:sta ylöspäin, tasapainon syntyyn kuluva aika
