5 TULOKSET JA TULOSTEN TARKASTELU
5.7 Lakkaaseilla käsiteltyjen MWL-ja LB-selluloosapintojen AFM-kuvaus
5.7.2 AFM-kuvat LB-selluloosapinnoista
M. albomyces-XakkdLasxWa. käsiteltyjä LB-selluloosapintoja kuvattiin AFM:llä. Refe- renssipintana MaL-entsyymillä käsitellyille pinnoille käytettiin natrium- asetaattipuskuriliuoksella turvotettua LB-selluloosapintaa (Kuva 42 a). M. albomyces lakkaasin oli annettu sitoutua 250 min ajan LB-selluloosapintaan. Tämän jälkeen pin
taa oli huuhdeltu natrium-asetaattipuskuriliuoksella noin 2 tuntia. Referenssipinnan nähdään olevan kohtuullisen tasainen (Kuva 42 a). Pinnan keskimääräinen karheus (Rq) turvotetussa LB-selluloosapinnassa on 0,592 nm. Entsyymipitoisuudella 1 pM käsiteltyyn LB-selluloosapintaan nähdään syntyneen kuoppia verrattuna referenssi- pintaan (Kuva 42b). Tämä näkyy myös pinnan keskimääräisessä karheudessa, joka on 1,51 nm. Nanoscope-ohjelman avulla teräväreunaisten kuoppien halkaisijan havaittiin olevan välillä 140 - 200 nm ja syvyydeltään noin 2 - 5 nm (Kuva 43). Entsyymipitoi
suuden kasvattaminen tästä viisinkertaiseksi muuttaa pintaa kukkulaisemmaksi (Kuva 42 c). Pinnasta ovat teräväreunaiset kuopat hävinneet, joita näkyi 1 pM kuvassa. Pin
nassa näkyy kuitenkin kuoppia, joiden syvyydeksi nanoscope-ohjelman avulla havait
tiin 2-5 nm. Pinnankeskimääräinen karheus (Rq) entsyymipitoisuudella 5 pM on 1,46 pm.
Kuva 42. AFM-kuvat M. albomyces lakkaasin käsittelemistä LB-selluloosapinnoista ja näiden referenssipinnasta. Pinnoista on kuvattu korkeus- (vasen) ja vaihesiirtymäkuva (oikea), (a) refe
renssi LB-selluloosapinta. (b) entsyymipitoisuudella 1 pM käsitelty pinta, (c) entsyymipitoisuu
della 5 pM käsitelty pinta.
50 100 150 200 250 300 350 400 nm
Kuva 43. Syvyysprofiili M. albomyces lakkaasin aiheuttamasta kuopasta LB-selluloosapinnalla.
Entsyymipitoisuus 1 pM. Kuvassa pystyviivoilla on rajattu kuopan reunat.
MaL käsitellyistä LB-selluloosapinnoista otettiin myös 1 pm resoluutiolla kuvat. Ku
vissa havaitaan MaL:n pitoisuudella 5 pM muodostuvan merkittäviä uria pintaan (Kuva 44) verrattuna referenssipintaan. QCM-D kokeissa samasta pinnasta nähtiin, että MaL:n sitouduttua LB-selluloosapintaan, sitoutunut massa alkoi laskea (Kuva 35) ja pinta muuttui pehmeämmäksi (Kuva 36).
Kuva 44. AFM-kuva M. albomyces lakkaasilla käsitellystä LB-selluloosapinnasta. Entsyymin- konsentraatio oli kuvissa (a) 1 pM ja (b) 5 pM. Pinta oli sitoutumisen jälkeen huuhdeltu puskuri- liuoksella.
M. albomyces lakkaasilla käsitellyistä pinnoista muodostettiin 3d-mallit. Näille refe
renssikuvana toimii turvotetusta LB-selluloosapinnasta tehty 3d-malli (Kuva 45).
Kuva 45. 3d-malli turvotetusta LB-selluloosapinnasta. Kuvassa näkyvä horisontaalinen uraisuus johtuu AFM-laitteen toiminnasta. Kuvan resoluutio on 1 pm.
M. albomyces-\akkü.dLÚn entsyymipitoisuudella 1 pM havaitaan pintaan ilmestyvän suurempia kukkuloita (Kuva 46 a) kuin referenssipinnassa. Lisäksi pintaan on tullut suurempia kuoppia kuin referenssipinnassa. Entsyymipitoisuuden kasvaessa tästä 5 pM:een, havaitaan kukkuloiden suurentuneen ja lisäksi kukkuloiden määrä on kasva
nut (Kuva 46 b).
a b
T. hirsuta lakkaasilla käsiteltyä LB-selluloosapintaan kuvattiin AFM:llä (Kuva 47).
Entsyymin pitoisuus käsittelyssä oli 1 pM ja käsittelyaika 5 tuntia. Pintaa ei huuhdel
tu käsittelyn lopuksi puhtaaksi. Pintaan havaitaan muodostuneen tulivuoren muotoisia rakenteita, joita pinnassa on runsaasti. Kraattereiden halkaisijoiksi saadaan Nanosco- pe ohjelman avulla 200 - 300 nm ja korkeudeksi noin 3 nm (Kuva 48).
Kuva 47. AFM-kuva T. hirsuta lakkaasilla käsitellystä LB-selluloosapinnasta. Entsyymikonsent- raatio oli 1цМ.
T. /u'rswtø-lakkaasilla käsitellyissä LB-selluloosapinnoissa näkyi AFM-kuvissa tuli
vuoren muotoisia muodostelmia. Pinta näyttää kuitenkin merkittävästi vastaavalta kuin referenssi LB-selluloosapinta. AFM-kuvan taustan vähäisiä muutoksia tukevat QCM-D tulokset, joissa ThL:n havaittiin sitoutuvan hitaasti LB-selluloosapintaan (Kuva 37) ilman merkittäviä muutoksia pinnassa. Nanoscope-ohjelman avulla muo
dostetuista tulivuoren korkeusprofiileista havaitaan (Kuva 48), ettei vuoren keskireikä ulotu LB-selluloosapinnan alle.
Kuva 48. Syvyysprofiili Trámeles hirsuta lakkaasin aiheuttamasta muodostelmasta LB- selluloosapinnalla. Kuvassa pystyviivoilla on rajattu tulivuoren muotoisten muodostelmien reu
nat.
6 YHTEENVETO
Tämän diplomityön kokeellisen osan aikana havaittiin QCM-D tekniikan soveltuvak
si entsyymien sitoutumistutkimukseen hyvin. Kuitenkin on huomioitava mallipintojen valmistamisesta johtuvat rajoitteet. QCM-D tekniikan erotuskyky havaita hyvin pie
niä sitoutuneita massoja on korkea. Lisäksi pinnan dissipaation muutoksen avulla saadaan tietoa entsyymin sitoutumiskonformaatiosta ja pinnassa tapahtuvista muutok
sista.
Työssä muodostettiin sitoutumisisotermit Cel7A ja Cel7B sellulaaseille. Isotermeihin sovitettiin Langmuirin laajennetut sitoutumismalli, joiden avulla pystyttiin arvioi
maan kummankin sellulaasin maksimisitoutumismääriä LB-selluloosapintaan. Cel7A sellulaasin havaittiin odotetusti hydrolysoivan amorfista LB-selluloosapintaa ja irtoa
van pinnasta huuhdeltaessa. Cel7B sellulaasin havaittiin hydrolysoidessaan aiheutta
van selluloosapinnan turpoamista. Cel7A sellulaasin mittausten yhteydessä tutkittiin
käytön inhibiittorina QCM-D tutkimuksessa estää sellobioosin sitoutuminen LB- selluloosapintaan.
M. albomyces lakkaasin havaittiin sitoutuvan MWL-ligniini- ja LB- selluloosapinnalle. Sitoutumisen MWL-pinnalle havaittiin olevan pysyvää, eikä ent
syymiä pystytty irrottamaan puskuriliuoshuuhtelulla. Huuhdeltaessa sitoutunutta ent
syymiä puskuriliuoksella, havaittiin pinnan dissipaation kasvavan tasaisesti. Tälle il
miölle ei löydetty selitystä. M. albomyces lakkaasin havaittiin sitoutuvan myös LB- selluloosapinnalle. Kokeissa havaittiin lakkaasin muokkaavan LB-selluloosapintaa ja QCM-D kiteen pinnasta otettiin AFM-kuva. Kuvissa havaittiin pinnan muuttuvan entsyym i käsittel yssä merkittävästi.
T. hirsuta lakkaasin havaittiin sitoutuvan amorfiselle LB-selluloosapinnalle ja MWL- pinnalle. Sitoutumisen havaittiin olevan kummallekin pinnalle hyvin hidasta. Käsi
tellystä LB-selluloosapinnasta otettiin AFM-kuva, josta havaittiin pintaan syntyvän symmetrisiä tulivuoren muotoisia muodostelmia.
7 JATKOTUTKIMUSEHDOTUKSIA
Tämän diplomityön aikana nousi esiin monia kiinnostavia asioita liittyen entsyymei
hin, pintoihin ja QCM-D laitteeseen, joita ei pystytty tämän työn rajoissa selvittä
mään. Näistä osan olen esittänyt seuraavassa listassa.
• QCD-laitteelle voitaisiin tehdä nesteen viskositeetin muutoksesta johtuva korjauskerrointaulukko.
• Sellulaasien sitoutumisisotermien määritys voitaisiin tehdä käyttäen mutant- tientsyymejä. Mutanteissa entsyymin aktiivisuus hydrolysoida selluloosaa on estetty.
• M. albomyces lakkaasin sitoutumisen ligniini- ja sellulaasipinnalle aiheutta
vien vuorovaikutusten selvitystä tulee jatkaa. Näistä esimerkiksi QCM-D:n sähkökemiallisella kennolla voitaisiin mahdollisesti tutkia sähköisiä vuoro
vaikutuksia entsyymin ja pinnan välillä.
• AFM-kuvissa näkyvien ilmiöiden tutkimusta tulisi jatkaa. Esimerkiksi sellu
loosa ei ole lakkaasien substraatti. Kuitenkin kokeissa nähtiin M. albomyces lakkaasin tekevän jotain selluloosapiinalle.
LÄHDELUETTELO
1. Josefsson, P. Biochemical modification of wood components. Lisensiaattityö.
KTH, the royal institute of technology. Fibre and polymer technology.
Stocholm 2006. s. 54
2. Linder, M. & Teeri, T. The cellulose-binding domain of the major cellobiohy- drolase of Trichoderma reesei exhibits true reversibility and a high exchange rate on crystalline cellulose. Biochem. 93(1996). s. 12251 - 12255.
3. Rabinovich, M. L., Melnick, M. S. & Bolobova, A. V. The structure and me
chanism of action of cellulolytic enzymes. Biochem. Moscow. 67(2002)8. s.
850-871.
4. Henrissat, B. Cellulases and their interaction with cellulose. Cellulose.
1(1994)3. s. 169- 196.
5. Palonen, H. Role of lignin in the enzymatic hydrolysis of lignocellulose. VTT publications 520. Espoo 2004. 80 s.
6. Palonen, H., Tenkanen, M. & Linder, M. Dynamic interaction of Trichoderma reesei cellobiohydrolases Cel6A and Cel7A and cellulose at equilibrium and during hydrolysis. App. Env. Microbial. 65(1999)12. s. 5229 - 5233.
7. Kyriacon, A. & Neufeld, R. J. Effect of physical parameters on the adsorption characteristics of fractionated Trichoderma reesei cellulose components. En
zyme Microb. Technol. 10(1988). s. 675 - 681.
8. Baker, J. O., Tatsumoto, K., Grohmann, K., Woodward, J., Wiehert, J. M., Shoemaker, S. P. & Himmel, M. E. Thermal dénaturation of trichoderma reesei cellulases studied by differential scanning calorimetry and tryptophan fluerescence. App. Biochem. Biotech. 34/35(1992). s. 217 - 231.
9. Carrard, G. & Linder, M. Widely different off rates of two closely related cel
lulose-binding domains from Trichoderma reesei. Eur. J. Biochem.
262(1999). s. 637-643.
10. Palonen, H., Tjemeld, F., Zacchi, G. & Tenkanen, M. Adsorption of Tricho- derma reesei CBHI and EGII and their catalytic domains on steam pretreated softwood and isolated lignin. J. Biotechnol. 107(2004). s. 65-72.
11. Gruño, M., Väljämäe, P., Pettersson, G. & Johansson, G. Inhibition of the Trichoderma reesei cellulases by cellobiose is strongly dependent on the na
ture of the substrate. Biotechnology and bioengineering. 86(2004)5. s. 503 - 511.
12 . Solomon, E. I., Sundaram, U, M. & Machonkin, T. E. Multicopper oxidases and oxygenases. Chem. Rev. 96(1996). s. 2563 - 2605.
13. Kiiskinen, L.-L. Characterization and heterologous production of a novel lac
ease from Melanocarpus albomyces. Väitöskirja. VTT biokemia. Espoo 2004.
94 s. + liitteet 42 s.
14 . Couto, S. R. & Herrera, J. L. T. Industrial and biotechnological applications of laceases: A review. Biotechnol. Adv. 24(2006). s. 500 - 513.
15. Alcalde, M. Laceases: biological functions, molecular structure and industrial applications. Industrial enzymes. Toim. J. Polaina & A. P. MacCabe. Julk.
Springer. Dordrect 2007. s. 461 -476.
16. Thurston, C. F. The structure and function of fungal laceases. Microbiol.
140(1994). s. 19-26.
17. Durán, N., Rosa, M. A., D'Annibale, A. & Gian freda, L. Applications of lac
eases and tyrosinases (phenoloxidases) immobilized on different supports: a review. Enz. and microb. tech. 31(2002). s. 907 - 931.
18. Kiiskinen, L.-L., Palonen, H., Linder, M., Viikari, L. & Kruus, K.. Lacease from Melanocarpus albomyces binds effectively to cellulose. FEBS Letters.
576(2004). s. 251 -255.
19. Konttori, E., Tammelin, T. & Österberg, M. Cellulose-model films and the fundamental approach. Chem. Soc. Rev. 35(2006). s. 1287 - 1304.
20. Pääkkö, M., Ankerfors, M., Kosonen, H., Nykänen, A., Ahola, S., Österberg,
Enzymatic hydrolysis combined with mechanical shearing and high-pressure homogenization for nanoscale cellulose fibrils and strong gels. Biomac romol. 8(2007) s. 1934- 1941.
21. Edgar, C. D. & Gray, D. G. Smooth model cellulose I surfaces from nanocrys
tal suspensions. Cellulose. 10(2003). s. 299 - 306.
22. Fleming, K., Gray, D. G. & Matthews, S. Cellulose crystallites. Chem. Eur. J.
7(2001)9. s. 1831 - 1835.
23. Kontturi, E., Thiine, P. C., Alexeev, A. & Niemantsverdriet, J. W. Introduc
ing open films of nanosized cellulose — atomic force microscopy and quantifi
cation of morphology. Polymer. 46(2005). s. 3307 - 3317.
24. Kontturi, E., Thiine, P. C. & Niematsverdriet, J. W. (Hans). Trimethylsilylcel- lulose/Polystyrene blends as a means to construct cellulose domains on cellu
lose. Macromolecules. 38(2005). s. 10712 - 10720.
25. Rowell, R. M., Pettersen, R. Han., James, S. R., Jeffrey S. & Tshabalala. M.
A. Cell wall chemistry. Handbook of wood chemistry and wood composites.
Toim. Roger M. Rowell. Julk. Boca Raton. Fla: CRC press 2005. s. 43 - 45.
26. Sjöström, E. Puukemia. Kolmas painos. Otakustantamo. Espoo 1977. s. 446.
27. Norgren, M., Notley, S. M., Majtnerova, A. & Gellerstedt, G. Smooth model surface from lignin derivatives. I. Preparation and characterization. Langmuir.
22(2006). s. 1209- 1214.
28. Tammelin, T., Österberg, M., Johansson, L.-S. & Laine, J. Preparation of lig
nin and extractive model surfaces by using spincoating technique - Applica
tion for QCM-D studies. Nord. Pulp Pap. Res. J. 21(2006)4. s. 444 - 450.
29. Tammelin, T. Surface interactions in TMP process waters. Väitöskirja. Tek
nillinen korkeakoulu. Puunjalostustekniikka. Puunjalostuksen kemian labora
torio 2006. s. 82.
30. Bornside, D. E., Brown, R. A., Ackmann, P. W., Frank, J. R. F., Tryba, A. A.
& Geyling, F. T. J. The effect of gas phase convection on mass transfer in spin coating. J. Appi. Phys. 73(1993)2. s. 585 - 600.
31. Konttori, E., Johansson, L.-S. Konttori, K. S., Ahonen, P., Thiine. P. C. &
Laine, J. Cellulose nanocrystal submonolayers by spincoating. Langmuir.
23(2007) s. 9674-9680.
32. Langmuir, I. The constitution and fundamental properties of solids and liq
uids. II Liquids. J. Am. Chem. Soc. 39(1917)9. s. 1848 - 1906.
33. Blodgett, K. B. Films built by depositing successive monomolecular layers on a solid surface. J. Am. Chem. Soc. 57(1935)6. s. 1007- 1022.
34. Barnes, G. & Gentle, I. Interfacial science, an introduction. Oxford university press. Oxford New York 2005. 264 s.
35. Höök, F. Development of a novel QCM technique for protein adsorption stud
ies. Chalmers university of technology. Deparment of applied physics.
Chalmers 1997. s. 102.
36. Q-Sense AB. Q-Sense company kotisivu [online], [viitattu 30.01.2008]. Q- sence sensors. Saatavissa http://www.q-sense.com/q_sense_sensors-27.asp.
37. Marx. K. A. Quartz crystal microbalance: a useful tool for studying thin polymer films and complex biomolecular systems at the solution-surface in
terface (Review). Biomacromolecules. 4(2003)5. s. 1009 -1120.
38. Nomura, T. & Hattori, O. Determination of micromolar concentrations of cyanide in solution with a piezoelectric detector. Analytica chimica acta.
(1980)115. s. 323-326.
39. Hodges, C., Harbottle, D. & Biggs, S. Investigating adsorbing viscous fluids with a quartz crystal microbalance. Q-sense user meeting. Heidelberg. 25 - 26 lokakuu 2006. University of Leeds. School of process, enviromental & mate
rial engineering 2006.
40. Medve, J., Karlsson, J., Lee, D. ja Tjerneld, F. Hydrolysis of microcrystalline cellulose by cellobiohydrolase I and endoglucanase II from Trichoderma reesei: Adsorption, sugar production pattern, and synergism of the enzymes.
Biotech, bioeng. 59(1998)5. s. 621 -634.
41. Scallan, A. M. & Caries, I. E. The correlation of the water retention value with the fibre saturation point. Svensk Papperstidn. 75(1972). s. 699 - 703.
42. Haselton, W. R. Gas adsorption by wood, pulp, and paper. I. The low- temperature adsorption of nitrogen, butane and carbon dioxide by sprucewood and its components. Tappi J. 37(1954). s. 404 - 412.
43. Keller, J. U. & Staudt, R. Gas adsorption equilibria: Experimental methods and adsorption isotherms. Springer. New York 2005. 422 s.
44. Tammelin, T., Saarinen, T., Österberg, M. & Laine, J. Preparation of Lang- muir/Blodgett-cellulose surfaces by using horizontal dipping procedure. Ap
plication for polyelectrolyte adsorption studies performed with QCM-D. Cel
lulose. 13(2006). s. 519-535.