Mikro- ja nanomuovien vaikutus rasvaliukoisten haitta-aineiden käyttäytymiseen makean veden ympäristössä

MIKRO- JA NANOMUOVIEN VAIKUTUS RASVALIUKOISTEN HAITTA-AINEIDEN KÄYTTÄYTYMISEEN MAKEAN VEDEN

YMPÄRISTÖSSÄ

DANIEL ROTKO

Pro gradu –tutkielma Itä-Suomen yliopisto Ympäristö- ja biotieteiden laitos

ITÄ - SUOMEN YLIOPISTO Ympäristö- ja biotieteiden laitos

ROTKO, DANIEL: Mikro- ja nanomuovien vaikutus rasvaliukoisten haitta-aineiden käyttäytymiseen makean veden ympäristössä.

Pro gradu -tutkielma, 41 s., liitteitä 2 Huhtikuu 2016

--- Mikro- ja nanomuovit ovat nousseet yhä huolestuttavammaksi ympäristöongelmaksi, ja niiden tutkimuksessa on yhä suuria puutteita. Muovien määrä luonnossa kasvaa jatkuvalla tahdilla, ja niiden tiedetään tukehduttavan eläimiä. Niiden tiedetään myös päätyvän eliöiden ruuansulatuselimistöön.

Muovien on myös epäilty toimivan vektoreina rasvaliukoisille haitta-aineille. Tässä tutkimuksessa tutkittiin mikro- ja nanomuovien vaikutusta rasvaliukoisten haitta-aineiden kertymiseen vesikirpulla (Daphnia magna). Tutkittavat haitta-aineet olivat polykloorattu bifenyyli 153 ja bentso(a)pyreeni 7,10 ja käytetty muovi oli polystyreeni (10, 1 ja 0,05 µm hiukkaskoot), joilla vesikirppuja altistettiin 48 tunnin ajan. Tutkimuksessa käytettiin keinotekoisen makean veden lisäksi myös humusainetta.

Kymmenen µm hiukkaskoolla ei ollut merkitystä kemikaalien kertymiseen osalta. Yhden µm ja 0,05 µm hiukkaset vaikuttivat kemikaalien kertymiseen. PCB:n osalta 1 µm hiukkasten läsnäolo lisäsi kemikaalien kertymää eliössä (P<0,01), kun taas BaP:llä merkittävää eroa ei ollut. Molempien kemikaalien osalta eroja löytyi 0,05 µm hiukkasten kanssa. Keinotekoisessa makeassa vedessä kemikaalien kertymä oli huomattavasti suurempi molemmissa kemikaalikäsittelyissä 0,05 µm hiukkaskoolla (P<0,05). Humusveden osalta tulokset olivat päinvastaiset, ja kemikaalikuorma vesikirpussa oli huomattavasti pienempi muovikäsittelyssä kontrolliin nähden. On siis epäiltävä, että mikro- ja nanomuoveilla on kyky toimia vektoreina haitta-aineille. Ne voivat lisätä haitta-aineiden kertymää eliöihin, ja lisätä niiden saatavuutta ravintoketjussa. Humuksella voi taas olla suojaava vaikutus nanomuovien osalta.

UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND

Department of Environmental and Biological Sciences

ROTKO, DANIEL: Effect of micro- and nanoplastics on lipid soluble pollutants behavior in fresh water environment.

MSc. Thesis, 41 pp., Appendices 2 April 2016

--- Micro- and nanoplastics have arisen as increasingly worrying environmental problem. The abundance of plastics in nature is increasing rapidly. It is also known that plastics can suffocate animals and they can accumulate in animals digestive systems. Research on micro- and nanoplastics is also lacking. In this research micro- and nanoplastics and their effect on the behaviour of lipid soluble substances was studied with D. magna. Micro- and nanoplastics have been suspected of working as vectors for lipid soluble pollutants. The substances studied were polychlorinated biphenyl 153 and benzo(a)pyrene 7,10 and the used plastic was polystyrene (10, 1 and 0,05 µm particle sizes). These were used to expose D. magna for 48 hours. In addition to artificial water, humic water was also used. There was no significant differences with 10 µm plastic treatments. 1 and 0,05 µm plastic treatments had greater differences compared to controls. PCB treatment with 1 µm plastic particles resulted into increased chemical exposure (P<0,01), when in contrast BaP had no such significant effect. Both used chemicals had an effect on 0,05 µm treatments (P<0,05). The amount of chemical exposure in D.

magna was increased greatly in artificial water treatment with plastics. In humic water this effect was reversed as the amount of accumulated chemical was significantly lower than in the control. It should be suspected that micro- and nanoplastics can work as vectors for pollutants. They can increase accumulation of pollutants and increase their availability. Humic water might protect from this effect with nanoplastics.

Sisällysluettelo

1. JOHDANTO ... 2

2. TUTKIMUKSEN TAVOITTEET JA HYPOTEESIT ... 4

3. AINEISTO JA MENETELMÄT... 4

3.1 Mikromuovit ... 4

3.2 Ympäristömyrkyt ... 4

3.3 Koe-eläin ... 6

3.4 Keinotekoinen makea vesi ja humusvesi ... 7

3.5 Esikokeet ... 8

3.6 Kertymiskoe muovipartikkeleilla ... 9

4. TULOKSET ... 10

4.1 Esikokeet ... 11

4.2 Kertymiskokeet ... 16

4.2.1 Vesinäytteet ... 16

4.2.2 PCB –yhdisteiden kertyminen eliöihin ... 21

4.2.3 BaP –yhdisteiden kertyminen eliöihin ... 25

5. TULOSTEN TARKASTELU ... 30

5.1 Polyklooratut Bifenyylit ... 30

5.2 Bentso(a)pyreeni ... 31

6. JOHTOPÄÄTÖKSET ... 32

7. KIITOKSET ... 33

LÄHDELUETTELO ... 33

LIITTEET ... 36

2 1. JOHDANTO

Muovit ovat tärkeä osa modernia yhteiskuntaa. Muovit ja niiden tuotanto työllistävät suoraan 1,45 miljoonaa ihmistä pelkästään Euroopassa. Euroopan muoviteollisuuden liikevaihto oli vuonna 2013 320 miljardia euroa. Vuonna 2013 muovin tuotanto maailmassa oli 299 miljoonaa tonnia. Muovia käytetään moniin tarkoituksiin, joista suurin yksittäinen tekijä Euroopassa on pakkausmateriaalit (39.6 %). Muovien eri tyyppejä on monia ja niiden käyttökohteet vaihtelevat muovipulloista ja jääkaappien laatikoista teflonpannujen pinnoitteisiin (PlasticsEurope 2014).

Ongelmaksi on koitunut muovin päätyminen luontoon, sillä 2012 vain 62 % Euroopan muovista (Euroopan Unioni, Norja ja Sveitsi) päätyi kierrätykseen, joten noin 20 miljoonaa tonnia vuodessa päätyy kaatopaikoille tai muualle ympäristöön (PlasticEurope 2014). Suuria määriä muovia ja mikrokokoon (<5 mm kokoa pidetään yleisesti raja-arvona) jauhautunutta muovia kertyykin meriin.

Muoveja on löydetty vesistöjen selkärangattomista sekä isoista nisäkkäistä, mikä viittaa eliöiden syövän muovia ja muovin siirtyvän pelagisessa ravintoketjussa eteenpäin (Wright ym. 2013).

Muovit voivat hajota monesta eri syystä pienemmäksi partikkeliksi. Auringon uv – valo ja mekaaninen hajotus hajottavat muoveja. Mikromuoveja syntyy esimerkiksi säistä riippuvaisen hajoamisen ja yleisen kulumisen kautta rantaolosuhteissa (Andrady 2011). Mikrokoon muoveja voi päätyä ympäristöön myös suoraan kaupallisista tuotteista kuten meikeistä (Browne ym. 2007).

Mikromuovit voidaan jakaa kahteen ryhmään, jotka ovat primääriset ja sekundääriset mikromuovit.

Primäärisillä mikromuoveilla tarkoitetaan suoraan tuotteista tulleita muoveja, kuten meikeissä olevia mikromuovipartikkeleita. Sekundäärisillä mikromuoveilla tarkoitetaan luonnossa isompien muovien hajoamisen seurauksena syntyneitä mikromuoveja (Cole ym. 2011).

Rockman ym. (2015) tutkivat ihmisten ravintoketjuun kuuluvia kaloja ja sitä, että löytyisikö niistä mikromuoveja tai niiden jäänteitä. Tutkimuksissa selvisi, että sekä USA:n ja Intian markkinoilla olleista ravinnoksi tarkoitetuista kaloista löytyi mikromuoveja sekä muita ihmisen toiminnasta syntyneitä roskia. Tämän lisäksi mikromuoveja on löydetty myös eläinplanktonista esimerkiksi Portugalin rannikkovesistä, joissa otetuista näytteistä jopa 60 %:sta eliöistä löytyi mikromuoveja (Frias ym 2014). Isojen muovipartikkelien aiheuttamat haitat ovat tuttuja yleisesti, mutta mikromuovit ovat varsin uusi tutkimusaihe, ja joidenkin mielestä jopa huomattavasti suurempi vaara kuin suuret muovit (The Independent 2014).

Tutkimuksissa on näytetty, että mikromuovit eivät välttämättä kerry kaikkiin pohjasedimenttien selkärangattomiin kuten hietamatoon (Arenocala marina). Tämän takia linnuille ehdotettu

3

ruuansulatuselimistön tukkeutuminen ei näyttäisi olevan mahdollista A. marina:lle. Ympäristömyrkyt voivat kuitenkin siirtyä muoveista niitä syöneisiin yksilöihin. Mikromuovien tiedetään sitovan pysyviä orgaanisia yhdisteitä (POP), ja muovit voivatkin toimia vektoreina ympäristömyrkkyjen tehostuneelle siirtymiselle ympäristöstä eliöihin. Tämän lisäksi A. marina:n pedot voivat myös altistua mikromuoveille syödessään muoveja syöneitä yksilöitä (Besseling ym 2012).

Pysyvät orgaaniset yhdisteet voivat siis altistaa koko ravintoketjun uudelle POP-saastumisreitille (Andrady 2011). Esimerkiksi Velzeboer ym. (2014) havaitsivat polykloorattujen bifenyylien (PCB) sitoutuvan voimakkaasti 70 nm polystyreenihiukkasiin. Tämä mahdollistaisi normaalia suuremman ympäristömyrkkykuorman, mikäli eliö syö nanomuoveja. Bakir ym. (2014) havaitsivat omissa tutkimuksissaan simuloidun merinisäkkään vatsan irrottavan tehokkaasti ympäristömyrkkyjä mikromuoveista, joka mahdollistaisi tehokkaan siirtymisen muoveista eliöön.

Vaikka merien muovisaasteita onkin tutkittu, makean veden tutkimukset ovat jääneet vähäisiksi, tai ovat täysin olemattomia. Wagner ym. (2014) mukaan nämä asiat vaatisivat huomattavia lisätutkimuksia sisältäen mm. seuraavat asiat:

1. Mikromuovien valvonta makeassa vedessä. Nykyinen tieto makean veden mikromuovisaasteen määrästä perustuu yksittäisiin tutkimuksiin, ja kokonaisvaltainen käsitys makean veden mikromuovisaasteesta tulisi saavuttaa.

2. Mikromuovisaasteen lähteiden ja kohtalon selvitys makeassa vedessä. Saasteiden kohtalon selvittämiseksi niiden sisävesilähteet ja muovin hajoamisen nopeus sisävesissä tulisi selvittää.

3. Mikromuovien saatavuus ja altistuminen makean veden eliöille tulisi selvittää. On osoitettu, että merieliöt kykenevät syömään mikromuovia, joten voidaan olettaa, että myös makeanveden eliöt voivat altistua muoville. Tästä ei toistaiseksi kuitenkaan ole kunnollista näyttöä. On tärkeää myös selvittää mitkä asiat vaikuttavat muovien syömiseen (koko, materiaali ja muoto), ja mikä niiden lopullinen kohtalo on.

4. Mikromuoville altistumisen vaikutus. Altistumisen vaikutukset pitää selvittää, jotta voidaan tehdä realistisia riskinarvioita.

5. Mikromuovien ja toisten makean veden saasteiden välisen vuorovaikutuksen ymmärtäminen.

Merissä tapahtuvan saasteiden muoveihin siirtymistä ei voi verrata makeaan veteen eri pitoisuuksien ja olosuhteiden takia.

6. Uudenlaisen viitekehyksen kehittäminen makean veden riskinarviota varten. Mikromuovit ovat uusi huolenaihe, ja ne voivat toimia vektoreina saasteille ja tulokaslajeille. Tämän huomioimiseksi klassinen riskinarvioinnin viitekehys pitää sovittaa nykytilanteeseen.

4 2. TUTKIMUKSEN TAVOITTEET JA HYPOTEESIT

Tässä Pro gradu tutkielmassa oli tavoitteena tutkia mikromuovien käyttäytymistä makeassa vedessä, ja mikro- ja nanomuovien vaikutusta ympäristömyrkkyjen kertymiseen, näin ollen sivuten edellisessä kappaleessa mainittua viidettä selvittämätöntä ongelmaa.

Tutkimuskysymyksinä olivat:

1) Vaikuttavatko muovipartikkelit kemikaalien kertymiseen koe-eliöön?

2) Onko muovipartikkelien koolla merkitystä koe-eliöön kertymisessä?

3) Vaikuttaako vesihumus kemikaalien kertymiseen muovipartikkelien läsnä ollessa?

Tutkimushypoteesina on, että mikro- ja nanomuovit voivat lisätä ympäristömyrkkyjen kertymää eliöissä.

3. AINEISTO JA MENETELMÄT

3.1 Mikromuovit

Kokeissa käytettiin Polysciences, Inc. (Warrington, USA) tuottamia mikro- ja nanomuovipartikkeleita. Kokeiden muovien koot valittiin Daphnia magna –vesikirpun tunnetun siivilöintikoon mukaan, joka on noin 1- 50 µm välillä riippuen yksilön koosta, vaikka myös 70 µm kokoisia partikkeleita on löydetty isojen yksilöiden sisältä (Ebert 2005). Kokeissa käytetyt muovikoot valittiin näillä esitiedoilla, ja valitut koot olivat 0,05 µm (tuotekoodi 08691), 1 µm (tuotekoodi 07310) ja 10 µm (tuotekoodi 17136).

Muovien määrä suspensiossa määräytyi alustavien tutkimusten mukaan, joissa todettiin soveltuvan pitoisuuden olevan 2 µl/l, ja tämä pitoisuus valittiin itse pääkokeeseen sekä humus että keinotekoista makeaa vettä varten. Kokeissa tehtiin 2 litran suspensioita yhtä käsittelyä varten.

Suspensiot tehtiin lisäämällä muovi keinotekoiseen makeaan veteen tai humusveteen. Yhdessä muovikäsittelyssä oli siten 160 µl mikromuovisuspensiota (4 µl/l muovia) koko 2 litran suspensiossa.

3.2 Ympäristömyrkyt

Käytetyt ympäristömyrkyt olivat hiili 14 -leimatut polykloorattu bifenyyli 153 (PCB, American Radiolabeled Chemicals Inc.) ja bentso(a)pyreeni 7,10 (BaP, GE Healthcare UK Limited).

Molempien kemikaalien liuottimena toimi etanoli.

5

PCB:n spesifinen aktiivisuus oli 12,6 mCi/mmol ja molekyylipaino 360,88 (g/mol). Log Kow (vesi-oktanoli jakautumiskerroin) on 7,75. PCB 153:n vesiliukoisuus on 0,038 mg/l. Sen haihtuvuus 20 ºC lämpötilassa on 2,5 x 10^-4 (Giesy & Kannan 2002). Käytetyn bentso(a)pyreenin spesifinen aktiivisuus oli 63 mCi/mmol ja molekyylipaino 254 (g/mol). BaP:n log Kow on 6,04, haihtuvuus 20 ºC lämpötilassa 5,0 x 10^-7 ja vesiliukoisuus on 0,0038 mg/l (Sims & Overcash 1983).

Molemmilla kemikaaleilla oli tavoiteltu määrä kemikaalia vedessä, johon pyrittiin suspensioiden spiikkauksessa. PCB 153 tavoiteltu suspension disintegrations per minute (DPM) -arvo kokeen alussa oli noin 250 DPM (n. 3,2 µg/l). BaP 7,10 tavoiteltu DPM arvo oli noin 600 DPM (n. 1 µg/l).

PCB:t ovat erittäin laajalti levinneitä kemikaaleja. Niitä löytyy ympäri maailmaa (Gustafsson ym.

2005, Tremolada ym. 1996) ja monista lajeista (Kannan ym. 1989). Lähtökohtaisesti PCB:t vaikuttavat laaja-alaisesti, ja niitä löytyy laajalti ympäristöstä (kuva 1). Ne leviävät myös päästöalueiltaan muille alueille, kuten vuoristoihin (Notarianni ym. 1998) PCB:iden tiedetään myös saastuttaneen vahvasti urbaaneja alueita, joilla niitä on tuotettu teollisesti (Turrio-Baldassarri ym.

2007). PCB:t ovat yhä yleisesti löydettävissä ihmiskehosta, vaikka niiden määrä esim. veriplasmassa onkin vähentynyt vuosikymmenien aikana (Schettgen ym. 2015). Mallinnukset ennustavat PCB:iden määrän vähenevän tulevien vuosikymmenien aikana merkittävästi. Tämä johtuu pääasiallisesti tuotannon kieltämisestä, eli primäärilähteiden loppumisesta. Tämä väheneminen olisi kuitenkin hitaampaa raskaammille versioille kuten PCB 153:lle (Lu ym. 2015). PCB:itä löytyy satoja erilaisia, ja niiden myrkyllisyyden mekanismit vaihtelevat. PCB:n 153 –kongeneeri on todettu olevan voimakkaasti karsinogeeninen (Strathmann ym. 2006).

6

Kuva 1. PCB 153:n mallinnettu jakautuminen Thames –joen valuma-alueella 2000 –luvulla (Lu ym.

2015).

BaP on myös erittäin laajalle levinnyt kemikaali. Tämän pääsyy löytyy sen syntymismekanismista, joka perustuu yleensä palamisreaktioihin. BaP:n vaikutukset on tunnettu jo pitkään 1700-luvulta.

Ennen se tunnettiinkin nuohoojien karsinoomana. Monet tutkimukset ovatkin havainneet BaP:n karsinogeenisuuden (mm. Sims & Overcash 1983). Tutkimuksissa on myös havaittu suora linkki BaP:n ja DNA:n vahinkojen välillä (Gao ym. 2011).

3.3 Koe-eläin

Koe-eläimenä käytettiin D. magna – vesikirppua, jota kasvatetaan Itä-Suomen yliopiston biologian laitoksen tiloissa. D. magna on kidusjalkaisiin (Branchiopoda) kuuluvien vesikirppujen (Cladocera) laji. D. magna on yksi suurikokoisimmista vesikirppulajeista. Vesikirppuihin kuuluu itsessään yli 100 tunnettua lajia, ja niitä löytää suurimmasta osasta seisovia vesistöjä kuumia lähteitä lukuun ottamatta.

Vesikirppujen ekologia tunnetaan myös kenties paremmin kuin minkään muun organismiryhmän (Ebert 2005).

Kokeissa käytettiin 1-2 viikon ikäisiä alkiottomia yksilöitä. Vesikirput ruokittiin ennen jokaista koetta, jotta ravinnonpuute ei olisi ongelma eliöille itse altistuksessa.

7 3.4 Keinotekoinen makea vesi ja humusvesi

Kokeissa käytettiin keinotekoista makeaa vettä (KTM). Keinotekoinen makea vesi tehtiin lisäämällä milliporeveteen (Milli-Q) magnesiumsulfaattiliuosta, natriumvetykarbonaattiliuosta, kalsiumkloridiliuosta ja kaliumkloridiliuosta. Keinotekoisen makean veden molaarisuus oli 2,5 mM magnesiumin ja kalsiumin osalta.

Magnesiumsulfaattiliuoksen (valmistaja Sigma-Aldrich) pitoisuus oli 30,8125 g/250 ml.

Natriumvetykarbonaattiliuoksen (valmistaja Riedel-de Haën) pitoisuus oli 16,19 g/250 ml.

Kalsiumkloridiliuoksen (valmistaja AnalaR NORMAPUR) pitoisuus oli 16,19 g/250 ml.

Kaliumkloridiliuoksen (valmistaja J. T. Baker) pitoisuus oli 1,4375 g/250 ml. Jokaista liuosta pipetoitiin 1 ml/l 2,5 mM saavuttamiseksi.

KTM- vedet tehtiin 10 –litran kokonaisuuksissa, joista jaettiin vedet yhteen kokeeseen. Koeveden pH tasattiin aina 7:ään ja sekoitus tapahtui magneettisekoittajalla.

Lopullisessa kokeeseen otettiin mukaan humus, eli vedessä usein esiintyvä eloperäinen aines.

Käytetty humus oli Svartberget fall/autumn humusta Norjasta. Tarkat kemialliset ominaisuudet ja tieto humuksen laadusta löytyvät artikkelista Vogt ym. (2003). Syy humuksen mukaan ottoon on sen poikkeukselliset ominaisuudet meriveteen verrattuna, ja sen kyky sitoa tehokkaasti eräitä ympäristömyrkkyjä kuten bentso[a]pyreeniä (BaP) (Akkanen ym. 2004).

Hyvänä puolena luonnollisen humuksen käyttämisessä, verrattuna teollisesti tuotettuun humukseen, on sen vertailukelpoisuus luonnonolosuhteiden kanssa. Haitzer ym. (1998) kannustivat varovaisuuteen teollisten humusten käytön kannalta, sillä niiden sisältämät humuksen osat (humic substances, HS) koostuvat jopa 100 % humusaineesta, kun taas luonnossa tämä määrä on yleensä vähäisempi.

Humusvedet tehtiin punnitsemalla ja sekoittamalla 0,265 g kuivahumusta neljään litraan KTM – veteen, lisäten tippa natriumhydroksidiä (NaOH) liukenemisen helpottamiseksi. Tiedossa oli, että kuivahumus on erittäin sähköistä, joten punnitus tehtiin sähkönpoistajan läpi. Tällä tavoin pyrittiin poistamaan humuksen sähköisyys ja mahdollinen häviö punnituksessa.

Humusveden pH tasattiin 7.0:aan suolahapolla (HCl), jonka jälkeen suspensiot jätettiin päiväksi sekoittumaan magneettisekoittajaan.

Seuraavana päivänä humusvedet suodatettiin ylimääräisen kiintoaineksen poistamiseksi vedestä.

Tämä tehtiin 0,45 µm suodattimella (Pall Corporation, tuotenumero 66068), joka vaihdettiin 300 ml välein suodattimien tukkeutumisen estämiseksi. Uusi suodatin huuhdeltiin 100 ml:llä milliporevettä suodattimesta irtoavien partikkelien poistamiseksi. Aikaisemmat kokemukset olivat osoittaneet

8

suodattimien lisäävän näytteiden TOC:in määrää suspensioissa. Milliporevedellä huuhtelu oli todettu poistavan tätä kontaminaatiota tehokkaasti. Vesistä otettiin näyte kokonaishiilen (total organic carbon, TOC) määrittämiseksi ennen ja jälkeen suodatuksen. Puhtaasta KTM – vedestä otettiin myös TOC – näyte kontrollipisteeksi. Humus- ja KTM - vedet jaettiin viimeisten TOC – näytteiden jälkeen kahteen erilliseen 2 litran Erlenmeyer – pulloon suspensioiden tekemiseksi.

3.5 Esikokeet

Mikromuovien käyttäytymistä tutkittiin aluksi peruskäyttäytymisen osalta taustatietojen kartuttamisen vuoksi. Ensimmäinen vaihe oli tutkia muovien käyttäytymistä keinotekoisessa makeassa vedessä, joka toteutettiin kuvantamalla vesinäytteitä läpäisyelektronimikroskoopilla (Transmission electron microscopy, TEM).

Muovipitoisuudeksi valittiin 2 mg/L. Pitoisuudet pyrittiin pitämään matalina, alle koe –eläinten akuutin toksisuusrajan. Näytteet tehtiin kolmeen 200 ml koeastiaan, joihin kuhunkin pipetoitiin 4 µl yhtä mikromuovityyppiä (160 µl mikromuovisuspensiota), jonka jälkeen ne jätettiin magneettisekoittimeen viikoksi. Pullot pidettiin sekoituksen ajan pimeässä foliolla peitettynä.

Viikon jälkeen suspensiosta tehtiin näytteet TEM:iä varten. TEM –hiloille tehty näytteiden pitoisuus laimennettiin kymmenesosaan alkuperäisestä. Edellisen kokeen ongelmien seurauksena koe uusittiin samalla tavalla, vaihtaen sekoittaja magneettisekoittajasta tasosekoittajaan.

Vesien analysoimisen jälkeen aloitettiin altistukset vesikirpuilla (D. magna), joita altistettiin kaikille kolmelle muovityypille. Tämä tehtiin mahdollisen kertymisen todentamiseksi ja muovien käyttäytymisen selvittämiseksi. Kokeessa käytettiin samaa suspensiota kuin edellisissä kokeissa (4 µl/200 ml), joka laimennettiin kymmenesosaan 20 ml tuikepulloihin KTM -vedellä.

Kokeen eläimet olivat kaksi viikkoa vanhasta populaatiosta, jotka eroteltiin edellisenä päivänä ja laitettiin puhtaaseen veteen suolen tyhjennystä varten. Seuraavana päivänä kirput siirrettiin tuikepulloihin, neljä kirppua per pullo, ja pullot jätettiin päiväksi pimeään.

Vuorokauden altistuksen jälkeen kirppuja analysoitiin optisilla kameroilla (Leica Microsystems).

Kirppujen liike ja heijastukset haittasivat kuvantamista, jolloin puolet kirpuista päätettiin valaa agariin. Toinen puoli näytteistä valmisteltiin TEM – analyysia varten.

Optisilla kameroilla tutkittiin myös kirppujen ja muovien fluoresointia, ja sen mahdollisuutta analytiikan toteuttamiseen. Muovien ja kirppujen havaittiin fluoresoivan, mutta näiden alustavien kokeiden aikana yritys löytää varmaa tapaa erotella muovien ja kirppujen fluoresointi epäonnistui.

Viimeisenä alustavana kokeena tehtiin edellisen kaltainen koe vastasyntyneillä kirpuilla. Kirput valettiin ksyleeni –depexi valokseen parempilaatuisten pysyvien näytteiden saamiseksi.

9 3.6 Kertymiskoe muovipartikkeleilla

Kertymiskokeen ideana on tutkia kemikaalin kertymistä ajan myötä eliöön tai ympäristöön. Koe suoritettiin kaikilla kolmella muovityypillä (0,05 µm, 1 µm ja 10 µm) ja neljällä näytteenottoajalla (6 h, 12 h, 24 h ja 48 h). Tämän lisäksi kokeeseen otettiin mukaan humus, jotta voitaisiin arvioida humuksen vaikutuksia muovin ja kemikaalin väliseen vuorovaikutukseen. Nollakontrollin (puhdas KTM) lisäksi KTM- ja humusvesi pelkällä kemikaalialtistuksella toimi vertailuna muovialtistuksille.

KTM jaettiin kolmeen osaan, kaksi 4 litran osaa humus- ja altistettua KTM-vettä varten ja loput nollakontrollia varten. Molemmista, KTM ja humusvedestä otettiin TOC –näyte (noin 15 ml).

Suodatetusta humusvedestä otettiin uusi TOC –näyte. Tämän lisäksi KTM ja humusvedet jaettiin vielä kahtia 2 litran astioihin lopullista koetta varten.

Suspensioiden ollessa valmiita niihin lisättiin hiili 14 leimattua PCB/etanoli tai BaP/etanoli liuosta. Spiikattujen suspensioiden annettiin sekoittua noin 15 minuuttia magneettisekoittimella, jonka jälkeen niistä otettiin kolme rinnakkaista 5 ml vesinäytettä todellisen hiili 14 leimatun kemikaalin mittaamiseksi tuikemittarilla (Wallac 1414 Win Spectral Liquid Scintillation Counter).

Jokaiseen pulloon lisättiin 5 ml tuikenestettä (Insta - Gel Plus, PerkinElmer Inc.), jonka jälkeen näytteiden annettiin hetken jähmettyä, ennen niiden mittaamista.

Kuvat 2A ja -B. Suspensioiden sekoituksen valmistelu. Kuvassa 2A yhden muovikoon käsittelyiden suspensiot valmiina, ja kuvassa 2B suspensiot on peitetty foliolla sekoituksen aikana.

Itse suspensioastioista poistettiin magneettisekoittajan magneetti, jotta se ei sitoisi itseensä muovipartikkeleita, altistuskemikaalia tai hajottaisi suurempia muovipartikkeleita. Suspensioastiat jaettiin käsittelyn mukaan: kaksi 2 litran astiaa pelkällä kemikaali -käsittelyllä (yksi humus ja yksi KTM) ja kaksi 2 litran astiaa kemikaalilla ja muovilla (yksi humus ja yksi KTM) (kuvat 2A).

Muovikäsittelyihin lisättiin 160 µl muovisuspensiota (2 µl/l muovia), jonka jälkeen kaikki astiat

10

suljettiin Bemis flexible packaging Parafilm ”M”:llä ja astiat myös peitettiin alumiinifoliolla (kuva 2B). Tämän jälkeen astiat laitettiin tasosekoittajalle viikoksi sekoittumaan 86 rpm.

Kuva 3. Valmistellut 120 ml koeastiat odottamassa suspensioita ja koe- eläimiä.

Viikon sekoituksen jälkeen jokaisesta käsittelystä otettiin 5 ml vesinäyte kemikaalipitoisuuden mittaamiseksi vedestä. Tämän jälkeen vedet jaettiin 120 ml koeastioihin (kuva 3), joihin jokaiseen laitettiin n. 100 ml vettä. Jokaista käsittelyä varten oli neljä eri aikajaksoa ja jokaisessa aikajaksossa oli neljä rinnakkaista, eli yhteensä 16 koeastiaa per käsittely, sekä yksi koeastia nollakontrollia varten.

Seuraavaksi lisättiin neljä vesikirppua jokaiseen koeastiaan. Aika, jolloin kirput laitettiin koeastioihin, kirjattiin ylös tarkan näytteenottoajan varmistamiseksi. Näytteenotot tehtiin kertakäyttöpipeteillä, joilla kirput otettiin pois vedestä pienen nestemäärän kanssa mikrova`alle siirtämistä varten. Tämän jälkeen kirput punnittiin ja asetettiin mittausastioihin. Astioihin lisättiin 10 ml tuikenestettä (Ultima Gold, PerkinElmer Inc.). Päivän jähmettymisen jälkeen näytteet laitettiin tuikemittariin.

Tutkimustulokset käsiteltiin GraphPad Prism ohjelmalla ja jokaisesta datamatriisista tehtiin yhdensuuntainen ANOVA-vertailu tilastollisesti merkittävien tulosten löytämiseksi. ANOVA:n kanssa tehtiin myös Tukey`s Multiple Comparison Test –Post testinä käsittelyiden välisten erojen vertailemiseksi.

Molemmille kemikaaleille laskettiin myös biokertymiskertoimet (bioconcentration factor: BCF), joiden avulla tehtiin kuvaajat vesikäsittelyiden mukaan. BCF:t laskettiin jakamalla kineettinen (first order kinetics) kertymisvakio (ku) eliminaatiovakiolla (ke).

4. TULOKSET

11

Tuloksissa kiinnitettiin huomiota kemikaalikertymän trendiin, mutta myös 48 tunnin, eli kokeen lopetuksen kemikaalikertymä eliöissä oli kiinnostuksen kohde. Tämän seurauksena 48 tunnin altistuspitoisuudet löytyvät eriteltyinä kohteina tuloksista.

Kaikille käsittelyille tehtiin myös ensimmäisen asteen kinetiikka –analyysi. Tämä tehtiin kinetiikan selvittämiseksi, mutta myös biokonsentraatio –arvojen (miten tehokkaasti aine kertyy eliöön) selvittämiseksi. Kuvien määrän takia kaikkia kinetiikkataulukkoja ei lisätty itse tuloksiin, vaan vain pieni osa lisättiin esimerkeiksi. Kaikki kinetiikkataulukot löytyvät liitteistä numero 2.

Tulosten kuvien lyhenteet ovat seuraavat: KTM (keinotekoinen makea vesi), humus (humusvesi), M (muovikäsittely), 48 h (48 tunnin eläinnäytteet). Humusvesien TOC oli suodatuksen jälkeen 10.50 +/- 0,50 mg/l.

4.1 Esikokeet

Esikokeissa ensimmäiseksi kuvattiin mikromuovipartikkeleita ja niiden käyttäytymistä vedessä.

Kuvat otettiin läpäisyelektronimikroskooppi TEM –kameralla. Saaduista kuvista nähtiin muovien käyttäytyminen pelkässä vedessä, kuten esimerkiksi muovien aggregoitumista eli kasaantumista (kuva 4).

TEM -hiloissa havaittiin ongelmia, sillä 1 µm ja 10 µm muovihiukkasia ei näkynyt kuvissa ollenkaan, ja sen epäiltiin johtuneen siitä, että magneettisekoittaja rikkoi suuremmat partikkelit.

Ensimmäisissä kokeissa havaittujen ongelmien takia koe uusittiin. Kokeessa toistettiin pitoisuuden laimennus vielä kymmenellä ja se osoittautui hyväksi pitoisuudeksi yhden hilan kanssa tehdyn vahingon avulla, jonka yhteydessä pitoisuus jäi alkuperäiseksi 2 mg/l:ksi. Kyseisessä hilassa nähtiin erittäin suuria muovipartikkelien kasaantumia, kun muissa sitä näkyi tasaisesti ympäri hilaa (kuva 6).

12

Kuva 4. 1 µm mikromuovipartikkeleita TEM:llä otetuissa kuvissa. Kuvassa näkyy isoja aggregaatteja, jotka olivat erittäin yleisiä tässä alkuperäisessä suspension näytteessä. Mittajanan skaala on 10 000 nm.

Kuvassa 4 oleva suspensio on alkuperäisestä laimentamattomasta 2 mg/l suspensiosta, josta tehtiin pari näytettä vahingossa.

Kuva 5. 1 µm mikromuovipartikkeleita TEM:llä otetuissa kuvissa. Kuvassa oleva suspensio on laimennettu 0,2 mg/l suspensio alkuperäisestä 2 mg/l suspensiosta. Mittaskaala on 10 000 nm.

13

Otetuissa TEM –kuvissa (kuva 5) näkyi vain harvoja yksittäisten partikkelin kasaantumia, ja enemmän yksittäisiä partikkeleita.

Kuva 6. 1 µm muovipartikkeleita vesikirpun suolen sisällä fluoresoivassa valossa. Suolen väri ja täyteläisyys kertovat koko suolen olevan täynnä mikromuovia. Vaaleanpunaisesti fluoresoiva materiaali on muovipartikkeleita kasaantuneena eläimen suolistoon.

Kuva 7. Kontrollikuva verrattuna kuvaan 8 samassa fluoresoivassa valaistuksessa. Kuvan kirpun suoli on tumma alapuolelta, jossa on vielä jäämiä leväateriasta, jonka kirppu oli nauttinut pari päivää ennen, mutta ei vaaleanpunertavasti fluoresoivaa materiaalia.

14

Kuva 8. Vesikirppu, joka on altistettu 10 µm mikromuoville.

Kuva 9. Kontrollikirppu valomikroskooppikuvassa, jossa suolen sisältö näkyy tummana levämassaa.

15

Kuva 10. Kuva, jossa pyrittiin löytämään oikeita fluoresoivia aallonpitoisuuksia Leica kameralla (Leica Microsystems).

Agar – näytteissä havaittiin mikromuovien kertyminen kirppujen suoleen (kuvat 6 ja 7), ja myös valomikroskooppia käyttämällä pystyttiin toteamaan sama asia (kuvat 8 ja 9). Kuvissa ero ei näy yhtä hyvin, kuin paljaalla silmällä katsoen. Tämä johtuu todennäköisesti siitä, että kameran ottamien kuvien värit ja valotus eroavat mikroskoopin läpi katsomisesta. Tästäkin huolimatta kuvissa näkyy muovien kertyminen, etenkin kuvassa 10, jossa muovihiukkaset on ympyröity punaisella.

Kuvassa 8 vesikirpun suolessa näkyy reilusti mikromuovipartikkeleita (kuvassa tummia säännöllisiä hiukkasia ympyröity punaisella) aina ruuansulatuksen yläpäästä alkaen kattaen koko ruuansulatuskanavan. Suolen ulkopuolella esiintyvät tummat ja vaaleat pallot ovat todennäköisesti rasvakertymiä tai niiden hajoamistuotteita.

Kuva 9 on kontrolli, jossa kirpun suolessa ei näy mikromuovia (vrt. kuva 8). Suolen ulkopuolella esiintyvät tummat ja vaaleat pallot ovat todennäköisesti rasvakertymiä tai niiden hajoamistuotteita.

Kuvassa 8 näkyy kuva fluoresoivilla aallonpitoisuuksilla. Tavoitteena oli etsiä aallonpitoisuuksia, joilla kirppu olisi pystytty häivyttämään niin, että pelkkä muovi näkyisi kuvassa. Oikeita haluttuja aallonpitoisuuksia ei löytynyt, mutta samalla saatiin kuva, jossa vesikirpussa (D. magna) näkyy muovit erittäin selvästi suolessa (10 µm partikkelikoko). Tämän lisäksi mahdollisesti havaittiin

16

muovipartikkeleita kudoksen sisällä (punaisella ympyröidyt kohdat). Itse suoli (ruskeahko alue kirpun sisällä) on täynnä pieniä muovipartikkeleita.

Kaikki kirput oli ruokittu edellisenä päivänä hyvin. Tämän ratkaisun takia kokeen aikana tuli nähtyä selkeä ero muovikäsittelyjen ja kontrollikäsittelyjen välillä kirppujen suolen sisällössä.

Kontrollikirppujen suolet sisälsivät levää, mutta muovikäsittelyn kirppujen suolet täyttyivät vähitellen valkoisella materiaalilla, eli altistuksissa käytetyllä muovilla, joka myös korvasi levän.

Kontrolli - kirpuissa suoli oli täynnä levää koko kokeen ajan. Tätä ei kuitenkaan dokumentoitu erikseen, sillä se oli jo todettu alustavissa kuvantamisissa.

TEM –kuvat altistetuista eläimistä olivat pitkälti tuloksettomia, sillä niistä ei joko saanut selvyyttä kunnollisella varmuudella, tai ne vain kertoivat jo todettuja asioita uusiksi.

Viimeiseksi tehty eläin -esikoe, aikaisemmista kokeista tehty uusintakoe nuorilla poikasilla, ei tuottanut lisätietoa. Tämä eläinkoe vain vahvisti jo aikaisempia tietoja, joten myös alustavat kokeet lopetettiin siihen.

4.2 Kertymiskokeet

4.2.1 Vesinäytteet

PCB 10 m vesinäytteet

0 20 40 60

0 1 2 3

4 KTM + PCB

KTM + PCB + M Humus + PCB Humus + PCB + M

Aika

 g /l

Kuva 11. PCB 10 µm muovialtistuksen vesinäytteet.

Vesinäytteiden välillä ei ollut merkittävää tilastollista tai edes silmämääräistä eroa käsittelyiden välillä (kuva 11). PCB:n pitoisuus alkoi lähes samoista määristä, ja laski samalla tavalla jokaisessa

17

käsittelyssä ajan myötä. Humus + muovikäsittelyn kemikaalikertymä alkaa hiukan korkeammalta kuin muissa käsittelyissä, mutta kokeen spiikkauksessa ei kuitenkaan löytynyt poikkeavuuksia.

PCB 1 m vesinäytteet

0 20 40 60

0 1 2 3

4 KTM + PCB

KTM + PCB + M Humus + PCB Humus + PCB + M

Aika

 g /l

Kuva 12. PCB 1 µm muovikäsittelyn vesipitoisuudet. Tässä kuvassa näkyy koko kokeen aikainen kehitys PCB:n pitoisuudessa vesipatsaassa. Kontrollivedet seuraavat 10 µm vesinäytteen käyriä, mutta merkittävä ero näkyy muovikäsittelyissä, joissa PCB:n pitoisuus vedessä pysyy koko ajan koholla kontrolleihin verrattuna (■ ja ▼).

PCB käsittely yhdistettynä 1 µm muovipartikkeleihin antoi erilaisia tuloksia kuin 10 µm muoveilla (kuva 12). Veden pitoisuuksissa oli jo lähtökohdassa eroja, ja niiden käyttäytymisessä ajan myötä näkyy selkeä ero. Myös tilastollisesti merkittäviä tuloksia löytyi esim. eri humus -käsittelyiden väliltä (P < 0,05). Muovikäsittelyiden kemikaalipitoisuudet ovat kuitenkin kontrollikäsittelyihin verrattuna koholla heti altistamisen aloittamisen jälkeen, ja pysyvät myös niin kokeen ajan. Muovikäsittelyissä vedessä pysyy siis suurempi kemikaalipitoisuus kontrolleihin verrattuna.

18 PCB 0.05 m vesinäytteet

0 20 40 60

0 2 4 6

8 KTM + PCB

KTM + PCB + M Humus + PCB Humus + PCB + M

Aika

 g /l

Kuva 13. PCB 0,05 µm kokeen arvot vedessä. Kuten 1 µm tuloksissa, myös 0,05 käsittelyssä muovilla oli merkittävä merkitys PCB:n määrään vesipatsaassa.

PCB 0,05 µm muovikäsittelyiden (kuva 13) erot tulevat vieläkin suurempina esiin, kuin mitä jo 1 µm käsittelyssä (kuva 11) nähdyt erot. Erot ovat tilastollisesti erittäin merkittäviä muovi versus kontrollikäsittelyiden välillä (P < 0,001). Muovikäsittelyiden kemikaalikertymä on huomattavasti suurempi, sekä oman vesityypin välillä, että myös toisen vesityypin välillä. Ainoat ei –tilastollisesti merkittävät erot ovat kahden kontrollikäsittelyn välillä ja kahden muovikäsittelyn välillä. Nämä erot näkee jo aika hyvin itse taulukosta, sillä erot kontrolli- ja muovikäsittelyiden välillä voivat olla 2-3 kertaiset, kun taas kontrollikäsittelyiden omat erot, niin kuin myös muovikäsittelyiden väliset omat erot ovat erittäin pieniä.

Muovikäsittelyiden kemikaalipitoisuus vedessä pysyy siis hyvin korkeana itse kontrolleihin verrattuna, ja kemikaalipitoisuuden lasku on myös vähäisempää kontrolleihin verrattuna.

19 BaP 10 m vesinäytteet

0 20 40 60

0.10 0.15 0.20

0.25 KTM + BaP

KTM + BaP + M Humus + BaP Humus + BaP + M

Aika

 g /l

Kuva 14. BaP ensimmäinen käsittely 10 µm polystyreenipalloilla.

BaP –käsittely 10 µm muovipartikkeleilla ei antanut suuria eroja vesinäytteiden suhteen (kuva 14). Tuloksissa näkyy jo aikaisemmin havaittu ero KTM- ja Humuskäsittelyiden välillä, mutta nekin ovat erittäin pienet. Muuten tuloksissa ei ole merkittäviä eroja eri käsittelyiden välillä. On kuitenkin hyvä osoittaa pitoisuuksien kasvavan ajan myötä alun laskemisen jälkeen, verrattuna PCB:hen (kuvat 11-13). BaP:in pitoisuudet vedessä laskevat alkuun, mutta lähtevät ajan myötä nousemaan kohti kokeen alkuperäisiä pitoisuuksia.

BaP 1m vesinäytteet

0 20 40 60

0.16 0.18 0.20 0.22 0.24 0.26

0.28 KTM + BaP

KTM + BaP + M Humus + BaP Humus + BaP + M

Aika

 g /l

Kuva 15. 1 µm muovipallojen BaP – käsittely. Käsittelyiden välillä ei ole suurta havaittavaa eroa, mutta KTM + BaP + M – käsittely on se käsittely, jolla on poikkeavasti suurimmat pitoisuudet kemikaalia vedessä. Kemikaalipitoisuudet lähtevät kasvamaan alun notkahduksen jälkeen.

20

BaP 1 µm muovikäsittely ei anna tilastollisesti merkittäviä eroja vesinäytteille eri käsittelyiden välillä (kuva 15). BaP pitoisuus KTM – muovikäsittelyssä on kokeen aloituksen yhteydessä muihin verrattuna hiukan koholla, ja se on myös kokeen lopussa muita korkeammalla, mutta silti sen ja muiden käsittelyiden väliltä ei löydy tilastollisesti merkittävää eroa.

Vesinäytteiden kemikaalipitoisuus lähtee taas kokeen alun laskun jälkeen kevyeen nousuun kokeen loppua kohti.

BaP 0.05 m vesinäytteet

0 20 40 60

0.10 0.15 0.20 0.25

0.30 KTM + BaP

KTM + BaP + M Humus + BaP Humus + BaP + M

Aika

 g /l

Kuva 16. BaP 0,05 µm muovikäsittelyn vesinäytteet. Käsittelyiden välillä on selkeä käyttäytymisero. Muovialtistuksissa veden kemikaalipitoisuus pysyy tasaisena koko altistusajan, kun taas kontrollikäsittelyissä kemikaalipitoisuus laskee ja lähtee kokeen loppua kohden nousemaan. Edellisiä kokeita seuraten humuskäsittelyiden pitoisuudet ovat KTM – käsittelyihin verrattuna koholla.

BaP 0,05 µm muovipartikkelikäsittelyllä antoi selkeästi muista BaP vesinäytteiden taulukoista (kuvat 14-15) poikkeavia tuloksia. Eri käsittelyiden välillä on selkeästi erilaisia tuloksia, ja ennen kaikkea selkeästi erilaisia käyttäytymisiä. Kontrollikäsittelyt seuraavat aikaisempien käsittelyiden trendiä. Niiden kemikaalipitoisuus lähtee laskuun kokeen aloittamisen jälkeen, ja nousee loppua kohden. Muovikäsittelyiden kemikaalipitoisuus pysyy taas lähes stabiilina koko kokeen ajan.

Tämän eron lisäksi käsittelyiden väliltä löytyy myös pitoisuuseroja. Humuskäsittelyn pitoisuudet ovat taas suurimpia, kuin vastaavat KTM –pitoisuudet, vaikkakin tilastollisia merkittävyyksiä ei löydy. Ainoa tilastollisesti merkittävä ero löytyy KTM- ja humuskäsittelyiden väliltä muovialtistuksissa (P < 0,05), joten niiden ero on erityisen silmiinpistävä ja kiinnostava.

21 4.2.2 PCB –yhdisteiden kertyminen eliöihin

PCB 10 m eläinnäytteet

0 20 40 60

0.000 0.001 0.002 0.003

KTM + PCB KTM + PCB + M Humus + PCB Humus + PCB + M

a a a a

Aika

 g /m g

PCB 1m eläinnäytteet

0 20 40 60

0.0000 0.0005 0.0010 0.0015 0.0020 0.0025

KTM + PCB KTM + PCB + M Humus + PCB Humus + PCB + M

a b a b

Aika

 g /m g

PCB 0.05 m eläinnäytteet

0 20 40 60

0.000 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005

KTM + PCB KTM + PCB + M Humus + PCB Humus + PCB + M a

b ab a

Aika

 g /m g

22

Kuva 17 a-c. A: 10 µm käsittely, B: 1 µm käsittely, C: 0,05 µm käsittely. Kuvissa näkyy eläinnäytteiden PCB kertymä koko kokeen osalta kaikkien muovityyppien kannalta. Tilastolliset erot on luokiteltu kirjaimilla a ja b jne. Sama kirjain osoittaa, ettei käsittelyiden väliltä löytynyt tilastollista eroa, ja eroava kirjain osoittaa tilastollista eroa (P <0,05) eroavan kirjaimen kanssa.

PCB 10 µm käsittely aloitti kokeet. Kokeissa muovikäsittelyjen ja kontrollikäsittelyjen välillä ei näkynyt merkittäviä eroja PCB altistuksissa. Ainoa ero näkyi humus ja KTM käsittelyiden välillä.

Humus käsittelyissä oli aina isompi PCB määrä kuin vastaavassa KTM –käsittelyissä.

Eläinnäytteiden kemikaalikertymä kasvaa heti altistumishetkestä alkaen nopeasti saavuttaen tasapainotilan jo alle 24 tunnissa (kuva 17A). Poikkeuksena tähän trendiin toimii humus + muovikäsittely, jossa on pienehköä kasvavaa trendiä vielä 24–48 tunnin aikana, jonka aikana se tasaantuu kontrolli - humusta vastaaviin kemikaalimääriin.

PCB käsittely 1 µm muovilla (kuva 17B) antoi erilaisia tuloksia kuin ensimmäinen 10 µm käsittely. Muovikäsittelyiden ja kontrollikäsittelyiden välillä oli huomattava tilastollinen ero.

Muovikäsittelyt olivat tilastollisesti merkittävästi eroavat sekä vastaaviin kontrollikäsittelyihin nähden, mutta myös vastakkaisen kontrollikäsittelyn kanssa (P < 0.01). Humus- ja KTM- käsittelyiden välillä näkyi samanlainen ero kuin 10 µm käsittelyissä. Humus- käsittelyissä PCB:n kertymä oli taas suurempi, kuin mitä KTM- käsittelyissä löytyi. Humus- ja KTM –kontrollin välinen ero ei kuitenkaan ollut tilastollisesti merkittävä.

Selkeästi poikkeavaa käyttäytymistä löytyi 0,05 µm muovikäsittelystä (kuva 17C), etenkin muovikäsittelyistä.. KTM –veden muovikäsittely jatkoi samaa trendiä 1 µm käsittelyn kanssa, ja muovikäsittelyn kemikaalipitoisuudet ovat huomattavat, moninkertaiset muihin tuloksiin verrattuna.

Erikoisin tulos on trendistä poikkeava humus + muovikäsittely, joka onkin merkittävästi pienempi kuin KTM + muovi. Tästäkin huolimatta tilastolliset erot ovat pieniä ja ainoastaan KTM – käsittelyiden välillä ja KTM + PCB + M ja Humus + PCB + M käsittelyn väliltä löytyy tilastollisesti merkittävää eroa (P < 0,05). 48 tunnin altistusajalta näkyy kuitenkin selkeä ero käyttäytymisessä.

Siinä missä KTM + M käsittely jatkaa 1 µm käsittelyjen trendiä, niin Humus + M käsittelyn kemikaalipitoisuudet ovat hyvin matalia. Humus + M käsittelyn ajallinen kemikaalikertymä on matalampi kuin kontrollihumuksen, joka on poikkeuksellista 1 µm tuloksiin verrattuna. Tuloksissa näkyy myös huomattava poikkeama 24 tunnin kohdalla Humus –kontrollin suhteen. Tämän aikapisteen kohdalla oli yksi merkittävä rinnakkaisista poikkeava tulos, joka todettiin selkeäksi outlyeriksi. Tämä poikkeava tulos päätettiin kuitenkin jättää tuloksiin, sillä sen merkitys lopullisiin tuloksiin oli pieni. Suurin ero, jonka tämä outlyerin poisto oli tilastollisen merkittävyyden muutoksen KTM –käsittelyiden välillä (P < 0,05  P < 0,01). Muuten se ei vaikuttanut tuloksiin millään tavalla.

23 PCB 10m 48 h

KTM + PCB KTM + PCB

+ M

Humus + P

CB

Humus + P

CB + M 0.000

0.001 0.002 0.003 0.004

a a

a a

a a

g/mg

PCB 1 m 48 h

KT M + PCB

KTM + P

CB + M

Humus + P

CB

Humus + P

CB + M 0.0000

0.0005 0.0010 0.0015 0.0020 0.0025

a

a b

c

 g /m g

PCB 0.05 m 48 h

KTM + PCB

KTM + PCB + M

Humus + P

CB

Humus + P

CB + M 0.000

0.001 0.002 0.003 0.004 0.005

a

a

a b

 g /m g

Kuva 18. Kuvissa näkyy 48 tunnin kemikaalikertymä D. magna:ssa. Kuvassa näkyy eläinnäytteiden PCB kertymä 48 tunnin osalta kaikkien muovityyppien kannalta. Tilastolliset erot on luokiteltu kirjaimilla a, b ja c. Sama kirjain osoittaa, ettei käsittelyiden väliltä löytynyt tilastollista eroa, ja eroava kirjain osoittaa tilastollista eroa (P <0,05) eroavan kirjaimen kanssa.

Kuvassa 18 näkyy 10 mikron eläinnäytteiden 48 tunnin mittauspiste, joka otettiin erikseen lopullisen kemikaalimäärän ja käsittelyiden välisen kokeiden havainnoimiseksi. PCB 10 µm muovikäsittelyssä erot eri käsittelyiden välillä olivat vähäisiä, eivätkä millään tavalla tilastollisesti merkittäviä. Selkein ero käsittelyiden välillä on jo edellä mainittu Humus ja KTM –käsittelyiden väliset erot kemikaalikertymässä, vaikka niissäkään ei ollut tilastollista merkittävyyttä.

24

Tulokset 48 tunnin näytteenotosta antavat varsin selkeän kuvan käsittelyiden välisistä eroista. Jo eri altistuspitoisuudet kertovat kemikaalin käyttäytymisen eroista eri käsittelyissä.

Humuskäsittelyissä on 10 µm trendiä jatkava ero KTM –vesiin verrattuna (kuva 18A). Kaikkien muiden vertailujen välillä on tilastollisesti merkittävä ero (P < 0,05), paitsi KTM + PCB versus Humus + PCB välillä. KTM vesien välinen tilastollinen merkitys oli P <0,01 ja joidenkin käsittelyiden välinen vertailu antaa jopa P <0,001 tilastollisen merkittävyyden. Nämä vertailukohdat olivat Humus + PCB versus Humus + PCB + M ja KTM + PCB versus Humus + PCB + M. Humuksen ja muovialtistuksen yhdistelmä antaa siis erittäin merkittävästi eroavia tuloksia kuin kumpikaan kontrollivesi.

PCB 0,05 µm muovikäsittelyn 48 tunnin tulokset antoivat selkeästi poikkeavan käyttäytymisen kuin edelliset tulokset (kuva 18C). Keinotekoisen makean veden käyttäytyminen jatkoi 1 µm tuloksia ja kemikaalipitoisuudet kasvoivat huomattaviksi (kuva 18B). Tilastollisesti merkittävät erot olivat kaikki sidottuna KTM –veden muovikäsittelyyn. Sen erot kaikkiin muihin käsittelyihin verrattuna olivat hyvin merkittäviä (P <0,001). Muiden käsittelyiden väliltä ei löytynyt tilastollisesti merkittäviä eroja. Huomion arvoista on kuitenkin humuskäsittelyiden väliset erot, jotka olivat lähes mitättömiä.

Muovikäsittely on jopa melkein pienempi kuin kontrollinsa.

KTM + PCB 1 µm

0 20 40 60

0 20000 40000 60000 80000

Aika

DPM

KTM + PCB+ M 1 µm

0 20 40 60

0 50000 100000 150000 200000

Aika

DPM

Kuva 19A ja -B. Kinetiikkataulukko -esimerkit PCB 1 µm KTM - veden käsittelyistä. Loput kinetiikkataulukot löytyvät liittestä 2. A: KTM + PCB, B: KTM+PCB+M. Suora viiva on simuloitu kinetiikka, ja palloilla varustettu viiva altistuskokeen tulokset.

Kinetiikka laskettiin, jotta voitaisiin laskea kemikaalien BCF –arvot, myös niille käsittelyille jotka eivät välttämättä ole tasapainossa. Kinetiikkakäyrät ja tulokset sopivat varsin hyvin yhteen (kuva 19A), tosin joitakin erilaisuuksia löytyi myös (esim. kuva 19B). Yllä esitetyt kuvat ovat vain esimerkki kinetiikan simuloinneista, ja kaikki muut PCB:n kinetiikkataulut löytyvät liitteistä (liite 2).

Lasketuista kinetiikka-arvoista laskettiin kemikaalien bioconentration factor –arvot (BCF).

25

Kuva 20. PCB –käsittelyiden BCF arvot. BCF –arvoilla nähdään kemikaalien kertymisen erot eri käsittelyiden välillä.

BCF – arvot kertovat kemikaalin kertymisestä eliöön. Vertaamalla muovi- ja kontrollikäsittelyä voidaan kertoa, aiheuttaako muovit voimakkaampaa kertymistä eliöön. BCF –arvot laskettiin ensimmäisen asteen kinetiikan mukaan saaduista arvoista, joita verrattiin käsin tehtyihin laskuihin.

Lopulta manuaalisesti tehdyt laskut jätettiin pois, koska niillä ei kyetty huomioimaan kunnolla vesipatsaissa tapahtuneita ajallisia muutoksia. PCB – käsittelyn BCF:ssä ei havaittu merkittäviä eroja (kuva 20), joissa muovikäsittelyiden BCF olisi ollut suurempi kontrolleihin verrattuna. Ainoastaan 1 µm muovikäsittelyssä BCF oli kontrollia suurempi. Merkittävin ero löytyi 0,05 µm muovi- ja kontrollikäsittelyn väliltä humusvedessä, jossa kontrollin BCF oli moninkertaisesti korkeampi kuin muovikäsittelyn.

4.2.3 BaP –yhdisteiden kertyminen eliöihin

0 5000 10000 15000 20000 25000

PCB 10 PCB 1 PCB 0,05 PCB 10 Humus

PCB 1 Humus

PCB 0,05 Humus

BCF

PCB -käsittely

Kontrolli Muovikäsittely

26 BaP 10 m eläinnäytteet

0 20 40 60

0.0000 0.0005 0.0010 0.0015

KTM + BaP KTM + BaP + M Humus + BaP Humus + BaP + M a

a b b

Aika

 g /m g

BaP 1m eläinnäytteet

0 20 40 60

0.0000 0.0005 0.0010 0.0015

KTM + BaP KTM + BaP + M Humus + BaP Humus + BaP + M

a a b b

Aika

 g /m g

BaP 0.05m eläinnäytteet

0 20 40 60

0.0000 0.0005 0.0010 0.0015

KTM + BaP KTM + BaP + M Humus + BaP Humus + BaP + M

a ab b c

Aika

 g /m g

Kuva 21 A-C. A: 10 µm käsittely, B: 1 µm käsittely, C: 0,05 µm käsittely. Kuvissa näkyy eläinnäytteiden BaP kertymä koko kokeen osalta kaikkien muovityyppien kannalta. Tilastolliset erot on luokiteltu kirjaimilla a ja b jne. Sama kirjain osoittaa, ettei käsittelyiden väliltä löytynyt tilastollista eroa, ja eroava kirjain osoittaa tilastollista eroa (P <0,05) eroavan kirjaimen kanssa.

27

BaP 10 µm muovikäsittely aloitti toisenkin kemikaalin kokeet (kuva 21A). Eläinkokeiden tuloksissa näkyy ero humus- ja KTM –käsittelyiden välillä, mutta tällä kertaa KTM –vedet ovat ne voimakkaammin kemikaalia kerryttävä vesityyppi. Kontrollikäsittelyiden ja muovikäsittelyiden väliltä ei löytynyt tilastollisesti merkittäviä eroja. Ainoastaan KTM –käsittelyiden ja Humus - käsittelyiden väliltä löytyi tilastollinen ero niin, että KTM –käsittelyissä kemikaalikuorma oli tilastollisesti merkittävästi suurempi (P < 0,05). Se oli ainoa merkittävä ero käsittelyiden välillä.

BaP 1 µm muovikäsittely antoi hyvin samanlaiset tulokset kuin 10 µm käsittely (kuva 21B). Eroja ei löytynyt muovi- ja kontrollikäsittelyiden väliltä. Tilastollisesti merkittävät erot löytyivät KTM- ja humuskäsittelyiden väliltä, niin että KTM –käsittelyissä kemikaalikertymä oli suurempi (P < 0,05).

BaP 0,05 µm muovikäsittelyssä näkyi suurempia eroja eri käsittelyiden välillä (kuva 21C).

Merkittävin ero löytyy KTM –muovikäsittelystä, joka eroaa kaikkiin muihin käsittelyihin verrattuna erittäin merkittävästi kemikaalikertymältään (P < 0,01), mutta myös käyttäytymiseltään. BaP 0,05 µm kemikaalikertymä on merkittävästi suurempi kaikkiin muihin käsittelyihin verrattuna.

Käyttäytymisen osalta ero on siinä, missä muiden KTM – tulosten trendi on ollut 24 tunnin jälkeen laskeva, niin 0,05 µm muovikäsittelyn kemikaalikertymän trendi on vakaa kokeen loppuun asti. Eroja löytyy myös muiden käsittelyiden väliltä. KTM –kontrollikäsittely eroaa humuksen muovikäsittelystä, mutta ei humuksen kontrollikäsittelystä. Humuskäsittelyiden väliltä ei löydy tilastollista eroa, mutta humus – muovikäsittely on selkeästi matalampi kemikaalikuormaltaan, ja sen käyttäytyminen on erilaista koko kokeen ajan.

28 BaP 10m 48 h

KTM + BaP

KTM + BaP + M Hu

mus + Ba

P

Humus + Ba

P + M 0.0000

0.0005 0.0010 0.0015

ab a

bc

c

 g /m g

BaP 1m 48 h

KTM + BaP

KTM + BaP + M

Humus + Ba

P

Humus + BaP + M 0.0000

0.0005 0.0010 0.0015

a ab

bc c

g/mg

BaP 0.05 m 48 h

KTM + BaP

KTM + BaP + M Humus + BaP

Humus + BaP + M 0.0000

0.0005 0.0010 0.0015

a b b

c

g/mg

Kuva 22 A-C. A: 10 µm käsittely, B: 1 µm käsittely, C: 0,05 µm käsittely. Kuvissa näkyy eläinnäytteiden BaP kertymä 48 h ajankohdalta kaikkien muovityyppien kannalta. Tilastolliset erot on luokiteltu kirjaimilla a, b ja c. Sama kirjain osoittaa, ettei käsittelyiden väliltä löytynyt tilastollista eroa, ja eroava kirjain osoittaa tilastollista eroa (P <0,05) eroavan kirjaimen kanssa.

Kuva 22 näyttävät BaP muovikokeen 48 tunnin näytteenoton kemikaalikertymät. Vaikka erot koko altistuksen aikana olivat pieniä tai olemattomia (kuva 22A-C), niin eri käsittelyiden väliltä löytyy hieman enemmän eroja pelkästään 48 tunnin näytteenoton perusteella.

BaP 10 µm altistuksessa merkittävin ero oli koko altistusajan aikana havaittu KTM- ja humusveden välinen ero. Sama näkyy 48 tunnin kohdalla, tosin eroina se, että eri vesien kontrollien väliltä ei löydy tilastollisesti merkittävää eroa.

29

Samanlainen poikkeava ero löytyy myös 1 µm 48 tunnin tuloksista, tosin erona on humus- kontrolli ja KTM – muovikäsittely, joiden väliltä ei löydy merkittävää eroa (kuva 22B).

Merkittävimmät erot löytyvät 0,05 µm muovikoosta (22C). Suurin ero löytyy KTM – muovikäsittelystä, joka eroaa muista käsittelyistä erittäin merkittävästi suuruudeltaan (P < 0,001).

Eroa löytyy myös humus – muovikäsittelystä muihin verrattuna. Se on tilastollisesti merkittävästi muita käsittelyjä pienempi (P < 0,05).

KTM + BaP 1 µm

0 20 40 60

0 200000 400000 600000

Aika

DPM

KTM + BaP + M 1 µm

0 20 40 60

0 200000 400000 600000

Aika

DPM

Kuva 23 A ja B. Kinetiikkataulukko -esimerkit BaP 1 µm KTM - veden käsittelyistä. Loput kinetiikkataulukot löytyvät liittestä 2. A: KTM + PCB, B: KTM+PCB+M. Suora viiva on simuloitu kinetiikka, ja palloilla varustettu viiva altistuskokeen tulokset.

Kuvissa 23A ja 23B näkyy BaP:lle tehtyjä kinetiikan simulaation esimerkkejä. Yleisesti ottaen kinetiikkasimulaatiot menivät aika hyvin havaittujen kinetiikkojen kanssa, mutta mainittavaa on, että joitakin poikkeamia löytyi. Edellä esitetyt kaksi kuvaa ovat vain osa kaikista BaP:n kinetiikka taulukoista, ja kaikki loput taulukot löytyvät liitteistä (liite 2). Kinetiikkasimulaatioista saaduilla arvoilla laskettiin BaP:n BCF arvot.

30

Kuva 24. BaP –käsittelyn BCF arvot. Erot ovat vähäisiä 10 ja 1 µm käsittelyiden välillä, vaikka muovikäsittelyt näyttävät johtavan suurempaan BCF -arvoon. Selkeät erot näkyvät 0,05 µm muovikäsittelyssä, jossa KTM –käsittelyssä BCF on melkein kaksinkertainen kontrolliin nähden, ja käänteisesti humus –käsittelyssä, jossa kontrollin BCF on melkein kaksinkertainen muovikäsittelyyn nähden.

BaP –käsittelyssä BCF arvot olivat muovikäsittelyissä melkein koko ajan kontrollia korkeammat (kuva 24). Erittäin merkittävä ero näkyy 0,05 µm KTM vedessä, jossa muovikäsittelyn BCF on melkein kaksinkertainen. Samanlainen, mutta käänteinen, ero löytyy 0,05 µm humusvedestä, jossa kontrollissa BCF on melkein kaksinkertainen muovikäsittelyyn verrattuna. Muuten muovikäsittelyt ovat vain vähäsen suuremmat BCF:n osalta 1 µm KTM –käsittelyä lukuun ottamatta, jossa kontrollin BCF on hiukan suurempi.

5. TULOSTEN TARKASTELU

5.1 Polyklooratut Bifenyylit

Tämän kokeen tulokset osoittavat sen, että eliöt voivat altistua mikro- ja nanomuoveille. Tämän tutkimuksen alustavien kokeiden tulokset kuitenkin on jo havaittu useissa muissa tutkimuksissa (Wright ym. 2013, Besseling ym. 2012). Tämän tutkimuksen merkittävämpi havainto on mikromuovien kyky siirtää kemikaalimääriä eliöiden sisälle tietyissä olosuhteissa tietyillä kemikaaleilla.

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

BaP 10 BaP 1 BaP 0,05 BaP 10 Humus BaP 1 Humus BaP 0,05 Humus

BCF

BaP -käsittely

Kontrolli Muovikäsittely

31

10 µm muovialtistus ei vaikuttanut PCB:n kertymiseen. Selkein ero oli humus –vesien korkeampi kemikaalipitoisuus verrattunaKTM –vesiin.

Vesinäytteissä näkyvä kemikaalin väheneminen PCB –näytteissä (kuvat 11-13) voi olla osittain PCB:n sitoutumista kokeissa käytettyjen lasiastioiden seiniin. PCB:n on kuitenkin havaittu sitoutuvan lasiin tehokkaasti, ja jopa noin 30 % kemikaalista voi sitoutua lasiastiaan merivesikäsittelyssä 12 tunnin aikana (Sullivan ym. 1981). Tämä todennäköisesti näkyy myös korkeina BCF –arvoina kontrollikäsittelyissä (kuva 20 & liite 1), koska vedessä olevat kemikaalipitoisuudet ovat erittäin matalia kokeen loppua kohden. Toisaalta muovikäsittelyissä kemikaalipitoisuudet pysyivät paljon vakaampina, joka viittaa niiden sitovan kemikaalia, ja siten pitävän yllä kemikaalin biosaatavuutta eliölle. Muovien onkin havaittu sitovan PCB:tä tehokkaammin kuin lasien (Pepe & Byrne 1980).

Esimerkiksi Mato ym. (2001) havaitsivat PCB:n sitoutuvan muovipelletteihin Japanin merialueilla.

Tulokset 1 µm:n muovilla tukivat tutkimushypoteesia. Muovikäsittelyissä olevissa vesikirpuissa oli merkittävästi suurempi kemikaalikuorma kontrolleihin verrattuna. Tulokset olivat tilastollisesti merkittäviä kaikissa altistuksissa (P < 0,01). Tämä tukee tuloksia mikromuovien kyvystä toimia vektoreina ympäristömyrkyille (Andrady 2011, Bakir ym. 2014, Besseling ym. 2012).

Tulokset 0,05 µm:n muovilla antoivat mielenkiintoisen poikkeaman. Tulokset seurasivat 1 µm:n muovin tuloksia ja kemikaalipitoisuudet kasvoivat KTM käsittelyissä kontrolleihin verrattuna. Tätä tulosta tukevat aikaisemmat tutkimukset, joissa PCB:n on todettu sitoutuvan helposti nanomuoveihin, etenkin polystyreeniin (Velzeboer ym. 2014). Merkittävä poikkeama oli kuitenkin hyvin alhaiset eläinpitoisuudet, vaikka Humus + PCB + M käsittelyssä veden PCB:n pitoisuudet olivat samansuuruiset verrattuna KTM + PCB + M käsittelyyn (kuvat 13, 17C ja 18C). Tämä antaakin aihetta mielenkiintoisen kysymykseen, mitä humuksen ja nanomuovien välillä tapahtuu, ja miten se vaikuttaa kemikaalien biosaatavuuteen? Wagner ym. (2014) esittivät ongelman mikromuovien ja muiden makean veden saasteiden välisen vuorovaikutuksen ymmärtämisestä. Merissä tapahtuvaa saasteiden siirtymistä muoveihin ei voi verrata makeaan veteen erilaisten pitoisuuksien ja olosuhteiden takia. Tämän tutkimuksen perusteella voidaan päätellä, että humuksen ominaisuudet muuttavat nanomuovien käyttäytymistä makeassa vedessä.

5.2 Bentso(a)pyreeni

BaP käsittelyissä havaittiin käänteinen ero humus- ja KTM-käsittelyiden välillä verrattuna PCB käsittelyihin. Tuloksissa BaP:n käsittelyissä humus –vesien kemikaalipitoisuus oli KTM –käsittelyitä pienempi, kun PCB:n kanssa se oli toisin päin. BaP:n onkin havaittu käyttäytyvän erilailla humusvedessä. Humusvedessä BaP:in biokertyminen vähenee merkittävästi, ja BaP on selkeästi

32

heikommin saatavilla eliöille (Akkanen ym. 2001, Akkanen & Kukkonen 2002). Tämä selittäisi osittain myös humuksen selkeästi pienemmät BCF –arvot näissä kokeissa (kuva 24).

Tulosten osalta BaP ei antanut merkittäviä tuloksia 10 ja 1 µm muovialtistuksilla. Erot löytyivät humus- ja KTM –vesien väliltä, mutta erot kontrolli ja muovikäsittelyiden välillä olivat pieniä.

Selkeästi muista tuloksista poikkeava käytös tulikin esille 0.05 µm muovipartikkelin kanssa, kuten PCB:n kanssa kävi. Ero muovikäsittelyn ja kontrollin välillä KTM –vedessä oli erittäin merkittävä.

Muovikäsittelyssä kemikaalin määrä oli huomattavasti suurempi (kuvat 21C & 22C). Samalla humusvedessä tehty käsittely antoi samanlaisen trendistä poikkeavan tuloksen, kuin mitä PCB:n kanssa oli havaittu (kuvat 17C & 21C). Humusvedessä 0,05 muovikäsittely ei ollut suurempi kemikaalikuormaltaan, vaan jopa muita käsittelyjä pienempi. Tämä näkyy etenkin BCF –tuloksissa, jossa ainoat merkittävät erot näkyvät 0,05 µm partikkeleilla. KTM- vedessä ero on merkittävästi suurempi muovikäsittelyn kannalta, kun taas humus- vedessä ero oli päinvastainen (kuva 24).

Tulokset osoittivat, että nanomuovit ja humusmateriaali muuttivat kemikaalin käytöstä odottamattomalla tavalla.

6. JOHTOPÄÄTÖKSET

Se mitä kohde-eliön, eli D. magna:n sisällä tapahtuu, on vielä vähän epäselvää, mutta kemikaalikertymä niissä antaa aihetta huoleen. Eliöt kuitenkin altistuvat huomattavasti suuremmalle annokselle pienien muovien kanssa, kuin mille ne altistuisivat ilman muovien läsnäoloa.

Mielenkiintoista oli kuitenkin havaita, ettei suuremmilla muovikoolla (10 µm) näyttänyt olevan merkitystä vedessä, saatikka sitten eliöön kertyneen kemikaalikuorman suhteen. Mahdollista on, että pitempi kontaktiaika muuttaisi tilanteen. Pitempi kontaktiaika voisi kompensoida pinta-alan puutetta imeytymisen osalta, joka pienemmillä partikkeleilla ei ole yhtä iso ongelma. Yksi vaihtoehto on myös se, että isoimmilla partikkeleilla havaittu nopeampi depurtaatio (Rosenkranz ym. 2009), eli ulostaminen, ehkäisee kemikaalien siirtymistä muovista eliöön. Kemikaalit eivät ehdi siirtyä muovista eliöön ennen suolesta poistamista.

Mielenkiintoisin tulos oli kuitenkin nanomuovien ja humuksen välinen käyttäytyminen. Sekä PCB että BaP käsittelyissä 0,05 µm muovin ja humuksen tulokset olivat täysin poikkeukselliset.

Kemikaalimäärät vedessä oli huomattavia, mutta siitä huolimatta D. magna:n altistuminen oli erittäin vähäistä. Tämä on ristiriidassa 1 µm:n muovilla saatujen tulosten kanssa, jossa samanlaista eroa ei näkynyt. Oletettavasti nanokokoinen polystyreeni muodostaa humuksen kanssa kompleksin, joka on liian suuri D. magna:n ravinnoksi. Tästä syystä D. magna ei oletettavasti altistu suurelle