1,6-DEHYDROPINIDIININ ANTIBAKTEERISUUDEN TESTAAMINEN HEVOSEN PÄÄNTAUTIA AIHEUTTAVALLA
BAKTEERILLA STREPTOCOCCUS EQUI SUBSP. EQUI AKSELI KOSKINEN
Pro gradu -tutkielma Itä-Suomen yliopisto Ympäristö- ja biotieteiden laitos
Biologia 2019
ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO
Ympäristö- ja biotieteiden laitos, biologia
KOSKINEN, AKSELI: 1,6-dehydropinidiinin antibakteerisuuden testaaminen hevosen pääntautia aiheuttavalla bakteerilla Streptococcus equi subsp. equi Pro gradu -tutkielma (40 op), 40 s., liitteitä 2
Kesäkuu 2019
avainsanat: Picea abies, Streptococcus equi, piperidiini, 1,6-dehydropinidiini, antibakteerinen Antibioottien liiallinen ja väärä käyttö on johtanut bakteerien antibioottiresistenssin nopeaan yleistymiseen, jonka lisäksi uusien antibioottien löytyminen on viimeisten vuosikymmenien aikana hidastunut. Uusien antibakteeristen yhdisteiden etsimisen lisäksi yhä enemmän kiinnitetään huomiota tunnettujen antibioottien ja luonnontuotteiden antibakteerisiin yhteisvaikutuksiin.
Sekundaarimetaboliitteihin kuuluvat alkaloidit ovat rakenteellisesti hyvin moninainen yhdisteryhmä, jonka molekyylit toimivat eri eliöryhmissä esimerkiksi estäen saalistusta ja infektioita. Mäntykasvien heimon (Pinaceae) alkaloidit ovat vähän tutkittuja piperidiinejä, joista epidihydropinidiinillä on havaittu antibakteerista vaikutusta. Epidihydropinidiinin biosynteesin välituotteena mahdollisesti toimii alustavasti tunnistettu 1,6-dehydropinidiini, jota esiintyy kuusella suurina määrinä nuorissa kerkissä.
Tässä pro gradu -tutkielmassa tavoitteena oli uuttaa ja puhdistaa 1,6-dehydropinidiiniä kuusen kerkistä ja tutkia kyseisen yhdisteen antibakteerisuutta hevosilla pääntautia aiheuttavaa Streptococcus equi subsp. equi -bakteeria vastaan. Tutkimuksessa verrattiin 1,6- dehydropinidiinin antibakteerisuutta penisilliini G:hen ja gentamisiiniin. Lisäksi työn tarkoituksena oli tutkia kuusen neulasista eristetyn kokonaisalkaloidifraktion mahdollisia vaikutuksia penisilliinin tehokkuuteen S. equi -bakteerin kasvun estossa.
Nuorista kuusentaimista kerätyistä kerkistä eristettiin alkaloidit kiinteäfaasiuutolla. 1,6- dehydropinidiiniä sisältävä fraktio erotettiin ohutlevykromatografialla. Tämän fraktion puhtaus ja pitoisuus todennettiin kaasukromatografianalyysillä. Yhdisteen antibakteerisuutta S. equi - bakteeria vastaan tutkittiin kuoppalevymenetelmällä penisilliiniin ja gentamisiiniin vertaillen.
Spektrofotometrillä mitattujen absorbanssien avulla laskettiin bakteerin kasvun inhibitioprosentit 1,6-dehydropinidiinin ja vertailuantibioottien erivahvuisille laimennoksille.
Checkerboard-menetelmällä tutkittiin kuusen kokonaisalkaloidifraktion ja penisilliinin yhteisvaikutuksia.
Pitoisuudella 110 µg/ml 1,6-dehydropinidiini esti S. equi -bakteerin kasvun täysin, joten tämä pitoisuus on yhdisteen MBC-arvo. MIC-arvo on 55 µg/ml, jolla yhdiste inhiboi bakteerin kasvua yli 70 %:sesti verrattuna kasvukontrolliin 24 tunnin kuluttua, mutta 48 tunnin kuluttua enää vain 22 %:sesti.
Gentamisiini inhiboi S. equi -bakteerin kasvua 70–80 %:sesti vähintään 7,8 µg/ml pitoisuudella, kun taas penisilliini inhiboi S. equi -bakteerin kasvua pienimmälläkin testatulla pitoisuudella 0,03 µg/ml.
Kokonaisalkaloidifraktion ja penisilliinin yhteisvaikutuksia tutkittaessa checkerboard- menetelmällä jo pienimmällä tutkitulla penisilliinipitoisuudella 0,03 µg/ml saavutettiin maksimaalinen estovaikutus, joten lisäkokeita pienemmillä penisilliinipitoisuuksilla tarvittaisiin yhteisvaikutusten määrittämiseen.
Työn tulokset osoittavat, että 1,6-dehydropinidiini estää hevosen pääntautia aiheuttavan bakteerin S. equi kasvua ainakin miedosti. Tulokset olisivat todennäköisesti olleet selvemmät, jos olisi käytetty verellä rikastettuja ravintoalustoja S. equi -bakteerille, sillä Mueller-Hinton- ravintoliemessä bakteerien hitaan kasvun vuoksi parhaimmat kasvunestoprosentit jäivät välille 70–80 %.
UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND
Department of Environmental and Biological Sciences, biology
KOSKINEN, AKSELI: Antibacterial activity of 1,6-dehydropinidine against equine strangles causing bacterium Streptococcus equi subsp. equi
MSc. Thesis (40 cp), 40 pp., Appendices 2 June 2019
key words: Picea abies, Streptococcus equi, piperidine, 1,6-dehydropinidine, antibacterial The widespread use and misuse of antibiotics has led to a rapid growth of resistant bacteria, and discovering new antibiotics has decreased in recent decades. In addition to searching new antibacterial compounds, more and more focus is put on combinational antibacterial effects of known antibiotics and natural compounds.
Alkaloids are secondary metabolites that is a structurally diverse group of compounds that function preventing predation and infections in organisms. Pinaceae family alkaloids are little studied piperidines. One such is epidihydropinidine that has been detected to have antibacterial activity. Tentatively identified 1,6-dehydropinidine functions probably as an intermediate compound in the biosynthesis route that has epidihydropinidine as an end product.
The aim of this Master of Science thesis was to extract 1,6-dehydropinidine from Norway spruce shoots and to study antibacterial effects of the compound against equine strangles causing bacterium Streptococcus equi subsp. equi. In this study, the antibacterial activity of 1,6- dehydropinidine was compared to penicillin G and gentamicin. In addition, the aim was to study possible synergistic effects of total alkaloid fraction from spruce and penicillin in inhibiting the growth of S. equi.
Alkaloids were extracted from young spruce shoots by using solid phase partitioning. The fraction containing 1,6-dehydropinidine was separated with thin layer chromatography.
Antibacterial activity of 1,6-dehydropinidine was studied with broth microdilution method by comparing the results with penicillin and gentamicin. Growth inhibition percentages were calculated for different dilutions of both 1,6-dehydropinidine and antibiotics after their absorbances were measured with a spectrophotometer. The synergistic effects of total alkaloid fraction and penicillin were studied with a checkerboard method.
1,6-dehydropinidine inhibited completely the growth of S. equi with a concentration of 110 µg/ml which is the MBC of the compound. MIC is 55 µg/ml that inhibits the growth of S. equi over 70 % after 24 hours compared to growth control, but only 22 % after 48 hours.
Gentamicin inhibited the growth of S. equi 70–80 % with a concentration of 7.8 µg/ml, whereas penicillin inhibited the growth of S. equi even with the lowest tested concentration 0.03 µg/ml.
The lowest tested penicillin concentration 0.03 µg/ml caused the maximum inhibition with the checkerboard method. More studies with lower penicillin concentrations are thus needed for surveying the synergistic effects of total alkaloid fraction and penicillin against S. equi.
This research shows that 1,6-dehydropinide inhibits to some extent the growth of S. equi.
The results would probably have been more distinct if mediums and broths enriched with blood were used for S. equi, because S. equi grew slowly in Mueller-Hinton broth and the highest growth inhibition percentages remained between 70–80 %.
SISÄLLYSLUETTELO
1 JOHDANTO ...4
2 KIRJALLISUUSOSIO ...5
2.1 Antibiootit ...5
2.2 Alkaloidit ...6
2.3 Pinaceae-alkaloidit ...7
2.4 Pääntauti ...9
3 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET... 10
4 AINEISTO JA MENETELMÄT... 10
4.1 Kasvimateriaali ... 10
4.2 Alkaloidien eristäminen kiinteäfaasiuutolla ... 12
4.3 Yksittäisten alkaloidiyhdisteiden eristäminen ohutlevykromatografian avulla ... 12
4.4 Alkaloidiyhdisteiden tunnistus ... 14
4.5 Näytteiden valmistaminen antibakteerisuusanalyyseja varten ... 17
4.6 Antibakteerisuusanalyysi ... 19
4.6.1 Tutkimuksessa käytetty bakteerikanta ... 19
4.6.2 Tutkittavien antibioottien ja kasvinäytteen valmistus kuoppalevykoetta varten ... 20
4.6.2.1 Antibioottilaimennokset ... 20
4.6.2.2 1,6-dehydropinidiinin ja kontrollinäytteen laimennokset ... 20
4.6.3 Kuoppalevymenetelmä ... 21
4.6.4 MBC-määritys ... 23
4.7 Checkerboard-menetelmä ... 24
5 TULOKSET ... 25
5.1 Kuoppalevymenetelmä ... 25
5.2 MBC-määritys ... 28
5.3 Checkerboard-menetelmä ... 32
6 TULOSTEN TARKASTELU ... 33
6.1. Kuusen piperidiinialkaloidi-uutteesta eristetyn 1,6-dehydropinidiinin antibakteeriset vaikutukset S. equi -bakteeriin... 33
6.2 MBC-määritys ja vertailuantibiootit ... 35
6.3 Kokonaisalkaloidifraktion ja penisilliinin yhteisvaikutuksia ... 36
7 JOHTOPÄÄTÖKSET ... 37
KIITOKSET ... 37
LÄHDELUETTELO ... 37 LIITTEET
4 1 JOHDANTO
Uusien antibioottien kehittämiselle on tarvetta bakteerikantojen antibioottiresistenssin vahvistuessa. Antibiootteja kehitetään synteettisesti, mutta myös luonnosta, kuten kasveista löytyy runsas joukko erilaisia antibakteerisia yhdisteitä. Kasvit tuottavat perustoiminnoilleen, kuten kasvulle, kehitykselle ja lisääntymiselle välttämättömien primaarimetaboliittien lisäksi niin kutsuttuja sekundaarimetaboliitteja, joista on myös hyötyä kasveille. Esimerkiksi jotkin kasvit erittävät myrkyllisiä tai haitallisia aineita saalistuksen tai patogeenisten mikrobien kasvun ehkäisemiseksi, tai houkuttelevat väreillä ja tuoksuilla hyönteisiä pölytyksen takaamiseksi (Drewes 2012). Kasvien sisältämät sekundaarimetaboliitit antavat yksinään usein melko heikon antimikrobisen vasteen ja onkin esitetty, että kasvit käyttävät useampaa sekundaariyhdistettä samanaikaisesti puolustautuessaan ympäristön mikrobeja vastaan (Stermitz ym. 2000, Tegos ym. 2002, Srivastava ym. 2014). Uusien kasviperäisten antimikrobiyhdisteiden seulonnassa ollaankin yhä enemmän kiinnostuneita näiden aineiden yhteisvaikutuksista tunnettujen antimikrobilääkkeiden kanssa (Abreu ym. 2017). Tällainen yhdistelmäterapia myös hidastaisi tai ehkäisisi vastustuskykyisten bakteerien kehittymistä (Cheesman ym. 2017).
Sekundaarimetaboliitteihin kuuluvat alkaloidit ovat suuri ja rakenteellisesti moninainen joukko orgaanisia yhdisteitä, joita löytyy kasveista, sienistä, eläimistä ja mikrobeista (Cushnie ym. 2014). Eräät mäntykasvien heimon (Pinaceae) suvut, kuten männyt (Pinus), kuuset (Picea) ja pihdat (Abies) tuottavat typpeä sisältäviä alkaloideja (Tawara ym. 1993). Pohjoisissa havumetsissä typpeä pidetään yleisesti kasvua rajoittavana tekijänä, joten kasvien kemialliseen puolustukseen liitetyillä alkaloideilla voi olla havupuiden kannalta merkittävä rooli herbivorian rajoittamisessa (Virjamo & Julkunen-Tiitto 2016). Havupuiden alkaloidien mahdollisesta roolista puolustautumisessa mikrobeja vastaan tiedetään kuitenkin hyvin vähän.
Pinaceae-heimon alkaloidit ovat rakenteellisesti 2,6-disubstituoituja heterosyklisiä typpiatomin sisältäviä renkaita, piperidiinejä, jotka ovat vähän tutkittuja. Pinaceae-alkaloidien trans-piperidiinien biosynteesireitin yksi lopputuotteista on epidihydropinidiini (Virjamo &
Julkunen-Tiitto 2016), jolla on havaittu antimikrobista vaikutusta (Fyhrquist ym. 2019). Saman biosynteesireitin välituotteena mahdollisesti toimii alustavasti tunnistettu 1,6-dehydropinidiini, jota esiintyy kuusella (Picea abies L. Karst) suurina määrinä nuorissa kerkissä (Virjamo &
Julkunen-Tiitto 2016, Virjamo, julkaisematon aineisto).
Streptococcus equi subsp. equi -bakteerin aiheuttama hevosen pääntauti on maailmanlaajuisesti hevosilla yleisin diagnosoitu infektiotauti (Erol ym. 2012). S. equi kuuluu
5
gram-positiivisiin kokkibakteereihin ja sitä esiintyy vain hevoseläimillä. Pääntauti on erittäin tarttuva ylempien hengitysteiden infektiotauti ja voi etenkin nuorilla hevosilla ja varsoilla johtaa kuolemaan. Pääntaudin oireina on kehittyvä kuume, nielutulehdus ja imusolmukkeiden turpoaminen sekä paiseiden muodostuminen kaulan alueella (Boyle ym. 2018). Pääntauti voi kestää kuukausia tai jopa vuosia maatiloilla ja talleilla aiheuttaen merkittäviä taloudellisia vaikutuksia hevosten pitkien eristys-, hoito- ja toipumisjaksojen vuoksi (Arias 2013).
Tämän pro gradu -tutkielman tavoitteena on selvittää kuusen neulasista eristetyn 1,6- dehydropinidiinin antibakteerisuusominaisuuksia tutkittavalla bakteerilla S. equi. Lisäksi tavoitteena on tutkia kuusen neulasista eristetyn kokonaisalkaloidiuutteen mahdollisia yhteisvaikutuksia penisilliinin kanssa S. equi -bakteerin kasvun estossa.
2 KIRJALLISUUSOSIO
2.1 Antibiootit
Huomattava osa infektioista ovat bakteeriperäisiä. Antibiootit ovat olleet suositeltu hoitokeino infektioihin hyvien tulostensa ja edullisuutensa vuoksi. Antibioottien laaja ja väärä käyttö on johtanut antibiooteille vastustuskykyisten bakteerikantojen syntymiseen. Tästä syystä uusien antibakteeristen yhdisteiden etsimiseen ja testaamiseen on syytä kiinnittää huomiota (Tanase ym. 2018).
Bakteerien antibioottiresistenssin nopean yleistymisen lisäksi uusien antibioottien löytyminen on viimeisten vuosikymmenien aikana hidastunut. Laajalle levinneen antibioottien liiallisen käyttämisen ja väärinkäyttämisen vuoksi osa bakteereista ovat kehittäneet vastustuskyvyn useille eri antibioottityypeille. Tällaiset multiresistentit bakteerit (engl. multi- drug resistant, MDR), laajasti lääkkeille resistentit bakteerit (engl. extensively drug resistant, XDR) tai jopa lääkkeille täysin resistentit bakteerit (engl. totally drug resistant, TDR) luovat merkittävän uhan ihmisten terveydelle. Maailman terveysjärjestön (World Health Organization, WHO) mukaan antibiooteille vastustuskykyisten bakteerien yleistyminen ja niiden ehkäiseminen ovat kenties nykylääketieteen suurin haaste (Cheesman ym. 2017).
Antibiootit tappavat bakteereita tai estävät niiden kasvua esimerkiksi pysäyttämällä proteiinien ja muiden metaboliittien synteesin, häiritsemällä solunjakautumista tai vahingoittamalla soluseinää (Cheesman ym. 2017). Bakteerit voivat kehittää vastustuskyvyn synnynnäisesti valintapaineen seurauksena, tai ne voivat saada vastustuskyvyn aikaansaavan geneettisen materiaalin suoraan ympäristöstään. Bakteerit kykenevät vastustamaan
6
antibiootteja estämällä niiden pääsyn kalvojen läpi, tuottamalla antibiootteja hajottavia tai niiden toimintaa ehkäiseviä entsyymejä tai tuottamalla antibiootteja solusta poistavia pumppuja (Cheesman ym. 2017, Gupta & Birdi 2017).
Uusien antibioottien etsinnässä kiinnitetään yhä enemmän huomiota jo käytössä olevien antibioottien ja luonnontuotteiden antibakteerisiin yhteisvaikutuksiin. Yhdistelmäterapia voi vahvistaa heikkojen antimikrobilääkkeiden tehoa bakteereihin ja yhteisvaikutus voi olla synergistinen eli voimakkaampi kuin yhdisteiden erilliset vaikutukset yhteensä (Cheesman ym.
2017).
2.2 Alkaloidit
Kasvit kehittävät ainutlaatuisia kemikaaleja suojatakseen itseään erilaisilta mikrobeilta. Kasvit ovat aina olleet lähteenä rohdoksille, joilla hoidetaan erilaisia sairauksia. Nykyäänkin kasveista saadaan merkittävä osa lääkkeistä. Kehitysmaissa ihmiset hyödyntävät edelleen perinnelääkintää, mutta kasvilääkinnän pitkästä historiasta huolimatta vain harva kasvilaji on perinpohjaisesti tutkittu lääkepotentiaalin kannalta (Singh ym. 2011).
Sekundaarimetaboliittien pitoisuudet vaihtelevat eri kasvilajien välillä, saman kasvilajin eri yksilöiden välillä ja jopa saman kasviyksilön eri osien välillä (Stermitz ym. 1994). Tämän vuoksi kasvilajin eri yksilöiden sekä eri kasvinosien analysoiminen on tärkeää hyväksikäytettäessä kasvin farmakologista potentiaalia (Singh ym. 2011).
Sekundaarimetaboliitteihin kuuluvat alkaloidit ovat rakenteellisesti hyvin moninainen yhdisteryhmä, jonka molekyylejä yhdistää vapaan elektroniparin omaava emäksinen typpiatomi ja se, että alkaloidit ovat aminohappojen johdannaisia tai syntyvät transaminaatioprosesseissa (Aniszewski 2007). Suurimmassa osassa alkaloideista on yksi typpiatomi, mutta joissakin voi olla jopa viisi. Typpi voi olla osana primaarista amiinia (RNH2), sekundaarista amiinia (R2NH) tai tertiääristä amiinia (R3N). Hiilen, vedyn ja typen lisäksi suurimmassa osassa alkaloideja on myös happea. Alkaloidit voivat esiintyä mono-, di- tri- ja tetrameereinä, yleensä homo-oligomeereinä rakentuen samoista yksiköistä, mutta alkaloidit voivat esiintyä myös hetero-oligomeereinä (Cushnie ym. 2014).
Alkaloideja tuottavat erityisesti kasvit, mutta myös sienet, eläimet ja mikrobit. Eri eliöryhmissä alkaloidien moninaisiin tehtäviin kuuluvat esimerkiksi saalistuksen ja infektioiden estäminen (Cushnie ym. 2014). Fysikaalis-kemiallisilta ominaisuuksiltaan suurin osa alkaloideista ovat kiinteitä, mutta hapettomat alkaloidit ovat nestemäisiä. Alkaloidit liukenevat heikosti veteen tai muihin poolisiin liuottimiin, ja liukenevat helposti poolittomiin liuottimiin
7
(Cushnie ym. 2014). Joitakin käytetyimpiä kasviperäisiä alkaloideja ovat kahvista (Coffea) ja teestä (Camellia) saatava kofeiini (Mazzafera 1999), tupakasta (Nicotiana) saatava nikotiini (Jacob ym. 1999), kiinapuusta (Cinchona) saatava kiniini (Tian ym. 2003), kokapensaasta (Erythroxylum) saatava kokaiini (Bailey 1995) ja oopiumiunikosta (Papaver somniferum L.) saatava morfiini (Grothe ym. 2001).
Alkaloidien typpiatomi voi vastaanottaa protonin ja aminoryhmä voi luovuttaa protonin, joten alkaloidit tekevät herkästi vetysidoksia erilaisten proteiinien, entsyymien ja reseptorien kanssa (Cushnie ym. 2014). Tämän lisäksi alkaloidimolekyyleissä on usein muita protoneja luovuttavia ja vastaanottavia funktionaalisia ryhmiä, mikä selittää alkaloidien poikkeuksellista bioaktiivisuutta. Alkaloidit ovatkin tänä päivänä tutkimuksen kohteena mahdollisten antibakteeristen ominaisuuksiensa johdosta (Cushnie ym. 2014).
2.3 Pinaceae-alkaloidit
Mäntykasvien heimon (Pinaceae) alkaloidit ovat pienen molekyylipainonsa vuoksi muista alkaloideista poiketen suhteellisen vesiliukoisia ja haihtuvia yhdisteitä (Tawara ym. 1993).
Piperidiinialkaloidin perusrunkona on heterosyklinen yhden typpiatomin ja viiden hiiliatomin rengas. Pinaceae-alkaloidit ovat rakenteellisesti 2,6-disubstituoituja piperidiinejä, eli piperidiinirungon typpiatomista laskettuna toiseen ja kuudenteen hiiliatomiin on liittyneenä sivuketjut (Kuva 1). Biosynteesireittinsä perusteella Pinaceae-alkaloidit ovat pseudoalkaloideja, koska niiden hiilirunko ei ole lysiinistä peräisin (Virjamo & Julkunen-Tiitto 2016).
Pinaceae-heimon suvuista männyt (Pinus) ja pihdat (Abies) tuottavat cis-2,6-disubstituoituja piperidiinejä, kun taas kuuset (Picea) kykenevät tuottamaan sekä cis- että trans-2,6- disubstituoituja piperidiinialkaloideja. Cis-piperidiinien biosynteesireitin lopputuotteet ovat euphococciniini sekä cis-pinidiini ja trans-piperidiinien biosynteesireitin lopputuotteet ovat trans-pinidiini sekä epidihydropinidiini (Kuva 1). Mäntykasvien varttuneissa osissa alkaloidisaannon yhdisteistä suurin osa on tyypillisesti edellä mainittuja lopputuotteita, mutta kehittyvissä osissa biosynteesireittien välituotteiden määrä voi suhteellisesti olla suurempi kuin lopputuotteiden (Virjamo & Julkunen-Tiitto 2016).
Trans-piperidiinien synteesireitin välituotteena todennäköisesti toimii alustavasti tunnistettu 1,6-dehydropinidiini, jolla on piperidiinirungossaan kaksoissidos typen ja hiilen välillä. 2- hiileen on liittynyt metyyliryhmä, ja 6-hiileen kolmihiilinen propeeni, jonka kahden piperidiinirunkoa lähempänä olevan hiiliatomin välillä on kaksoissidos (Tawara 1994, Gerson
8
& Kelsey 2004, Virjamo & Julkunen-Tiitto 2016) (Kuva 1). 1,6-dehydropinidiiniä esiintyy kuusella nuorissa kerkissä suurina määrinä verrattuna muihin piperidiinialkaloideihin (Virjamo, julkaisematon aineisto). Lisäksi kuusenkerkkiä on käytetty perinnelääkinnässä, minkä vuoksi 1,6-dehydropinidiini ja muut kuusen alkaloidit ovat tutkimuskohteena kiinnostavia yhdisteitä.
Kuva 1. Pinaceae-piperidiinialkaloidien biosynteesireitti. Pinaceae-alkaloidien trans- piperidiinien biosynteesireitin (oikealla puolella) yksi lopputuotteista on epidihydropinidiini, jolla on havaittu antimikrobista vaikutusta (Fyhrquist ym. 2019). Saman biosynteesireitin välituotteena mahdollisesti toimii alustavasti tunnistettu 1,6-dehydropinidiini (Virjamo &
Julkunen-Tiitto 2016).
9 2.4 Pääntauti
Streptococcus equi subsp. equi -bakteerin (lyhennetään tästä eteenpäin S. equi) aiheuttama pääntauti on erittäin tarttuva vain hevoseläimillä esiintyvä ylempien hengitysteiden infektiotauti. Pääntauti on tunnettu yli kahden vuosituhannen ajan, sillä se on mainittu muun muassa Rooman imperiumin armeijan eläinlääkärien toimesta (Lindahl ym. 2013). Pääntaudista raportoi ensimmäisenä Jordanus Ruffus vuonna 1251. Tänä päivänä pelkästään Yhdistyneissä Kuningaskunnissa todetaan vuosittain 1000 uutta pääntautitapausta (Waller 2013), ja maailmanlaajuisesti esiintyvä pääntauti aiheuttaa merkittäviä taloudellisia kustannuksia hevosten pitkien eristys-, hoito- ja toipumisjaksojen vuoksi (Arias 2013).
S. equi kuuluu gram-positiivisiin β-hemolyyttisiin kokkibakteereihin, eli se aiheuttaa verisolujen täydellisen hajoamisen. Veriagaralustalla tämä näkyy kirkkaana vyöhykkeenä bakteeripesäkkeiden ympärillä (Arias 2013). S. equi -bakteerin virulenssiin liittyvät streptokokeille ominainen hyaluronikapselin muodostaminen ja eksotoksiinien eritys (Wessels ym. 1991, Cole ym. 2015).
S. equi kulkeutuu hevoseen sierainten tai suun välityksellä saastuneen ruoan, juomaveden tai valjaiden kautta sekä kontaktilla toiseen hevoseen tai sairaan hevosen sierainten tai paiseiden eritteeseen. Pääntauti voi tarttua myös oireettomasta hevosesta, joka kantaa tautia (Cole ym.
2015). S. equi voi selvitä viikkoja juottokaukaloissa, mutta bakteeri kuolee nopeasti maaperässä ja laitumilla. Populaatiotiheys ja eläinten liikkuminen kasvattavat sairastumisalttiutta (Timoney 2000).
S. equi tarttuu ylempien hengitysteiden epiteelisoluihin. Bakteeri monistuu kaulan imusolmukkeissa kolmen tunnin sisällä tartunnasta. Neutrofiilit siirtyvät imusolmukkeisiin, mutta eivät ole tehokkaita fagosytoimaan bakteeria (Waller 2013). Imusolmukkeiden tulehtumisen ja paiseiden muodostumisen lisäksi pääntaudin oireina ovat kuume ja nielutulehdus. Kuume, joka voi nousta jopa +42°C:seen, voi säilyä paiseiden puhkeamiseen asti. Nielutulehdus voi aiheuttaa yskää ja hevosen haluttomuutta syödä tai juoda.
Imusolmukkeiden turpoamisesta voi seurata hengitys- ja nielemisvaikeuksia ja vuoto sieraimista on yleistä (Boyle ym. 2018).
Taudin hallinta ja ehkäisy ovat haastavia huolimatta kaupallisista rokotteista: Equilis StrepE on saatavilla Euroopassa ja Pinnacle IN Yhdysvalloissa. Molemmat rokotteet sisältävät eläviä, mutta heikennettyjä S. equi -bakteereja. Tehokkain tapa ennaltaehkäistä pääntautia on altistuksen rajoittaminen eristämällä ja tarkastamalla mahdolliset uudet hevoset maatiloilla.
Mahdollisesti saastuneet välineet tulisi desinfioida (Arias 2013, Boyle ym. 2018). Pääntaudin
10
kontrolloimisessa oleellista on taudin havaitseminen myös oireettomilla kantajilla, jotka tulisi myös eristää. Pääntauti voidaan diagnosoida sekä soluviljelyllä että tarkemmalla, mutta kalliimmalla DNA-diagnostiikkaan perustuvalla testillä (Cole ym. 2015). Pääntauti saattaa vallita 4‒6 kuukautta maatilalla alttiissa populaatiossa asianmukaisten eristysmenetelmien puuttuessa. Vaikka pääntaudin kontrolloiminen on kallista, kustannukset ovat matalammat kuin pääntautiepidemian puhkeamisesta seuraavat pitkät hevosten toipumis- ja eristysjaksot sekä hoito kustantaisivat (Arias 2013).
Suurin osa pääntaudin sairastaneista eläimistä saa immuniteetin kyseistä sairautta vastaan, mutta jotkin yksilöt voivat saada saman taudin toisen ja jopa kolmannen kerran. (Timoney 2000). Altistuneissa populaatioissa pääntaudin sairastavuus on 85 %‒100 %, mutta kuolleisuus on matalahko 4 %‒8 % (Arias 2013).
Suurimmassa osassa pääntautitapauksia hoidoksi riittää kunnollinen lepo, lämmin talli sekä hyvälaatuinen, pehmeä ja kostea ruoka, jolloin tauti sairastetaan luonnollisella tavalla.
Eläinlääkärien keskuudessa ei edelleenkään ole yhteistä mielipidettä antibioottihoidon hyödyllisyydestä pääntaudin tapauksessa. Epäillään, että antibioottien käyttäminen mahdollisesti lisää riskiä pääntaudin leviämisessä metastaattiseksi, ja antibiootit saattavat estää antigeenien synteesiä heikentäen luonnollisen immuniteetin syntymistä (Boyle ym. 2018).
Antibiooteista pääntautiin tehoavat penisilliini ja gentamisiini, joista voi olla hyötyä esimerkiksi vakavien hengitysvaikeuksien hoidossa (Cole ym. 2015, Boyle ym. 2018).
3 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET
Tutkimuksen tavoitteena oli uuttaa ja puhdistaa 1,6-dehydropinidiiniä kuusen kerkistä ja tutkia kyseisen yhdisteen antibakteerisuutta hevosilla pääntautia aiheuttavaa Streptococcus equi subsp. equi -bakteeria vastaan. Tutkimuksessa verrattiin 1,6-dehydropinidiinin antibakteerisuutta kahteen tunnettuun antibioottiin, penisilliini G:hen ja gentamisiiniin. Lisäksi työn tarkoituksena oli tutkia kuusen neulasista eristetyn kokonaisalkaloidifraktion mahdollisia vaikutuksia penisilliinin tehokkuuteen S. equi -bakteerin kasvun estossa.
4 AINEISTO JA MENETELMÄT
4.1 Kasvimateriaali
Kasvimateriaali oli siemenalkuperää olevista metsän uudistamiseen tarkoitetuista kuusen kaksivuotisista pakastetaimista (Fin Forelia Oy) (Liite 1). Taimet istutettiin turpeeseen (Kekkilä
11
Oy) ja kasvatettiin kerkkävaiheeseen kasvihuoneessa (Itä-Suomen yliopisto, Ympäristö- ja biotieteiden laitos, Joensuu) keväällä 2017. Kerkät oli kerätty ja pakastettu pusseissa myöhempää käyttöä varten (Kuva 2). Taimien kasvatus oli gradututkielman kokeellisen osion ainoa osuus, johon gradun kirjoittaja ei itse osallistunut. Tästä eteenpäin kaikki työvaiheet on tehty tutkielman kirjoittajan toimesta ohjaajien neuvomana.
Kuva 2. Kerkkävaiheeseen kasvatettu kasvimateriaali (Kuva: Virpi Virjamo).
12 4.2 Alkaloidien eristäminen kiinteäfaasiuutolla
Alkaloidit eristettiin kasvimateriaalista Virjamo ym. 2013 mukaillen. Nuoret kuusenkerkät jauhettiin huhmareen ja survimen avulla nestetypessä hienoksi jauheeksi. 10 grammaa jauhettua kasvimateriaalia kohti lisättiin 85 ml 0,5 M HCl:a. Liuosta inkuboitiin noin tunnin ajan magneettisekoittajalla. Inkuboitu liuos imusuodatettiin (SUE 30, Heto). Liuoksen pH säädettiin emäksiseksi (pH > 12) lisäämällä 12,5 ml 6 M NaOH:a. Liuos jaettiin Extrelut-kolonneihin (NT 20 PE, Merck, Saksa) niin, että yhtä kolonnia kohti oli enintään 20 ml liuosta. 10 minuutin kuluttua liuosten kolonneihin lisäämisestä kolonnit eluoitiin 18 ml dikloorimetaanilla kolmesti 20 minuutin välein. Eluentit yhdistettiin haihdutettavaksi 1–2 ml tilavuuteen pyöröhaihduttajalla (Heidolph, Laborota 4002, Rotavac senso). Pyöröhaihduttajan lämpötila pidettiin vakiona +40 °C ja paine vakiona 850 millibaarissa. Valmiit näytteet säilytettiin tiiviisti suljetuissa HPLC-pulloissa (engl. high performance liquid chromatography) jääkaapissa +8 °C lämpötilassa.
Alkaloidieristyksen onnistuminen tarkastettiin kaasukromatografian avulla (Kuva 3) (Virjamo ym. 2013).
Kuva 3. Kokonaisalkaloidifraktion kaasukromatogrammi. X-akselilla on retentioaika minuutteina ja y-akselilla on yhdisteen suhteellinen määrä (engl. abundance). Kuusen alkaloidiyhdisteet esiintyvät retentioajoilla 2–6 minuuttia (Virjamo ym. 2013).
4.3 Yksittäisten alkaloidiyhdisteiden eristäminen ohutlevykromatografian avulla
Silikageelilevyt (PLC Silica gel 60 F254, 2 mm, Merck KGaA, Darmstadt, Saksa) kasteltiin ajoliuoksessa ajokammiossa ennen näytteiden applikointia (Liite 2). Levyt kuivattiin
13
lämpökaapissa tunnin ajan +80 °C lämpötilassa, jonka jälkeen ne laitettiin eksikaattoriin jäähtymään huoneenlämpöisiksi. Näyte applikoitiin jäähtyneille geelilevyille kapillaaripipetillä 10 µl kärjellä janalle noin 2,5 cm levyjen alareunasta 0,5 cm välein, kuitenkin 2 cm vasemmasta ja oikeasta reunasta tyhjäksi jättäen. Ajokammioiden pohjalle kaadettiin ajoliuosta sen verran, että se nousi enintään 2,5 cm korkeudelle. Levyt asetettiin ajoliuokseen, ja liuoksen annettiin nousta noin neljä viidesosaa levyjen korkeudesta, jonka jälkeen levyt otettiin ajokammioista kuivumaan (Kuva 4).
Kuva 4. Havainnollistava kuva ohutlevykromatografia-ajosta (engl. thin layer chromatography, TLC) (vasemmalla) ja jodivärjäyksestä (oikealla). TLC-ajossa ajokammion pohjalla oleva ajoliuos nousee kapillaari-ilmiön vuoksi levyä kastellen. Liuosrintaman annetaan nousta levyllä korkealle kuitenkaan yläreunaa saavuttamatta, jolloin eri yhdisteitä sisältävät fraktiot erottuvat toisistaan. Jodivärjäyksessä valkoisilla nuolilla on merkitty eniten 1,6-dehydropinidiiniä sisältävät vyöhykkeet. Kontrollinäytevyöhyke on merkitty aaltosulkeella { värjäytyneiden vyöhykkeiden yläpuolelle alueelle, jolle ajoliuosrintama ei noussut (Kuva: Virpi Virjamo).
14
Kuivuneiden silikageelilevyjen reunoista leikattiin pystysuunnassa palat jodivärjäystä varten. Palat asetettiin jodikammioon kiinteän jodin kanssa vähintään muutamaksi tunniksi.
Jodilla värjäytyneitä vyöhykkeitä vastaavat kohdat merkattiin lyijykynällä vastaaviin värjäämättömiin silikageelilevyihin. Kontrollinäytettä varten lyijykynällä merkattiin levyihin ajoliuosrintaman yläpuolelta vajaan senttimetrin korkuinen vyöhyke, jossa ei ollut jodivärjäyksen perusteella alkaloideja (Kuva 4). Näyte- ja kontrollivyöhykkeet raaputettiin omiin dekantterilaseihinsa. Näytteeseen ja kontrolliin lisättiin 20 ml 0,5 M HCl:a, ja liuoksia inkuboitiin magneettisekoittajalla noin 15 minuutin ajan. Liuosten pH säädettiin lisäämällä 2,5 ml 6 M NaOH:a.
Liuokset kaadettiin kahteen Extrelut-kolonniin. 10 minuutin kuluttua liuosten kolonneihin lisäämisestä kolonnit eluoitiin 18 ml dikloorimetaanilla kolmesti 20 minuutin välein. Näyte- ja kontrollieluentit haihdutettiin 1–2 ml:n tilavuuteen pyöröhaihduttajalla. Pyöröhaihduttajan lämpötila pidettiin vakiona +40 °C ja paine vakiona 850 millibaarissa. Valmiit näytteet säilytettiin tiiviisti suljetuissa HPLC-pulloissa jääkaapissa +8 °C lämpötilassa.
4.4 Alkaloidiyhdisteiden tunnistus
Kokonaisalkaloidifraktion ja jodivärjäytymiä vastaavien yksittäisten vyöhykkeiden sisältämät alkaloidiyhdisteet tunnistettiin kaasukromatografi-massaspektrometrillä (engl. gas chromatography mass spectrometry, GC-MS) vertaamalla retentiojärjestystä ja massaspektriä kirjallisuuteen (Virjamo ym. 2013, Taulukko 1). Esimerkiksi 1,6-dehydropinidiinille laskettiin GC-MS-ajosta seuraavat fragmentit ja niiden suhteelliset osuudet seuraavasti (Kuva 5, Taulukko 1): yleisin fragmentti (massa = 122, suhteellinen määrä = 8945) asetettiin sadaksi prosentiksi ja muiden merkittävien piikkien massat laskettiin suhteessa tähän fragmenttiin.
Toisiksi suurimman suhteellisen määrän (5480) omaavan fragmentin (massa = 68) prosentuaaliseksi osuudeksi laskettiin: (5480/8945) 100 % = 61,26… % ≈ 61 %. Samalla tavalla piikeille 84, 94 ja 137 laskettiin prosentuaalisiksi osuuksiksi 26 %, 23 % ja 36 %.
15
Kuva 5. 1,6-dehydropinidiinin massaspektri. X-akselilla on massa/varaussuhde (engl. mass-to- charge ratio, m/z) ja y-akselilla on fragmentin suhteellinen määrä.
Taulukko 1. Kokonaisalkaloidifraktiossa ja yksittäisissä alkaloidifraktioissa esiintyvien alkaloidiyhdisteiden tunnistus kaasukromatografilta. Rt (retention time) on minuutteina, M on yhdisteen moolimassaa vastaavan massan omaava fragmentti, suluissa on fragmentin esiintyvyys yhdisteessä (yleisin fragmentti asetettuna 100 % ja muut fragmentit suhteessa tähän). Asteriskilla * on merkitty yhdisteet, joiden tunnistus on alustava ja perustuu pelkkään GC-MS-dataan. Lopullinen nimi vaatii rakenteen varmistuksen NMR-tunnistuksella (engl.
nuclear magnetic resonance). Tunnistuksessa on käytetty kirjallisuutta ja spektrikirjastoa (Wiley275). Samankaltaisuus spektrikirjaston yhdisteiden kanssa on ilmoitettu prosentteina.
Yhdiste Rt m/z (%) Tunnistus
2-metyyli-6- propyyli-1,6- piperideine
3,39 139 [M] (19), 124 (44), 111 (51), 96 (100), 70 (30)
Todd ym. 1995
epidihydropinidiini 3,41 141 [M] (1), 126 (7), 98 (100), 81 (4)
Tawara ym. 1993
(83 % samankaltaisuus Wiley275
#28858) trans-pinidiini 3,49 139 [M] (33), 124 (100), 111
(19), 96 (67), 82 (44) Todd ym. 1995
(94 % samankaltaisuus Wiley275
#27236)
*alustava 1,6- dehydropinidiini
3,97 137 [M] (36), 122 (100), 94 (23), 84 (26) 68 (61)
Tawara 1994, Gerson & Kelsey 2004, Virjamo, julkaisematon aineisto
epipinidinone 4,53 155 [M] (7), 140 (21), 112 (15), 98 (100), 82 (70)
Tawara ym. 1993
(95 % samankaltaisuus Wiley275
#41334) cis-pinidinoli 4,56 157 [M] (2), 142 (9), 98 (100),
82 (7)
Tawara ym. 1993
(87 % samankaltaisuus Wiley275
#43203)
*alustava 1,6- dehydropinidinone
5,32 153 [M] (9), 110 (23), 97 (9), 96 (100), 94 (19)
Virjamo & Julkunen-Tiitto 2014
16
1,6-dehydropinidiinin rakennetta ei ole kirjallisuudessa varmistettu, joten yhdisteen tunnistus on alustava. Tämän vuoksi 1,6-dehydropinidiinin massa varmistettiin analysoimalla sitä sisältävä fraktio suorasyötöllä Q-ToF-massaspektrometrille (engl. quadrupole time of flight) (Virjamo ym. 2014). Q-ToF-massaspektrometrillä yhdisteen massa voidaan todeta neljän desimaalin tarkkuudella kaasukromatografin antaman yhden desimaalin tarkkuuden sijasta (Kuva 6). 1,6-dehydropinidiininäyte valmisteltiin Q-ToF-ajoa varten haihduttamalla näyte pyöröhaihduttajalla mahdollisimman tyhjäksi, jonka jälkeen näytteen kuivaus viimeisteltiin jättämällä se vähintään puoleksi tunniksi vetokaappiin. Haihdutettuun pulloon lisättiin 1 ml 99,9 % etanolia (Etax Aa), pulloa pyöriteltiin varovaisesti näytejäämien liuottamiseksi etanoliin ja liuos siirrettiin HPLC-pulloon.
Q-ToF-ajoista 1,6-dehydropinidiinille laskettiin massaspektrometrisen analyysin tarkkuutta mittaavat ppm-arvot (engl. parts per million) tunnistuksen varmentamiseksi.
M = molekyylimassa
ppm = (M mitattu - M laskettu) 106 M laskettu-1 1,6-dehydropinidiinin (C9H15N) massa:
M laskettu: M(C9H15N) = M(C9) + M(H15) + M(N) = 9 12,0000 + 15 1,0078 + 14,0031 = 137,1201
M mitattu: 138,1278 - 1,0078 = 137,1200 (yhdisteeseen positiivisessa moodissa sitoutunut vety M = 1,0078 vähennetty)
ppm: (137,1200 - 137,1201) 106 137,1201-1 = -0,729…
Ppm-arvo on riittävän lähellä nollaa, joten tunnistus voidaan pitää luotettavana.
17
Kuva 6. 1,6-dehydropinidiinin (+ vety) massan tarkastaminen Q-ToF-massaspektrometrillä (138,1278). Tätä epäpuhdasta fraktiota ei käytetty varsinaisissa antibakteerisuustesteissä.
Kokonaisalkaloidifraktiosta oli 2-metyyli-6-propyyli-1,6-piperideineä 13 %, epidihydropinidiiniä 17 %, trans-pinidiiniä 9 %, alustavasti tunnistettua 1,6-dehydropinidiiniä 36 %, epipinidinone + cis-pinidinolia 13 % ja alustavasti tunnistettua 1,6-dehydropinidinonea 11 %. (Kuva 3, Taulukko 1).
4.5 Näytteiden valmistaminen antibakteerisuusanalyyseja varten
Antibakteerisuusanalyyseissä käytetiin 1,6-dehydropinidiiniä sisältävää fraktiota, kontrollifraktiota ja kokonaisalkaloidifraktiota.
1,6-dehydropinidiinifraktio koostui kahdesta ylimmästä ohytlevykromatografian erottelemasta vyöhykkeestä (Kuva 4), joissa todettiin runsaasti 1,6-dehydropinidiiniä ja hyvin vähäisiä määriä muita epäpuhtauksia (Kuva 7). Kun TLC-ajoista oli tunnistettu haluttu vyöhyke, eristyksiä toistettiin, kunnes arvioitu saanto oli riittävä. Kaikki kaasukromatografianalyysin perusteella kelvolliset 1,6-dehydropinidiinifraktiot yhdistettiin keskenään ja yhdistelmäliuoksesta otettiin 200 µl näytteet kaasukromatografilla tapahtuvaa pitoisuuden määrittämistä varten (Taulukko 2).
18
Kasvimateriaalin lähtömassa oli 28 g ja 1,6-dehydropinidiiniä saatiin eristettyä noin 0,22 mg (Taulukko 2). Osa ohytlevykromatografiasta saaduista fraktioista kuitenkin hylättiin epäpuhtaina, joten tarkkaa saantoa ei ole tiedossa.
Kuva 7. 1,6-dehydropinidiininäytteen kaasukromatogrammi. X-akselilla on retentioaika minuutteina. 1,6-dehydropinidiinipiikki näkyy noin neljän minuutin kohdalla.
Taulukko 2. Yhdistettyjen 1,6-dehydropinidiinifraktioiden kokonaisnäytteen pitoisuuden määritys kaasukromatografiajon avulla. Kokonaisnäyte ajettiin triplikaattina, josta keskiarvona laskettiin 1,6-dehydropinidiinin määrä näytteessä. Antibakteerisuustesteihin vietiin tilavuudeltaan 250 µl näyte, jolle laskettiin pitoisuudeksi noin 0,879 mg/ml. y = yhdisteen kaasukromatogrammipiikin integroitu pinta-ala, raseemisen epidihydropinidiinin standardisuora: y = -1190589 + 4,69 107 x, jossa x on µg epidihydropinidiiniä injisointitilavuudessa (2 µl) (Virjamo ym. 2013). Kokonaisalkaloidifraktion pitoisuudet laskettiin vastaavalla tavalla.
Silikageelilevyistä raaputettiin 1,6-dehydropinidiinivyöhykkeiden lisäksi kontrollinäytevyöhykkeet antibakteerisuustestejä varten (Kuva 4). Kontrollinäytteen tarkoitus oli rajata poiskäytettyjen liuosten, pylväiden ja silikageelilevyjen aiheuttamien epäpuhtauksien vaikutus antibakteerisuusanalyyseissä. Kaasukromatografin massaspektrikirjaston (Wiley275) mukaan kontrollinäyte sisälsi pentadekaania, n-nonadekaania ja 4,7-dimetyloitua undekaania (Kuva 8). Kontrollinäytteen sisältämiä hiilivetyjä oli epäpuhtautena myös 1,6-
y x injisointitilavuus (2 µl) huomioiden (mg/ml) 1,6-dehydropinidiinin massa 10 ml:ssa (mg)
840970 0,0433 0,0217 0,2166
871505 0,0440 0,0220 0,2198
900879 0,0446 0,0223 0,2230
massan keskiarvo (mg) 250 µl näytteen konsentraatio (mg/ml)
0,2198 0,8792
19
dehydropinidiininäytteessä (Kuva 7), mutta noin 30 % pienemmissä pitoisuuksissa kuin kontrollinäytteessä.
Kuva 8. Kontrollinäytteen kaasukromatogrammi. X-akselilla on retentioaika minuutteina. Piikit ovat pentadekaani (6,03 min), n-nonadekaani (7,37 min) ja 4,7-dimetyloitu undekaani (8,58 min).
Tämän jälkeen kaikkien antibakteerisuusanalyyseissä käytettävien näytteiden (1,6- dehydropinidiini, kontrollinäyte ja kokonaisalkaloidifraktio) liuottimet vaihdettiin dikloorimetaanista vedeksi. Sekä alkaloidi- että kontrollinäytteet haihdutettiin mahdollisimman tyhjiksi pyöröhaihduttajalla, jonka lämpötila pidettiin vakiona +40 °C ja paine vakiona 850 millibaarissa. Näytteiden kuivaus viimeisteltiin jättämällä pullot vähintään puoleksi tunniksi vetokaappiin.
Tyhjentyneiden sekä alkaloidi- että kontrollinäytteiden pullojen sisäreunoille lisättiin 250 µl steriiliä MQ-vettä. Pulloja pyöriteltiin varovasti samalla kun reunoja huuhdeltiin vedellä, jotta näytejäämät jäisivät veteen. Lopulta näytteet pipetoitiin omiin 0,5 ml Eppendorf- mikrosentrifuugiputkiin, jotka suljettiin tiiviisti parafilmillä. Näytteet säilytettiin jääkaapissa +8 °C lämpötilassa.
4.6 Antibakteerisuusanalyysi
4.6.1 Tutkimuksessa käytetty bakteerikanta
Työssä käytettiin hevosen pääntautia aiheuttavaa Streptococcus equi. subsp. equi ATCC 9528 -bakteerikantaa.
20
4.6.2 Tutkittavien antibioottien ja kasvinäytteen valmistus kuoppalevykoetta varten
4.6.2.1 Antibioottilaimennokset
Tutkimuksessa käytettävistä tunnetuista antimikrobilääkkeistä gentamisiinistä ja penisilliini G:stä valmistettiin kantaliuokset metanoliin pitoisuudeksi 10 mg/ml. Gentamisiinin sulfaattisuolaa (Sigma-Aldrich) ja penisilliini G:tä (BioChemica) punnittiin 10 mg omiin koeputkiinsa. Molemmat antibiootit liuotettiin 1000 µl metanoliin. Gentamisiini ja penisilliini valittiin vertailuantimikrobilääkkeiksi, sillä molempia käytetään yleisesti hevosen pääntaudin hoidossa, ja niiden on todettu olevan verrattain tehokkaita (Cole ym. 2015).
Kuoppalevykoetta varten antimikrobilääkkeistä tehtiin laimennokset MIC- (engl. minimum inhibitory concentration, pienin bakteerin kasvua estävä pitoisuus) ja MBC-määrityksiä (engl.
minimum bactericidal concentration, pienin bakteeria tappava pitoisuus) varten. Ensimmäinen laimennos tehtiin kymmenkertaiseksi kantaliuoksesta (10 mg/ml) yhdistämällä Eppendorf- mikrosentrifuugiputkeen 900 µl Mueller-Hinton-ravintolientä ja 100 µl antibioottiliuosta. Tästä eteenpäin antibioottia laimennettiin kaksinkertaisesti 500 µl edellistä pitoisuutta siirtäen aina uuteen putkeen ja lisäten sinne 500 µl Mueller-Hinton-lientä. Molemmille antibiooteille tehtiin samanlaiset laimennossarjat viiteentoista tilavuudeltaan kahden millilitran Eppendorf- mikrosentrifuugiputkeen pitoisuuksilla 1000, 500, 250, 125, 62,50, 31,25 15,62, 7,81, 3,90, 1,95, 0,97, 0,48, 0,244, 0,122 ja 0,061 µg/ml.
Jokaisen uuden laimennoksen synnyttyä laimennosta sekoitettiin pumppaamalla pipetillä liuosta sisään ja ulos kymmenisen kertaa, ennen kuin laimennosta siirrettiin seuraavaan putkeen. Työskentely tehtiin laminaarikaapissa käyttäen steriilejä pipetinkärkiä ja jokaisen laimennoksen kohdalla uuteen kärkeen vaihtaen. Jokaiseen putkeen jäi 500 µl liuosta, paitsi viimeiseen (0,061 µg/ml), johon jäi 1000 µl liuosta.
4.6.2.2 1,6-dehydropinidiinin ja kontrollinäytteen laimennokset
1,6-dehydropinidiini- ja kontrollinäytteestä (250 µl) otettiin puolet (125 µl) ensimmäiseen laimennokseen 375 µl Mueller-Hinton-liemen kanssa, jolloin alkuperäinen pitoisuus (879 µg/ml) laski neljäsosaan (219,75 µg/ml). Seuraavat viisi laimennosta tehtiin kaksinkertaisesti seuraaviin pitoisuuksiin (µg/ml): 109,88, 54,94, 27,47, 13,73 ja 6,87. Edellistä liuosta siirrettiin aina 250 µl seuraavaan putkeen, jonne lisättiin myös 250 µl Mueller-Hinton-lientä.
21 4.6.3 Kuoppalevymenetelmä
Kokeen tarkoituksena oli määrittää 1,6-dehydropinidiinin eri pitoisuuksien vaikutuksia hevosen pääntautia aiheuttavan bakteerin S. equi kasvuun. Menetelmässä käytettiin Mueller- Hinton-ravintolientä, vaikka tutkimuksiin suositellaan käytettävän verellä rikastettuja kasvumediumeita. Laboratoriossa, jossa kokeet tehtiin, ei ollut kokemusta Streptococcus-lajien kasvatuksesta. Kirjallisuuskatsauksen mukaan joitakin tutkimuksia Streptococcus-lajien antibioottiherkkyydestä on kuitenkin tehty puhtaalla Mueller-Hinton-ravintoliemellä, koska turbidimetrisissä kokeissa veri voi vaikeuttaa optisen tiheyden määritystä spektrofotometrisesti (Bowersock ym. 2000, Hyatt ym. 2005).
Ennen kuoppalevykoetta bakteeria kasvatettiin yön yli seuraavasti: Kahteen eri koeputkeen lisättiin karkeasti 5 ml Mueller-Hinton-lientä. S. equi -bakteerisoluja siirrettiin kasvatusalustalta koeputkiin siirrostussauvan silmukkapäällä varoen koskettamasta silmukalla mihinkään muuhun. Koeputket laitettiin tasoravistelijaan inkuboitumaan yön yli +37 °C lämpötilassa 100 RPM (engl. revolutions per minute, kierrosta minuutissa) kierrosnopeudella.
Yön yli kasvaneista bakteereista tehtiin kuoppalevykoetta varten bakteerisiirroste (inoculum), jossa bakteerisolujen lukumäärä millilitraa kohti vakioitiin tutkimalla bakteerisuspension turbiditeettiä (optinen tiheys, optical density, OD) spektrofotometrillä 620 nm aallonpituudella. Spektrofotometri (UV-Visible Spectrophotometer, Pharmacia LKB- Biochrom 4060) nollattiin Mueller-Hinton-lientä sisältävällä kyvetillä, ja sen jälkeen mitattiin bakteerisuspension absorbanssi aallonpituudella 620 nm. Tulokseksi saatiin 0,3433.
Solumäärän lukumäärä vakioitiin laimentamalla bakteerisuspensiota niin, että sen OD620- arvo olisi 0,1, joka vastaa noin 1,0 108 CFU/ml (engl. colony-forming unit, pesäkkeitä muodostava yksikkö). Laimennos suoritettiin pipetoimalla koeputkeen 100 µl bakteerisuspensiota ja 243 µl Mueller-Hinton-lientä, sillä 0,3433 / 0,1 = 3,43 ja laimennossuhteeksi saatiin 1:2,43. Kuoppalevykoetta varten tämä suspensio laimennettiin vielä satakertaisesti pieneen Erlenmeyer-pulloon pipetoimalla 100 µl edellä laimennettua bakteerisuspensiota ja 9900 µl Mueller-Hinton-lientä. Tämä suspensio sisälsi 1,0 106 CFU/ml.
Omiin kolmeen kaukaloon lisättiin 10 ml steriiliä vettä, 10 ml Mueller-Hinton-lientä ja 10 ml laimennettua bakteerisuspensiota, jolloin monikanavapipetillä pystyi helposti pipetoimaan useaa kärkeä samanaikaisesti käyttäen.
96-kuoppalevylle 1 (Taulukko 3) pipetoitiin kaikkiin reunoilla sijaitseviin kaivoihin (pystyrivit 1 ja 12, vaakarivit A ja H) 200 µl steriiliä vettä haihtumisen estämiseksi, sillä
22
reunalla sijaitsevissa kaivoissa haihtuminen on suurinta. Kasvukontrollirivin 2 vaakariveille B–
G pipetoitiin 100 µl Mueller-Hinton-lientä ja 100 µl bakteerisuspensiota. Näytteen eri laimennoksia pipetoitiin 100 µl pystyrivien 3–5 kaivoihin yhdessä 100 µl bakteerisuspension kanssa taulukkoon tehtyjen merkintöjen mukaisesti. Antibiootin (gentamisiini) eri laimennoksia pipetoitiin 100 µl pystyrivien 6–10 kaivoihin vaakariveillä B–G yhdessä 100 µl bakteerisuspension kanssa. Näyte-, antibiootti- ja kasvukontrollikaivoissa lopullinen solumäärä oli 5,0 105 CFU/ml, sillä kaivoihin pipetoitiin 100 µl bakteerisuspensiota (1,0 106 CFU/ml) ja 100 µl näytettä, antibioottia tai Mueller-Hinton-lientä. Pystyrivin 11 kaivot vaakariveillä B–
G täytettiin Mueller-Hinton-liemellä (levy 1) tai vedellä (levy 2) haihtumisen estämiseksi (Taulukko 3).
96-kuoppalevylle 2 pipetoitiin samalla tavalla kuin levylle 1, paitsi että 1,6- dehydropinidiini-näytteen sijasta pipetoitiin kontrollinäytettä ja gentamisiinin sijasta penisilliiniä (Taulukko 4).
Pipetoinnin jälkeen spektrofotometrillä (Victor 1420 microplate reader, Wallac, Finland) mitattiin heti alkutilanteen (T = 0) absorbanssit 620 nm aallonpituudella molemmilla levyillä.
Mittaustulokset tallennettiin Excel-tiedostona. Mittauksia suoritettiin alkutilanteen lisäksi aluksi tunnin välein ja sitten vielä 24 tunnin, 29 tunnin ja 48 tunnin ajankohdissa.Mittausten välissä levyt laitettiin tasoravistelijaan inkuboitumaan +37 °C lämpötilassa 100 RPM kierrosnopeudella. Pidempien mittausvälien aikana levyjen ympäri asetettiin parafilmiä haihtumisen vähentämiseksi. Molemmat levyt jätettiin yön yli inkuboitumaan +37 °C lämpötilassa 100 RPM kierrosnopeudella.
Taulukko 3. Pipetointikaavakuva 96-kuoppalevylle 1. Pitoisuuksien yksikkönä on µg/ml.
Vaakarivit ovat merkitty kirjaimilla A–H ja pystyrivit numeroilla 1–12. Riveillä 3–5 on 100 µl 1,6-dehydropinidiiniä ja 100 µl bakteerisuspensiota, jossa 1 106 CFU/ml. Riveillä 6–10 on 100 µl gentamisiini-antibioottia ja 100 µl bakteerisuspensiota. Taulukkoon on merkitty pipetoidut pitoisuudet, jotka kaivoissa ovat puolet niistä. V = steriili vesi, KK = kasvukontrolli (100 µl bakteerisuspensiota + 100 µl Mueller-Hinton-lientä), MH = Mueller-Hinton-liemi
KK 1,6-dehydropinidiini
A V V V V V V V V V V V V
B V KK 878,8 54,94 6,87 1000 125 15,62 1,95 0,24 MH V
C V KK 219,75 27,47 1000 125 15,62 1,95 0,24 MH V
D V KK 219,75 27,47 500 62,5 7,81 0,97 0,12 MH V
E V KK 109,88 13,73 500 62,5 7,81 0,97 0,12 MH V
F V KK 109,88 13,73 250 31,25 3,9 0,48 0,06 MH V
G V KK 54,94 6,87 250 31,25 3,9 0,48 0,06 MH V
H V V V V V V V V V V V V
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Gentamisiini
23
Taulukko 4. Pipetointikaavakuva 96-kuoppalevylle 2. Pitoisuuksien yksikkönä on µg/ml.
Vaakarivit ovat merkitty kirjaimilla A–H ja pystyrivit numeroilla 1–12. Riveillä 3–5 on 100 µl kontrollinäytettä, jonka laimennossuhteet vastaavat 1,6-dehydropinidiini-laimennoksia ja 100 µl bakteerisuspensiota, jossa 1 106 CFU/ml. Riveillä 6–10 on 100 µl penisilliini-antibioottia ja 100 µl bakteerisuspensiota. Taulukkoon on merkitty pipetoidut pitoisuudet, jotka kaivoissa ovat puolet niistä. V = steriili vesi, KK = kasvukontrolli (100 µl bakteerisuspensiota + 100 µl Mueller-Hinton-lientä)
Kasvukontrollikaivoille (6 kpl) ja kullekin duplikaattinäytekaivolle ja duplikaattiantibioottikaivolle laskettiin absorbansseista omat keskiarvonsa. Kasvuprosentti laskettiin näyte- ja antibioottikaivojen absorbanssien keskiarvojen ja kasvukontrollikaivojen absorbanssien keskiarvon osamäärä kerrottuna sadalla. Kasvun inhibitioprosentti laskettiin vähentämällä kasvuprosentti sadasta prosentista. Kaavana tämä voidaan esittää seuraavasti:
kasvu % = [(näytekaivojen OD620 / kasvukontrollikaivojen OD620) 100] ja kasvun inhibitio %
= 100 - kasvu % (Kaya ym. 2009).
4.6.4 MBC-määritys
MBC-määrityksellä tarkoitetaan pienimmän mahdollisen S. equi -bakteereja tappavan pitoisuuden selvittämistä. Kuoppalevymenetelmän kasvunestomittausten tuloksien perusteella valittiin inkuboitavaksi petrimaljoille 1,6-dehydropinidiiniä ne pitoisuudet, jotka vastasivat MIC- tai MBC-pitoisuuksia. Kuoppalevy 1:ltä pipetoitiin 50 µl näyte-bakteerisuspensioliuosta kaivoista C3 (219,75 µg/ml) ja E3 (109,88 µg/ml) omille veriagar-maljoille ja siirrostuskolmiolla leviteltiin liuos tasaisesti koko maljalle. Kaivoista D3 (219,75 µg/ml) ja F3 (109,88 µg/ml) pipetoitiin 50 µl näyte-bakteerisuspensioliuosta omille Mueller-Hinton- maljoille ja leviteltiin siirrostuskolmiolla. Kolmannelle Mueller-Hinton-maljalle pipetoitiin 50 µl puhdasta bakteerisuspensiota kontrolliksi. Kaikki maljat inkuboitiin lämpökaapissa yön yli +37 °C lämpötilassa. MBC-pitoisuutena pidettiin sitä tutkittua pitoisuutta, joka johti täydelliseen kasvun estoon inkubaation jälkeen eli täysin kirkkaaseen petrimaljan pintaan (Millo ym. 2017).
KK Kontrollinäyte
A V V V V V V V V V V V V
B V KK 878,8 54,94 6,87 1000 125 15,62 1,95 0,24 V V
C V KK 219,75 27,47 1000 125 15,62 1,95 0,24 V V
D V KK 219,75 27,47 500 62,5 7,81 0,97 0,12 V V
E V KK 109,88 13,73 500 62,5 7,81 0,97 0,12 V V
F V KK 109,88 13,73 250 31,25 3,9 0,48 0,06 V V
G V KK 54,94 6,87 250 31,25 3,9 0,48 0,06 V V
H V V V V V V V V V V V V
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Penisilliini
24 4.7 Checkerboard-menetelmä
Checkerboard-menetelmää käytettiin kuusen neulasista eristetyn kokonaisalkaloidifraktion ja penisilliinin yhteisvaikutusten tutkimiseen S. equi -bakteerin kasvuun (El-Azizi 2017).
Checkerboard-analyysia varten S. equi -bakteerisoluja siirrettiin siirrostussauvalla kahteen eri koeputkeen 5 ml Mueller-Hinton-ravintoliemeen ja laitettiin koeputket inkuboitumaan tasoravistelijaan yön yli +37 °C lämpötilassa 100 RPM kierrosnopeudella.
Työssä käytetty kokonaisalkaloidifraktio oli pitoisuudeltaan 6,9 mg/ml ja tilavuudeltaan 250 µl. Fraktio laimennettiin kymmenkertaiseksi pitoisuuteen 690 µg/ml pipetoimalla 100 µl fraktiota ja 900 µl Mueller-Hinton-liuosta Eppendorf-mikrosentrifuugiputkeen. Tämän jälkeen liuos laimennettiin kaksinkertaisesti seitsemän kertaa, jolloin laimennoksien pitoisuuksiksi tulivat 345, 172,5, 86,25, 43,13, 21,56, 10,78 ja 5,39 µg/ml.
Yön yli koeputkessa inkuboituneesta bakteerisuspensiosta tehtiin satakertainen laimennos OD620 = 0,1 -arvosta Erlenmeyer-pulloon, jotta lopullinen solutiheys checkerboard-analyysin käyttösuspensiolle (siirrosteelle) olisi noin 1 106 CFU/ml.
96-kuoppalevylle pipetoitiin checkerboard-analyysia varten 200 µl steriiliä vettä pystyriveille 10 ja 11 (Taulukko 5). Kasvukontrolliriville 9 pipetoitiin 100 µl Mueller-Hinton- lientä sekä 100 µl bakteerisuspensiota, joka sisältää 1 106 CFU/ml. Tämän johdosta lopullinen solumäärä/ml kuoppaa kohti oli puolet edellisestä eli 5 105 CFU/ml. Bakteerisuspensiota pipetoitiin niin ikään 100 µl pystyriveille 1–8. Penisilliinin laimennoksia pipetoitiin 50 µl pitoisuudella 7,81 µg/ml riville 1. Samalla tavalla penisilliiniä pipetoitiin pitoisuudella 3,90 riville 2, 1,95 riville 3, 0,97 riville 4, 0,48 riville 5, 0,24 riville 6, 0,12 riville 7 ja riville 8 ei pipetoitu penisilliiniä (Taulukko 5).
Kokonaisalkaloidifraktion laimennoksia pipetoitiin 50 µl vaakariveille A–G pystyrivistä 1 riviin 8 asti niin, että pitoisuuden 345 µg/ml fraktiota pipetoitiin riville A, 172,5 riville B, 86,25 riville C, 43,13 riville D, 21,56 riville E, 10,78 riville F, 5,39 riville G ja riville H ei pipetoitu kokonaisalkaloidifraktiota (Taulukko 5).
Riville 8 pipetoitiin 100 µl kokonaisalkaloidifraktiota eri laimennoksilla, sillä sille riville ei tullut penisilliiniä ollenkaan. Riville H pipetoitiin 100 µl penisilliiniä, sillä sille riville ei tullut kokonaisalkaloidifraktiota ollenkaan. Näin kaikkiin kaivoihin tuli 200 µl liuosta, paitsi H8- kaivoon, johon tuli pelkästään 100 µl bakteerisuspensiota eikä penisilliiniä tai kokonaisalkaloidifraktiota ollenkaan. Pystyrivi 12 jätettiin kokonaan tyhjäksi kuoppalevyllä (Taulukko 5).
25
Spektrofotometrillä mitattiin kuoppalevyn absorbanssien alkutilanne aallonpituudella 620 nm. Levy suljettiin parafilmillä ja laitettiin tasoravistelijaan inkuboitumaan yön yli +37 °C lämpötilassa 100 RPM kierrosnopeudella.
Checkerboard-analyysikuoppalevyn absorbanssit mitattiin uudestaan ajanhetkellä 24 tuntia alkuhetken jälkeen.
Kasvukontrollirivin kaivojen absorbansseille (8 kpl) laskettiin keskiarvo. Kasvuprosentit kullekin kaivolle laskettiin kaivon absorbanssin ja kasvukontrollikaivojen absorbanssien keskiarvon osamäärä kerrottuna sadalla prosentilla. Kasvun inhibitioprosentti laskettiin vähentämällä sadasta prosentista kasvuprosentti.
Taulukko 5. Pipetointikaavakuva checkerboard-96-kuoppalevylle. Pitoisuuksien yksikkönä on µg/ml. Vaakarivit ovat merkitty kirjaimilla A–H ja pystyrivit numeroilla 1–12. Pystyriveillä 1–
8 on 100 µl bakteerisuspensiota, jossa 1 106 CFU/ml. Kullakin vaakarivillä on 50 µl tiettyä pitoisuutta kokonaisalkaloidifraktiota ja kullakin pystyrivillä on 50 µl tiettyä pitoisuutta penisilliiniä. Taulukkoon on merkitty pipetoidut pitoisuudet, jotka kaivoissa ovat neljäsosa niistä. V = steriili vesi, KK = kasvukontrolli (100 µl bakteerisuspensiota + 100 µl Mueller- Hinton-lientä)
5 TULOKSET
5.1 Kuoppalevymenetelmä
Aikomus oli aluksi mitata kuoppalevyiltä absorbanssit tunnin välein kasvukäyrän muodostamiseksi, mutta S. equi -bakteerit kasvoivat hitaasti, eikä muutosta juurikaan ollut ensimmäisten tuntien aikana. 24 tunnin ja 29 tunnin ajankohdissa mittaustulokset olivat samanlaiset, joten seuraavaksi on esitettyinä vain 24 tunnin ja 48 tunnin ajankohtien tulokset.
1,6-dehydropinidiini inhiboi S. equi -bakteerin kasvua 70–80 %:sesti verrattuna kasvukontrolliin pitoisuuksilla 54,94, 109,875 ja 439,4 µg/ml 24 tunnin kuluttua kokeen aloittamisesta (Kuva 9). Kasvun estovaikutus oli pitoisuudesta riippuvainen siten, että suuremmat pitoisuudet, 54,94, 109,875 ja 439,4 µg/ml antoivat parhaan estovaikutuksen.
Pitoisuudella 109,875 µg/ml oli hieman enemmän estovaikutusta kuin pitoisuudella 439,4 µg/ml. Pitoisuutta 54,94 µg/ml voi pitää 1,6-dehydropinidiinin MIC-pitoisuutena S. equi -
7,81 3,9 1,95 0,97 0,48 0,24 0,12 0
A 345 KK V V
B 172 KK V V
C 86 KK V V
D 43 KK V V
E 21 KK V V
F 10 KK V V
G 5 KK V V
H 0 KK V V
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Penisilliinin konsentraatio (µg/ml)
konsentraatio (µg/ml)
Kokonaisalkaloidifraktion
26
bakteerin kasvua vastaan. Tämä pitoisuus esti kuitenkin 48 tunnin kuluttua kokeen aloittamisesta enää vain 22 %:sesti bakteerin kasvua. Sen sijaan suuremmat pitoisuudet inhiboivat yli 70 %:sesti S. equi -bakteerin kasvua vielä 48 tunnin inkubaation jälkeen (Kuva 9). Pitoisuudella 27,47 µg/ml ja sitä pienemmillä pitoisuuksilla 1,6-dehydropinidiini inhiboi vain alle 6 %:sesti mitatuilla ajanhetkillä 24 ja 48 tuntia (Kuva 9).
Kontrollinäyte inhiboi laimennoksella, joka vastaa 439,4 µg/ml pitoisuuden omaavaa 1,6- dehydropinidiini-näytettä S. equi -bakteerin kasvua lähes 80 %:sesti verrattuna kasvukontrolliin 24 tunnin kuluttua kokeen aloittamisesta ja noin 54 %:sesti 48 tunnin kuluttua. Laimennoksella, joka vastaa 1,6-dehydropinidiini-näytteen pitoisuutta 109,875 µg/ml ja sitä pienemmillä laimennoksilla kontrollinäyte inhiboi bakteerin kasvua alle 15 %:sesti mitatuilla ajanhetkillä 24 ja 48 tuntia (Kuva 10).
Kuva 9. 1,6-dehydropinidiinin vaikutuksia S. equi -bakteerin kasvuun 24 tunnin (vasemmalla) ja 48 tunnin (oikealla) kuluttua. 109,875µg/ml pitoisuudella yhdiste inhiboi bakteerin kasvua yli 70 %:sesti verrattuna kasvukontrolliin 24 tunnin ja 48 tunnin kuluttua. 54,94 µg/ml pitoisuudella yhdiste inhiboi bakteerin kasvua yli 70 %:sesti verrattuna kasvukontrolliin 24 tunnin kuluttua, mutta 48 tunnin kuluttua enää vain 22 %:sesti. Alhaisemmilla pitoisuuksilla kasvun inhibitiota ei havaittu.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Kasvun inhibitio (%)
1,6-dehydropinidiinin pitoisuus (µg/ml)
1,6-dehydropinidiini vs. S.
equiT=24h
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Kasvun inhibitio (%)
1,6-dehydropinidiinin pitoisuus (µg/ml)
1,6-dehydropinidiini vs. S.
equiT=48h
27
Kuva 10. Kontrollinäytteen vaikutuksia S. equi -bakteerin kasvuun 24 tunnin (vasemmalla) ja 48 tunnin (oikealla) kuluttua. Suurin pitoisuus 439,4 µg/ml inhiboi bakteerin kasvua lähes 80
%:sesti verrattuna kasvukontrolliin 24 tunnin kuluttua, mutta 48 tunnin kuluttua enää vain 54
%:sesti. Alhaisemmat pitoisuudet eivät inhiboi kasvua merkittävästi. X-akselilla on kontrollinäytteen laimennokset, jotka vastaavat 1,6-dehydropinidiinin pitoisuuksia.
Gentamisiini inhiboi S. equi -bakteerin kasvua 70–80 %:sesti verrattuna kasvukontrolliin pitoisuudella 7,81 µg/ml ja sitä suuremmilla pitoisuuksilla 24 ja 48 tunnin kuluttua kokeen aloittamisesta. Pitoisuutta 7,81 µg/ml voi siis pitää gentamisiinin MIC-arvona S. equi -bakteeria vastaan. Lisäksi tämä MIC-pitoisuus vaikuttaa olevan bakterisidinen, koska vielä 48 tunnin kuluttua sen estovaikutus on yli 70 %. Yllättäen 48 tunnin kohdalla pitoisuuden 15,625 µg/ml gentamisiini inhiboi poikkeuksellisesti vain 46 %:sesti bakteerin kasvua. 3,905 µg/ml pitoisuus ja sitä pienemmät pitoisuudet gentamisiinia eivät juurikaan inhiboi bakteerin kasvua (Kuva 11).
Penisilliini inhiboi S. equi -bakteerin kasvua 77,5–80 %:sesti verrattuna kasvukontrolliin kaikilla testatuilla pitoisuuksilla 0,03–500 µg/ml väliltä mitatuilla ajanhetkillä 24 ja 48 tuntia kokeen aloittamisesta (Kuva 12). Pienin tutkittu pitoisuus 0,03 µg/ml ei kuitenkaan ole vielä MIC-arvo, joka on pitoisuudeltaan vieläkin pienempi.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Kasvun inhibitio (%)
Kontrollinäytteen pitoisuus (µg/ml) Kontrollinäyte vs. S. equi
T=24h
0 10 20 30 40 50 60
Kasvun inhibitio (%)
Kontrollinäytteen pitoisuus (µg/ml) Kontrollinäyte vs. S. equi
T=48h
28
Kuva 11. Gentamisiinin vaikutuksia S. equi -bakteerin kasvuun 24 tunnin (vasemmalla) ja 48 tunnin (oikealla) kuluttua. Antibiootin pitoisuuden ollessa 7,81 µg/ml tai sitä suurempi bakteerin kasvun inhibitio on yli 70 % verrattuna kasvukontrolliin 24 tunnin ja 48 tunnin kuluttua sillä poikkeuksella, että 48 tunnin kuluttua pitoisuuden 15,625 µg/ml gentamisiini inhiboi vain 46 %:sesti. Alhaisemmilla pitoisuuksilla bakteerin kasvun inhibitiota ei havaittu.
Kuva 12. Penisilliinin vaikutuksia S. equi -bakteerin kasvuun 24 tunnin (vasemmalla) ja 48 tunnin (oikealla) kuluttua. Antibiootti inhiboi bakteerin kasvua kaikista alhaisimmillakin testatuilla pitoisuuksilla 0,03 µg/ml lähtien yli 78 %:sesti verrattuna kasvukontrolliin.
5.2 MBC-määritys
MBC-määrityksessä vertailtiin S. equi -bakteerien kasvua maljoilla, joissa oli verellä rikastettua Mueller-Hinton-agaria maljoihin, joissa oli pelkkää Mueller-Hinton-agaria. S. equi -bakteerit
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
0,03 0,06 0,12 0,24 0,485 0,975 1,95 3,905 7,81 15,625 31,25 62,5 125 250 500
Kasvun inhibitio (%)
Gentamisiinin pitoisuus (µg/ml) Gentamisiini vs. S. equiT=24h
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
0,03 0,06 0,12 0,24 0,485 0,975 1,95 3,905 7,81 15,625 31,25 62,5 125 250 500
Kasvun inhibitio (%)
Gentamisiinin pitoisuus (µg/ml) Gentamisiini vs. S. equiT=48h
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Kasvun inhibitio (%)
Penisilliinin pitoisuus (µg/ml) Penisilliini vs. S. equiT=24h
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Kasvun inhibitio (%)
Penisilliinin pitoisuus (µg/ml) Penisilliini vs. S. equiT=48h
29
eivät olleet vuorokaudessa juurikaan kasvaneet veriagar-maljassa, johon pipetoitiin 219,75 µg/ml merkitystä kaivosta (todellinen pitoisuus 1,6-dehydropinidiinille puolet tästä, 109,88 µg/ml, sillä bakteerisuspensiota liuoksesta oli puolet) (Kuva 13). Veriagar-maljassa, johon pipetoitiin 109,88 µg/ml merkitystä kaivosta (todellinen pitoisuus 54,94 µg/ml), bakteerit olivat vuorokaudessa levittäytyneet lähes koko maljalle (Kuva 14).
Kuva 13. Kuvat veriagar-maljoista kannen kanssa (vasemmalla) ja ilman kantta (oikealla) 219,75 µg/ml merkitystä kaivosta pipetoidun 50 µl 1,6-dehydropinidiinin kanssa vuorokauden jälkeen. Kaivon bakteerisuspension vuoksi 1,6-dehydropinidiinin todellinen pitoisuus on puolet merkitystä arvosta eli 109,88 µg/ml. S. equi ei ollut kasvanut alustalla.
Kuva 14. Kuvat veriagar-maljoista kannen kanssa (vasemmalla) ja ilman kantta (oikealla) 109,88 µg/ml merkitystä kaivosta pipetoidun 50 µl 1,6-dehydropinidiinin kanssa vuorokauden jälkeen. Kaivon bakteerisuspension vuoksi 1,6-dehydropinidiinin todellinen pitoisuus on puolet merkitystä arvosta eli 54,94 µg/ml. S. equi oli levittäytynyt lähes koko maljalle.
