Antibioottilaimennokset

Tutkimuksessa käytettävistä tunnetuista antimikrobilääkkeistä gentamisiinistä ja penisilliini G:stä valmistettiin kantaliuokset metanoliin pitoisuudeksi 10 mg/ml. Gentamisiinin sulfaattisuolaa (Sigma-Aldrich) ja penisilliini G:tä (BioChemica) punnittiin 10 mg omiin koeputkiinsa. Molemmat antibiootit liuotettiin 1000 µl metanoliin. Gentamisiini ja penisilliini valittiin vertailuantimikrobilääkkeiksi, sillä molempia käytetään yleisesti hevosen pääntaudin hoidossa, ja niiden on todettu olevan verrattain tehokkaita (Cole ym. 2015).

Kuoppalevykoetta varten antimikrobilääkkeistä tehtiin laimennokset MIC- (engl. minimum inhibitory concentration, pienin bakteerin kasvua estävä pitoisuus) ja MBC-määrityksiä (engl.

minimum bactericidal concentration, pienin bakteeria tappava pitoisuus) varten. Ensimmäinen laimennos tehtiin kymmenkertaiseksi kantaliuoksesta (10 mg/ml) yhdistämällä Eppendorf-mikrosentrifuugiputkeen 900 µl Mueller-Hinton-ravintolientä ja 100 µl antibioottiliuosta. Tästä eteenpäin antibioottia laimennettiin kaksinkertaisesti 500 µl edellistä pitoisuutta siirtäen aina uuteen putkeen ja lisäten sinne 500 µl Mueller-Hinton-lientä. Molemmille antibiooteille tehtiin samanlaiset laimennossarjat viiteentoista tilavuudeltaan kahden millilitran Eppendorf-mikrosentrifuugiputkeen pitoisuuksilla 1000, 500, 250, 125, 62,50, 31,25 15,62, 7,81, 3,90, 1,95, 0,97, 0,48, 0,244, 0,122 ja 0,061 µg/ml.

Jokaisen uuden laimennoksen synnyttyä laimennosta sekoitettiin pumppaamalla pipetillä liuosta sisään ja ulos kymmenisen kertaa, ennen kuin laimennosta siirrettiin seuraavaan putkeen. Työskentely tehtiin laminaarikaapissa käyttäen steriilejä pipetinkärkiä ja jokaisen laimennoksen kohdalla uuteen kärkeen vaihtaen. Jokaiseen putkeen jäi 500 µl liuosta, paitsi viimeiseen (0,061 µg/ml), johon jäi 1000 µl liuosta.

4.6.2.2 1,6-dehydropinidiinin ja kontrollinäytteen laimennokset

1,6-dehydropinidiini- ja kontrollinäytteestä (250 µl) otettiin puolet (125 µl) ensimmäiseen laimennokseen 375 µl Mueller-Hinton-liemen kanssa, jolloin alkuperäinen pitoisuus (879 µg/ml) laski neljäsosaan (219,75 µg/ml). Seuraavat viisi laimennosta tehtiin kaksinkertaisesti seuraaviin pitoisuuksiin (µg/ml): 109,88, 54,94, 27,47, 13,73 ja 6,87. Edellistä liuosta siirrettiin aina 250 µl seuraavaan putkeen, jonne lisättiin myös 250 µl Mueller-Hinton-lientä.

21 4.6.3 Kuoppalevymenetelmä

Kokeen tarkoituksena oli määrittää 1,6-dehydropinidiinin eri pitoisuuksien vaikutuksia hevosen pääntautia aiheuttavan bakteerin S. equi kasvuun. Menetelmässä käytettiin Mueller-Hinton-ravintolientä, vaikka tutkimuksiin suositellaan käytettävän verellä rikastettuja kasvumediumeita. Laboratoriossa, jossa kokeet tehtiin, ei ollut kokemusta Streptococcus-lajien kasvatuksesta. Kirjallisuuskatsauksen mukaan joitakin tutkimuksia Streptococcus-lajien antibioottiherkkyydestä on kuitenkin tehty puhtaalla Mueller-Hinton-ravintoliemellä, koska turbidimetrisissä kokeissa veri voi vaikeuttaa optisen tiheyden määritystä spektrofotometrisesti (Bowersock ym. 2000, Hyatt ym. 2005).

Ennen kuoppalevykoetta bakteeria kasvatettiin yön yli seuraavasti: Kahteen eri koeputkeen lisättiin karkeasti 5 ml Mueller-Hinton-lientä. S. equi -bakteerisoluja siirrettiin kasvatusalustalta koeputkiin siirrostussauvan silmukkapäällä varoen koskettamasta silmukalla mihinkään muuhun. Koeputket laitettiin tasoravistelijaan inkuboitumaan yön yli +37 °C lämpötilassa 100 RPM (engl. revolutions per minute, kierrosta minuutissa) kierrosnopeudella.

Yön yli kasvaneista bakteereista tehtiin kuoppalevykoetta varten bakteerisiirroste (inoculum), jossa bakteerisolujen lukumäärä millilitraa kohti vakioitiin tutkimalla bakteerisuspension turbiditeettiä (optinen tiheys, optical density, OD) spektrofotometrillä 620 nm aallonpituudella. Spektrofotometri (UV-Visible Spectrophotometer, Pharmacia LKB-Biochrom 4060) nollattiin Mueller-Hinton-lientä sisältävällä kyvetillä, ja sen jälkeen mitattiin bakteerisuspension absorbanssi aallonpituudella 620 nm. Tulokseksi saatiin 0,3433.

Solumäärän lukumäärä vakioitiin laimentamalla bakteerisuspensiota niin, että sen OD620 -arvo olisi 0,1, joka vastaa noin 1,0  10⁸ CFU/ml (engl. colony-forming unit, pesäkkeitä muodostava yksikkö). Laimennos suoritettiin pipetoimalla koeputkeen 100 µl bakteerisuspensiota ja 243 µl Mueller-Hinton-lientä, sillä 0,3433 / 0,1 = 3,43 ja laimennossuhteeksi saatiin 1:2,43. Kuoppalevykoetta varten tämä suspensio laimennettiin vielä satakertaisesti pieneen Erlenmeyer-pulloon pipetoimalla 100 µl edellä laimennettua bakteerisuspensiota ja 9900 µl Mueller-Hinton-lientä. Tämä suspensio sisälsi 1,0  10⁶ CFU/ml.

Omiin kolmeen kaukaloon lisättiin 10 ml steriiliä vettä, 10 ml Mueller-Hinton-lientä ja 10 ml laimennettua bakteerisuspensiota, jolloin monikanavapipetillä pystyi helposti pipetoimaan useaa kärkeä samanaikaisesti käyttäen.

96-kuoppalevylle 1 (Taulukko 3) pipetoitiin kaikkiin reunoilla sijaitseviin kaivoihin (pystyrivit 1 ja 12, vaakarivit A ja H) 200 µl steriiliä vettä haihtumisen estämiseksi, sillä

22

reunalla sijaitsevissa kaivoissa haihtuminen on suurinta. Kasvukontrollirivin 2 vaakariveille B–

G pipetoitiin 100 µl Mueller-Hinton-lientä ja 100 µl bakteerisuspensiota. Näytteen eri laimennoksia pipetoitiin 100 µl pystyrivien 3–5 kaivoihin yhdessä 100 µl bakteerisuspension kanssa taulukkoon tehtyjen merkintöjen mukaisesti. Antibiootin (gentamisiini) eri laimennoksia pipetoitiin 100 µl pystyrivien 6–10 kaivoihin vaakariveillä B–G yhdessä 100 µl bakteerisuspension kanssa. Näyte-, antibiootti- ja kasvukontrollikaivoissa lopullinen solumäärä oli 5,0  10⁵ CFU/ml, sillä kaivoihin pipetoitiin 100 µl bakteerisuspensiota (1,0  10⁶ CFU/ml) ja 100 µl näytettä, antibioottia tai Mueller-Hinton-lientä. Pystyrivin 11 kaivot vaakariveillä B–

G täytettiin Mueller-Hinton-liemellä (levy 1) tai vedellä (levy 2) haihtumisen estämiseksi (Taulukko 3).

96-kuoppalevylle 2 pipetoitiin samalla tavalla kuin levylle 1, paitsi että 1,6-dehydropinidiini-näytteen sijasta pipetoitiin kontrollinäytettä ja gentamisiinin sijasta penisilliiniä (Taulukko 4).

Pipetoinnin jälkeen spektrofotometrillä (Victor 1420 microplate reader, Wallac, Finland) mitattiin heti alkutilanteen (T = 0) absorbanssit 620 nm aallonpituudella molemmilla levyillä.

Mittaustulokset tallennettiin Excel-tiedostona. Mittauksia suoritettiin alkutilanteen lisäksi aluksi tunnin välein ja sitten vielä 24 tunnin, 29 tunnin ja 48 tunnin ajankohdissa.Mittausten välissä levyt laitettiin tasoravistelijaan inkuboitumaan +37 °C lämpötilassa 100 RPM kierrosnopeudella. Pidempien mittausvälien aikana levyjen ympäri asetettiin parafilmiä haihtumisen vähentämiseksi. Molemmat levyt jätettiin yön yli inkuboitumaan +37 °C lämpötilassa 100 RPM kierrosnopeudella.

Taulukko 3. Pipetointikaavakuva 96-kuoppalevylle 1. Pitoisuuksien yksikkönä on µg/ml.

Vaakarivit ovat merkitty kirjaimilla A–H ja pystyrivit numeroilla 1–12. Riveillä 3–5 on 100 µl 1,6-dehydropinidiiniä ja 100 µl bakteerisuspensiota, jossa 1  10⁶ CFU/ml. Riveillä 6–10 on 100 µl gentamisiini-antibioottia ja 100 µl bakteerisuspensiota. Taulukkoon on merkitty pipetoidut pitoisuudet, jotka kaivoissa ovat puolet niistä. V = steriili vesi, KK = kasvukontrolli (100 µl bakteerisuspensiota + 100 µl Mueller-Hinton-lientä), MH = Mueller-Hinton-liemi

KK 1,6-dehydropinidiini

23

Taulukko 4. Pipetointikaavakuva 96-kuoppalevylle 2. Pitoisuuksien yksikkönä on µg/ml.

Vaakarivit ovat merkitty kirjaimilla A–H ja pystyrivit numeroilla 1–12. Riveillä 3–5 on 100 µl kontrollinäytettä, jonka laimennossuhteet vastaavat 1,6-dehydropinidiini-laimennoksia ja 100 µl bakteerisuspensiota, jossa 1  10⁶ CFU/ml. Riveillä 6–10 on 100 µl penisilliini-antibioottia ja 100 µl bakteerisuspensiota. Taulukkoon on merkitty pipetoidut pitoisuudet, jotka kaivoissa ovat puolet niistä. V = steriili vesi, KK = kasvukontrolli (100 µl bakteerisuspensiota + 100 µl Mueller-Hinton-lientä)

Kasvukontrollikaivoille (6 kpl) ja kullekin duplikaattinäytekaivolle ja duplikaattiantibioottikaivolle laskettiin absorbansseista omat keskiarvonsa. Kasvuprosentti laskettiin näyte- ja antibioottikaivojen absorbanssien keskiarvojen ja kasvukontrollikaivojen absorbanssien keskiarvon osamäärä kerrottuna sadalla. Kasvun inhibitioprosentti laskettiin vähentämällä kasvuprosentti sadasta prosentista. Kaavana tämä voidaan esittää seuraavasti:

kasvu % = [(näytekaivojen OD620 / kasvukontrollikaivojen OD620)  100] ja kasvun inhibitio %

= 100 - kasvu % (Kaya ym. 2009).

4.6.4 MBC-määritys

MBC-määrityksellä tarkoitetaan pienimmän mahdollisen S. equi -bakteereja tappavan pitoisuuden selvittämistä. Kuoppalevymenetelmän kasvunestomittausten tuloksien perusteella valittiin inkuboitavaksi petrimaljoille 1,6-dehydropinidiiniä ne pitoisuudet, jotka vastasivat MIC- tai MBC-pitoisuuksia. Kuoppalevy 1:ltä pipetoitiin 50 µl näyte-bakteerisuspensioliuosta kaivoista C3 (219,75 µg/ml) ja E3 (109,88 µg/ml) omille veriagar-maljoille ja siirrostuskolmiolla leviteltiin liuos tasaisesti koko maljalle. Kaivoista D3 (219,75 µg/ml) ja F3 (109,88 µg/ml) pipetoitiin 50 µl näyte-bakteerisuspensioliuosta omille Mueller-Hinton-maljoille ja leviteltiin siirrostuskolmiolla. Kolmannelle Mueller-Hinton-maljalle pipetoitiin 50 µl puhdasta bakteerisuspensiota kontrolliksi. Kaikki maljat inkuboitiin lämpökaapissa yön yli +37 °C lämpötilassa. MBC-pitoisuutena pidettiin sitä tutkittua pitoisuutta, joka johti täydelliseen kasvun estoon inkubaation jälkeen eli täysin kirkkaaseen petrimaljan pintaan (Millo ym. 2017).

24 4.7 Checkerboard-menetelmä

Checkerboard-menetelmää käytettiin kuusen neulasista eristetyn kokonaisalkaloidifraktion ja penisilliinin yhteisvaikutusten tutkimiseen S. equi -bakteerin kasvuun (El-Azizi 2017).

Checkerboard-analyysia varten S. equi -bakteerisoluja siirrettiin siirrostussauvalla kahteen eri koeputkeen 5 ml Mueller-Hinton-ravintoliemeen ja laitettiin koeputket inkuboitumaan tasoravistelijaan yön yli +37 °C lämpötilassa 100 RPM kierrosnopeudella.

Työssä käytetty kokonaisalkaloidifraktio oli pitoisuudeltaan 6,9 mg/ml ja tilavuudeltaan 250 µl. Fraktio laimennettiin kymmenkertaiseksi pitoisuuteen 690 µg/ml pipetoimalla 100 µl fraktiota ja 900 µl Mueller-Hinton-liuosta Eppendorf-mikrosentrifuugiputkeen. Tämän jälkeen liuos laimennettiin kaksinkertaisesti seitsemän kertaa, jolloin laimennoksien pitoisuuksiksi tulivat 345, 172,5, 86,25, 43,13, 21,56, 10,78 ja 5,39 µg/ml.

Yön yli koeputkessa inkuboituneesta bakteerisuspensiosta tehtiin satakertainen laimennos OD620 = 0,1 -arvosta Erlenmeyer-pulloon, jotta lopullinen solutiheys checkerboard-analyysin käyttösuspensiolle (siirrosteelle) olisi noin 1  10⁶ CFU/ml.

96-kuoppalevylle pipetoitiin checkerboard-analyysia varten 200 µl steriiliä vettä pystyriveille 10 ja 11 (Taulukko 5). Kasvukontrolliriville 9 pipetoitiin 100 µl Mueller-Hinton-lientä sekä 100 µl bakteerisuspensiota, joka sisältää 1  10⁶ CFU/ml. Tämän johdosta lopullinen solumäärä/ml kuoppaa kohti oli puolet edellisestä eli 5  10⁵ CFU/ml. Bakteerisuspensiota pipetoitiin niin ikään 100 µl pystyriveille 1–8. Penisilliinin laimennoksia pipetoitiin 50 µl pitoisuudella 7,81 µg/ml riville 1. Samalla tavalla penisilliiniä pipetoitiin pitoisuudella 3,90 riville 2, 1,95 riville 3, 0,97 riville 4, 0,48 riville 5, 0,24 riville 6, 0,12 riville 7 ja riville 8 ei pipetoitu penisilliiniä (Taulukko 5).

Kokonaisalkaloidifraktion laimennoksia pipetoitiin 50 µl vaakariveille A–G pystyrivistä 1 riviin 8 asti niin, että pitoisuuden 345 µg/ml fraktiota pipetoitiin riville A, 172,5 riville B, 86,25 riville C, 43,13 riville D, 21,56 riville E, 10,78 riville F, 5,39 riville G ja riville H ei pipetoitu kokonaisalkaloidifraktiota (Taulukko 5).

Riville 8 pipetoitiin 100 µl kokonaisalkaloidifraktiota eri laimennoksilla, sillä sille riville ei tullut penisilliiniä ollenkaan. Riville H pipetoitiin 100 µl penisilliiniä, sillä sille riville ei tullut kokonaisalkaloidifraktiota ollenkaan. Näin kaikkiin kaivoihin tuli 200 µl liuosta, paitsi H8-kaivoon, johon tuli pelkästään 100 µl bakteerisuspensiota eikä penisilliiniä tai kokonaisalkaloidifraktiota ollenkaan. Pystyrivi 12 jätettiin kokonaan tyhjäksi kuoppalevyllä (Taulukko 5).

25

Spektrofotometrillä mitattiin kuoppalevyn absorbanssien alkutilanne aallonpituudella 620 nm. Levy suljettiin parafilmillä ja laitettiin tasoravistelijaan inkuboitumaan yön yli +37 °C lämpötilassa 100 RPM kierrosnopeudella.

Checkerboard-analyysikuoppalevyn absorbanssit mitattiin uudestaan ajanhetkellä 24 tuntia alkuhetken jälkeen.

Kasvukontrollirivin kaivojen absorbansseille (8 kpl) laskettiin keskiarvo. Kasvuprosentit kullekin kaivolle laskettiin kaivon absorbanssin ja kasvukontrollikaivojen absorbanssien keskiarvon osamäärä kerrottuna sadalla prosentilla. Kasvun inhibitioprosentti laskettiin vähentämällä sadasta prosentista kasvuprosentti.

Taulukko 5. Pipetointikaavakuva checkerboard-96-kuoppalevylle. Pitoisuuksien yksikkönä on µg/ml. Vaakarivit ovat merkitty kirjaimilla A–H ja pystyrivit numeroilla 1–12. Pystyriveillä 1–

8 on 100 µl bakteerisuspensiota, jossa 1  10⁶ CFU/ml. Kullakin vaakarivillä on 50 µl tiettyä pitoisuutta kokonaisalkaloidifraktiota ja kullakin pystyrivillä on 50 µl tiettyä pitoisuutta penisilliiniä. Taulukkoon on merkitty pipetoidut pitoisuudet, jotka kaivoissa ovat neljäsosa niistä. V = steriili vesi, KK = kasvukontrolli (100 µl bakteerisuspensiota + 100 µl Mueller-Hinton-lientä)

5 TULOKSET

5.1 Kuoppalevymenetelmä

Aikomus oli aluksi mitata kuoppalevyiltä absorbanssit tunnin välein kasvukäyrän muodostamiseksi, mutta S. equi -bakteerit kasvoivat hitaasti, eikä muutosta juurikaan ollut ensimmäisten tuntien aikana. 24 tunnin ja 29 tunnin ajankohdissa mittaustulokset olivat samanlaiset, joten seuraavaksi on esitettyinä vain 24 tunnin ja 48 tunnin ajankohtien tulokset.

1,6-dehydropinidiini inhiboi S. equi -bakteerin kasvua 70–80 %:sesti verrattuna kasvukontrolliin pitoisuuksilla 54,94, 109,875 ja 439,4 µg/ml 24 tunnin kuluttua kokeen aloittamisesta (Kuva 9). Kasvun estovaikutus oli pitoisuudesta riippuvainen siten, että suuremmat pitoisuudet, 54,94, 109,875 ja 439,4 µg/ml antoivat parhaan estovaikutuksen.

Pitoisuudella 109,875 µg/ml oli hieman enemmän estovaikutusta kuin pitoisuudella 439,4 µg/ml. Pitoisuutta 54,94 µg/ml voi pitää 1,6-dehydropinidiinin MIC-pitoisuutena S. equi

-7,81 3,9 1,95 0,97 0,48 0,24 0,12 0

26

bakteerin kasvua vastaan. Tämä pitoisuus esti kuitenkin 48 tunnin kuluttua kokeen aloittamisesta enää vain 22 %:sesti bakteerin kasvua. Sen sijaan suuremmat pitoisuudet inhiboivat yli 70 %:sesti S. equi -bakteerin kasvua vielä 48 tunnin inkubaation jälkeen (Kuva 9). Pitoisuudella 27,47 µg/ml ja sitä pienemmillä pitoisuuksilla 1,6-dehydropinidiini inhiboi vain alle 6 %:sesti mitatuilla ajanhetkillä 24 ja 48 tuntia (Kuva 9).

Kontrollinäyte inhiboi laimennoksella, joka vastaa 439,4 µg/ml pitoisuuden omaavaa 1,6-dehydropinidiini-näytettä S. equi -bakteerin kasvua lähes 80 %:sesti verrattuna kasvukontrolliin 24 tunnin kuluttua kokeen aloittamisesta ja noin 54 %:sesti 48 tunnin kuluttua. Laimennoksella, joka vastaa 1,6-dehydropinidiini-näytteen pitoisuutta 109,875 µg/ml ja sitä pienemmillä laimennoksilla kontrollinäyte inhiboi bakteerin kasvua alle 15 %:sesti mitatuilla ajanhetkillä 24 ja 48 tuntia (Kuva 10).

Kuva 9. 1,6-dehydropinidiinin vaikutuksia S. equi -bakteerin kasvuun 24 tunnin (vasemmalla) ja 48 tunnin (oikealla) kuluttua. 109,875µg/ml pitoisuudella yhdiste inhiboi bakteerin kasvua yli 70 %:sesti verrattuna kasvukontrolliin 24 tunnin ja 48 tunnin kuluttua. 54,94 µg/ml pitoisuudella yhdiste inhiboi bakteerin kasvua yli 70 %:sesti verrattuna kasvukontrolliin 24 tunnin kuluttua, mutta 48 tunnin kuluttua enää vain 22 %:sesti. Alhaisemmilla pitoisuuksilla kasvun inhibitiota ei havaittu.

27

Kuva 10. Kontrollinäytteen vaikutuksia S. equi -bakteerin kasvuun 24 tunnin (vasemmalla) ja 48 tunnin (oikealla) kuluttua. Suurin pitoisuus 439,4 µg/ml inhiboi bakteerin kasvua lähes 80

%:sesti verrattuna kasvukontrolliin 24 tunnin kuluttua, mutta 48 tunnin kuluttua enää vain 54

%:sesti. Alhaisemmat pitoisuudet eivät inhiboi kasvua merkittävästi. X-akselilla on kontrollinäytteen laimennokset, jotka vastaavat 1,6-dehydropinidiinin pitoisuuksia.

Gentamisiini inhiboi S. equi -bakteerin kasvua 70–80 %:sesti verrattuna kasvukontrolliin pitoisuudella 7,81 µg/ml ja sitä suuremmilla pitoisuuksilla 24 ja 48 tunnin kuluttua kokeen aloittamisesta. Pitoisuutta 7,81 µg/ml voi siis pitää gentamisiinin MIC-arvona S. equi -bakteeria vastaan. Lisäksi tämä MIC-pitoisuus vaikuttaa olevan bakterisidinen, koska vielä 48 tunnin kuluttua sen estovaikutus on yli 70 %. Yllättäen 48 tunnin kohdalla pitoisuuden 15,625 µg/ml gentamisiini inhiboi poikkeuksellisesti vain 46 %:sesti bakteerin kasvua. 3,905 µg/ml pitoisuus ja sitä pienemmät pitoisuudet gentamisiinia eivät juurikaan inhiboi bakteerin kasvua (Kuva 11).

Penisilliini inhiboi S. equi -bakteerin kasvua 77,5–80 %:sesti verrattuna kasvukontrolliin kaikilla testatuilla pitoisuuksilla 0,03–500 µg/ml väliltä mitatuilla ajanhetkillä 24 ja 48 tuntia kokeen aloittamisesta (Kuva 12). Pienin tutkittu pitoisuus 0,03 µg/ml ei kuitenkaan ole vielä MIC-arvo, joka on pitoisuudeltaan vieläkin pienempi.

0

28

Kuva 11. Gentamisiinin vaikutuksia S. equi -bakteerin kasvuun 24 tunnin (vasemmalla) ja 48 tunnin (oikealla) kuluttua. Antibiootin pitoisuuden ollessa 7,81 µg/ml tai sitä suurempi bakteerin kasvun inhibitio on yli 70 % verrattuna kasvukontrolliin 24 tunnin ja 48 tunnin kuluttua sillä poikkeuksella, että 48 tunnin kuluttua pitoisuuden 15,625 µg/ml gentamisiini inhiboi vain 46 %:sesti. Alhaisemmilla pitoisuuksilla bakteerin kasvun inhibitiota ei havaittu.

Kuva 12. Penisilliinin vaikutuksia S. equi -bakteerin kasvuun 24 tunnin (vasemmalla) ja 48 tunnin (oikealla) kuluttua. Antibiootti inhiboi bakteerin kasvua kaikista alhaisimmillakin testatuilla pitoisuuksilla 0,03 µg/ml lähtien yli 78 %:sesti verrattuna kasvukontrolliin.

5.2 MBC-määritys

MBC-määrityksessä vertailtiin S. equi -bakteerien kasvua maljoilla, joissa oli verellä rikastettua Mueller-Hinton-agaria maljoihin, joissa oli pelkkää Mueller-Hinton-agaria. S. equi -bakteerit

0

0,03 0,06 0,12 0,24 0,485 0,975 1,95 3,905 7,81 15,625 31,25 62,5 125 250 500

Kasvun inhibitio (%)

0,03 0,06 0,12 0,24 0,485 0,975 1,95 3,905 7,81 15,625 31,25 62,5 125 250 500

Kasvun inhibitio (%)

29

eivät olleet vuorokaudessa juurikaan kasvaneet veriagar-maljassa, johon pipetoitiin 219,75 µg/ml merkitystä kaivosta (todellinen pitoisuus 1,6-dehydropinidiinille puolet tästä, 109,88 µg/ml, sillä bakteerisuspensiota liuoksesta oli puolet) (Kuva 13). Veriagar-maljassa, johon pipetoitiin 109,88 µg/ml merkitystä kaivosta (todellinen pitoisuus 54,94 µg/ml), bakteerit olivat vuorokaudessa levittäytyneet lähes koko maljalle (Kuva 14).

Kuva 13. Kuvat veriagar-maljoista kannen kanssa (vasemmalla) ja ilman kantta (oikealla) 219,75 µg/ml merkitystä kaivosta pipetoidun 50 µl 1,6-dehydropinidiinin kanssa vuorokauden jälkeen. Kaivon bakteerisuspension vuoksi 1,6-dehydropinidiinin todellinen pitoisuus on puolet merkitystä arvosta eli 109,88 µg/ml. S. equi ei ollut kasvanut alustalla.

Kuva 14. Kuvat veriagar-maljoista kannen kanssa (vasemmalla) ja ilman kantta (oikealla) 109,88 µg/ml merkitystä kaivosta pipetoidun 50 µl 1,6-dehydropinidiinin kanssa vuorokauden jälkeen. Kaivon bakteerisuspension vuoksi 1,6-dehydropinidiinin todellinen pitoisuus on puolet merkitystä arvosta eli 54,94 µg/ml. S. equi oli levittäytynyt lähes koko maljalle.

30

S. equi ei ollut kasvanut vuorokaudessa Mueller-Hinton-maljoilla, joihin pipetoitiin 50 µl 219,75 ja 109,88 µg/ml merkityistä kaivoista (Kuvat 15 ja 16).

Kuva 15. Kuvat Mueller-Hinton-maljoista kannen kanssa (vasemmalla) ja ilman kantta (oikealla) 219,75 µg/ml merkitystä kaivosta pipetoidun 50 µl 1,6-dehydropinidiinin kanssa vuorokauden jälkeen. Kaivon bakteerisuspension vuoksi 1,6-dehydropinidiinin todellinen pitoisuus on puolet merkitystä arvosta eli 109,88 µg/ml. S. equi ei ollut kasvanut alustalla.

Kuva 16. Kuvat Mueller-Hinton-maljoista kannen kanssa (vasemmalla) ja ilman kantta (oikealla) 109,88 µg/ml merkitystä kaivosta pipetoidun 50 µl 1,6-dehydropinidiinin kanssa vuorokauden jälkeen. Kaivon bakteerisuspension vuoksi 1,6-dehydropinidiinin todellinen pitoisuus on puolet merkitystä arvosta eli 54,94 µg/ml. S. equi ei ollut kasvanut alustalla.

31

Kontrollina toimineella Mueller-Hinton-maljalla, jossa oli vain 50 µl bakteerisuspensiota eikä yhtään 1,6-dehydropinidiiniä, ei näkynyt muutosta S. equi -bakteerin kasvussa vuorokauden jälkeen. Neljän vuorokauden jälkeen bakteeri oli kasvanut pieninä valkoisina pesäkkeinä (Kuva 17).

Kuva 17. Kuva kontrollimaljasta, jolle pipetoitiin vain 50 µl bakteerisuspensiota eikä lainkaan 1,6-dehydropinidiiniä. Neljän vuorokauden jälkeen S. equi oli kasvanut pieninä valkoisina pesäkkeinä.

32 5.3 Checkerboard-menetelmä

Kokonaisalkaloidifraktion ja penisilliinin yhdistelmäliuos inhiboi S. equi -bakteerin kasvua 68–

71 %:sesti kaikilla testattujen kokonaisalkaloidifraktion pitoisuuksien (86,25, 43,13, 21,56, 10,78, 5,39, 2,70, 1,35 ja 0 µg/ml) ja penisilliinin pitoisuuksien (1,95, 0,98, 0,49, 0,24, 0,12, 0,06 ja 0,03 µg/ml) yhdistelmillä (Kuvat 18 ja 19).

Kuva 18. Kokonaisalkaloidifraktion (pitoisuuksiltaan 86,25, 43,13, 21,56 ja 10,78 µg/ml) ja penisilliinin yhdistelmäliuosten vaikutuksia S. equi -bakteerin kasvuun.

Penisilliinipitoisuuksilla 1,9525–0,0305 µg/ml yhdistelmäliuos inhiboi bakteerin kasvua 68–71

%:sesti verrattuna kasvukontrolliin.

33

Kuva 19. Kokonaisalkaloidifraktion (pitoisuuksiltaan 5,39, 2,70 ja 1,35 µg/ml) ja penisilliinin yhdistelmäliuosten vaikutuksia S. equi -bakteerin kasvuun sekä pelkän penisilliinin vaikutuksia bakteerin kasvuun. Penisilliinipitoisuuksilla 1,9525–0,0305 µg/ml yhdistelmäliuos inhiboi bakteerin kasvua 68–71 %:sesti verrattuna kasvukontrolliin, kuten myös pelkkä penisilliini kaikilla tutkituilla pitoisuuksilla.

6 TULOSTEN TARKASTELU

6.1. Kuusen piperidiinialkaloidi-uutteesta eristetyn 1,6-dehydropinidiinin antibakteeriset vaikutukset S. equi -bakteeriin

Työn tulokset viittaavat siihen, että kuusen piperidiinialkaloideilla olisi mieto antibakteerinen vaikutus hevosen pääntautia aiheuttavaa S. equi -bakteeria vastaan. Pitoisuudella 54,94 µg/ml 1,6-dehydropinidiini inhiboi S. equi -bakteerin kasvua 75 %:sesti 24 tunnin inkubaatioajan jälkeen. Tämä vaikutus ei säilynyt kuitenkaan 48 tunnin inkubaatioajan jälkeen, jolloin

1,6-0

+ penisilliini vs. S. equiT=24h

0

+ penisilliini vs. S. equiT=24h

0

+ penisilliini vs. S. equiT=24h

0

3,905 1,95 0,975 0,485 0,24 0,122 0,061

Kasvun inhibitio (%)

Penisilliinin pitoisuus (µg/ml) Vain penisilliini vs. S. equi T=24h

34

dehydropinidiini esti enää vain 22 % bakteerin kasvusta. Tämä tulos osoittaa, että kyseisellä pitoisuudella 1,6-dehydropinidiinillä on bakteriostaattinen, eli kasvua estävä, mutta ei tappava vaikutus. Kuusen alkaloidien antibakteerisia vaikutuksia on aiemmin tutkittu hyvin vähän.

Pohjoisamerikkalaisista mäntykasvilajeista Picea pungens (Engelm.) ja Pinus edulis (Engelm.) -lajien neulasista on eristetty (+)-euphococciniinia, jonka todettiin olevan miedosti antibakteerinen (MIC 1000 µg/ml Bacillus subtilis -bakteeria vastaan) (Tawara ym. 1993). 1,6-dehydropinidiinin aktiivisuus S. equi -bakteeria vastaan on myös suurempi kuin toisen miedosti antibakteerisen kuusen alkaloidiyhdisteen, epidihydropinidiinin, Pseudomonas aeruginosa ja Enterococcus faecalis -bakteereja vastaan (Fyhrquist ym. 2019).

1,6-dehydropinidiinin kontrollinäyte esti yllättävänä tuloksena S. equi -bakteerin kasvua kasvukontrolliin verrattuna suurimmalla testatulla pitoisuudella 439,4 µg/ml 79 %:sesti 24 tunnin kuluttua ja vielä 54 %:sesti 48 tunnin kuluttua kokeen aloittamisesta. Tämän tuloksen perusteella osa dehydropinidiininäytteen tehosta saattaa johtua epäpuhtauksista. 1,6-dehydropinidiininäytteessä pentadekaanin, n-nonadekaanin ja 4,7-dimetyloidun undekaanin osuus on kuitenkin noin 30 % pienempi kuin kontrollinäytteessä, joten vaikka epäpuhtauksilla saattaa olla vaikutusta, ei niiden osuus todennäköisesti ole merkitsevä 1,6-dehydropinidiinin tehossa S. equi -bakteerin kasvun estossa.

Tässä työssä kuusen neulasista eristetty piperidiinialkaloidi 1,6-dehydropinidiini oli hieman tehokkaampi estämään S. equi -bakteerin kasvua kuin kaikki kuusessa esiintyvät piperidiinialkaloidit sisältävä kuusen kokonaisalkaloidifraktio (Fyhrquist ym. 2018).

Verrattuna 1,6-dehydropinidiiniin kokonaisalkaloidifraktio inhiboi 64 % kasvusta pitoisuudella 43 µg/ml 24 tunnin inkubaatioajan jälkeen. Tässä työssä ne pitoisuudet tutkittavista aineista, fraktiosta ja antibiooteista, jotka aiheuttivat yli 70–80 % kasvun eston verrattuna kasvukontrolliin, on pidetty MIC-arvoina, sillä kokeissa käytettiin puhdasta Mueller-Hinton ravintolientä ilman verta, mikä hidasti bakteerin kasvua. Näin ollen 1,6-dehydropinidiinin MIC-arvo on 54,94 µg/ml (IC75) verrattuna kokonaisalkaloidifraktion MIC-MIC-arvoon, 265 µg/ml (Fyhrquist ym. 2018), joten 1,6-dehydropinidiini on noin viisi kertaa tehokkaampi kuin kokonaisalkaloidifraktio. 1,6-dehydropinidiinin prosentuaalinen osuus kuusen kokonaisalkaloidifraktiosta on merkittävä, noin 36 % (w/w) (engl. weight by weight, tietyn yhdisteen massaosuus seoksesta) (Fyhrquist ym. 2018). Tämän vuoksi 1,6-dehydropinidiinillä voi olla ratkaiseva vaikutus myös kokonaisalkaloidifraktion antibakteerisuuteen.

Piperidiinialkaloideja sisältävien uutteiden antibakteerisia vaikutuksia on tutkittu jonkin verran, ja esimerkiksi Prosopis juliflora (Sw. DC) -lajin uutteet olivat antibakteerisia useita bakteerikantoja vastaan (MIC 25–75 µg/ml) (Singh ym. 2011). Kyseisessä tutkimuksessa

35

(Singh ym. 2011) ei kuitenkaan tutkittu eristettyjen piperidiinialkaloidien vaikutuksia. Myös havupuiden uutteiden antibakteerisia vaikutuksia on tutkittu jonkin verran. Tutkimuksissa on kuitenkin keskitytty muihin yhdisteisiin kuin alkaloideihin, ja kuusesta on tutkittu erityisesti polyfenoleiden ja stilbeenien antibakteerisuuksia. Esimerkiksi Tanase työryhmineen (2018) totesivat, että kuusesta (Picea abies) eristetyillä vesiliukoisilla polyfenolifraktioilla oli antibakteerisia vaikutuksia (MIC 230 µg/ml) erityisesti gram-positiivisiin kokkibakteereihin.

Lisäksi etanoli, metanoli ja kloroformiuutteet Picea smithiana (Wall. Boiss.) -lajin varren kuoresta olivat antibakteerisia Bacillus subtilis -bakteeria vastaan (Joshi ym. 2016).

6.2 MBC-määritys ja vertailuantibiootit

Työssä tutkittiin myös 1,6-dehydropinidiinin pitoisuuden ja kaksinkertaisen MIC-pitoisuuden kasvun eston laatua S. equi -bakteeriin. Kokeessa vertailtiin kasvun estoa veriagar-maljojen ja verettömien Mueller-Hinton-agarveriagar-maljojen välillä. Veriagar-maljoilla S.

equi -bakteerit olivat kasvaneet 1,6-dehydropinidiinin pitoisuuden ollessa 54,94 µg/ml, mutta bakteerin kasvu oli estynyt pitoisuudella 109,88 µg/ml (Kuvat 13 ja 14). Tämän perusteella 1,6-dehydropinidiinin MBC-arvo olisi 109,88 µg/ml. Sen sijaan pelkästään Mueller-Hinton-agaria sisältävillä maljoilla kasvua ei esiintynyt maljalla, johon oli lisätty 54,95 µg/ml 1,6-dehydropinidiiniä, ja tämän kokeen tuloksen perusteella MBC-arvo 1,6-dehydropinidiinille olisi 54,95 µg/ml (Kuva 16). Tulokset osoittavat, että on suositeltavaa käyttää verellä rikastettuja ravintoalustoja antibakteerisuustutkimuksiin S. equi -bakteeria käytettäessä. MIC- ja MBC-arvot voivat olla todellisuutta pienemmät ei-rikastetuilla mediumeilla, koska bakteeri kasvaa huonosti niillä.

Työssä vertailtiin kahden hevosen pääntaudin hoidossa yleisesti käytetyn antimikrobilääkkeen, gentamisiinin ja penisilliinin, in vitro -antibakteerista tehoa S. equi -bakteeriin. Lisäksi lääkkeiden tehoa vertailtiin kuusen kokonaisalkaloidifraktioon ja 1,6-dehydropinidiiniin. Työn tulosten mukaan gentamisiinin kasvun estovaikutus oli pienempi kuin penisilliinin ja selkeästi pitoisuudesta riippuvainen (Kuvat 11 ja 12). Gentamisiini inhiboi S.

equi -bakteerin kasvua 70–80 %:sesti pitoisuudella 7,81 µg/ml (MIC-arvo) ja sitä suuremmilla pitoisuuksilla 24 ja 48 tunnin kuluttua kokeen aloittamisesta. Poikkeuksena oli, että 48 tunnin kohdalla 15,625 µg/ml pitoisuuden gentamisiini inhiboi 46 %:sesti bakteerin kasvua. 3,905 µg/ml pitoisuus ja sitä pienemmät pitoisuudet gentamisiinia eivät juurikaan inhiboineet bakteerin kasvua. Verrattuna kuusen kokonaisalkaloidifraktioon gentamisiini oli noin 34 kertaa aktiivisempi ja 1,6-dehydropinidiiniin verrattuna noin seitsemän kertaa aktiivisempi (Fyhrquist

36

ym. 2018). Työn tulokset ovat yhdenmukaisia kirjallisuuden kanssa, jonka mukaan gentamisiinille vastustuskykyisten kantojen osuus kaikista hevosista eristetyistä S. equi -kannoista on kasvanut aikajaksona 1999–2012 (Johns & Adams 2016, Boyle ym. 2016).

Penisilliini oli gentamisiinia huomattavasti tehokkaampi S. equi -bakteerin kasvun estossa.

Tämä tulos on yhdenmukainen kirjallisuuden kanssa, jossa penisilliinille vastustuskykyisiä kantoja S. equi -bakteerista ei ole raportoitu (Johns & Adams 2016). Tämä antimikrobilääke inhiboi S. equi -bakteerin kasvua 77,5–80 %:sesti kaikilla testatuilla pitoisuuksilla 0,03–500 µg/ml väliltä kaikilla mitatuilla ajanhetkillä 24 ja 48 tuntia kokeen aloittamisesta (Kuva 12).

Tulosten mukaan penisilliinin MIC-arvo on pienempi kuin 0,03 µg/ml, joten pienempiä pitoisuuksia pitäisi vielä tutkia. Kirjallisuudessa penisilliinistä on esitetty <0,015 µg/ml luokan MIC-arvoja Streptococcus equi subsp. zooepidemicus -bakteeria vastaan (Ensink ym. 2003).

Tässä tutkimuksessa kaikista Mueller-Hinton-ravintoliemessä saaduista estovaikutuksista voidaan yleisesti todeta, että ne olisivat olleet selkeämpiä verellä rikastettua Mueller-Hinton-lientä käytettäessä. Verellä rikastettujen ravintoliuosten käyttö olisi mahdollisesti johtanut noin kaksi kertaa suurempiin MIC-arvoihin, kuten MBC-testien kohdalla todettiin.

6.3 Kokonaisalkaloidifraktion ja penisilliinin yhteisvaikutuksia

Kuusen alkaloidien yhteisvaikutuksia tunnettujen antimikrobilääkkeiden kanssa ei ole tiettävästi aiemmin tutkittu. Luonnonaineet voivat tunnetusti parantaa antimikrobilääkkeiden vaikutuksia ja lääketeollisuudessa ollaan yhä enemmän kiinnostuneita tällaisista niin kutsutuista adjuvanteista tai antibioottien apuaineista (Abreu ym. 2012).

Tässä työssä tarkasteltiin kuusen kokonaisalkaloidifraktion yhteisvaikutuksia penisilliinin kanssa käyttäen checkerboard-menetelmää (Kuvat 18 ja 19). Koska jo pienimmällä tutkitulla penisilliinin pitoisuudella 0,03 µg/ml saavutettiin maksimaalinen estovaikutus, yhteisvaikutuksesta ei voida sanoa oikein mitään. Tulokset viittaavat siihen, että hyvin pieniä pitoisuuksia penisilliiniä (0,01–0,001 µg/ml) kannattaisi käyttää jatkotutkimuksissa selvitettäessä penisilliinin ja kuusen alkaloidien sekä alkaloidijakeiden yhteisvaikutuksia S.

equi -bakteerin kasvun estoon.

Eräiden piperidiinialkaloidien on todettu toimivan yhteisvaikutteisesti tunnettujen antimikrobilääkkeiden kanssa: Kumar yhteistyökumppaneineen (2004) esitti, että synteettisellä piperidiinialkaloidilla amplodiinilla oli yhteisvaikutuksia streptomysiinin kanssa muun muassa Salmonella enterica -bakteeria vastaan, ja amplodiini paransi streptomysiinin vaikutusta jopa 6,5–8-kertaisesti. Tämän lisäksi toisista alkaloidiryhmistä, kuten esimerkiksi Berberis-lajeissa

37

esiintyvistä isokinoliinialkaloideista, on esitetty yhteisvaikutuksia antimikrobilääkkeiden kanssa. Berberis-lajista eristetyllä alkaloidiuutteella todettiin yhteisvaikutuksia ampisilliinin kanssa Bacillus cereus -bakteeria vastaan (Manosalva ym. 2016).

7 JOHTOPÄÄTÖKSET

Työn tulokset osoittavat, että kuusen kokonaisalkaloidiuute sekä 1,6-dehydropinidiini estävät hevosen pääntautia aiheuttavan bakteerin S. equi kasvua. Estovaikutus on kuitenkin mieto ja lisätutkimuksia tarvitaan verellä rikastettuja ravintoalustoja käyttäen. Tutkimuksia kuusen alkaloidien yhteisvaikutuksista tunnettujen antimikrobilääkkeiden, kuten penisilliinin ja muiden hevosen pääntaudin hoidossa käytettyjen antibioottien kanssa, olisi hyvä jatkaa.

KIITOKSET

Kiitän pro gradu -tutkielmani ohjaajia Virpi Virjamoa, Riitta Julkunen-Tiittoa ja Pia Fyhrquistia heidän opastuksesta tutkimuksen kokeellisessa osuudessa, neuvoista lähdemateriaalin etsinnässä ja ylipäätään kaikesta tutkielman kirjoittamiseen liittyvästä avusta. Kiitän Katri Nissistä ja muuta väkeä laboratoriossa heidän avustaan aineistoni keruussa. Kiitän Ville Saksia minun majoittamisestani viikoksi Helsingissä suoritettua aineiston keruuta varten. Kiitän Niko Hyytiäistä graduseminaariesitykseni opponoimisesta.

LÄHDELUETTELO

Abreu, A.C., McBain, A.J., Simoes, M. 2012: Plants as sources of new antimicrobials and resistance modifying agents. Natural Product Reports 29: 1007–1021.

Abreu, A.C., McBain, A.J., Simoes, M. 2012: Plants as sources of new antimicrobials and resistance modifying agents. Natural Product Reports 29: 1007–1021.

In document 1,6-dehydropinidiinin antibakteerisuuden testaaminen hevosen pääntautia aiheuttavalla bakteerilla Streptococcus equi subsp. equi (sivua 21-0)