Allergeenien hallinta jäätelön valmistusprosesseissa

(1)

Ammattikorkeakoulututkinnon opinnäytetyö Hämeenlinna, Bio- ja elintarviketekniikka

Syksy, 2019 Krista Jussila

(2)

Bio- ja elintarviketekniikka Hämeenlinna

Tekijä Krista Jussila Vuosi 2019

Työn nimi Allergeenien hallinta jäätelön valmistusprosesseissa Työn ohjaaja Tuija Pirttijärvi

TIIVISTELMÄ

Tämän opinnäytetyön aiheena oli allergeenien hallinta jäätelön valmistusprosesseissa. Työn toimeksiantaja oli Froneri Finland Oy, Turengin jäätelö- tehdas. Toimeksiantajan tarpeiden perusteella tässä opinnäytetyössä tutkittiin mahdollisia manteli- ja maitoproteiinijäämien esiintymisiä pesujen jälkeen tuotannossa ja ristikontaminaatioriskejä valikoiduilta jäätelön valmistuslinjoilta. Opinnäytetyön tarpeellisuuden taustalla oli yrityksen mie- lenkiinto kehittää uutuustuote, joka tarvitsi allergeenien hallintaa tuoteturvallisuuden varmistamiseksi. Ensimmäistä kertaa mantelia lisättiin jo massan valmistusvaiheessa jäätelömassaan, jolloin allergeeni kulki koko jäätelön valmistuslinjaston halki aina lopputuotteeksi asti. Mantelimassan soveltuvuutta ja pesujen riittävyyttä testattiin tarkkaan hallitulla koeajolla yhdellä jäätelön valmistuslinjalla. Uutuustuotteen kehittäminen hylättiin, kun mantelimassan todettiin koeajon seurauksena olevan erittäin vaikeasti pois pestävää ja aiheuttavan huomattavan ristikontaminaatioriskin.

Opinnäytetyössä analysoitiin manteliproteiinin lisäksi myös maitoproteiinin ristikontaminaatioriskiä kahdelta jäätelön valmistuslinjalta. Maitopro- teiinin analysoinnin tarkoituksena oli selvittää, olisiko mehujäistä ja kaura- juomapohjaisista jäätelöistä mahdollisuutta tulevaisuudessa poistaa ”saattaa sisältää…” -merkintää. Merkinnän poistamiseksi yrityksen on todistet- tava puhtain analyysituloksin, että jäätelön valmistuslinjastojen pesut ovat riittävät eikä ristikontaminaatioriskiä maidon kanssa ole. Opinnäytetyön kokeellisessa osuudessa kerätyistä näytteistä löytyi maitoproteiinijäämiä toisesta tutkittavasta linjastosta. Tämän jäätelön valmistuslinjan pesuaikaa nostettiin ja tämän jälkeen kerättiin uusintanäytteitä. Uusintanäytteet to- distivat pesuajan noston olleen riittävä toimenpide maitoproteiinijäämien hävittämiseksi.

Avainsanat allergeeni, ristikontaminaatio, jäätelön valmistuslinjasto Sivut 26 sivua, joista liitteitä 0 sivua

(3)

Degree Programme in Biotechnology and Food Engineering Hämeenlinna University Centre

Author Krista Jussila Year 2019

Subject Management of allergens in ice cream manufacturing processes

Supervisor Tuija Pirttijärvi

ABSTRACT

The subject of this thesis was the management of allergens in ice cream manufacturing processes. The commissioner was Froneri Finland Oy, an ice cream factory at Turenki. The aim of this thesis was to detect the possible presence of almond and milk protein residues after washing the production area and the risk of cross-contamination from selected ice cream production lines. The motivating force for this thesis was thus arisen from the company’s interest in developing a new product that needs allergen management to ensure product safety.

In the study, for the first time ever, almonds were added to the ice cream mass during the stage of mass manufacture. The allergen passed through the entire ice cream line all the way to the product. The suitability of the almond mass and the adequacy of the product area washes were tested by a carefully controlled test run on one ice cream production line. The development of the novelty product was discarded when the almond mass was found to be very difficult to wash off as a result of the test run and there was a significant risk of cross-contamination.

In addition to the almond protein, the risk of cross-contamination of milk protein from two ice cream production lines was analyzed in order to de- termine whether there might be a possibility to remove the warning label

“may contain…” from popsicles and oatmeal-based ice creams. To remove the label, the company must verify by pure analytical results that the washing of the lines is adequate and that there is no risk of cross-contamination with milk. The samples collected in the experimental part of the thesis con- tained milk protein residues but only in one production line. After increasing the washing time of the production line, additional samples were collected for analysis. As a result, by increasing the washing time it was possible to eliminate milk protein residues.

Keywords allergen, cross-contamination, ice cream production line Pages 26 pages including appendices 0 pages

(4)

1 JOHDANTO ... 1

2 TYÖN TAVOITE JA MERKITYS ... 1

3 ALLERGEENIT JA RUOKA-AINEALLERGIA ... 2

3.1 Allergiset reaktiot ... 2

3.2 Allergeenien merkitseminen tuotteen pakkausmerkintöihin ... 3

4 ALLERGEENIEN POISTAMINEN TUOTANTOPROSESSEISTA MÄRKÄPESUTOIMINNOILLA ... 3

5 ELISA-MENETELMÄT ALLERGEENIPESUJEN LAADUNVARMISTUKSESSA ... 5

5.1 ELISA-menetelmän periaate ... 5

5.1.1 Suora ELISA ... 7

5.1.2 Epäsuora ELISA ... 7

5.1.3 Sandwich ELISA ... 8

5.1.4 Kilpaileva ELISA ... 9

5.2 ELISA-menetelmien vertailu ... 10

6 MANTELIJÄÄMIEN OSOITTAMINEN JÄÄTELÖN VALMISTUSLINJALTA ... 10

6.1 Työn suoritus ... 11

6.2 Näytteenotto ... 11

6.3 Manteliproteiinijäämän analysointimenetelmä ... 13

7 MAITOPROTEIINIJÄÄMIEN OSOITTAMINEN JÄÄTELÖN VALMISTUSLINJOILTA ... 13

7.1 Työn suoritus ... 14

7.2 Näytteenotto ... 14

7.3 Maitoproteiinijäämän analysointimenetelmä ... 15

8 TULOKSET JA NIIDEN TARKASTELU ... 16

9 JOHTOPÄÄTÖKSET JA POHDINTA ... 18

9.1 Manteli ... 18

9.2 Maito ... 18

LÄHTEET ... 21

(5)

1 JOHDANTO

Opinnäytetyöni aiheeksi valikoitui manteliallergeenin hallinnan kehittämi- nen jäätelönvalmistuslinjalla pesujen osalta, koska se oli työn teettäjälle, Froneri Finland Oy:lle, ajankohtainen ja tarpeellinen. Ensimmäistä kertaa Turengin jäätelötehtaalla pähkinäallergeenia lisätään tuotantolinjalle jo massan valmistusvaiheessa. Tämän vuoksi oli tärkeää selvittää mantelial- lergeenijäämien onnistunut poistaminen jäätelön valmistuslinjastosta.

Tällä hetkellä Froneri Finland Oy:lla ei ole aikaisempaa kokemusta tai tut- kimustietoa manteliallergeenien hallinnasta osana massan valmistuspro- sessia. Yrityksessä on kuitenkin pyritty jo aiemmin optimoimaan linjojen pesut siten, että ne ovat riittävän tehokkaat kaikenlaisten jäämien hävittä- miseksi ja ovat energiataloudellisesti kannattavia.

Opinnäytetyön edetessä työnkuvaan lisättiin maitoproteiinijäämien tutkiminen manteliproteiinin tavoin. Tarkoituksena oli kartoittaa jääkö maito- pohjaisten tuotteiden ajojen ja pesujen jälkeen linjastoille maitoproteiini- jäämiä, jotka saattaisivat aiheuttaa ristikontaminaatioriskin esimerkiksi kaurajuomapohjaisia tuotteita ajettaessa. Myös maitoproteiinijäämien tutkimisessa tärkeää on varmistaa pesujen optimointi tutkimustulosten perusteella sopiviksi.

2 TYÖN TAVOITE JA MERKITYS

Tämän opinnäytetyön keskeinen tavoite oli tutkia jääkö manteli- ja maito- proteiinijäämiä jäätelön valmistuslinjastoihin nykyisten pesujen jälkeen ja kehittää jäätelönvalmistuslinjan pesuja siten, että ne ovat riittävän tehokkaat jäämien poistamiseksi, mutta kuitenkin mahdollisimman vähäiset esimerkiksi vesihävikin kannalta. Toimeksiantaja halusi selvittää, riittävätkö pesut nykyisellään tuoteturvallisuuden takaamiseksi ja jos eivät, miten niitä tulisi kehittää.

Allergeenien valvominen on tärkeä osa elintarvikeyritysten omavalvonta- suunnitelmaa. Allergeenien käsittely vaatii yritykseltä riskiarviointia esimerkiksi ristikontaminaatiovaarojen selvittämiseksi. Allergeenien oikeat käsittelytavat varmistavat lopputuotteiden kuluttajille, että ei tuote sisällä sellaisia ainesosia, joita siinä ei kuulu olla.

Allergeenien hallinnalla yritys kykenisi tarjoamaan tuotteitaan myös laa- jemmalle asiakaskunnalle, kun tuotteista olisi mahdollista poistaa ”saattaa sisältää…” -merkintä. Nykyisellään merkintä kattaa mahdollisuuden ristikontaminaatioon jonkin tuotteeseen kuulumattoman raaka-ainejäämän

(6)

kanssa, kuten esimerkiksi vegaanisissa tuotteissa maitoproteiinien. Aller- geenien onnistuneella hallinnalla ja tutkimustyöllä merkintä olisi mahdollista poistaa, mikä tarjoaisi erityisesti allergisille kuluttajille monipuoli- suutta jäätelövaihtoehtoihinsa.

3 ALLERGEENIT JA RUOKA-AINEALLERGIA

Ruoka-aineallergiat ovat nykyisin yleinen terveysongelma: noin 10–15 % alle kouluikäisistä lapsista, kouluikäisistä noin 5 % ja noin 3 % aikuisista kär- sii erilaisista ruoka-aineallergioista Suomessa. Ruoka-aineallergiat aiheuttavat ihmiskehossa yliherkkyysreaktion, jolloin elimistö ei tunnista ainetta ja elimistö reagoi siihen. Yleisiä allergian aiheuttajia ovat ruoka-aineiden proteiinit, mutta ruoissa on muitakin allergisoivia ainesosia. Pienen osan allergeeneista tiedetään aiheuttavan allergikolle hengenvaarallisen reaktion, joka voi olla yhtä vakava kuin anafylaktinen reaktio. Anafylaksia on hyvin vakava allerginen reaktio, jossa useampi kuin yksi sisäelin reagoi jopa henkeä uhkaavasti allergian laukaisijaan. (Allergia-, Iho- ja Astmaliitto n.d.;

Houhoula ym., 2014; Ruokatieto, n.d.)

3.1 Allergiset reaktiot

Allergiseksi reaktioksi kutsutaan tapahtumaa, jossa elimistö reagoi johon- kin ympäristömme yleiseen valkuaiseen yliherkkyysreaktiolla. Allergisen ihmisen elimistö on muodostanut immunologisen vasteen eli vasta-aineita tai herkistyneitä valkosoluja allergeenia vastaan. Allergiaa aiheuttavaa ainetta kutsutaan allergeeniksi. (Terveyskirjasto, n.d.)

Tavallisesti allergian muodostuessa ihmisen elimistö teettää immunoglo- buliini E-vasta-aineita eli igE-vasta-aineita esimerkiksi jotakin ruoka-ainetta kohtaan. Tällaista allergiaa kutsutaan välittömäksi igE-välitteiseksi allergiaksi tai atooppiseksi allergiaksi. Nämä vasta-aineet kiinnittyvät ihossa ja limakalvoilla olevien solujen pintaan ja kun igE-vasta-aineet tunnistavat allergeenin, ne reagoivat allergeenin kanssa solujen pinnoilla. Tällöin solut vapauttavat histamiinia ja muita välittäjäaineita, jotka kutsuvat luokseen tulehdussoluja. Allergisessa reaktiossa elimistö pyrkii torjumaan yleensä muutoin harmittoman allergeenin ja reaktion seurauksena voi ilmetä esimerkiksi kutinaa ja vatsaoireita. Oireet ilmenevät atooppista allergiaa sai- rastavalle yleensä hyvin nopeasti, mutta viimeistään tunnin kuluessa allergeenille altistumisesta. (Terveyskirjasto, n.d.)

Allergisen reaktion toisessa yleisessä muodossa elimistön valkosolut ovat herkistyneet jollekin allergeenille. Kyseessä on siis soluvälitteinen allergia.

Tätä allergian muotoa kutsutaan viivästyneeksi allergiaksi, sillä oireet ilme- nevät yleensä viiveellä. Viivästynyttä allergiaa aiheuttavat yleensä jotkin

(7)

ympäristön kemikaalit, joten tämä allergian muoto ei ole tämän opinnäy- tetyön kannalta merkittävä. (Terveyskirjasto, n.d.)

3.2 Allergeenien merkitseminen tuotteen pakkausmerkintöihin

On hyvin tärkeää, että ruoka-aineallergioista kärsivät voisivat välttää aller- gisoivan ruoka-aineen erilaisia elintarvikkeita ostaessaan. Siksi on äärim- mäisen tärkeää, että allergeenit on merkitty selvästi pakkausmerkintöihin.

Ne on saatava selville ennen ostopäätöksen tekoa ja ilman ylimääräisiä kustannuksia. Allergeenejä tulee korostaa ainesosaluettelossa esimerkiksi paksummalla tekstillä, kirjasinlajilla tai taustavärin avulla. (Ruokavirasto, n.d.a)

Erityistä huomiota allergeenien osalta on kiinnitettävä teollisiin tuotteisiin, joiden valmistuksessa on mahdollisuus allergeenien ristikontaminaatioon.

Ristikontaminaatiolla tarkoitetaan allergeenien välittymistä esimerkiksi yhteisen tuotantolinjan kautta tuotteeseen, jossa allergisoivaa raaka-ainetta ei kuuluisi tuoteselosteen pohjalta olla. Tämän vuoksi jaettavien vä- lineiden ja valmistuslinjojen puhdistus on yksi merkittävimmistä kriittisistä pisteistä allergeenien kontrolloinnissa. Ristikontaminaation aiheuttama uhka ilmoitetaan tuotteen etiketissä ilmauksella ”saattaa sisältää…”, mikä on erittäin hyödyllinen tieto kuluttajille. Merkinnöissä on mainittava esimerkiksi mitä pähkinää tuote saattaa sisältää. (Houhoula ym., 2014; Jack- son ym., 2008, ss. 445–458; Ruokavirasto, n.d.b)

4 ALLERGEENIEN POISTAMINEN TUOTANTOPROSESSEISTA MÄRKÄPESUTOIMINNOILLA

Elintarviketeollisuudessa tuotantotilojen pesutoiminnot voidaan jakaa kahteen eri luokkaan: on olemassa märkä- ja kuivapesuja. Näiden pesutoi- mintojen merkittävin ero on veden käyttö puhdistuksen apuvälineenä. Ni- mensä mukaisesti märkäpesuissa käytetään vettä osana pesuprosessia ja vastaavasti kuivapesuissa ei. Kuivapesut ovat esimerkiksi imurointia, lakai- semista, pyyhkimistä liinoilla tai siveltimillä, kaapimista ja paineilman hyö- dyntämistä puhdistuksissa. Kuivapesut ovat yleisesti käytössä sellaisilla elintarviketehtailla, joilla käsitellään esimerkiksi jauhemaisia raaka-aineita kuten mausteita. Myös meijeriteollisuudessa hyödynnetään kuivapesuja erilaisia maito- ja herajauheita valmistettaessa ja käsiteltäessä. Froneri Fin- land Oy:lla kuivapesuja käytetään muun muassa jauheosastolla ja pakkaus- puolella, missä jäätelöt pakataan kuljetuslaatikoihin. Tässä opinnäyte- työssä on kuitenkin keskitytty märkäpesuprosesseihin, sillä työn tarkoituksena on tutkia allergeenien poistamista tuotantoprosesseista, jotka pesey- tyvät vesipesutoiminnoilla. (Jackson ym., 2008, ss. 445–458)

(8)

Elintarviketeollisuus hyödyntää vesipesuissaan pääasiassa neljää eri tapaa.

Niistä ensimmäinen on niin kutsuttu CIP-pesu (clean in place). CIP-pesu tarkoittaa, ettei laitteistoa tarvitse lainkaan tai juuri lainkaan purkaa pesua varten ja pesuvesi voi olla kierrätettävää. Esimerkiksi meijereiden putkilin- jastot pestään pääasiassa CIP-pesuilla. Toisessa pesutavassa osa laitteis- tosta puretaan pesua varten, jolloin pesutekniikkaa kutsutaan COP-pesuksi (clean out of place). Kolmas pesutapa on vaahto- tai geelipuhdistus, jossa pesua varten tarkoitettua kemikaalia suihkutetaan pestävälle pinnalle vaahtona tai geelinä. Tämä puhdistustekniikka on yleisesti käytössä tuotantotilojen pinnoilla, kuten lattioilla. Lisäksi neljäntenä puhdistustekniik- kana käytetään puhtaasti manuaalista pesemistä käsin. Teollisuus, joka vaatii korkeatasoista hygieniaa, käyttää CIP-pesuja laitteistolleen ja esimerkiksi vaahtopesuja lattiapinnoille. Näitä teollisuuden aloja ovat esimerkiksi meijerit ja panimot. Näiden kaikkien pesujen onnistumisen takaamiseksi on varmistettava, että käytetään tilanteeseen soveltuvia puhdis- tusaineita ja mekaaninen teho on riittävä. Lisäksi täytyy huomioida lämpö- tilan ja ajan optimointi sopivaksi raaka-ainekomponenttien irrottamiseksi.

(Jackson ym., 2008, ss. 445–458; Thomas & Sathian, 2014, ss. 41–44) Tuotantolaitoksissa on otettava huomioon, että niin tavallisissa pesuissa kuin allergeenien poistoon tarkoitetuissa pesuissa mikään käytäntö ei ole ihanteellinen kaikissa tilanteissa. Pesuja suunnitellessa on otettava huomioon esimerkiksi useat raaka-ainekomponentit ja niiden irrottamiseen sekä liuottamiseen parhaiten soveltuvat pesuaineet. Raaka-ainekomponenttien liukoisuus riippuu monista tekijöistä, kuten koostumuksesta, iästä, kuivuu- desta ja aikaisemmasta lämpöaltistuksesta. Puhdistettavan raaka-aine- komponentin ominaisuudet tulisi tiedostaa ennen pesun valitsemista, jotta pesusta saataisiin mahdollisimman optimaalinen. (Jackson ym., 2008, ss. 445–458)

Clean in place-pesuprosessi käynnistyy esihuuhtelulla. Seuraava vaihe on emäspesu, joka on yleisesti päivittäinen pesu, jolla poistetaan orgaaninen lika, kuten rasva, proteiinit ja laktoosi. Emäspesun lisäksi tehdään säännöl- lisin väliajoin happopesu kalkkikiven ja muiden saostumien poistamiseksi linjastosta. Tämän varsinaisen pesuvaiheen jälkeen suoritetaan huuhtelu, jotta pesuaineet saadaan pestyä myös pois. Huuhtelua seuraava vaihe on desinfiointi, jonka tarkoituksena on varmistaa, että mikrobit ovat tuhoutu- neet ja taata ettei tuotantolinjalle jää biofilmejä. Biofilmit ovat mikrobien pesäkkeitä. Myös desinfiointiaine on tärkeää huuhdella pois. Lopuksi suoritetaan kuivaus. (Pienmeijeriopas, n.d.)

Raaka-ainekomponentit voidaan luokitella neljään pääasialliseen luokkaan niiden makroainesosien muodon perusteella: hiilihydraatit, rasvat, mine- raalit ja proteiinit. Tavallisesti tuotantolinjoilla valmistettavista tuotteista jää linjan/putkistojen pinnoille jäämiä näiden komponenttien yhdistel- mistä. Yleisesti proteiinit, joihin lukeutuvat mukaan allergeeniset proteiinit, ovat hankalimpia poistaa tuotantolinjojen pinnoilta. Usein tuotteiden valmistukseen kuuluu jonkinlaista lämpökäsittelyä, joka saa proteiinit

(9)

denaturoitumaan ja tarttumaan kiinni valmistuslinjan pintoihin, kuten esimerkiksi putkistoon. Proteiinikalvojen peseminen pois vaatii emäspohjai- sia pesuaineita, kuten esimerkiksi kaliumhydroksidia tai natriumhydroksi- dia. Emäspesut ovat yleisiä elintarviketeollisuudessa ja erityisesti meijeriteollisuudessa, sillä emäsliuokset saippuoittavat hyvin rasvajäämiä ja ha- jottavat proteiinia vesiliukoisempaan muotoon. Yleisin ja vahvin emäksi- nen pesuaine on natriumhydroksidi eli lipeä. Lipeästä käytetään tyypilli- sesti konsentraatiota välillä 0,15–1 prosenttia 70–85 °C:ssa, kun puhdistus- aika on 10–30 minuuttia. Emäksisien pesuaineiden pH on yli 7, tavallisesti 10–11. (Jackson ym., 2008, ss. 445–458; Thomas & Sathian, 2014, ss. 41–

44)

Emäspesujen yhteydessä käytetään usein myös hapettimia, jotka auttavat liuottamaan vaikeasti irrotettavia raaka-ainekomponentteja halutuilta pinnoilta. Pinta-aktiiviset aineet tehostavat liukenemista kostuttamalla pin- taa, jolloin varsinaisen puhdistusliuoksen on helpompi irrottaa pinttynyt lika. Proteiinijäämiä poistettaessa pestävät laitteet on käsiteltävä ensin emäspohjaisella pesuaineella, sillä happamat puhdistusaineet aiheuttaisi- vat proteiinien kiinnittymisen puhdistettaviin pintoihin yhä tiukemmin.

Tällöin käytetään jopa yli 5 prosenttista lipeäliuosta. Tavallisimmin meije- riteollisuuden kiertopesuissa käytetään happopesuaineena typpihappoa, jonka pH on alle 2. Happopesut tapahtuvat yleensä 55–80 °C:ssa ja kestä- vät 5–20 minuuttia. (Jackson ym., 2008, ss. 445–458; Thomas & Sathian, 2014, ss. 41–44)

5 ELISA-MENETELMÄT ALLERGEENIPESUJEN LAADUNVARMISTUKSESSA

Elintarviketeollisuuden allergeenijäämien analysointi perustuu enimmäk- seen ELISA-menetelmiin (Enzyme-linked Immunosorbent Assay). Myös PCR-menetelmiä (Polymerase Chain Reaction) käytetään elintarviketeollisuudessa allergeenijäämien analysointiin. PCR-menetelmät perustuvat po- lymeraasiketjureaktioon, jonka avulla on mahdollista monistaa DNA:sta moninkertaisia kopioita lyhyessä ajassa. Tässä opinnäytetyössä perehdy- tään kuitenkin laajemmin ELISA-periaatteeseen, sillä näitä menetelmiä on käytetty opinnäytetyön kokeellisessa osuudessa. (Besler, 2001, ss. 662–

672)

5.1 ELISA-menetelmän periaate

Manteli- ja maitoproteiinijäämien tutkimiseksi käytetään esimerkiksi ELISA-menetelmää. Tämä menetelmä perustuu antigeeni-vasta-ainereak- tioon. Näiden kohdatessa muodostuu sidos, jota voidaan käyttää näytteen spesifiseen tunnistamiseen. Tulosta varten mitattava signaali muodostuu entsyymien toiminnasta. ELISA-menetelmällä näytteestä määritetään siis

(10)

suoraan allergisoivaa proteiinia ja tulos ilmoitetaan kvantitatiivisesti (mg/kg). (Tuovinen, 2013)

ELISA-menetelmät ovat immunologisia tekniikoita biologisten näytteiden kuten esimerkiksi erilaisten allergeenijäämien tutkimiseksi antigeeni- vasta-ainereaktiolla. ELISA-menetelmille on yhteistä, että ne suoritetaan esimerkiksi mikrotiitterilevyllä, johon antigeeni tai vasta-aine on sitoutu- nut. Antigeenillä tarkoitetaan tässä opinnäytetyössä mantelin tai maidon proteiinia, mutta antigeeni voi olla myös mikä tahansa molekyyli, joka mahdollisesti aiheuttaa ihmisen elimistössä allergisen reaktion. Vasta-aineet ovat puolestaan eliöiden elimistöissä luonnostaan olevia immuunijär- jestelmän puolustusmekanismeja, jotka havaitsevat antigeenejä. Tietty vasta-aine tunnistaa ainoastaan tiettyä antigeeniä ja tämän vuoksi ELISA- menetelmä on hyvin riippuvainen vasta-aineen valinnasta. Tietylle antigeenille, kuten vaikka mantelin proteiinille, on löydettävä spesifinen vasta- aine, jonka tulisi sitoutua antigeeniinsä nopeasti ja voimakkaasti. Lisäksi si- toutuneen vasta-aine-antigeenikompleksin tulisi olla vakaa tulosten luo- tettavuuden varmistamiseksi. (Cell Signaling Technology, n.d.a; Janatui- nen, 2015, ss. 17–19)

Tuloksien mittaamiseksi on tärkeää osoittaa antigeeni-vasta-ainereaktion tapahtuminen. Havaintotapana voi olla esimerkiksi vasta-ainevärjäys, jolla voidaan mitata värin absorboivia ominaisuuksia ja näin todeta, onko näyt- teessä tapahtunut antigeenin läsnäoloa paljastavia reaktioita eli niin kut- suttuja reaktiotuotteita. ELISA-tekniikassa sitoutuneisiin antigeeneihin ja vasta-aineisiin lisätään konjugaatioliuosta, joka tuottaa leimaentsyymejä luomalla leimaavan sidoksen. Konjugaatiolla tarkoitetaan sidosten luo- mista yhdisteiden välille. Nimensä mukaisesti leimaentsyymit kiinnittyvät vasta-aineisiin ja kun mukaan lisätään substraattiliuosta, syntyy väriainere- aktio. Mitä voimakkaammin väriä muodostuu, sitä enemmän tutkittavassa näytteessä on reaktiotuotteita ja siten antigeeniä. Tämän reaktion vuoksi ELISA-menetelmää kuvaillaan entsymaattiseksi menetelmäksi. (Cell Sig- naling Technology, n.d.a; Janatuinen, 2015, ss. 17–19)

(11)

5.1.1 Suora ELISA

ELISA-menetelmistä Suora ELISA on yksinkertaisin. Antigeeni sitoutuu suoraan esimerkiksi mikrotiitterilevyn kuoppaan ja sen perään lisätään estoai- netta, joka siis estää epäspesifisten vasta-aineiden sitoutumista levykuoppiin. Tarkoituksena on varmistaa, että antigeenin kanssa pääsee reagoi- maan vain oikea vasta-aine. Tutkittavaa antigeeniä havaitsevaan vasta-aineeseen sitoutuu leimaentsyymi konjugaatioliuoksella. Antigeeni ja vasta- aine reagoivat keskenään levykuopissa ja sitten suoritetaan pesu, jonka tarkoituksena on huuhtoa ylimääräiset vasta-aineet pois. Lopuksi lisätään substraattiliuos entsyymireaktion käynnistämiseksi ja värimuunnoksen ai- kaansaamiseksi. Suorassa ELISA-menetelmässä on lyhyt inkubointiaika. Re- aktiot pysäytetään lopetusliuoksella, minkä jälkeen tulos luetaan ELISA- analysaattorilla. Suoran ELISAn etuja ovat nopeus ja yksinkertaisuus, mutta vastaavastikaan tällä menetelmällä ei saada yhtä tarkkoja tuloksia kuin muilla ELISA-menetelmillä. Kuvassa 1 on suoran ELISA-menetelmän toimintaperiaate havainnollistavana kuvana. (Cell Signaling Technology, n.d.b; Virolainen, 2017, s. 10)

Kuva 1. Suoran ELISA-menetelmän toimintaperiaate (Cell Signaling Tech- nology n.d.b)

5.1.2 Epäsuora ELISA

Epäsuora ELISA-menetelmä on pitkälti toteuttamisvaiheiltaan samanlai- nen kuin edellä kuvailtu suora ELISA-menetelmä. Yleensä epäsuoran ELI- SAn tekeminen alkaa samalla tavalla kuin suorankin ELISAn, eli antigeenin kiinnittämisellä esimerkiksi mikrotiitterilevyn kuoppiin ja estoaineen lisää- misellä. Tämän jälkeen lisätään vasta-aine, joka, toisinkuin suorassa ELI- SAssa, ei ole konjugoitu eli sidottu leimaentsyymiin vaan on ainoastaan spesifinen antigeenille. Seuraavaksi lisätään mukaan vasta-ainetta, joka on sidottu leimaentsyymiin tämän ensimmäisen sitovan vasta-aineen havait- semiseksi. Viimeiset vaiheet noudattavat jälleen samaa kaavaa suoran

(12)

ELISAn kanssa: levykuopat pestään ja tämän päätteeksi lisätään substraatti, inkuboidaan ja pysäytetään reaktio lopetusliuoksella. Kuvassa 2 on epäsuoran ELISA-menetelmän toimintaperiaate havainnollistavana kuvana. (Cell Signaling Technology, n.d.c; Virolainen, 2017, s. 11)

Kuva 2. Epäsuoran ELISA-menetelmän toimintaperiaate (Cell Signaling Technology n.d.c)

5.1.3 Sandwich ELISA

Sandwich ELISA-menetelmän etuina pidetään erityisesti sen tarkkuutta.

Sandwich-menetelmällä saadaan kvantitatiivisesti tarkin ja merkittävin tulos tutkittavasta näytteestä verrattuna suoraan tai epäsuoraan ELISAan.

Tässä tutkintatavassa vasta-aine sidotaan mikrotiitterilevyn kuoppiin antigeenin sijaan. Tämän lisäksi antigeeni tunnistetaan kahdella vasta-aineella:

ensin antigeeni sitoutuu levykuopassa olevaan entsyymileimattomaan vasta-aineeseen ja tämän jälkeen lisätään vielä toinen vasta-aine, joka on entsyymileimattu. Näiden aineiden reaktiosta muodostuu kompleksi, josta sandwich-menetelmä on saanut nimensä. Antigeeni jää tässä tekniikassa ikään kuin kahden vasta-aineen väliin ja syntyy ”voileipä”. Muutoin tässä- kin menetelmässä muut työvaiheet noudattavat pitkälti samaa kaavaa kuin suorassa ja epäsuorassakin ELISAssa. (Cell Signaling Technology, n.d.a; Vi- rolainen, 2017, ss. 11–12)

ELISA-testaus aloitetaan punnitsemalla näytettä tarvittava määrä ja lisää- mällä siihen uuttopuskuria. Ne laitetaan 60 °C:n lämpöiseen vesihautee- seen 15 minuutiksi ja ravistetaan kahden minuutin välein. Lopullinen uutos on tämän jälkeen valmis analysoitavaksi. Uutosliuos sisältää siis mahdollisesti antigeeniä ja on tutkittava näyte. Analysointi tapahtuu lisäämällä

(13)

uutosliuosta ja standardiliuoksia niille tarkoitetulle alustalle. Alustana toi- mii esimerkiksi mikrotiitterilevy, jossa on kuoppia, johon liuokset pipetoi- daan. Levykuopissa on jo valmiiksi antigeenille spesifioitua vasta-ainetta ja nyt mikrotiitterilevylle lisätään entsyymileimattua vasta-ainetta. Pipetoin- nin jälkeen liuoksia inkuboidaan 20 minuutin ajan huoneenlämmössä.

Huoneenlämpö on 20–25 °C. Inkubaation aikana antigeeni eli tutkittava näyte sitoutuu kuoppiin sidottuihin vasta-aineisiin ja syntyy sidoksia.

Vasta-aineet ovat muodostuneet siten, että sopivat täydellisesti yhteen antigeenin kanssa. Tämän vuoksi ELISA-menetelmää kutsutaan myös avain-lukkoperiaatteeksi. (Eurofins, 2018; Tuovinen, 2013)

Analysoinnin seuraava vaihe on levykuoppien pesu pesuliuoksella. Kuopat pestään kolme kertaa, jonka jälkeen ne kuivataan taputtamalla mikrotiit- terilevyä. Pesulla poistetaan ylimääräiset proteiinit. (Eurofins, 2018; Tuo- vinen, 2013)

Seuraavassa vaiheessa kuoppiin lisätään konjugaatioliuosta ja mikrotiitterilevyn annetaan näytteineen inkuboitua jälleen huoneenlämmössä 20 minuuttia. Konjugaation seurauksena syntyy leimaentsyymejä. Leimavasta- aineet ovat osa vasta-ainevärjäystä, jolla saadaan näkyviin mitattava väri näytteestä. Seuraava vaihe on jälleen kuoppien pesu kolmesti pesuliuoksella. Pesun tarkoituksena on huuhdella sitoutumattomat vasta-aineet pois mikrotiitterilevyn kuopista. Pesujen päätteeksi kuoppiin lisätään sub- staattiliuosta. Substraattiliuos on kasvualustaa, jossa leimaentsyymi tuottaa testissä mitattavaa yhdistettä. Analysoinnissa käytettävä mikrotiitterilevy näytteineen viedään pimeään tilaan 20 minuutiksi, missä näytteiden väri kehittyy. Värin kehittyminen pysäytetään lopuksi pysäytysliuoksella.

Tämän jälkeen kvantitatiiviset tulokset ovat luettavissa 450 nanometrillä ELISA-analysaattorilla. Analysaattori mittaa siis näytteen väriä. (Eurofins, 2018; Tuovinen, 2013)

5.1.4 Kilpaileva ELISA

Kilpailevassa ELISA-menetelmässä mikrotiitterilevyn kuoppiin on sidottu tutkittavalle antigeenille spesifistä vasta-ainetta ja tekniikan ajatuksena on kilpailuttaa tutkittavaa antigeeniä entsyymileimatun antigeenin kanssa.

Nämä molemmat antigeenit pyrkivät kilpailemaan sitoutumisesta vasta-aineiden kanssa levykuopissa. Entsyymileimatun antigeenin matala sitoutu- mismäärä osoittaa korkean tutkittavan antigeenin määrän. Entsyymilei- mattu antigeeni on konjugoitu esimerkiksi fluoresoivan väriaineen kanssa, joten mikäli värireaktio on heikko, on näytteessä runsaasti tutkittavaa an- tigeeniä, kuten esimerkiksi jotakin allergeeniä. (Cell Signaling Technology, n.d.a; Janatuinen, 2015, ss. 17–18)

(14)

5.2 ELISA-menetelmien vertailu

Taulukossa 1 on esitetty erilaisten ELISA-menetelmien hyvät ja huonot puolet taulukkomuodossa. Taulukossa 1 on eritelty suora-, epäsuora-, sandwich- ja kilpaileva ELISA toisistaan. Tarkoituksena on kiteyttää aikai- semmin kuvailtujen menetelmien edut ja haittapuolet, jotka vaikuttavat myös osaltaan menetelmän valintaan.

Taulukko 1. ELISA-menetelmien vertailua (Cell Signaling Technology, n.d.a)

6 MANTELIJÄÄMIEN OSOITTAMINEN JÄÄTELÖN VALMISTUSLINJALTA

Manteli (Amygdalys communis) on hedelmä, joka on läheistä sukua persi- kalle ja aprikoosille. Tämän hedelmän sisällä on luumarja, jonka sisällä puolestaan on pähkinämäinen siemen. Tämä siemen tunnetaan paremmin mantelina. Manteleita käytetään laajasti ympäri maailmaa erilaisissa elin- tarvikkeissa, kuten muroissa, kekseissä ja suklaassa. Manteleilla on korkea proteiinipitoisuus (n. 25 %), joka tekee niistä paitsi hyvin ravitsevia myös hyvin allergisoivia. Näistä proteiineista 95 % on vesiliukoisia. Kuitenkin jopa muutama milligramma mantelia saattaa aiheuttaa allergisen reaktion manteliallergiselle, joten on erittäin tärkeää voida varmistaa, ettei mante- littomissa tuotteissa ole esimerkiksi ristikontaminaation vuoksi mantelijää- miä. (Anydaynuts, n.d.; Mediq, n.d.)

Hyvät puolet Huonot puolet

Suora ELISA Helppous Jokainen käytettävä vasta-aine

täytyy sitoa levykuoppiin Ideaalinen menetelmä vasta-

aineen määrän mittaamiseksi näytteistä

Muita menetelmiä epätarkempi ja joustamattomampi

Epäsuora ELISA Tarkempi kuin suora ELISA Useampi työvaiheiden lukumäärä saattaa altistaa virheille

Mahdollisuus käyttää konjugoitua vasta-ainetta useisiin

määrityksiin; kustannustehokas

Pitkäkestoisempi kuin suora menetelmä

Sandwich ELISA

Edellä mainittuja menetelmiä tarkempi, koska määritys vaatii kahta vasta-ainetta tutkittavan antigeenin tunnistamiseksi

Kallis ja pitkäkestoinen menetelmä

Kilpaileva ELISA

Hyvä menetelmä näytteen kvantitatiiviselle mittaamiselle, mikäli antigeenipitoisuus on alhainen

Hyödyllinen immuunivasteiden mittaamisessa

(15)

6.1 Työn suoritus

Tässä opinnäytetyötutkimuksessa selvitettiin jääkö mantelijäämiä jäätelön valmistusprosessissa linjastoon. Manteliproteiinijäämiä tutkittiin tässä opinnäytetyössä yhdestä jäätelönvalmistuslinjastosta, joka on tässä opin- näytetyössä nimetty linja A:ksi. Linjalla A valmistetaan yksinomaan erilaisia jäätelöpuikkoja. Työssä kartoitettiin mahdolliset riskipaikat näytteenottoa ajatellen ja pohdittiin, mistä näytteet oli järkevintä ottaa. Näytteenotto- paikat valikoitiin huolellisesti tämän perusteella linjalta A.

Näytteenottopaikkoja oli yhteensä kahdeksan. Mukana oli kohteita, joista näyte kerättiin sivelynäytteenä ja myös esimerkiksi pesuveden huuhtelu- näyte CIP-pesusta. Näytteenottopaikoissa oli otettu huomioon kohdan kriittisyys ja tärkeys linjaston puhtauden kannalta.

Näytteenotto tapahtui steriileillä välineillä. Näytteitä otettiin sekä sively- että nestemäisinä näytteinä. Näytteet lähetettiin ulkopuoliselle taholle tutkittavaksi, eikä pikamenetelmiä käytetty manteliallergeenijäämien tutkimiseen. Tarkoituksena oli maksimoida tulosten oikeellisuus ja tarkkuus.

6.2 Näytteenotto

Manteliproteiinijäämien kartoittamisessa pyrittiin ottamaan huomioon koko jäätelönvalmistuslinja, sillä mantelimassaa lisätään tuotteeseen jo massanvalmistusvaiheessa. Taulukkoon 2 (s. 12) koottiin yksinkertaiste- tusti tieto siitä, onko näytteenotto tapahtunut massaosaston vai tuotannon puolella, numeroitu näytteet, kerrottu tarkemmin näytteenottopaikat sekä näytteenottotavat tutkittavilta paikoilta. Näytteenotossa on nouda- tettu hygieenisyyttä ja tarkkuutta, jonka lisäksi näytteenotto on tapahtunut steriileillä välineillä. Näytteet otettiin hetimmiten manteliajon ja linjaston pesun jälkeen tai heti seuraavan tuoteajon alussa näytteestä riippuen.

(16)

Taulukko 2. Manteliproteiinijäämätestin näytteenottopaikat- ja tavat jäätelöpuikkolinjalta

Ensimmäiset neljä näytettä ovat kaikki massaosastolta kerättyjä. Näyte 1 otettiin sekoitussäiliön sihdistä sivelynäytteenä heti manteliajon ja CIP- pesun päätteeksi. Tällöin sihti avattiin ja sen sisäpinnalta pyyhittiin sivelyllä näytettä tutkittavaksi. Seuraava näyte 2 otettiin myös CIP-pesun yhtey- dessä, kun kiertopesu oli pessyt ja desinfioinut linjaston. Desinfioinnin päätteeksi huuhteluvettä valutettiin pesukeskuksen näytteenottoputkesta näytepurkkiin. Pastöörista näytteenotto tapahtui viikonlopun aikana, sillä sen avaaminen ja peseminen oli työläämpi tehtävä. Pastöörin pesusta vas- taavat henkilöt kaapivat orgaanista jätettä pastööristä avattuaan sen. Pas- tööriin kertyneitä jäämiä haluttiin tutkia, sillä on tiedossa, että laitteen si- säpinnoille kertyy jonkin verran orgaanisiä jäämiä tuoteajojen päätteeksi.

Pastöörin todettiin olevan yski kriittisimmistä kohdista myös allergeenijää- mien keräämiseen ja riskikontaminaation välittämiseksi seuraavaan tuotteeseen. Viimeinen massaosaston näytteistä oli näyte 4, joka otettiin ba- lanssialtaasta sivelynä pesun päätteeksi. Balanssialtaan pesu kuuluu myös CIP-pesun yhteyteen.

Tuotannosta otettavia näytteitä kerättiin sekä CIP-pesun että käsin tehtä- vien pesujen päätteeksi. Näyte 5 otettiin visparista laitteen kiertopesun päätteeksi. Huuhteluvettä valutettiin visparin näytteenottohanasta näyte- purkkiin tutkimista varten. Seuraavat kaksi näytettä (6 ja 7) otettiin vasta seuraavana päivänä, juuri ennen seuraavan tuotteen ajon alkamista. Kar- kaisutunnelin levyt ja tamppari, joka pitää huolen jäätelöpuikkojen yhden- mukaisesta ulkopinnasta, kuuluvat molemmat käsin pesun piiriin. Ne eivät ole CIP-pesun yhteydessä, vaan pestään erikseen. Näiden puhtautta tutkittiin sivelynäytteillä. Karkaisutunnelin levyistä otettiin näytepurkkiin sive- lyitä useammasta eri levystä, sillä mantelia sisältänyt ajo oli verrattain lyhyt, eikä pesun päätteeksi ollut täyttä varmuutta, millä kaikilla levyillä mantelia sisältäneitä puikkoja oli ollut. Näytteenotossa pyrittiin siis

Näytteet Näytteenottopaikka Näytteenottotapa Massaosasto Näyte 1. Sekoitussäiliön sihti Sively

Näyte 2. Sekoitussäiliön huuhteluvesi

Näytepurkillinen vettä kiertopesun viimeisen huuhtelun jälkeen Näyte 3. Pastööri Näytepurkkiin kaavitaan

orgaanista jätettä

Näyte 4. Balanssiallas Sively

Tuotanto Näyte 5. Visparin huuhteluvesi

Näytepurkillinen vettä kiertopesun viimeisen huuhtelun jälkeen Näyte 6. Karkaisutunnelin levyt Sively

Näyte 7. Tamppari Sively

Näyte 8. 1. puikko annostelijasta Seuraavan ajon 1. puikko

(17)

laajemmalla näytemäärällä varmistamaan, että mukana on myös karkaisutunnelin levyjä, joita oltiin käytetty tutkittavassa ajossa. Viimeinen mante- lijäämätestaukseen tarvittava näyte oli näyte 8. Tämä näyte otettiin vasta seuraavaa tuoteajoa aloitettaessa. Kahdeksas näyte otettiin, kun jääte- lömassan oikea koostumus oltiin saavutettu ja mukaan lisättiin myös lisukeannostelijasta lisuketta. Näin saatiin mantelijäämien tutkimista varten näyte, joka sisälsi sekä visparista että lisukeannostelijasta uusinta massaa mantelimassa-ajon jälkeen. Tällöin mahdolliset mantelijäämät todennä- köisimmin löytyisivät, sillä manteliton massa ei olisi vielä ennättänyt

”huuhtelemaan” linjastoa uudella massalla.

6.3 Manteliproteiinijäämän analysointimenetelmä

Manteliproteiinijäämät määritettiin ulkopuolisessa analyysilaboratoriossa ELISA-periaatteeseen perustuvalla RIDASCREEN®FAST Mandel / Almond (r- biopharm Test-Combination R6901:2015-07, mod. [DE Food]) testikitillä.

Lyhenne ”mod.” tarkoittaa tässä yhteydessä sitä, että analyysin suorittanut laboratorio on tehnyt määrityksen joltain osin eri lailla kuin testikitin valmistaja on suositellut. Riippuen siitä oliko kyseessä huuhteluvesinäyte vai sivelynäyte, näytteen analysointimenetelmä oli hiukan erilainen. Sive- lynäytteitä lukuun ottamatta näytteet kyettiin analysoimaan suoraan ELISA-menetelmällä, kun taas sivelynäytteissä proteiinit uutettiin kuivasta sivelypuikosta 2 ml:llä uuttoliuosta ennen varsinaista tutkimusta. Mantelin määritysraja esitetyllä tavalla valmistetusta näytteestä on tällöin 0,125 mg/l, eikä tietoa määrityksen saannosta ole saatavilla. Uuttoliuosten tulokset laboratorio on ilmoittanut negatiivinen/positiivinen. Muissa näyt- teissä, missä uuttoliuosta ei ole erikseen valmistettu, määritysraja on 2,5 mg/kg. Menetelmä on akkreditoitu sitä testanneella laboratoriolla, mikä tarkoittaa laboratorion olevan pätevöitynyt testaukseen ja tuottavan luotettavia tuloksia.

7 MAITOPROTEIINIJÄÄMIEN OSOITTAMINEN JÄÄTELÖN VALMISTUSLINJOILTA

Froneri Finland Oy on lanseerannut markkinoille lähiaikoina uutuustuot- teina kaurapohjaisia jäätelöitä sekä vegaanisia jäätelöitä. Lisäksi jo ennes- tään tuotevalikoimaan on kuulunut mehujäitä, jotka eivät myöskään ole maitopohjaisia tuotteita. Näissä tuoteryhmissä on kuitenkin jouduttu pitä- mään tuoteselosteessa merkintää mahdollisesta ristikontaminaatiosta maidon kanssa, sillä tähän mennessä ei olla pystytty todentamaan, jääkö maitojäämiä jää linjastoon pesujen jälkeen. Tämän merkinnän poistamiseksi opinnäytetyössä on tutkittu myös maitoproteiinijäämiä kahdesta eri jäätelön valmistuslinjastosta. Linja A on sama kuin manteliproteiineja kartoittaessakin, eli kyseessä on puikkoja valmistava laitteisto. Lisäksi on

(18)

tutkittu linjaa, joka valmistaa jäätelöpurkkeja. Tämä linjasto on nimetty opinnäytetyössä linjaksi B.

7.1 Työn suoritus

Maitoproteiinijäämien tutkimiseksi pohdittiin tutkimussuunnitelmaa, jonka perusteella voitaisiin valita viisaimmin näytteenottopaikat mahdollisimman loogisesti maitojäämien kartoittamiseksi. Maitoproteiinijäämien tutkiminen kohdistui kahteen eri jäätelön valmistuslinjastoon, joten kum- mallekin linjalle tehtiin omat suunnitelmansa näytteenottoja varten. Näyt- teenottopaikkojen valinnassa pyrittiin ottamaan huomioon jäätelön val- mistusprosessin vaiheet siten, että mikäli maitoproteiinijäämiä löytyisi tes- tituloksista, voitaisiin linjasta kohdentaa laite tai paikka, joka ei pesuissa peseytyisi riittävästi jäämien poistamiseksi.

7.2 Näytteenotto

Maitoproteiinijäämien näytteenottosuunnitelmasta tehtiin alla oleva taulukko 3. Taulukossa on eritelty ensimmäisessä sarakkeessa ajot 1–3, joista näytteet on kerätty eri päivinä. Kyseessä on siis eri tuoteajot laajemman kokonaiskuvan muodostamiseksi. Taulukosta 3 käy myös ilmi, onko otettu näyte linjalta A vai B. Näiden jälkeisissä sarakkeissa on ilmoitettu sekä näyt- teenottopaikka, että näytteenottotapa eli millainen näyte on kyseessä.

Taulukko 3. Maitoproteiinijäämätestin näytteenottopaikat- ja tavat (A = jäätelöpuikkolinja, B = jäätelöpurkkilinja)

Ajo 1 Linja Näytteenottopaikka Näytteenottotapa

B Sisäkehä 1. purkki sisäkehältä

B Ulkokehä 1. purkki ulkokehältä

B Visparit Visparit

A Annostelija 1. puikko annostelijasta

A Karkaisutunneli 1. puikko tunnelista

A Käärintäkone 1. puikot käärinnästä

A Visparit Visparit

Ajo 2 B Sisäkehä 1. purkki sisäkehältä

B Visparit Visparit

A Annostelija 1. puikko annostelijasta

A Karkaisutunneli 1. puikko tunnelista

A Käärintäkone 1. puikot käärinnästä

A Visparit Visparit

Ajo 3 B Sisäkehä 1. purkki sisäkehältä

B Visparit Visparit

A Visparit Visparit

(19)

Jäätelön valmistuslinjalla B näytteenotto on keskittynyt pitkälti lopputuotteiden tutkimiseen. Linja B:llä on sekä sisä- että ulkokehä, jotka molemmat toimivat samanaikaisesti ja syöttävät jäätelöä purkkeihin eri annosteli- joista. Tämän vuoksi näytteenotossa on eritelty kehät toisistaan ja pää- dytty ottamaan tutkittavaksi kummaltakin kehältä omat näytteensä. Tä- män lisäksi näytteitä on kerätty vispareista, joita linjalla B on käytössä. Mi- käli esimerkiksi vispareissa havaittaisiin yli määritysarvon meneviä testitu- loksia, olisi todennäköistä, että vaikka annostelijat olisikin saatu pestyä moitteettomasti, tulisi vispareiden kautta maitojäämiä kuitenkin loppu- tuotteisiin asti.

Jäätelön valmistuslinjalla A laitteiston rakenne on aivan erilainen kuin linjalla B. Tällä koneella on otettava huomioon myös karkaisutunnelin levyt, joilla puikot ovat vielä ilman suojaavaa käärettään sekä käärintäkone, joka paketoi ne kääreisiinsä. Linjalla A päädyttiin ratkaisuun, jossa maitoprote- iinijäämien kartoittaminen aloitetaan vispareista samoista syistä kuin linjalla B:kin. Tämän jälkeen on jäätelön valmistusvaiheiden perusteella edetty näytteenottosuunnitelmassa siten, että konkreettisimmat paikat tulisivat tutkituiksi. Tällöin jäätelön annostelija on seuraava näytteenotto- kohde, karkaisutunneli sitä seuraava ja viimeinen käärintäkone. Näin saadaan melko kattava kuvaus linjan A eri vaiheista, jotka vaativat erillisiä pesuja ja saattaisivat siten olla lähteenä maitoproteiinijäämille.

7.3 Maitoproteiinijäämän analysointimenetelmä

Maitoproteiinijäämät määritettiin ulkopuolisessa analyysilaboratoriossa ELISA-periaatteeseen perustuvalla Food Allergen Casein ELISA II (MIoBS Test-Combination M2113:2017-07, mod. [DE Food]) testikitillä. Lyhenne

”mod.” tarkoittaa tässä yhteydessä sitä, että analyysin suorittanut laboratorio on tehnyt määrityksen joltain osin eri lailla kuin testikitin valmistaja on suositellut. Tämä tutkimusmenetelmä on kohdennettu nimenomaan maitoproteiinien tutkimiseen ja kaseiinin erottamiseen tutkittavasta näyt- teestä. Edellä mainitulla menetelmällä havaintoraja vesi- ja tuotenäyt- teissä on vähemmän kuin 0,25 mg/kg. Sivelynäytteissä tulos annettiin muodossa negatiivinen/positiivinen. Menetelmä on akkreditoitu sitä testanneella laboratoriolla, mikä tarkoittaa laboratorion olevan pätevöitynyt testaukseen ja tuottavan luotettavia tuloksia.

(20)

8 TULOKSET JA NIIDEN TARKASTELU

Taulukossa 4 on esitetty manteliproteiinijäämätestin tulokset kullekin näytteelle yhdestä kahdeksaan. Taulukosta käy ilmi näytenumero ja sille ilmoitettu tulos joko mustalla tai lihavoidulla punaisella, riippuen siitä, onko tulos mennyt ylitse määritysarvojen vai ei. Lisäksi taulukossa 4 on vielä jaoteltu näytteet massaosaston ja tuotannon näytteisiin taulukon sel- keyttämiseksi.

Taulukko 4. Manteliproteiinin esiintyminen jäätelöpuikkolinjalla

*Menetelmän havaintoraja vesi- ja tuotenäytteissä oli 0,25 mg/kg. Neg = sivelynäytteessä ei ollut havaittavissa manteliproteiinia

Pos = sivelynäytteessä oli havaittavissa manteliproteiinia

Manteliproteiinijäämien testauksessa todettiin raja-arvojen ylityksiä sekä massaosastolla että tuotannossa. Näytteessä numero kolme eli pastöö- rista kaavitussa orgaanisessa jäämässä todettiin reippaasti määritysarvon ylittänyt tulos: enemmän kuin 18 mg/kg manteliproteiinia. Tämän lisäksi tuotannossa olevasta tampparista tutkimuksen suorittanut laboratorio sai positiivisen tuloksen.

Taulukossa 5 (s. 17) on esitetty maitoproteiinijäämätestauksen tuloksia.

Näytteenottosuunnitelman pohjalta luotuun taulukkoon on lisätty tulossa- rake, joka ilmaisee kerätyistä näytteistä saadut tulokset. Määritysraja-arvo on maitoproteiinitestauksessa vähemmän kuin 0,25 mg/kg ja tämän arvon ylittävät tulokset ovat positiivisia. Positiiviset tulokset on merkitty taulukkoon korostetusti lihavoidulla punaisella tekstillä ja koko rivi on väritetty tummemmalla sävyllä taulukon luvun helpottamiseksi.

Näytteet Näytteenottopaikka Manteliproteiinia*

Massaosasto Näyte 1. Sekoitussäiliön sihti Neg Näyte 2. Sekoitussäiliön huuhteluvesi <2,5 mg/kg

Näyte 3. Pastööri >18 mg/kg

Näyte 4. Balanssiallas Neg

Tuotanto Näyte 5. Visparin huuhteluvesi <2,5 mg/kg Näyte 6. Karkaisutunnelin levyt Neg

Näyte 7. Tamppari Pos

Näyte 8. 1. puikko annostelijasta <2,5 mg/kg

(21)

Taulukko 5. Maitoproteiinin esiintyminen jäätelöpuikko- ja jäätelöpurkki linjoilla

Taulukosta 5 on nähtävissä, että jäätelön valmistuslinja B on saanut vain puhtaita tuloksia, eikä maitoproteiinijäämiä olla haivattu testauksissa. Lin- jalla A puolestaan esiintyy raja-arvoa ylittäviä testaustuloksia toistuvasti.

Ajosta 1 huomataan, että visparinäytteet ovat ylittäneet reilusti raja-arvon tuloksella 0,59 mg/kg, linjan A annostelijassa ylitykseen riittävä arvo on 0,40 mg/kg ja myös käärintäkoneella otetuista puikoista maitoproteiinijää- miä oli 0,47 mg/kg.

Ajossa 2 linjalla A raja-arvon ylittäneitä tuloksia on jälleen vispareilla tulok- silla 0,38 mg/kg ja käärintäkoneen puikoilla 0,29 mg/kg:n verran. Ajossa 3 ylityksiä ei esiinny kummallakaan jäätelön valmistuslinjastolla, mutta vali- tettavasti ajosta ei olla pystytty keräämään linjan A näytteitä kuin vispareiden verran.

Ajo 1 Linja Näytteenottopaikka Näytteenottotapa Maitoproteiinia B Sisäkehä 1. purkki sisäkehältä <0,25 mg/kg B Ulkokehä 1. purkki ulkokehältä <0,25 mg/kg B Visparit Tuotenäyte visparilta <0,25 mg/kg A Annostelija 1. puikko annostelijasta 0,40 mg/kg A Karkaisutunneli 1. puikko tunnelista <0,25 mg/kg A Käärintäkone 1. puikot käärinnästä 0,47 mg/kg

A Visparit Tuotenäyte visparilta 0,59 mg/kg

Ajo 2 B Sisäkehä 1. purkki sisäkehältä <0,25 mg/kg

B Ulkokehä 1. purkki ulkokehältä <0,25 mg/kg B Visparit Tuotenäyte visparilta <0,25 mg/kg A Annostelija 1. puikko annostelijasta <0,25 mg/kg A Karkaisutunneli 1. puikko tunnelista <0,25 mg/kg A Käärintäkone 1. puikot käärinnästä 0,29 mg/kg

A Visparit Tuotenäyte visparilta 0,38 mg/kg

Ajo 3 B Sisäkehä 1. purkki sisäkehältä <0,25 mg/kg

B Ulkokehä 1. purkki ulkokehältä <0,25 mg/kg B Visparit Tuotenäyte visparilta <0,25 mg/kg A Visparit Tuotenäyte visparilta <0,25 mg/kg

(22)

9 JOHTOPÄÄTÖKSET JA POHDINTA

Tässä luvussa tarkastellaan manteli- ja maitoproteiinijäämätestien tuloksia tarkemmin sekä tulosten vaikutusta jatkotoimenpiteiden kannalta yrityk- selle. Tämän lisäksi kappaleessa pohditaan kokeelliseen osuuteen vaikut- taneita tekijöitä mahdollisine virheineen ja pohditaan syvemmin tuloksia.

Kappale on jaoteltu erikseen manteli- ja maitoproteiinien tutkimukselle.

9.1 Manteli

Opinnäytetyön tutkinnallisessa osuudessa pääpaino oli aluksi pitkälti manteliproteiinin kartoittamisessa linjastosta A. Pähkinäallergeenin tutkiminen otettiin erittäin vakavasti, sillä kyseessä on hyvin allergisoiva raaka- ainekomponentti. Alun perin tarkoituksena olikin validoida sopiva pesuprosessi, jotta mantelimassaa voitaisiin ajaa ilman ristikontaminaation ris- kiä. Ensimmäinen koeajo osoitti, että mantelijäämiä ei pystytty puhdista- maan riittävän hyvin ja yrityksessä päädyttiin hylkäämään mantelimassa tuotteen raaka-aineena, minkä vuoksi mantelijäämätutkimusta ei jatkettu tämän pidemmälle.

Syitä tutkittavan mantelimassan hylkäämiselle oli muutamia. Mantelipro- teiinijäämätulosten perusteella todettiin, että pastööriin kertyi runsas määrä pähkinäallergeenia sen huolellisesta pesemisestä huolimatta. Tä- män lisäksi raja-arvon ylityksen antava tulos saatiin myös tampparista.

Suurimmaksi syyksi mantelimassan hylkäämiselle osoittautui kuitenkin massan koostumus ja liukenemattomuus vaahtopesujen yhteydessä. Man- telimassa toimitettiin tehtaalle pöntöissä, joista se lisättiin mukaan massan valmistukseen. Raaka-aine oli hyvin tahmeaa ja lattialle roiskuneita tahroja oli äärimmäisen hankala pestä pois. Tällöin todettiin, että on olemassa riski, että lattioiden ja muiden pintojen pesujen yhteydessä pähkinäaller- geeni ei peseydy kunnolla pois ja ristikontaminaatio on vakavasti mahdol- linen.

Mantelimassan peseminen lattioilta ja kuljetuspöntöistä osoittautui erit- täin vaikeaksi. Lisäksi reilut määritysarvojen ylitykset testituloksissa johti- vat siihen, että mantelijäätelön kehittäminen päätettiin hylätä muiden tuotteiden tuoteturvallisuuden varmistamiseksi.

9.2 Maito

Maitoproteiinijäämätestaukseen valittiin ajoja kauratuotteista mehujäi- hin, sillä molemmissa tapauksissa maito on ei-toivottu raaka-ainekomponentti, jota on saattanut jäädä ristikontaminaation seurauksena myös näi- hin tuotteisiin. Seurattavista, ensimmäisistä kolmesta ajosta löydettiin määritysarvon ylittäviä poikkeamia linjalta A. Nämä mittaustulosten ylitykset olivat ajoista 1 ja 2. Ajossa 3 linjalta A ei saatu kerättyä kuin

(23)

visparinäytteet epäonnistuneen tuoteajon vuoksi. Tällöin kattava tietous ajon 3 tuloksista jäi osittain epäselväksi, vaikka visparinäytteet olivatkin negatiivisia. Vastaavasti kahdessa edeltävässä ajossa molempien vispari- näytteistä löytyi maitoproteiinijäämiä. Se, että vispariin on jäänyt jäämiä maidosta, heijastuu myös linjaston loppupäähän. Tämä näkyy tuloksissa esimerkiksi siinä, että maitoproteiinijäämiä havaittiin annostelijassa ja aina käärityistä puikoista asti. Voidaan todeta, että mikäli vispareihin on jäänyt maitoa, se kulkeutuu jäätelön valmistuslinjastossa myös eteenpäin ja ulot- tuu aina lopputuotteeseen asti.

Ajossa 3 visparinäyte oli puhdas, mutta koska muita näytteitä ei saatu tällä kerralla otettua, jää epäselväksi olisiko maitoproteiinijäämiä esiintynyt vispareiden puhtaudesta huolimatta esimerkiksi annostelijassa tai käärintä- koneella.

Maitoproteiinijäämien havaitsemisen myötä todettiin, että visparit eivät peseydy riittävästi ristikontaminaation välttämiseksi. Tämän havainnon myötä vispareiden peseytymisaikaa nostettiin korjaavana toimenpiteenä.

Emäspesuun aikaa lisättiin 50 sekuntia, mikä koettiin mahdollisesti riittä- väksi parannukseksi. Pesuaikaa nostettiin, sillä pesuveden lämpötila ja käy- tettävä pesuliuos olivat jo kunnossa. Pesuajan lisäämistä tarvitaan silloin, kun kiertopesun virtausta ei voida enää nostaa esimerkiksi siksi, että paine linjastossa nousisi liian korkeaksi tai edellytykset hyvälle mekaaniselle vai- kutukselle ovat jo olemassa. Virtauksen tulee olla vähintään 1,5 metriä se- kunnissa, jotta se antaa pestävälle linjastolle vaadittavan mekaanisen vai- kutuksen lian irrottamiseksi.

Vispareiden pesuajan nostamista ja sen tehon vaikutuksia seurattiin uusin- tanäytteiden muodossa. Näiden uusien ajojen näytteenotto kohdistui tällä kertaa pelkästään linjaan A, jossa raja-arvojen ylityksiä havaittiin. Tällä kertaa visparinäytteiden sijaan kerättiin vispareiden pesusta saatua kiertope- suvettä huuhteluvaiheesta, sillä jäätelösesongin hiivuttua syksyä vastaan kaurapohjaisia tuotteita ja mehujäitä ajettiin harvemmin kuin kesällä ja näytteitä olisi joutunut odottamaan pitkän tovin. Näytteitä kerättiin nel- jästä eri ajosta syksyllä 2019. Alla olevassa taulukossa 6 on esitetty uusin- tanäytteiden tulokset.

Taulukko 6. Maitoproteiininäytteiden tulokset pesuajan noston jälkeen

Linjalla A on käytössä kaksi visparia jäätelön valmistukseen. Aikaisemmilla näytteenottokerroilla visparinäytteet otettiin ajossa käytetystä visparista tai molemmista vispareista merkitsemättä tarkemmin, kumpi vispari oli

Käytetty vispari Maitoproteiinia Ajo 1 Ei tiedossa <0,25 mg/kg

Ajo 2 1 <0,25 mg/kg

Ajo 3 2 <0,25 mg/kg

Ajo 4 2 <0,25 mg/kg

(24)

kyseessä. Raja-arvojen ylittyessä katsottiin kuitenkin tarpeelliseksi kohdentaa tutkintaa erikseen kumpaankin vispariin, jotta selviäisi jääkö mai- toproteiinijäämiä yhtä lailla molempiin laitteisiin. Tämän vuoksi taulukossa 6 on merkitty kullekin ajokerralle myös tutkimuskohteena ollut vispari sekä tutkimustulos.

Kaikista ajoista on uusintanäytteiden kohdalla saatu puhdas tulos. Tulokset ovat kaikki alle määritysraja-arvon eli vähemmän kuin 0,25 mg/kg. Tämän perusteella voidaan todeta, että 50 sekunnin lisääminen vispareiden pesu- aikaan on ollut riittävä toimenpide maitoproteiinijäämien hävittämiseksi jäätelön valmistuslinjastosta. On otettava kuitenkin huomioon, että tutkit- tavien näytteiden määrä on rajallinen, eikä vielä riittävä täyden varmuu- den toteamiseksi. Lisäksi on muistettava, että alkuperäisessä tutkimuksessa linjalta A löytyi myös kontaminoituneita kohtia muualtakin kuin vispareista. Tuolloin todettiin, että todennäköisin syy maitoproteiinien löyty- miseen esimerkiksi annostelijan ensimmäisestä puikosta olisi juurikin vispareissa, joista maitoproteiineja olisi kulkeutunut pidemmälle linjastoon.

Kyseessä on kuitenkin vain järkisyihin perustuvaa pohdintaa, jonka toden- peräisyyttä ei olla toistaiseksi todistettu. Tämän perusteella seuraava loo- ginen vaihe olisi jatkaa tutkimusta jälleen kattavammalla näytteenotto- suunnitelmalla. Tällöin voitaisiin mahdollisestikin todeta vispareiden olleen syynä linjasto A:n kontaminoitumiseen tai vastaavasti löytää uusia kohteita jäätelön valmistuslinjastosta, jotka tarvitsisivat pesuohjelman muutosta maitoproteiinijäämien hävittämiseksi. Vasta näiden toimenpitei- den jälkeen olisi mahdollista alkaa kokoamaan puhdasta näytteiden sarjaa, jonka seurauksena päästäisiin mahdollisesti luopumaan ”saattaa sisältää”- merkinnästä.

(25)

LÄHTEET

Allergia-, Iho- ja Astmaliitto. (n.d.). Anafylaksia. Haettu 12.6.2019 osoitteesta https://www.allergia.fi/allergia/anafylaksia/

Anydaynuts. (n.d.) Pähkinäopas. Manteli. Haettu 12.6.2019 osoitteesta http://www.anydaynuts.fi/ingredient/manteli

Besler, M. (2001). Determination of allergens in foods. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 20(11), 662-672.

Cell Signaling Technology. (n.d.a) Haettu 3.10.2019 osoitteesta

https://www.cellsignal.com/common/content/content.jsp?id=elisa-solu- tions

Cell Signaling Technology. (n.d.b) Suoran ELISA-menetelmän toimintaperiaate. Haettu 3.10.2019 osoitteesta https://www.cellsignal.com/common/content/content.jsp?id=types-of-elisas

Cell Signaling Technology. (n.d.c) Epäsuoran ELISA-menetelmän toimintaperiaate. Haettu 3.10.2019 osoitteesta https://www.cellsignal.com/common/content/content.jsp?id=types-of-elisas

Eurofins. (2018). Eurofins SENSIS Allergen test Kits. Haettu 27.8.2019 osoitteesta https://www.eurofins-technologies.com/products/allergens.html

Pienmeijeriopas. (n.d.) Pesu ja puhdistus. Haettu 20.8.2019 osoitteesta https://hami.fi/pienmeijeriopas/pesu-ja-puhdistus/?cn-reloaded=1#puh- distusohjelma-ja-puhtauden-tarkkailuohjelma

Houhoula, D., Belsis V., Georgopolous, L., Giannou, V., Kyrana, V., Tsak- nik, J., Lougovois, V. & Koussissis, S. (2014). Detection of Sesame Allergen Traces with Two PCR Assays – The Cllange to Protect Food-Allergic Con- sumers. Turkish Journal of Agriculture – Food Science and Technology 7/2014. Haettu 12.6.2019 osoitteesta http://www.agri-

foodscience.com/index.php/TURJAF/article/view/221/109

Jackson, L., Al-Taher, F., Moorman, M., DeVries, J., Tippett, R., Swansson, K., Fu, T., Salter, R., Dunaif, G., Estes, S., Albillos, S. & Gendel, S. (2008).

Cleaning and other Control and Validation Strategies To Prevent Allergen Cross-Contact in Food-Processing Operations. Journal of Food Protection 71(2), s. 445-458.

Janatuinen, E. (2015). Western blot- ja ELISA-menetelmät mikrobiologian laboratoriossa. Posteri bioanalyytikko-opiskelijoille. Opinnäytetyö.

(26)

Bioanalytiikan koulutusohjelma. Savonia-ammattikorkeakoulu. Haettu 3.10.2019 osoitteesta https://www.theseus.fi/bitstream/han-

dle/10024/87975/emmi.janatuinen.pdf?sequence=1&isAllowed=y Mediq. (n.d.). Tuoteluettelo. Ridascreen®Fast mandel. Haettu 20.8.2019 osoitteesta http://tuoteluettelo.mediq.fi/liitteet/d368618/

Ruokatieto. (n.d.). Ruoka-aineallergiat ja yliherkkyys. Haettu 12.6.2019 osoitteesta https://www.ruokatieto.fi/ruokakasvatus/ruokaketju-ruuan- matka-pellolta-poytaan/ravitsemus-ja-ruuan-valinta/erityisruokava- liot/ruoka-aineallergiat-ja-yliherkkyys

Ruokavirasto. (n.d.a). Allergeenit. Pakkausmerkinnät. Haettu 7.7.2019 osoitteesta https://www.ruokavirasto.fi/henkiloasiakkaat/tietoa-elintarvikkeista/pakkausmerkinnat/allergeenit/

Ruokavirasto. (n.d.b). Vapaaehtoiset merkinnät. Haettu 7.7.2019 osoitteesta https://www.ruokavirasto.fi/henkiloasiakkaat/tietoa-elintarvikkeista/ruoka-allergeenit/mita-tietoa-pakkauksista-saa/vapaaehtoiset- merkinnat/

Terveyskirjasto. (n.d.). Allergiat. Haettu 7.7.2019 osoitteesta https://www.terveyskirjasto.fi/terveyskirjasto/tk.koti?p_artik- keli=dlk00561

Thomas, A. & Sathian, C. (2014). Cleaning-In Place (CIP) System in Dairy Plant. Journal of Environmental Science Toxitology and Food Technology 8(6), s. 41-44.

Tuovinen, T. (2013). Vertailumenetelmän kehittäminen vasta-ainesenso- rille. Opinnäytetyö. Laboratorioalan koulutusohjelma. Oulun seudun am- mattikorkeakoulu. Haettu 22.6.2019 osoitteesta

https://www.theseus.fi/bitstream/handle/10024/67813/Tuovi- nen_Teemu.pdf?sequence=1&isAllowed=y

Virolainen, V. (2017). Gluteenifragmentit elintarvikkeista havaitsevan ELISA-menetelmän validointi. Insinöörityö. Bio- ja elintarviketekniikka.

Metropolia ammattikorkeakoulu. Haettu 3.10.2019 osoitteesta https://www.theseus.fi/bitstream/handle/10024/127013/Virolai- nen_Veera.pdf?sequence=1&isAllowed=y