Manteli- ja maitoproteiinijäämien tutkimiseksi käytetään esimerkiksi ELISA-menetelmää. Tämä menetelmä perustuu antigeeni-vasta-ainereak-tioon. Näiden kohdatessa muodostuu sidos, jota voidaan käyttää näytteen spesifiseen tunnistamiseen. Tulosta varten mitattava signaali muodostuu entsyymien toiminnasta. ELISA-menetelmällä näytteestä määritetään siis
suoraan allergisoivaa proteiinia ja tulos ilmoitetaan kvantitatiivisesti (mg/kg). (Tuovinen, 2013)
ELISA-menetelmät ovat immunologisia tekniikoita biologisten näytteiden kuten esimerkiksi erilaisten allergeenijäämien tutkimiseksi antigeeni-vasta-ainereaktiolla. ELISA-menetelmille on yhteistä, että ne suoritetaan esimerkiksi mikrotiitterilevyllä, johon antigeeni tai vasta-aine on sitoutu-nut. Antigeenillä tarkoitetaan tässä opinnäytetyössä mantelin tai maidon proteiinia, mutta antigeeni voi olla myös mikä tahansa molekyyli, joka mahdollisesti aiheuttaa ihmisen elimistössä allergisen reaktion. Vasta-ai-neet ovat puolestaan eliöiden elimistöissä luonnostaan olevia immuunijär-jestelmän puolustusmekanismeja, jotka havaitsevat antigeenejä. Tietty vasta-aine tunnistaa ainoastaan tiettyä antigeeniä ja tämän vuoksi ELISA-menetelmä on hyvin riippuvainen vasta-aineen valinnasta. Tietylle anti-geenille, kuten vaikka mantelin proteiinille, on löydettävä spesifinen vasta-aine, jonka tulisi sitoutua antigeeniinsä nopeasti ja voimakkaasti. Lisäksi si-toutuneen vasta-aine-antigeenikompleksin tulisi olla vakaa tulosten luo-tettavuuden varmistamiseksi. (Cell Signaling Technology, n.d.a; Janatui-nen, 2015, ss. 17–19)
Tuloksien mittaamiseksi on tärkeää osoittaa antigeeni-vasta-ainereaktion tapahtuminen. Havaintotapana voi olla esimerkiksi vasta-ainevärjäys, jolla voidaan mitata värin absorboivia ominaisuuksia ja näin todeta, onko näyt-teessä tapahtunut antigeenin läsnäoloa paljastavia reaktioita eli niin kut-suttuja reaktiotuotteita. ELISA-tekniikassa sitoutuneisiin antigeeneihin ja vasta-aineisiin lisätään konjugaatioliuosta, joka tuottaa leimaentsyymejä luomalla leimaavan sidoksen. Konjugaatiolla tarkoitetaan sidosten luo-mista yhdisteiden välille. Nimensä mukaisesti leimaentsyymit kiinnittyvät vasta-aineisiin ja kun mukaan lisätään substraattiliuosta, syntyy väriainere-aktio. Mitä voimakkaammin väriä muodostuu, sitä enemmän tutkittavassa näytteessä on reaktiotuotteita ja siten antigeeniä. Tämän reaktion vuoksi ELISA-menetelmää kuvaillaan entsymaattiseksi menetelmäksi. (Cell Sig-naling Technology, n.d.a; Janatuinen, 2015, ss. 17–19)
5.1.1 Suora ELISA
ELISA-menetelmistä Suora ELISA on yksinkertaisin. Antigeeni sitoutuu suo-raan esimerkiksi mikrotiitterilevyn kuoppaan ja sen perään lisätään estoai-netta, joka siis estää epäspesifisten vasta-aineiden sitoutumista levykuop-piin. Tarkoituksena on varmistaa, että antigeenin kanssa pääsee reagoi-maan vain oikea vasta-aine. Tutkittavaa antigeeniä havaitsevaan ai-neeseen sitoutuu leimaentsyymi konjugaatioliuoksella. Antigeeni ja vasta-aine reagoivat keskenään levykuopissa ja sitten suoritetaan pesu, jonka tarkoituksena on huuhtoa ylimääräiset vasta-aineet pois. Lopuksi lisätään substraattiliuos entsyymireaktion käynnistämiseksi ja värimuunnoksen ai-kaansaamiseksi. Suorassa ELISA-menetelmässä on lyhyt inkubointiaika. Re-aktiot pysäytetään lopetusliuoksella, minkä jälkeen tulos luetaan ELISA-analysaattorilla. Suoran ELISAn etuja ovat nopeus ja yksinkertaisuus, mutta vastaavastikaan tällä menetelmällä ei saada yhtä tarkkoja tuloksia kuin muilla ELISA-menetelmillä. Kuvassa 1 on suoran ELISA-menetelmän toi-mintaperiaate havainnollistavana kuvana. (Cell Signaling Technology, n.d.b; Virolainen, 2017, s. 10)
Kuva 1. Suoran ELISA-menetelmän toimintaperiaate (Cell Signaling Tech-nology n.d.b)
5.1.2 Epäsuora ELISA
Epäsuora ELISA-menetelmä on pitkälti toteuttamisvaiheiltaan samanlai-nen kuin edellä kuvailtu suora ELISA-menetelmä. Yleensä epäsuoran ELI-SAn tekeminen alkaa samalla tavalla kuin suorankin ELIELI-SAn, eli antigeenin kiinnittämisellä esimerkiksi mikrotiitterilevyn kuoppiin ja estoaineen lisää-misellä. Tämän jälkeen lisätään vasta-aine, joka, toisinkuin suorassa ELI-SAssa, ei ole konjugoitu eli sidottu leimaentsyymiin vaan on ainoastaan spesifinen antigeenille. Seuraavaksi lisätään mukaan vasta-ainetta, joka on sidottu leimaentsyymiin tämän ensimmäisen sitovan vasta-aineen havait-semiseksi. Viimeiset vaiheet noudattavat jälleen samaa kaavaa suoran
ELISAn kanssa: levykuopat pestään ja tämän päätteeksi lisätään substraatti, inkuboidaan ja pysäytetään reaktio lopetusliuoksella. Kuvassa 2 on epäsuoran ELISA-menetelmän toimintaperiaate havainnollistavana kuvana. (Cell Signaling Technology, n.d.c; Virolainen, 2017, s. 11)
Kuva 2. Epäsuoran ELISA-menetelmän toimintaperiaate (Cell Signaling Technology n.d.c)
5.1.3 Sandwich ELISA
Sandwich ELISA-menetelmän etuina pidetään erityisesti sen tarkkuutta.
Sandwich-menetelmällä saadaan kvantitatiivisesti tarkin ja merkittävin tu-los tutkittavasta näytteestä verrattuna suoraan tai epäsuoraan ELISAan.
Tässä tutkintatavassa vasta-aine sidotaan mikrotiitterilevyn kuoppiin anti-geenin sijaan. Tämän lisäksi antigeeni tunnistetaan kahdella vasta-aineella:
ensin antigeeni sitoutuu levykuopassa olevaan entsyymileimattomaan vasta-aineeseen ja tämän jälkeen lisätään vielä toinen vasta-aine, joka on entsyymileimattu. Näiden aineiden reaktiosta muodostuu kompleksi, josta sandwich-menetelmä on saanut nimensä. Antigeeni jää tässä tekniikassa ikään kuin kahden vasta-aineen väliin ja syntyy ”voileipä”. Muutoin tässä-kin menetelmässä muut työvaiheet noudattavat pitkälti samaa kaavaa kuin suorassa ja epäsuorassakin ELISAssa. (Cell Signaling Technology, n.d.a; Vi-rolainen, 2017, ss. 11–12)
ELISA-testaus aloitetaan punnitsemalla näytettä tarvittava määrä ja lisää-mällä siihen uuttopuskuria. Ne laitetaan 60 °C:n lämpöiseen vesihautee-seen 15 minuutiksi ja ravistetaan kahden minuutin välein. Lopullinen uutos on tämän jälkeen valmis analysoitavaksi. Uutosliuos sisältää siis mahdolli-sesti antigeeniä ja on tutkittava näyte. Analysointi tapahtuu lisäämällä
uutosliuosta ja standardiliuoksia niille tarkoitetulle alustalle. Alustana toi-mii esimerkiksi mikrotiitterilevy, jossa on kuoppia, johon liuokset pipetoi-daan. Levykuopissa on jo valmiiksi antigeenille spesifioitua vasta-ainetta ja nyt mikrotiitterilevylle lisätään entsyymileimattua vasta-ainetta. Pipetoin-nin jälkeen liuoksia inkuboidaan 20 minuutin ajan huoneenlämmössä.
Huoneenlämpö on 20–25 °C. Inkubaation aikana antigeeni eli tutkittava näyte sitoutuu kuoppiin sidottuihin vasta-aineisiin ja syntyy sidoksia.
Vasta-aineet ovat muodostuneet siten, että sopivat täydellisesti yhteen antigeenin kanssa. Tämän vuoksi ELISA-menetelmää kutsutaan myös avain-lukkoperiaatteeksi. (Eurofins, 2018; Tuovinen, 2013)
Analysoinnin seuraava vaihe on levykuoppien pesu pesuliuoksella. Kuopat pestään kolme kertaa, jonka jälkeen ne kuivataan taputtamalla mikrotiit-terilevyä. Pesulla poistetaan ylimääräiset proteiinit. (Eurofins, 2018; Tuo-vinen, 2013)
Seuraavassa vaiheessa kuoppiin lisätään konjugaatioliuosta ja mikrotiitte-rilevyn annetaan näytteineen inkuboitua jälleen huoneenlämmössä 20 mi-nuuttia. Konjugaation seurauksena syntyy leimaentsyymejä. Leimavasta-aineet ovat osa vasta-ainevärjäystä, jolla saadaan näkyviin mitattava väri näytteestä. Seuraava vaihe on jälleen kuoppien pesu kolmesti pesuliuok-sella. Pesun tarkoituksena on huuhdella sitoutumattomat vasta-aineet pois mikrotiitterilevyn kuopista. Pesujen päätteeksi kuoppiin lisätään sub-staattiliuosta. Substraattiliuos on kasvualustaa, jossa leimaentsyymi tuot-taa testissä mitattavaa yhdistettä. Analysoinnissa käytettävä mikrotiitteri-levy näytteineen viedään pimeään tilaan 20 minuutiksi, missä näytteiden väri kehittyy. Värin kehittyminen pysäytetään lopuksi pysäytysliuoksella.
Tämän jälkeen kvantitatiiviset tulokset ovat luettavissa 450 nanometrillä ELISA-analysaattorilla. Analysaattori mittaa siis näytteen väriä. (Eurofins, 2018; Tuovinen, 2013)
5.1.4 Kilpaileva ELISA
Kilpailevassa ELISA-menetelmässä mikrotiitterilevyn kuoppiin on sidottu tutkittavalle antigeenille spesifistä vasta-ainetta ja tekniikan ajatuksena on kilpailuttaa tutkittavaa antigeeniä entsyymileimatun antigeenin kanssa.
Nämä molemmat antigeenit pyrkivät kilpailemaan sitoutumisesta vasta-ai-neiden kanssa levykuopissa. Entsyymileimatun antigeenin matala sitoutu-mismäärä osoittaa korkean tutkittavan antigeenin määrän. Entsyymilei-mattu antigeeni on konjugoitu esimerkiksi fluoresoivan väriaineen kanssa, joten mikäli värireaktio on heikko, on näytteessä runsaasti tutkittavaa an-tigeeniä, kuten esimerkiksi jotakin allergeeniä. (Cell Signaling Technology, n.d.a; Janatuinen, 2015, ss. 17–18)