L-fukoosin sähkökemiallinen määritys sylkinäytteistä

L

-fukoosin sähkökemiallinen määritys sylkinäytteistä

Teemu Tuomainen Pro gradu -tutkielma Sovelletun fysiikan koulutusohjelma Itä-Suomen yliopisto, Sovelletun fysiikan laitos 25. kesäkuuta 2019

ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, Luonnontieteiden ja metsätieteiden tiedekunta, Sovelletun fysiikan koulutusohjelma, lääketieteellinen fysiikka

Teemu Tuomainen: l-fukoosin sähkökemiallinen määritys sylkinäytteistä Pro gradu -tutkielma, 82 sivua

Ohjaajat: Prof. Reijo Lappalainen, FT (pääohjaaja) & Dos. Sami Myllymaa, FT Avainsanat: 6-deoksi-l-galaktoosi, amperometria, bioanturi,d-threo-aldoosi 1-dehyd- rogenaasi, entsymaattinen määritys, kronoamperometria,l-fukoosi,l-fukoosidehydro- genaasi, silkkipainantaelektrodi, syklinen voltammetria, voltammetria

Tiivistelmä

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli kehittää luotettavia ja kustannustehokkaita ratkaisujal-fukoosin määritykseen sylkinäytteistä käyttäen sähkökemiallisia menetel- miä ja silkkipainettuja elektrodiliuskoja (SPE). Syljenl-fukoosipitoisuuden kasvusta on viitteitä pään ja kaulan alueen levyepiteelikarsinooma -potilailla (HNSCC).

Tutkimuksessa käytettiin sähkökemiallisina menetelminä syklistä voltammetri- aa (CV) ja kronoamperometriaa (CA). l-fukoosipitoisuuden määritys perustuu l- fukoosin hapetus- pelkistysreaktiota (redox) katalysoivan l-fukoosidehydrogenaasi - entsyymin (l-FDH) toimintaan sekä sen fosforyloituneen nikotiiniamidiadeniininukleo- tidi -koentsyymin (NADP) redox-reaktioon.l-fukoosipitoisuusmääritystä tutkittiinl- FDH:n ja NADP:n sisältävillä liuoksilla sekä erilaisilla kiinnitysmenetelmillä: kiinni- tys elektropolymerisoituun polypyrrolikalvoon (PPy) ja adsorptio elektrodin pinnalle glutaraldehydin (GA) aikaansaaman ristisilloituksen avulla. Sylkinäytteet oli kerätty HNSCC -potilailta sekä ikä- ja sukupuoli -sovitetulta terveeltä vertailuryhmältä.

Tutkimuksessa havaittiin, että l-fukoosipitoisuus voidaan määrittää vesipohjai- sista liuoksista CV- ja CA -menetelmillä; CA-menetelmällä puskurin ja tukielektro- lyytin sisältävillä vesiliuoksilla voitiin l-fukoosipitoisuus C [mM] yhdistää virtaan i [µA]. Samanlainen havainto tehtiin ilman puskuria tai tukielektrolyyttiä. Vasteen li- neaarisuuden ja kalibraatiokuvaajan numeeristen arvojen havaittiin olevan lämpötila- ja pH- sekä SPE-materiaali -sidonnaista. Puskuroimattomalla 23^◦C vesiliuoksella yh- tälöksi saatiin hiilielektrodilla i = 5.26·C + 0.75. CV-menetelmällä l-fukoosi voi- tiin erottaad-glukoosista ja d-galaktoosista, koska vainl-fukoosilla oli havaittavissa redox-huippu. Tämä on hyvä esimerkki menetelmän mahdollisuuksista sylkidiagnos- tiikassa, koska nämä ovat syljen sisältämiä monosakkarideja. PPy-kalvojen vasteissa ei havaittu redox-huippua, ja näin voidaan päätellä, että muodostunut kalvo on joko liian tiheä NADP:n liikkumiselle tail-FDH on muuttunut pois natiivikonfiguraatios- taan. Pois-huuhtoutuminen on myös mahdollista. Adsorptiomenetelmällä havaittiin redox-huippu CV-menetelmällä, mutta voltammogrammin paksuus viitannee proses- sissa mukana olevan kaksoiskerroksen varautumiseen potentiaalin muutoksen vuoksi (kapasitiivinen virta). Puskuroimattomia sylkinäytteitä tutkittiin lisäämällä l-FDH ja NADP näytteeseen. Pitoisuutta ei voitu määrittää luotettavasti johtuen todennä- köisesti muiden syljessä esiintyvien aineiden aiheuttamista häiriöistä.

Työssä käytetyt elektrodimateriaalit vaativat suuren yli-potentiaalin, joka voi myös vaikuttaa vasteeseen. Potentiaalin madaltamiseksi mediaattorien käyttö voi olla jatkossa perusteltua. Lisäksi selektiivisempien kalvojen valmistusta voidaan jatkossa tutkia sylkinäyteissä ilmenevien häiriöiden vähentämiseksi.

UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND, Faculty of Science and Forestry, Department of Applied Physics, Medical Physics

Teemu Tuomainen: Electrochemical quantification of l-fucose from saliva samples Master’s Thesis, 82 pages

Supervisors: Prof. Reijo Lappalainen, Ph.D. & Docent Sami Myllymaa, Ph.D.

Keywords: 6-deoxy-l-galactose, amperometry, biosensor, chronoamperometry, cyclic voltammetry, d-threo-aldose 1-dehydrogenase, enzymatic quantification,l-fucose, l- fucose dehydrogenase, screen-printed electrode, voltammetry

Abstract

The purpose of this thesis was to develop reliable and cost-effective approaches for the quantification of l-fucose using electrochemical methods and screen-printed elect- rodes (SPE). There are indications that an elevated salivary l-fucose concentration might be a biomarker for head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC).

In this thesis, cyclic voltammetry (CV) and chronoamperometry (CA) were used for the quantification of l-fucose. The quantification is based on the reduction and oxidation reaction (redox) of l-fucose catalyzed by an enzyme, l-fucose dehydroge- nase (l-FDH) and the redox of its coenzyme, phosphorylated nicotinamide adenine dinucleotide (NADP). The quantification of the l-fucose concentration was investi- gated using solutions containing l-FDH and NADP. Reagent immobilization on to the SPE surface was also investigated with two methods; entrapment in an electro- polymerized polypyrrole (PPy) film and adsorption with the help of glutaraldehyde (GA) as a cross-linking agent. The saliva samples used with CA were collected from HNSCC patients and age- and sex-matched healthy controls.

It was observed that the l-fucose concentration could be quantified from water- based solutions using CV and CA. Using CA, the l-fucose concentration C [mM] in solutions containing water, a buffer and a supporting electrolyte was linearly propor- tional to the current i [µA]. Similar behaviour was observed in the absence of the buffer and supporting electrolyte. The linearity of the response and the numerical va- lues of calibration graphs were observed to be dependent on temperature, pH and the SPE material. For a 23^◦C non-buffered solution and a carbon SPE, the calibration curve equation was i = 5.26·C + 0.75. Using CV, l-fucose could be differentiated from d-glucose and d-galactose: a redox peak was only observed forl-fucose. These sugars are present in saliva which demonstrates the feasibility of the method in sali- vary diagnostics. The CV with the PPy film did not possess a redox peak and thus it can be deduced that the PPy matrix might be too dense for the native configuration of the l-FDH or for the NADP to freely navigate. A wash-out is also a possibility.

The GA-adsorption method displayed a redox peak with CV, although the thickness of the graph suggests that there exists double layer charging caused by the varying potential (capacitive currents). Saliva samples were investigated as non-buffered rea- gent solutions. From these, thel-fucose concentration could not be reliably quantified possibly due to interference from other substances in the sample.

The large over-potential needed for the redox reaction might be a source of error.

To lower the needed potential, the use of mediators should be further investigated.

In order to minimize the interference, selective membranes can also be evaluated.

Lyhenteet

Ag/AgCl Hopea-hopeakloridi -vertailuelektrodi

BSA Naudan seerumialbumiini, Bovine serum albumin CE Vastaelektrodi, counter electrode

CHES N-sykloheksyyli-2-aminoetaanisulfonihappo -puskuri, C₈H₁₇NO₃S CV Syklinen voltammetria / syklinen voltammogrammi, cyclic voltammetry

/ cyclic voltammogram

DH Dehydrogenaasi, dehydrogenase

fuc Fukoosi

GA Glutaraldehydi

gal Galaktoosi

GDP Guanosiinidifosfaatti

glc Glukoosi

Hg/HgCl₂ Kalomeli -vertailuelektrodi

HNSCC Pään ja kaulan alueen levyepiteelikarsinooma, head and neck squamous cell carcinoma

IdoA Iduronihappo, iduronic acid

IHP Sisempi Helmholtz kerros, inner Helmholtz plane KCl Kaliumkloridi -tukielektrolyytti

L-FDH l-fukoosidehydrogenaasi (EC 1.1.1.122), l-fucose dehydrogenase. Myös d-threo-aldoosi dehydrogenaasi

LSV Lineaarinen pyyhkäisy voltammetria / lineaarinen pyyhkäisy voltammo- grammi, linear sweep voltammetry / linear sweep voltammogram

man Mannoosi

MB Meldolan sininen, Meldola’s blue

MB⁺ Meldolan sinisen (MB) hapettunut muoto MBH Meldolan sinisen (MB) pelkistynyt muoto NAD⁺ Nikotiiniamidiadeniinidinukleotidi-koentsyymi NAD(P)⁺ Joko NAD⁺ tai NADP⁺ -koentsyymi

NAD(P)H Joko NADH tai NADPH -koentsyymi

NADH Nikotiiniamidiadeniinidinukleotidi-koentsyymin pelkistynyt muoto NADP⁺ Nikotiiniamidiadeniinidinukleotidifosfaatti-koentsyymi (fosforyloitunut

NAD⁺)

NADPH Nikotiiniamidiadeniinidinukleotidifosfaatti-koentsyymin pelkistynyt muoto (fosforyloitunut NADH)

NHE normalisoitu vetyelektrodi, normalized hydrogen electrode NMR Ydinmagneettinen resonanssi,nuclear magnetic resonance NMWL Nimellinen molekyylipainoraja nominal molecular weight limit OHP Ulompi Helmholtz kerros, outer Helmholtz plane

Ox Oksidaasi,oxidase

PATP poly(6-(N-allyyli-1,1,2,2-tetrahydroperfluorododekyyli)amino-1,3,5- triatsiini-2,4-disulfidi)

POC Vieritestaus, point-of-care testing PPy Polypyrroli, (C₄H₂NH)_n

Py Pyrroli, C₄H₂NH

RE Vertailuelektrodi,reference electrode

SCE Kyllästetty kalomeli elektrodi, saturated calomel electrode SHE Standardivetyelektrodi, standard hydrogen electrode

SPCE Seulapainantahiilielektrodi/Seripainettu hiilielektrodi, screen-printed carbon electrode

SPE Seulapainantaelektrodi / Seripainettu elektrodi / Silkkipainettu elektro- di,screen-printed electrode

Tris Tris(hydroksimetyyli)aminometaani -puskuri, C₄H₁₁NO₃ WE Työelektrodi, working electrode

xyl Ksyloosi

Symbolit

λ Ajanhetki, jolloin potentiaalin lineaarisen muutoksen suunta vaihdetaan CV:ssa

A Elektrodin (diffuusio)pinta-ala

C^∗ Analyytin pitoisuus kaukana elektrodi-elektrolyyttirajapinnasta C_d Kaksoiskerroksen varautumisen kapasitanssi

C_ox Hapettuvan aineen pitoisuus C_red Pelkistyvän aineen pitoisuus D Diffuusiovakio

E Potentiaali(ero) sähkökemiallisissa mittauksissa tai entsyymin merkintä entsymaattisissa (kemiallisissa) reaktioissa

ES Entsyymi-substraattikompleksi. Entsyymin ja substraatin muodostama rakenne entsymaattisessa reaktiossa

E_f Lopetuspotentiaali voltammetriassa: mittaus päätetään LSV:ssa tai po- tentiaalin muutossuuntaa vaihdetaan CV:ssa

E_i Aloituspotentiaali voltammetriassa

E_p Potentiaali, millä virran huippuarvo (i_p) saavutetaan F Faradayn vakio, F = 96485.33 C ·mol⁻¹

K_m Michaelisin vakio K_d Dissosiaatiovakio, ^k_k⁻¹

1

NA Avogadron vakio, NA = 6.22 ·10²³ mol⁻¹ P Entsymaattisen reaktio lopputuote Q Varaus, kokonaisvaraus

R_u Resistanssi, jota potentiostaatti ei kompensoi,uncompensated resistance S Substraatti (eli esimerkiksi analyytti). Aine, jonka reaktion entsyymi

katalysoi T Lämpötila U Potentiaali

e Alkeisvaraus,e=1.602176620898·10⁻¹⁹ C

i Virta

i_a Anodinen virta, hapettava virta i_c Katodinen virta, pelkistävä virta icap Virran kapasitiivinen komponentti id Diffuusiolla rajoittuneen virran arvo i_{f ar} Virran faradinen komponentti i_p Virran huippuarvo

k Sähkökemiallisen prosessin siirtonopeusvakio, rate constant tai kemialli- sen reaktion reaktionopeus

n Elektronien lukumäärä, aineen ainemäärä t Aika

v Pyyhkäisynopeus voltammetriassa, potentiaalin E vakio muutosnopeus,

dE

dt =v,scan rate / sweep rate

Kuvat

2.1 l-fukoosin pyranoosirakenne . . . 3

2.2 Tyypillisiä selkärankaisilla esiintyviä monosakkarideja . . . 4

2.3 Esimerkki syklisestä voltammogrammista . . . 11

2.4 Esimerkki (krono)amperogrammista . . . 13

2.5 Kronoamperogrammin pinta-alan laskeminen puolisuunnikassäännöllä 15 2.6 DropSensin hiilityöelektrodilleen esittämä voltammetrinen vaste NADH- koentsyymille . . . 21

2.7 l-fukoosin sähkökemiallisen entsymaattisen tunnistuksen periaate Mel- dolan sinisellä . . . 22

2.8 Mediaattorina käytettävän Meldolan sinisen rakenne . . . 22

2.9 Sähköä johtavia polymeerirakenteita . . . 25

2.10 Esimerkki elektropolymerisaatioajan vaikutuksesta polymeerikalvon pak- suuteen . . . 27

3.1 CHES-puskurin pH-arvon säätäminen entsyymireaktiolle ihanteelliselle alueelle. . . 32

3.2 Amicon Ultra-2 -suodatusjärjestelmän osat . . . 37

3.3 Pyrrolin elektropolymerisoinnissa mitattava amperometrinen vaste ajan funktiona . . . 39

3.4 Platinatyöelektrodien pinnat elektropolymerisaation jälkeen . . . 39

3.5 Platinapinnan naarmutuksen vaikutus pyrrolin elektropolymerisaation sähkökemialliseen vasteeseen. . . 40

3.6 Sähkökemiallinen estimaatti PPy-kalvon paksuudelle hiilityöelektrodin pinnalla ajan funktiona . . . 42

3.7 Ohjausviillon tekeminen elektrodiliuskan hallittuun katkaisuun . . . . 44

3.8 Poikkileikatun elektrodiliuskan PPy-kalvon paksuuden määrityksen pe- riaate . . . 45

3.9 Esimerkki Raman konfokaalimikroskopian spektreistä saadusta korre- laatiokuvaajasta elektrodi-PPy -rajapinnalla . . . 46

3.10 Esimerkki Raman konfokaalimikroskopian spektreistä saadusta korre- laatiokuvaajasta pinnoittamattoman platinatyöelektrodin pinnalla . . 46

3.11 l-FDH-PPy kalvojen muodostumisesta aiheutuvat amperogrammit nel- jän minuutin polymerisaatioajalla . . . 49

3.12 l-FDH-NADP⁺-PPy kalvojen muodostumisesta aiheutuvat ampero- grammit yhden minuutin polymerisaatioajalla . . . 49

3.13 l-FDH-PPy kalvojen muodostumisesta aiheutuvat amperogrammit yh- den minuutin polymerisaatioajalla . . . 50

4.1 0.3 M l-fukoosia sisältävällä entsyymireaktioliuoksella saadut sykliset voltammogrammit . . . 54 4.2 0.0 mM l-fukoosia sisältävällä entsyymireaktioliuoksella saadut sykli-

set voltammogrammit . . . 54 4.5 Reaktioliuoksilla saatujen kronoamperogrammien avulla määritetyt vir-

tojen keskiarvot, niiden keskihajonnat sekä pistejoukkoon sovitettu PNS-suora. . . 56 4.6 Reaktioliuoksilla huoneenlämmössä ja pH:ssa 7 saadut sähkökemialliset

vasteet . . . 57 4.7 Adsorptiolla kiinnitetyn entsyymin syklinen voltammogrammi 0.3 M

l-fukoosilla . . . 58 4.10 Neljän minuutin polymerisaatioajalla pinnoitetuilla l-FDH-NADP⁺-

PPy -elektrodeilla saadut voltammogrammit . . . 60 4.11 Minuutin polymerisaatioajalla pinnoitetuillal-FDH-NADP⁺-PPy -elek-

trodeilla saadut voltammogrammit . . . 61 4.12 Minuutin polymerisaatioajalla pinnoitetuillal-FDH-PPy -elektrodeilla

saadut voltammogrammit . . . 61 4.13 l-fukoosin, d-glukoosin ja d-galaktoosin vasteet l-FDH -entsyymille . 62 4.14 Entsyymireaktioliuoksilla saadut amperogrammit . . . 63 4.15 Entsyymireaktioliuoksilla saaduista amperogrammeista muodostettu

kalibraatiokuvaaja ja pistejoukkoon sovitettu suora . . . 64 4.16 NMR-spektroskopialla ja kronoamperometrialla määritettyjen pitoi-

suuksien vastaavuus erilaisista sylkinäytteistä entsyymireaktioliuoksien avulla . . . 65

Taulukot

2.1 Yleisimpien monosakkaridien moolimassoja ja niiden esiintyminen syl- jessä terveillä yksilöillä . . . 5 3.1 Reaktioliuoksien ainesosat, lämpötilat ja happamuudet. . . 33 3.2 Kuivattujen ja ristisilloitettujen elektrodien valmistuksessa ja sähkö-

kemiallisissa mittauksissa käytettyjen liuosten ainesosien pitoisuudet . 36 3.3 Sähkökemiallisesti arvioidut kalvojen paksuudet sekä Raman konfo-

kaalimikroskopialla määritetyt paksuudet . . . 47 3.4 l-FDH-PPy -elektrodien valmistuksessa ja sähkökemiallisissa mittauk-

sissa käytettyjen liuosten ainesosien pitoisuudet . . . 48 3.5 Sylkinäytteiden l-fukoosipitoisuuksien määrityksessä käytettyjen liu-

osten sisältämät ainesosat . . . 52 4.1 Erilaisten entsymaattisten menetelmien mahdollisuus l-fukoosin tun-

nistukseen ja määritykseen . . . 53 4.2 Sylkinäytteiden sähkökemiallisilla entsymaattisilla vasteilla määritetyt

l-fukoosipitoisuudet ja niitä vastaavat pitoisuudet NMR-menetelmällä 64

Sisältö

1 Johdanto 1

2 Teoria 2

2.1 L-fukoosi ja muut monosakkaridit . . . 2

2.2 Sylki . . . 4

2.3 Sähkökemialliset mittaustekniikat . . . 6

2.4 Entsymaattisen tunnistuksen periaate . . . 15

2.5 L-fukoosin entsymaattinen tunnistus . . . 19

2.5.1 L-fukoosidehydrogenaasin kiinnitys elektrodin pinnalle . . . . 21

3 Materiaalit ja menetelmät 30 3.1 CHES -puskuriliuoksen valmistus . . . 31

3.2 Entsyymin sekoitus reaktioliuoksiin . . . 32

3.3 Entsyymin kuivaaminen elektrodin pinnalle . . . 34

3.4 Entsyymin kiinnitys PPy-kalvoihin . . . 38

3.4.1 PPy-kalvon paksuuden arviointi kronoamperogrammeista . . . 40

3.4.2 PPy-kalvon paksuuden mittaaminen . . . 42

3.4.3 Entsymaattinen määritys PPy-kalvoilla . . . 47

3.5 L-fukoosin entsymaattinen määritys sylkinäytteistä . . . 50

4 Tulokset 53 4.1 Entsymaattinen määritys reaktioliuoksilla . . . 53

4.2 Entsymaattinen määritys adsorptiopinnoituksella . . . 58

4.3 L-fukoosin määritys L-FDH-PPy-elektrodeilla . . . 60

4.4 L-fukoosin entsymaattinen määritys syljestä . . . 62

5 Pohdinta 66

6 Johtopäätökset 76

Viitteet 77

1 Johdanto

Tämän tutkielman tarkoituksena on esitelläl-fukoosin tunnistuksen mahdollisuuksia sähkökemiallisin menetelmin ja siihen liittyvin materiaalivalinnoin. Sähkökemiallisia mittaustekniikoita käytetään nykyisin esimerkiksi veren glukoosipitoisuuksien mää- rittämiseen erittäin pienistä verinäytetilavuuksista niin kutsuttujen pikamittarien tai

"biosensorien" avulla. Näin ollen näitä menetelmiä voidaan käyttää vieritutkimukses- sa (point-of-care testing, POC). Mahdollisuus pienten kannettavien laitteiden käyt- töön patofysiologisten oireiden seurannassa sekä diagnostiikan tukena on varteenotet- tavaa ja hyödyllistä etenkin tilanteissa, joissa laboratoriotutkimus tai suurten analyy- silaitteiden käyttö on käytännössä mahdotonta tai erittäin hankalasti toteutettavis- sa, esimerkiksi haja-asutusalueilla ja matalan elintason maissa. Syljen metaboliittien kvantitointiin ja tunnistamiseen on käytetty esimerkiksi NMR-laitteistoa,^[1–3] mikä tyypillisesti vaatii mittaukseen näytettä noin 500 µl,^[3] siinä missä sähkökemiallinen mittaus seulapainantaelektrodilla tarvitsee noin 50µl. Tämä ero tekee sähkökemialli- sista menetelmistä varteenotettavia sylkidiagnostiikassa, jossa saatavilla olevat näy- tetilavuudet ovat ymmärrettävästi varsin pieniä.

l-fukoosi -monosakkaridi on molekyylinä glykaanirakenteissa yhdistetty esimer- kiksi rintasyöpään.^[4] Lisäksi syljen vapaan l-fukoosipitoisuuden on alustavasti ha- vaittu olevan koholla pään ja kaulan alueen levyepiteelikarsinooma -potilailla,^[3] mi- kä tekee l-fukoosin edullisesta ja nopeasta tunnistuksesta sekä kvantitoinnista toi- vottua. Toisin kuin d-glukoosin, l-fukoosin tunnistusta ei ole tutkittu samassa mit- takaavassa, etenkään sylkidiagnostiikan näkökulmasta. Yleisesti ottaen, syljen mo- lekyylipitoisuuksien on havaittu muuttuvan suuresti fysiologisen tilan, rasituksen ja ärsykkeiden vaikutuksesta,^[1] joten näiden pitoisuuksien ja patofysiologisten oireiden sekä sairauksien yhdistäminen on tärkeä osa diagnostiikan kehitystä ja näin kansan- terveyttä. Lisäksi sylkinäytteen ei-invasiiviset keräysmenetelmät^{[1, 5]} asettavat syljen diagnostisena alustana varteenotettavaksi. Näistä perusteluista huolimatta sylkeä on kuitenkin käytetty diagnostiikassa huomattavasti vähemmän kuin ihmiskehon muita nesteitä.^[1]

Tämän tutkimuksen tarkoituksena on esitellä l-fukoosipitoisuuksien määrittämi- nen pienistä näytetilavuuksista sähkökemiallisin menetelmin silkkipainettujen elektro- dien avulla. Tutkimuksessa käytetään sähkökemiallisina menetelminä syklistä voltam- metriaa ja kronoamperometriaa yhdessä entsymaattisen reaktion kanssa. Tutkimuk- sen tarkoituksena oli kehittää nykyisiin menetelmiin nähden kustannustehokkaampi ratkaisu l-fukoosin määritykseen, jota voitaisiin tulevaisuudessa käyttää esimerkiksi riskiryhmään kuuluvien henkilöiden seulonnassa, diagnostiikan tukena sekä hoidon seurannassa.

2 Teoria

Tässä luvussa esitelläänl-fukoosin sähkökemialliseen tunnistukseen ja kvantitointiin tarvittava teoreettinen perusta, esittelemällä l-fukoosin ominaisuuksia, kuten raken- netta, synteesiä ja esiintymistä sekä sähkökemiallisten mittaustekniikoiden periaattei- ta sekä tutkimuksessa käytettyjen elektrodimateriaalien ja reagenssien taustaa. Ent- symaattisen tunnistuksen kannalta on erittäin tärkeä ymmärtää siinä käytettävien entsyymiproteiinien ominaisuuksia ja reaktioreittejä sekä niiden vahvuuksia ja rajoit- teita.

2.1

-fukoosi ja muut monosakkaridit

Monosakkaridit, eli yksinkertaiset sokerit, luokitellaan aldooseihin ja ketooseihin, nii- den karbonyyliryhmän sijainnin mukaan.^[6] Lisäksi niiden nimeäminen perustuu niis- sä esiintyvien hiilien lukumäärään; esimerkiksi pentooseissa on 5 ja heksooseissa 6 hiiliatomia. Jokaisesta monosakkaridista on myös olemassa kaksi eri muotoa; l- ja d -konfiguraatiot (levojadextro, vasen ja oikea). Nämä muodot eroavat toisistaan karbo- nyyliryhmää kaukaisimpana olevan hiilen hydroksyyliryhmän puolen osalta Fischerin projektiossa.^[6] Näiden konfiguraatioiden lisäksi sokeri voi olla erilaisissa muodoissa.

Suoraketjuisen aldoosi-monosakkaridin karbonyyliryhmä voi muodostaa kovalenttisen sidoksen hapen kanssa muodostaen rengasrakenteen.^[6] Monosakkaridin suoraketjui- nen muoto ja sen rengasketjuiset muodot ovat liuoksessa tasapainossa.^[40] Tyypilli- sesti monosakkaridi on rengasketjuinen; suoraketjuisten osuus tasapainoisessa liuok- sessa on tyypillisesti alle 0.01 %.^[40] Monosakkaridien rengasketjuista on anomeerisia α- ja β -muotoja, jonka lisäksi rengasketjut määritellään renkaassa olevien hiilien lukumäärän mukaan furanoosiksi tai pyranoosiksi (renkaassa 4 tai 5 hiiliatomia ja li- säksi yksi happiatomi). Näin ollen vain viisi tai useampia hiiliatomeja sisältävä mon- osakkaridi voi muodostaa pyranoosirakenteen.^[6] Näidenkin muotojen suhde riippuu monosakkaridista. Esimerkiksi d-glukoosia esiintyy vesiliuoksessa likipitäen kolmas- osa α-glukopyranoosi -muodossa ja kaksi kolmasosaa β-glukopyranoosi -muodossa.^[6]

Monosakkaridin erilaisten α- ja β -anomeerimuotojen suhteet palaavat aina tiettyyn ominaiseen suhteeseen eli tasapainoon mutarotaation seurauksena liuoksissa.^[6] Tyy- pillisiä selkärankaisten monosakkarideja on esitetty taulukossa 2.1 ja kuvassa 2.2.

l-fukoosi, eli 6-deoksi-l-galaktoosi,^[7] on selkärankaisten yleisimpiä monosakkari- deja.^[40] Toisin kuin suurin osa selkärankaisten monosakkarideista, fukoosi esiintyy l-konfiguraatiossa muille tyypillisen d-konfiguraation sijaan (kuva 2.2).^{[4, 7, 40]} Esi- tettyyn nimeen perustuen l-fukoosi on siis l-galaktoosi, josta puuttuu kuudenteen hiiliatomiin kiinnittynyt happi (hydroksyyliryhmästä).

Nisäkkäillä l-fukoosia esiintyy osana N- ja O- linkittyneitä glykaaneja ja glyko-

lipidejä.^[7] Lisäksi l-fukoosin ollessa 6-deoksi-sokeri, siltä puuttuu hydroksyyliryhmä kuudennesta hiiliatomista,^{[4, 7]} mikä puolestaan kasvattaa sen hydrofobisuutta.^[8] l- fukoosinα-pyranoosi -rengasrakenne on esitetty kuvassa 2.1.l-fukoosi on ainoa eläin- solujen glykaaneissa esiintyvä deoksiheksoosi.^{[4, 41]} l-fukoosia sisältäviä glykaaneja on yhdistetty esimerkiksi rintasyöpiin,^[4] mutta todennäköisesti tunnetuin esimerkki fu- kosyloituneista glykaanirakenteista ovat ABO-veriryhmien antigeenit.^[7] Lisääntynyt fukosyloituneiden glykaanien määrä veren seerumin immunoglobuliineissa on yhdis- tetty nivelreumaan^[7] ja syljen koholla olevasta vapaasta l-fukoosipitoisuudesta on viitteitä pään ja kaulan alueen levyepiteelikarsinoomissa (head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC).^[3]Lisäki veren seerumin kohonneestal-fukoosipitoisuudesta on viitteitä suun levyepiteelikarsinooma -potilailla (ONSCC).^[10]

l-fukoosia syntetisoidaan eläinsoluissa,^{[4, 7]} mutta solut voivat kerätä sitä käyt- töönsä myös solunulkoisesta tilasta spesifisten kalvonläpimenevien kuljettajaproteii- nien avulla^{[4, 7]} tai hajottamalla lysosomaalisesti fukosyloituneita glykaaneja.^[7] Vaik- ka l-fukoosi on rakenteeltaan ehkäpä lähimpänä l-galaktoosia, sitä ei kuitenkaan eläinsoluissa syntetisoida tästä monosakkaridista. Tämän synteesireitin puutos joh- tunee siitä, etteil-galaktoosi ole yleinen selkärankaisten monosakkaridi taulukon 2.1 mukaisesti. l-fukoosi voidaan syntetisoida mannoosista.^{[7, 41]} GDP-mannoosi käy lä- pi muutaman peräkkäisen entsymaattisen reaktion, missä GDP-mannoosista muun- tuu GDP-4-keto-6-deoksi-mannoosi. Tämä tuote puolestaan epimerisoituu 4. ja 5.

hiiliatomista epimeraasi -entsyymin katalysoimana GDP-4-keto-6-deoksi-glukoosiksi.

Tämän jälkeen reduktaasi-entsyymi pelkistää muodostuneen sokerin 4. hiiliatomis- ta, jolloin muodostuu GDP-fukoosia.^{[7, 41]} Tämä on niin kutsuttul-fukoosin de novo -synteesireitti.^[7] GDP-fukoosia, eli nukleotidiaktivoitua fukoosin muotoa käytetään fukosyloitujen oligosakkaridien rakentamisessa.^[7] Entsyymit ovat siis läsnä vahvas- ti solujen fukoosisynteesissä ja yllä esitetty synteesireitti osoittaa omalta osaltaan entsyymien monimuotoisuuden ja monikäyttöisyyden.

1

3 2

4 5

6 CH

OH

O OH OH OH

Kuva 2.1: α-l-fukopyranoosi eli l-fukoosin α-pyranoosirakenne (Haworth - projektiona). Kuvaan on lisätty hiiliatomien numerointi punaisella. Kuudennesta hii- liatomista puuttuu hydroksyyliryhmä (OH). Kuva on muokattu lähteestä^[4] .

d-glukoosi d-galaktoosi d-mannoosi d-ksyloosi

N-asetyyli-d-glukosamiini N-asetyyli-d-galaktosamiini d-glukuronihappo

l-fukoosi N-asetyylineuramiinihappo

Kuva 2.2: Tyypillisiä selkärankaisilla esiintyviä monosakkarideja tuolikonformaatiossa (chair conformation). Kuva on muokattu lähteestä^[40] .

2.2 Sylki

Sylki on läpinäkyvä erittäin monimutkainen neste,^[9] joka on tästä huolimatta yli 99 % vettä.^{[1, 2, 9]} Alle yhden prosentin osuus sisältää kuitenkin lukuisia biomolekyyliryhmiä kuten elektrolyyttejä, proteiineja ja pieni molekyylipainoisia aineenvaihduntatuottei- ta.^[2] Lisäksi sylki sisältää ruoansulatusentsyymejä, immunoglobuliineja, kasvuteki- jöitä ja bakteereita.^[1] Sylki on lievästi hapan sen pH-arvon ollessa 6.0-7.0.^[9]

Sylkeä tuotetaan kolmessa suuressa sylkirauhasparissa (Glandula parotis, G. sub- mandibulus ja G. sublingualis)^{[1, 2, 5]} ja noin 800-1000 pienemmässä sylkirauhasessa.^[1]

Sylkirauhasten yhteistoiminnan tuloksena sylkeä erittyy vuorokaudessa keskimääräi- sesti 0.75 litrasta 1.5 litraan.^[1] Kolme suurinta sylkirauhasparia tuottavat jopa 90 % syljen kokonaistilavuudesta.^[9]

Glandula parotis-sylkirauhasparin erittämä sylki on amylaasi -entsyymipitoinen ja on näin toiminnassa ravinnonnauttimisen aikana; amylaasi pilkkoo ravinnon tärkke- lystä, eli glukoosi-monosakkaridien välisiä sidoksia. Kaksi muuta suurempaa sylkirau- hasparia (G. submandibulus jaG. sublingualis) toimivat taas levossa; niiden erittämä sylki sisältää musiini-proteiineja, jotka muodostavat limakerroksia suuontelon pinnal- le, mikä puolestaan estää haitallisten aineiden, kuten vapaiden protonien, diffuusiota.

Lisäksi musiinit estävät muun muassa haitallisten bakteerien toimintaa.^[5] Syljen teh- tävät suuontelossa kohdistuvat suun terveyden ylläpitoon suojaamalla hampaita ja limakalvoja sekä estämällä bikarbonaatti-ionien liiallista happamuutta. Sylki toimii liukasteena edistäen ravinnon siirtymistä ja suojaamalla suun kudoksia mekaanisel- ta rasitukselta. Lisäksi sylki muodostaa liukastavan proteiinikalvon hampaan kiiltee- seen, joka suojaa eroosiolta.^[5] Sylki pitää yllä suun terveyttä,^[2] esimerkiksi suojaa- malla suuonteloa mikrobeilta.^[1] Sylkinäytteen kerääminen ja valmistelu on sylkidiag-

nostiikan suurin haaste, mutta ei-invasiivisuutensa vuoksi sylkidiagnostiikka voidaan nähdä kiinnostavana.^[9] Syljen keräysmenetelmä, kohdehenkilön ikä, vuorokausiryt- mi, mahdollinen lääkitys ja elinympäristö voivat vaikuttaa syljen sisältämien aineiden pitoisuuksiin.^[1] Sylkeä voidaan kerätä esimerkiksi suoraan sylkirauhasen suuonteloon yhdistävästä kanavasta tai keräämällä kokosylkeä, eli sylkeä joka muodostuu erilais- ten sylkityyppien sekoittuessa suuontelossa. Kokosylkeä voidaan kerätä stimuloimalla (esimerkiksi parafiinin pureskelu) tai stimuloimatta (leposylki).^[5]

Syljestä on tunnistettu ja kvantitoitu terveillä ihmisillä monosakkarideista d- glukoosia, d-galaktoosia ja l-fukoosia aineenvaihduntatuotteina.^[1] Tyypillisiä selkä- rankaisten monosakkarideja sekä niiden pitoisuuksia syljessä on esitetty taulukossa 2.1 ja niiden rakenteita kuvassa 2.2. Myös suuontelon ulkopuolisten patogeenien on osoitettu olevan läsnä syljessä, mikä edelleen voi tehdä (koko)syljestä ja suuontelosta varteenotettavan alustan yleisterveyden diagnostiikalle ja seurannalle.^[5]Sylki sisältää aineenvaihduntatuotteita, metaboliitteja, jotka ovat aineenvaihdunnan seurauksena muodostuneita molekyylejä. Nämä molekyylit voivat viitata jonkin aineenvaihdun- tamekanismin olemassaoloon ja edelleen siihen liittyvän sairauden tai taudin läsnä- oloon mekanismin ja esimerkiksi molekyylien pitoisuuksien muutosten seurauksena.^[9]

Aineenvaihduntatuotteiden pitoisuudet voivat muuttua suuresti erilaisten tautien ja sairauksen seurauksena.^[3] Sylki on varteenotettava tutkimuskohde suusyöpien diag- nostiikassa sen ollessa suorassa kosketuksessa suun limakalvojen ja mahdollisen syö- päsolukon kanssa.^[9] Tämä tekee syljestä erittäin lupaavan alustan suusyöpien (kuten pään ja kaulan alueen levyepiteelikarsinooma, head and neck squamous cell carcino- ma, HNSCC) diagnosointiin.^[3]

Taulukko 2.1: Selkärankaisilla esiintyvien yleisimpien monosakkaridien^[40] ja niiden johdannaisten moolimassoja sekä niiden pitoisuudet syljessäterveilläyksilöillä^[1]. Esi- tetyt pitoisuudet ovat muodossa (pitoisuus ± keskihajonta,n = 16).

Monosakkaridi Moolimassa [g·mol⁻¹] Pitoisuus syljessä [µM]

l-fukoosi 164.16 112.06 ± 87.04

d-glukoosi 180.16 355.05 ±260.74

d-galaktoosi 180.16 83.46 ±31.16

d-ksyloosi 150.13 -

d-mannoosi 180.16 -

N-asetyyli-d-glukosamiini 221.21 tunnistettu

N-asetyyli-d-galaktosamiini 221.21 -

N-asetyylineuramiinihappo 309.27 -

d-glukuronihappo 194.14 -

2.3 Sähkökemialliset mittaustekniikat

Sähkökemiallinen kenno ja elektrodit

Sähkökemialliset mittaustekniikat perustuvat sähkökemialliseen kennoon ja siinä ole- vien elektrodien ja tutkittavan aineen väliseen vuorovaikutukseen. Sähkökemiallinen kenno koostuu elektrolyyttisestä liuoksesta, tutkittavasta molekyylityypistä eli ana- lyytista ja (vähintään) kahdesta elektrodista. Nämä elektrodit on upotettuna ana- lyytin sisältävään näyteliuokseen. Sähkökemialliset kennot luokitellaan elektrolyyt- tisiin kennoihin ja galvaanisiin kennoihin.^[11] Elektrolyyttisessä kennossa kennon yli asetetaan jännite, joka saa aikaan kemiallisen reaktion. Galvaanisessa kennossa reak- tio tapahtuu spontaanisti, kun elektrodit yhdistetään johtimella. Esimerkkinä gal- vaanisesta kennosta ovat paristot, joissa kemiallinen energia muutetaan sähköiseksi energiaksi ja elektrolyyttisestä kennosta erilaiset pinnoitusmenetelmät (elektrolyytti- nen synteesi sekä galvanointi,electroplating, suomenkielisestä nimestään huolimatta), joissa katalysoidaan jotakin kemiallista prosessia.^[11] Ladattaessa akut ovat elektro- lyytisiä kennoja ja purettaessa galvaanisia kennoja.^[11]

Sähkökemiallinen kenno voidaan jakaa kahteen puolikennoon (half-cell), jotka mo- lemmat koostuvat yhdestä elektrodista ja elektrolyyttiliuoksesta sen ympärillä. Näin ollen tällaisessa puolikennossa tapahtuvaa reaktiota voidaan tarkastella koko systee- min sijasta.^[11] Puolikennoa ja siinä tapahtuvaa reaktiota tarkasteltaessa ei ole varsi- naisesti merkitystä, onko kyseessä galvaaninen vai elektrolyyttinen kenno.^[11]

Elektrolyyttisessä liuoksessa olevia elektrodeja kutsutaan työ- ja vastaelektrodeik- si (working electrode, WE ja counter electrode, CE).^[11] Lisäksi systeemissä voi olla kolmas elektrodi, vertailuelektrodi (reference electrode, RE), jonka tarkoituksena on mitata tai vakauttaa mahdollisista jännitteen muutoksista seuraavia häiriöitä työ- elektrodilla.^[13] Vertailuelektrodin potentiaali on kiinnitetty ja tunnettu.^[12] Vertai- luelektrodin läpi tulee kulkea riittävän pieni tai olematon virta, jotta sen potentiaalin voidaan olettaa olevan likimain vakio.^{[12, 13]} Lisäksi liian suuret virran arvot voivat vaurioittaa vertailuelektrodia.^[12] Tyypillisiä vertailuelektrodeja ovat^[11]

• normaali vetyelektrodi (normal/standard hydrogen electrode, NHE/SHE)

• kyllästetty kalomelielektrodi (saturated calomel electrode, SCE)

• hopea-hopeakloridielektrodi (silver-silver chloride electrode, Ag/AgCl).

Näiden suhteen esitetyt potentiaalit voidaan esittää toistensa avulla, kunhan niiden väliset suhteet ovat tiedossa. Esimerkiksi Ag/AgCl verrattuna NHE:n potentiaaliin on 0.197 V ja SCE verrattuna NHE:n potentiaaliin 0.242 V. Näin ollen, jos oletetaan NHE:n potentiaalin olevan "nollapotentiaali", voidaan esimerkiksi SCE:n suhteen esi-

tetty potentiaali esittää Ag/AgCl -elektrodin avulla; koska näiden potentiaalien ero- tus on 0.045 V, täytyy SCE:n suhteen esitetystä potentiaalista vähentää 0.045 V.

Vastaavasti Ag/AgCl -elektrodin potentiaalin suhteen esitettyyn potentiaaliin on li- sättävä 0.045 V. Mikäli Ag/AgCl -elektrodin suhteen esitetty potentiaali halutaan taas esittää NHE:n avulla on potentiaalista vähennettävä 0.197 V. Tällöin siis 0 V vs.Ag/AgCl on -197 mV vs. NHE.

Yksinkertaisimmillaan sähkökemiallisessa (galvaanisessa) kennossa tapahtuu reak- tio seuraavasti: Kun materiaaleiltaan ja muilta ominaisuuksiltaan sopivat työ- ja vas- taelektrodit on upotettu elektrolyyttiseen liuokseen, eli liuokseen, missä on vapaita varauksen kuljettajia, työelektrodi reagoi analyytin kanssa. Tämä työelektrodin ja analyytin välinen reaktio on hapetus-pelkistysreaktio (redox-reaktio), missä varauk- sen kuljettajat siirtyvät elektrodin ja analyytin välillä hapettaen toisen ja pelkistäen toisen. Tämän reaktion seurauksena elektrodille syntyy sähköinen potentiaali. Vastae- lektrodilla tapahtuu vastaavanlainen hapetus-pelkistysreaktio, mutta johon liuoksessa esiintyvä analyytti ei osallistu. Näiden puolikennojen välille syntyy näin ollen poten- tiaaliero, jännite, joka voidaan mitata ja parhaassa tapauksessa yhdistää analyytin pitoisuuteen liuoksessa. Tämä jännite (tunnetaan myös nimellä kennopotentiaali,cell potential) on systeemissä varauksen kuljettamiseen käytettävissä olevan energian mit- ta.^[11] Edelliseen pohjautuen on intuitiivisesti lisäksi selvää, että potentiaalieron saa- vuttamiseksi työ- ja vastaelektrodien on jollakin tavalla erottava toisistaan, jotta ne samaan liuokseen upotettuina antaisivat toisistaan eroavan potentiaalin ja edelleen jännitteen. Erona voi olla esimerkiksi elektrodin pintamateriaali tai pinta-ala. Potenti- aali, mikä ilmenee työelektrodin ja analyytin välillä on analyytin redox-potentiaali, ja on seurausta analyytin redox-reaktiosta. Vastaavasti elektrolyyttisessä kennossa ase- tetaan jonkinlainen potentiaaliero, eli jännite, elektrodien (WE ja CE) välille. Tämä katalysoi kemiallisen reaktion, mitä voidaan tarkastella WE-puolikennon ja systeemin muutosten (esimerkiksi virran) avulla.

Niin kutsutulla pelkistävällä virralla eli katodisella virralla tarkoitetaan näissä säh- kökemiallisissa mittauksissa elektronien siirtymistä (työ)elektrodista liuokseen. Vas- taavasti hapettavalla virralla eli anodisella virralla tarkoitetaan päinvastaista reaktio- ta.^[11] Kirjallisuudessa on vakiintunut käytännöksi valita kuvaajissa katodiset virrat positiivisiksi ja anodiset virrat negatiivisiksi.^[11]

Elektrodi-elektrolyyttirajapinnoilla tapahtuu kahdenlaisia reaktioita. Varaus voi siirtyä rajapinnan yli noudattaen Faradayn lakia. Tätä reaktiota kutsutaan faradi- seksi prosessiksi^[11] ja siinä syntyvää virtaa faradiseksi virraksi (tai virran faradiseksi komponentiksi). Faradisessa prosessissa varaus siis liikkuu elektrodi-liuos -rajapinnan yli.^[13] Faradayn (elektrolyysi)lain mukaan elektrodiprosessissa tuotetun tai kulute- tun aineen ainemäärä n on verrannollinen elektrodin läpi kulkeneen varauksen mää-

räänq.^[12] Kun systeemissä ei ole muita prosesseja voidaan näiden kahden parametrin välinen yhteys esittää muodossa^[12]

q =N F n,

missäN on siirtyneiden elektronien lukumäärä jaF Faradayn vakio.^[12]Faradiset vir- rat ja niiden aiheuttamat prosessit ovat yleensä sähkökemiallisten mittaustekniikoiden pääasiallisena mielenkiinnon kohteena,^{[11, 12]} koska kyseinen prosessi ja siitä seuraava virta tapahtuu tutkittavan aineen hapettuessa tai pelkistyessä.^[12]Jotta faradinen vir- ta voi syntyä, täytyy molekyylien tai ionien siirtyä elektrodin pinnalle. Tämä siirtymä tapahtuu aina massansiirtona, joka voidaan jakaa kolmeen erilaiseen siirtoreaktioon.

Massansiirto voi tapahtua diffuusiolla (pitoisuusgradientin mukaisesti), migraatiolla eli ionien siirtymisenä (potentiaaligradientin mukaisesti) tai konvektiolla.^{[11, 12]} Pitoi- suusgradientti muodostuu aina, kun aine hapettuu tai pelkistyy elektrodin pinnal- la.^[12] Tällöin siis analyytti muuttuu reaktiotuotteekseen, jolloin analyytin pitoisuus rajapinnalla laskee ja reaktiotuotteen pitoisuus rajapinnalla kasvaa. Nämä puoles- taan aiheuttavat pitoisuusgradientit niiden koko liuoksessa olevien pitoisuuserojen seurauksena.

Toiset reaktiot ovat ei-faradisia prosesseja, joissa varaukset eivät siirry rajapinnan yli.^[13] Näitä ovat esimerkiksi adsorptio- tai desorptio -prosesseista seuraava virran muodostuminen.^[11] Esimerkkinä ei-faradisesta prosessista on myös kaksoiskerroksen muodostuminen ja varautuminen elektrodi-näyteliuos -rajapinnalla. Tällöin systee- miin muodostuu kapasitanssi^[11] ja sen seurauksena kapasitiivinen virta.^[13] Kapasi- tiivinen virta ilmenee muuttuvan elektrodipotentiaalin seurauksena,^[13] joka on mer- kityksellinen etenkin seuraavassa alaluvussa esiteltävässä sähkökemiallisessa mittaus- tekniikassa, voltammetriassa.

Vasteita jotka saadaan analyyttia sisältämättömällä elektrolyyttiliuoksella, jolla on matala resistanssi, kutsutaan "tausta-arvoiksi" (background limit) ja tätä liuos- ta tukielektrolyytiksi (tai inertti elektrolyytti, supporting electrolyte).^[11] Tukielekt- rolyytin ionit toimivat liuoksessa varauksen kuljettajina.^[13] Migraatiolla (ionien siir- tymisellä potentiaaligradientin mukaisesti) tapahtuva analyytin massansiirto voidaan minimoida käyttämällä tällaista tukielektrolyyttiä.^{[11, 13]}

Tukielektrolyytin käyttö laskee liuoksen sisäistä resistanssia ja näin myös ohmista pudotusta (ohmic drop) työ- ja vertailuelektrodin välillä. Koska tämä vaihtelu saa- daan minimoitua, se puolestaan helpottaa työelektrodin potentiaalin hallintaa. Kak- soiskerroksen paksuus pysyy myös ohuena suhteessa diffuusiokerrokseen (eli verrat- tuna kerrokseen jossa aineen siirtyminen tapahtuu pitoisuusgradientin avulla). Tu- kielektrolyyttiä käytettäessä voidaan lisäksi hallita tutkittavan liuoksen pH-arvoa,

ionivahvuutta ja ligandien pitoisuutta, joten näiden parametrien vakioiminen on hel- pompaa. Koska tukielektrolyytti vaikuttaa liuoksen ionivahvuuteen, se myös tasapai- nottaa tätä tilannetta elektrodi-liuos -rajapinnalla tapahtuvan ionien muodostumisen (tai poistumisen) aikana tehden liuoksen ionivahvuudesta homogeenisemmän.^[11]

Huomioitavaa kuitenkin on, että kaikki tukielektrolyytin toiminnot eivät ole vält- tämättä haluttuja sähkökemiallisia vasteita tutkittaessa. Esimerkiksi tukielektrolyytti voi joissakin tilanteissa antaa oman vasteensa joko reagoimalla analyytin kanssa tai absorboitumalla elektrodin pinnalle vaikuttaen näin ionien muodostumisen ja poistu- misen kinetiikkaan.^[11]

Kaksoiskerros koostuu erimerkkisesti varautuneista tiiviistä kerroksesta ja dif- fuusiokerroksesta.^[13] Nämä kerrokset voidaan käsittää systeemissä sarjaan kytket- tyinä kondensaattoreina.^[13] Kapasitiivinen virta on seurausta muuttuvasta elektro- dipotentiaalista^{[12, 13]} tai muuttuvasta elektrodin pinta-alasta.^[12]

Avoimen piirin potentiaalilla (OCP, open circuit potential) tarkoitetaan piirin yli mitattavaa jännitettä siten, että piiriin ei syötetä ulkopuolista virtaa. Tämä jänni- te voidaan mitata suuri-impedanssisella jännitemittarilla.^[11] Potentiaali on jollakin tausta-arvojen välisellä alueella.^[11] Kennossa redox-potentiaali on avoimen piirin po- tentiaalia suurempi. Näin ollen esimerkiksi elektrolyyttiseen kennoon aiheutettavan potentiaalin on oltava suurempi kuin OCP, jotta hapetus-pelkistysreaktiosta aiheu- tuva varausten siirto voi tapahtua.^[11]

Aineen virtaus J(x, t) jollakin ajanhetkellä t ja jossakin paikassa x, esittää ai- neen massansiirtonopeutta jonkin pinnan läpi (mol s⁻¹cm⁻²). Fickin ensimmäisen diffuusiolain mukaan tämä vuo J voidaan yhdistää pitoisuuden paikalliseen muutok- seen, eli pitoisuusgradienttiin, joka on yksiulotteisessa tapauksessa muotoa^[11]

J(x, t) = −D∂C(x, t)

∂x , (1)

missä D on diffuusiovakio.

Fickin toinen diffuusiolaki yhdistää taas pitoisuuden ajallisen muutoksen pitoi- suuksien paikallisten erojen muutosnopeuteen. Tällöin yksiulotteisessa tapauksessa se voidaan esittää muodossa^[11]

∂C(x, t)

∂t =D∂²C(x, t)

∂x² . (2)

Voltammetria

Aiemmin esitetyllä tavalla tyypillisesti sähkökemiallisessa kennossa kemiallinen reak- tio saa aikaan sähköisen vasteen, eli kemiallinen energia muuttuu sähköiseen muotoon.

Suoraan kahden elektrodin redox-potentiaalien erojen (jännitteen) mittaamisen sijas-

ta, voidaan työ- ja vastaelektrodin välille asettaa ajallisesti muuttuva potentiaaliero.

Tällöin käänteisesti sähköisellä ärsykkeellä voidaan siis saada aikaan kemiallinen reak- tio. Näin ollen muutos jännitteessä aiheuttaa redox-reaktioiden määrän kasvun tai las- kun riippuen kunkin ajanhetken jännitteestä ja analyytin redox-potentiaalin suuruu- desta; mitä lähempänä käytetty potentiaali on analyytin redox-potentiaalia, sitä suu- rempi osa analyytista hapettuu tai pelkistyy elektrodi-elektrolyytti -rajapinnalla. Täl- löin myös kennossa kulkevan virran suuruus kasvaa elektronien siirron seurauksena.

Muuttuvan jännitteen vaikutusta kennossa muodostuvaan virtaan sekä tämän virta- potentiaali -kuvaajan mittaamista ja arvioimista kutsutaan voltammetriaksi.^{[12, 14]}

Tyypillisesti voltammetriassa työ- ja vastaelektrodien välillä käytetään lineaari- sesti vaihtuvaa jännitettä E siten, että jännitteen muutosnopeus on vakio. Tällöin

siis dE

dt =v = vakio.

Tätä vakiota v kutsutaan pyyhkäisynopeudeksi (scan rate tai sweep rate) ja sen SI- järjestelmän yksikkönä on Vs⁻¹. Vakiopyyhkäisynopeudella tehty mittaus tunnetaan lineaarisena pyyhkäisyvoltammetriana (linear sweep voltammetry, LSV). Kun tie- tyllä ajanhetkellä t = λ potentiaalin lineaarisen muutoksen suunta vaihdetaan, pu- hutaan syklisestä voltammetriasta (cyclic voltammetry, CV). Esimerkki syklisestä voltammogrammista on esitetty kuvassa 2.3a. Tällöin esimerkiksi täysin hapettunut analyytti voi reversiibelissä tilanteessa pelkistyä uudelleen alkuperäiseksi analyytiksi.

Tämän seurauksena mitattava virran arvo kertoo analyytin käänteisestä reaktiosta verrattuna alkuperäiseen lineaarisella pyyhkäisyllä saatavaan voltammogrammiin, eli voltammetriseen E vs. i -kuvaajaan. On olemassa myös muita tapoja vaihdella jän- nitettä; esimerkiksi pulssimaisesti muuttuvalla ja amplitudiltaan vaihtelevalla jännit- teellä tehtyä voltammetriaa kutsutaan differentiaalipulssivoltammetriaksi (differential pulse voltammetry, DPV),^{[12, 14]} kanttiaallolla/neliöaallolla vaihtelevalla potentiaalil- la mitattavaa voltammetriaa neliöaaltovoltammetriaksi (square wave voltammetry, SWV)^[14] ja vaihe-erolla kapasitiivisen ja faradisen virran erottelevaa vaihtovirtaa ja tasavirtaa hyödyntävää menetelmää vaihtovirtavoltammetriaksi (alternative current voltammetry, ACV).^[12] Tässä tutkimuksessa keskitytään kuitenkin voltammetristen tekniikoiden osalta sykliseen voltammetriaan.

Syklisessä voltammetriassa lineaarisesti vaihtuva potentiaali E := E(t) voidaan esittää muodossa^[11]

E(t) =







E_i−vt, kun 0< t≤λ E_i−2vλ+vt, kun t > λ

(3)

missä E_i on aloituspotentiaali, v pyyhkäisynopeus, λ ajanhetki, jolloin potentiaali

käännetään ja t aika. Vaihtuva potentiaali voidaan esittää myös osin päätöspotenti- aalin (E_f) avulla. Tällöin^[13]

E(t) =







E_i−vt, kun 0≤t≤λ

E_f +v(t−λ) = 2E_f −Ei+vt, kun λ≤t ≤2λ

Molemmilla yhtälöillä muodostuu potentiaali kuvan 2.3a mukaisesti. Esimerkki potentiaalieron vaikutuksesta virran arvoon, eli syklisestä voltammogrammista, on esitetty kuvassa 2.3b. Syklisessä voltammetriassa on mahdollista suorittaa useita kier- roksia (syklejä), jolloin mittaus aloitetaan uudelleen potentiaalista E_i. Tarkkaan ot- taen esitetyt potentiaalin lineaarista muutosta kuvaavat kaavat eivät kuitenkaan ota suoraan huomioon useita kierroksia, jos aika ei ala alusta (hetkestä t = 0) jokaisen syklin jälkeen.

(a) (b)

Kuva 2.3: Havainnollistus syklisestä voltammetriasta. Sinisellä eteenpäin pyyhkäisy -vaihe ja punaisella taaksepäin pyyhkäisy -vaihe. (a) Esimerkki potentiaalin E muu- toksesta ajantsuhteen syklisessä voltammetriassa yhden syklin ajalta.λon ajanhetki, jolloin potentiaalin suunta vaihtuu. (b) Esimerkki havaittavasta virran muutoksesta potentiaalin muuttuessa kuvan (a) mukaisesti. Kuvaajat on tehty lähteiden[11, 13–15]

pohjalta.

Aiemmassa alaluvussa esiteltiin lyhyesti faradinen prosessi sekä ei-faradiset pro- sessit ja siihen kuuluva kaksoiskerroksen varautumisen seurauksena muodostuva ka- pasitiivinen virta. Voltammetriassa virran kapasitiivinen ja faradinen komponentti i_cap ja i_{f ar} riippuvat pyyhkäisynopeudesta v siten, että^{[11, 13]}

icap∝v i_{f ar} ∝√ v.

Tällöin mitä suurempia pyyhkäisynopeuksia v käytetään voltammetrisissa mittauk- sissa, sitä suurempi osuus virrasta on kapasitiivista. Jos analyytin pitoisuus liuoksessa on matala, voi voltammogrammista faradisen ja kapasitiivisen virran erottaminen toi- sistaan olla vaikeaa;^[13] kun analyytin pitoisuus tutkittavassa liuoksessa laskee, niin faradinen virta laskee, mutta analyytin pitoisuus ei vaikuta kapasitiiviseen virtaan.^[12]

Kapasitiiviselle virralle on esitetty pelkistetty muoto eteen- ja taaksepäin pyyhkäisyl- le^[13]

i_cap=















C_dv

1−exp

−E_i−E vR_uC_d

kun t < λ

−C_dv

1−2exp

−E−Ef

vR_uC_d

kun t > λ

missä R_u on resistanssi, jota potentiostaatti ei kompensoi. Pyyhkäisyn aikana ka- pasitiivinen virta siis pyrkii tasolle, joka on kapasitanssin C_d ja pyyhkäisynopeuden v tulon suuruinen. Huomioitavaa kuitenkin on, että edellä olevassa kaavassa olete- taan, että kaksoiskerroksen kapasitanssi C_d olisi riippumaton elektrodipotentiaalista E, mikä ei tarkkaan ottaen pidä paikkaansa.^[13]Kun kaksoiskerrosta varaava virta on enää häviävän pieni, kapasitiivisen virran suuruus voidaan pelkistetysti esittää lisäksi muodossa^[11]

|i_cap|=AC_dv,

missä A on elektrodin pinta-ala,Cd vaurautuneen kaksoiskerroksen kapasitanssi ja v pyyhkäisynopeus.^[11]

Kapasitiivisen virran komponentin muodostumisen selityksenä on rajapinnalle muodostuva kaksoiskerros, joka toimii systeemissä kahtena sarjaan kytkettynä kon- densaattorina.^[13] Mitattu virta i on kapasitiivisen i_cap ja faradisen virran i_{f ar} kom- ponenttien summa^[12]

i=i_{f ar}+i_cap.

Voltammetristen tekniikoiden suurimpana haasteena juurikin sopivan kapasitiivisen ja faradisen virran suhteen (ⁱ_i^{f ar}

cap) saaminen;^[12]ihanteellisessa tilanteessa esitelty suhde on siis mahdollisimman suurta (i_cap < i_{f ar}).

Kronoamperometria

Toisin kuin voltammetriassa, missä potentiaalin muutoksella saadaan mitattavia vir- ran arvoja, (krono)amperometriassa potentiaali on kiinnitettynä lähelle analyytin redox-potentiaalia.^[15] Tämän seurauksena suuri osa analyytista hapettuu tai pelkis- tyy, minkä seurauksena saadaan mitattavia virran arvoja. Virran arvot alkavat kui- tenkin laskea, koska analyytin määrä laskee liuoksessa sen hapettumisen tai pelkisty- misen seurauksena. Virran arvot laskevat, koska analyytin siirtyminen (pitoisuusgra-

dientin mukaisesti) kohti sitä hapettavaa tai pelkistävää elektrodia aiheuttaa analyyt- tiä sisältämättömän, kokoajan paksunevan kerroksen muodostumisen rajapinnalle;^[11]

diffuusiokerroksen paksuus kasvaa elektrodi-liuos -rajapinnalla.^[15]Kronoamperomet- riassa kiinnitetyn jännitteen arvoksi valitaan jännite, joka vastaa voltammetriassa havaittavan virran huippuarvon jännitettä.^[15] Kuvassa 2.4a on esitetty kiinnitetty potentiaali E ajan funktiona t ja kuvassa 2.4b esimerkki sitä vastaavasta mahdolli- sesta kronoamperogrammista (t vs.i).

(a) (b)

Kuva 2.4: Esimerkki kronoamperometrisen mittauksen kuvaajista. (a) Potentiaalin muutos ajan suhteen kronoamperometrisissa mittauksissa. Mittauksen alussa poten- tiaali nostetaan halutulle tasolle (punainen) ja potentiaali pidetään mittauksen lop- puun saakka samalla tasolla. (b) Esimerkki havaittavasta virran muutoksesta Cott- rellin yhtälöä noudattavassa prosessissa, kun potentiaalia muutetaan kuvan (a) mu- kaisesti. Virran suuruus voidaan suotuisassa tilanteessa yhdistää prosessissa mukana olevan analyytin pitoisuuteen esimerkiksi Cottrellin yhtälön avulla. Sisäkuva: Kaa- vassa (4) esitetyn Cottrellin yhtälön mukaisen virranilineaarisuuden tarkastelu ajan neliöjuuren käänteislukuun t^−1/2. Kuvaajat on tehty lähteiden^{[11, 15]} avulla.

Ideaalisessa tilanteessa, kun systeemiin vaikuttaa vain faradinen virta ja elektro- nien siirto elektrodi-liuos -rajapinnalla tapahtuu ainoastaan diffuusiolla, virran i_d(t) on todettu noudattavan Cottrellin yhtälöä, joka on tasomaisille elektrodeille muo- toa[11, 12, 15]

i_d(t) = nF A√ DC^∗

√π√

t , (4)

missänon siirtyneiden elektronien lukumäärä,F Faradayn vakio,Aelektrodin pinta- ala, Dsysteemin diffuusiovakio, C^∗ analyytin pitoisuus liuoksessa kaukana elektrodi- elektrolyytti-rajapinnasta jat aika.^[11] i_don niin kutsuttu diffuusiorajoitettu virta.^[11]

Kun kyseessä ei ole tasomainen elektrodi, on yhtälö erilainen. Esimerkiksi pallomai- sen elektrodin tapauksessa yhtälössä on summautuneena lisäksi pallon säteestä r0

riippuva vakiotermi ^{nF AD}

∗ C

r0 .^[11] Cottrellin yhtälössä oletetaan, ettei tutkittavaa liuos- ta sekoiteta. Cottrellin yhtälö voidaan johtaa kaavassa (2) esitetystä yksiulotteisesta

Fickin toisesta diffuusiolaista sopivilla reunaehdoilla, jotka kuvaavat alkutilanteen ho- mogeenisyyttä (C(x,0) = C^∗), pitoisuuden häiriöttömyyttä kaukana elektrodi-liuos -rajapinnasta ( lim

x→∞C(x, t) =C^∗) sekä mittaukseen liittyvää analyytin nollapitoisuut- ta rajapinnalla (C(0, t) = 0, t > 0).^[11] Viimeinen ehto tarkoittaa käytännössä, että alkuperäinen analyytti muuttuu kaiken aikaa rajapinnalla substraatikseen, eikä se tämän vuoksi käytännössä "ole koskaan rajapinnalla".

Vaikkakaan Cottrellin yhtälössä ja siihen pohjautuvassa esimerkkikuvassa 2.4b ei havaita kapasitiivisen virran vaikutusta mitattaviin virran arvoihin, on syytä huomioi- da, että käytännön mittauksissa kapasitiivinen virta muodostuu potentiaalin muutok- sesta. Näin ollen kuvassa 2.4a ajanhetkellät= 0 tehtävä potentiaaliaskel aiheuttaa ka- pasitiivisen virran.^[11] Ei-faradisen virran vaikutus katoaa ajansuhteen amperogram- mista eksponentiaalisesti riippuen systeemissä olevan kompensoimattoman resistans- sin ja kapasitanssin tulosta R_uC_d.^[11] Lisäksi alkuhetkien virran arvoihin vaikuttavat käytetty potentiostaatti ja tallennusvälineeseen liittyvät rajoitteet.^[11] Nämä rajoit- teet tulee huomioida kronoamperometrisissa mittauksissa. Lisäksi Cottrellin yhtälön mukaisesti ajanhetkellä t → 0 (positiiviselta puolelta lähestyttäessä) havaitaan teo- riassa äärettömän suuria virran arvoja

lim

t→0⁺id=∞.

Kronoamperogrammin alle jäävä pinta-ala antaa tietoa varauksen muutoksesta systeemissä. Kuten edellä todettiin kronoamperometriassa virtaa tarkastellaan ajan funktiona,i:=i(t). Toisaalta virta on määritelty varauksenQ ajallisena muutoksena jonkin pinnan läpi, eli

i(t) = dQ(t) dt .

Aikavälillä t∈[t₀, t_f] olevan funktion i(t) ja vakiofunktion i= 0 rajaama pinta-ala I on puolestaan muotoa

I =

tf

Z

t0

i(t)dt.

Koska virta on varauksen aikaderivaatta, saadaan pinta-alaksi

I =

tf

Z

t0

dQ(t) dt dt=

tf

Z

t0

dQ(t) =

tf

t0

Q(t) = Q(t_f)−Q(t₀) = ∆Q.

Kronoamperometrisen mittauksen pinta-ala kertoo näin ollen varausten määrän muu- toksesta tutkittavan aikavälin loppu- ja alkuhetken välillä. Tällöin funktion i(t) alle jäävän pinta-alan yksikkö on ampeerisekunti [A·s] eli coulombi [C], ja kronoampe- rometristen mittausten pinta-alojen tarkastelua voidaan kutsua coulometrisiksi mit-

tauksiksi.^[11]

Pinta-ala välillä [t₁, t_n] voidaan numeerisesti arvioida mittauksista esimerkiksi puolisuunnikassäännöllä (trapezoidal rule),^[16] jonka yhtälö on muotoa

∆Q=

tn

Z

t1

i(t)dt ≈

n−1

X

k=1

i(t_k+1) +i(t_k)

2 (t_k+1−t_k), (5)

missä n on mittauspisteiden lukumäärä, i mitatut virran arvot ja t niitä vastaavat ajanhetket. Puolisuunnikassääntöä voidaan pitää hyvänä arviona kuvauksen integraa- lille, kun kuvaus on riittävän sileä ja pisteitäk on riittävästi.^[16] Havainnollistus puo- lisuunnikassäännöstä on esitetty kuvassa 2.5.

Kuva 2.5: Kronoamperogrammin pinta-alan laskeminen puolisuunnikassäännöllä.

Mittauspisteiden välisten puolisuunnikkaiden (yksi esitetty punaisella) pinta-alat summataan yhteen.

2.4 Entsymaattisen tunnistuksen periaate

Jotta entsymaattisen sähkökemiallisen tunnistuksen periaate voidaan esitellä, on syy- tä ensin ymmärtää entsyymien ominaisuuksiin ja rakenteisiin liittyviä perusteita sekä termistöä. Entsyymit ovat noin 10-100 kilodaltonin kokoisia^[14] proteiinikomplekseja, jotka kykenevät suuresti laskemaan tiettyyn reaktioon tarvittavan energian määrää ja näin myös siihen kuluvaa aikaa.^[6] Entsyymit kykynevät siis toimimaan katalyytteinä jollekin reaktiolle.^[6]Katalysoidakseen jonkin muun molekyylinStoimintaa, entsyymi E sisältää kyseiselle molekyylille (esimerkiksi l-fukoosille) aktiivisen alueen, joka on komplementaarinen molekyylinStransitiotilalle,^[6] eli molekyylin substraattimuodon S ja reaktiotuotteen P välissä olevalle tilalle. Näin ollen entsyymin kolmiuloitteinen

rakenne on katalysoitavan reaktion kannalta erittäin tärkeä.^[14] Aktiivinen alue on pieni suhteessa entsyymin kokoon, mutta se on merkittävä entsymaattisten reaktioi- den kannalta.^[14] Entsymaattinen reaktio voidaan esittää muodossa^{[6, 14]}

E+S ^k1

k−1

ES ^k2

k−2

E+P,

missäE on entsyymi,S tutkittava aine (substraatti/analyytti),P reaktiotuote jaES entsyymi-substraatti -kompleksi. k₁, k_-1, k₂ ja k_-2 ovat reaktionopeusvakioita.^[6]

Tärkeä parametri entsyymireaktioissa on reaktion alkunopeus V₀ (M min⁻¹), eli nopeus, joka on reaktion alussa substraatin S pitoisuuden C_S ollessa likimain vakio.

Tämä alkunopeus riippuu ymmärrettävästi entsyymin pitoisuudesta ja substraatin pitoisuudesta. Kun entsyymin pitoisuus pidetään vakiona, voidaan alkunopeus V0

esittää substraatin pitoisuuden CS funktiona. Kun substraatin määrää kasvatetaan liuoksessa, havaitaan kuitenkin lopulta saturaatio, eli piste, jossa reaktion alkunopeus lähestyy asymptoottisesti reaktion maksiminopeutta V_max. Tämä on seurausta ES- kompleksien muodostumisesta. Koska entsyymin pitoisuusC_E oli vakioitu, vain tietty määrä komplekseja voi muodostua, vaikka substraatin pitoisuutta C_S kasvatetaan.

Tällöin V₀ lähestyy suurinta mahdollista arvoa V_max.^[6]

Reaktion alkunopeus V₀ (M min⁻¹) voidaan esittää Michaelis-Mentenin yhtälöllä, joka on yhden substraatin reaktiolle muotoa

V₀ = V_maxC_S K_m+C_S,

missä C_S on substraatin pitoisuus (mol l⁻¹), V_max on reaktion maksiminopeus ja K_m on Michaelisin vakio (mol l⁻¹).^{[6, 15]} Yhtälöstä nähdään, että alkunopeudenV₀ ollessa puolet maksiminopeudesta V_max, pätee Michaelisin vakiolleK_m =C_S.^[6]

Michaelisin vakion tulkinta riippuu tutkittavasta reaktiosta ja edelleen siinä ole- vien reaktioiden reaktionopeusvakioistak.^[6] Kun reaktionopeusvakiok_-2on häviävän pientä muihin reaktionopeusvakioihin nähden, on Michaelisin vakio¹ muotoa^{[6, 14]}

Km= k₂ +k_-1 k₁ .

Lisäksi jos k₂, eli reaktionopeusvakio, joka kuvaa entsyymikompleksin irtautumista entsyymiksi ja tuotteeksi P on häviävän pientä, on yhtälö muotoa

K_m= k_-1 k₁.

Tässä tilanteessa Michaelisin vakio tunnetaan myös dissosiaatiovakionaK_d.K_dilmai-

1Tunnetaan myös Michaelis-Mentenin vakiona.^[14]

see, kuinka paljon entsyymeistä ja substraateista kiinnittyy toisiinsa suhteessa siihen, miten paljon ne irtoavat takaisin entsyymiksi ja substraatiksi. Tällöin puhutaan myös substraatin ja entsyymin affiniteetista,^[6] eli kiinnitymiskyvystä. Huomioitavaa on, et- tä dissosiaatiovakio ei kaikissa tapauksissa tarkoita Michaelisin vakiota.^[6]

Entsyymit on luokiteltu niiden katalysoimien reaktioiden mukaan kuuteen pää- ryhmään; (1) oksidoreduktaaseihin, (2) transferaaseihin, (3) hydrolaaseihin, (4) ly- aaseihin, (5) isomeraaseihin ja (6) ligaaseihin.^[6] Näistä sähkökemiallisten menetel- mien tärkeimpänä mielenkiinnon kohteena voidaan nähdä ensimmäinen ryhmä, ok- sidoreduktaasit, jotka kykenevät hapettamaan tai pelkistämään jonkin molekyylin.

Oksidoreduktaasien alaryhmiä ovat esimerkiksi oksidaasit ja dehydrogenaasit. Näistä oksidaasit (Ox) katalysoivat redox-reaktioita, jotka sisältävät happea, eli^[14]

S+ O₂ ^Ox→P + H₂O₂,

missä lopputuotteen P lisäksi muodostuu vetyperoksidia (H₂O₂). Dehydrogenaasit (DH) katalysoivat puolestaan redox-reaktioita, jotka sisältävät nikotiiniamidiadenii- nidinukleotidia (NAD⁺). Tällöin

S+ NAD^{+ DH}→ P + NADH + H⁺,

missä S on substraatti, P reaktiotuote ja NADH nikotiiniamidiadeniinidinukleotidin pelkistynyt muoto (koentsyymi).^[14]S jaP eivät ole yleensä sähkökemiallisesti aktiivi- sia, minkä takia tarkastellaan edellä esiteltyjä pareja O₂/H₂O₂ja NAD⁺/NADH sekä niiden pitoisuuden kasvua tai laskua.^[14]NAD⁺/NADH -koentsyymin redox-potentiaali on 0.8 V vs. Ag/AgCl.^[14] l-fukoosin näkökulmasta olennaisempi esitetyistä entsy- maattisista reaktioista on dehydrogenaaseille tyypillinen reaktio NAD⁺-koentstyymin kanssa, sillä oksidaaseista, jotka reagoisivat l-fukoosin kanssa ei löydetty mainintaa kirjallisuudesta.

NAD⁺/NADH -koentsyymin sijasta on dehydrogenaaseille käytetty kofaktorina myös nikotiiniamidiadeniinidinukleotidifosfaattia (NADP⁺/NADPH).^[19] NAD⁺ tai NADP⁺ -koentsyymiä hyödyntäviä entsyymejä tunnetaan yli 200.^[6] Kun tarkoituk- sena on puhua yleisesti dehydrogenaaseille tyypillisistä koentsyymeistä eikä niinkään juuri niiden hapettuneesta tai pelkistyneestä muodosta, käytetään tässä tutkielmassa jatkossa merkintöjä NAD ja NADP. Lisäksi mikäli tarkoitetaan joko NAD tai NADP -koentsyymiä, käytetään merkintää NAD(P). Hapettuneiden koentsyymien tapauk- sessa käytetty yläindeksi (⁺) ei tarkoita koentsyymin kokonaisvarausta², vaan ky- seessä on tapa ilmaista aineen hapettunut muoto.^[6] Vastaavasti pelkistynyt muoto esitetään merkinnällä H, esimerkiksi NADPH.^[6]

2Molemmat näistä koentsyymeistä ovat positiivisesti kokonaisvarautuneita.^[6]