2.5 L -fukoosin entsymaattinen tunnistus
2.5.1 L-fukoosidehydrogenaasin kiinnitys elektrodin pinnalle
Tässä tutkielmassa on tähän asti esitelty entsymaattisia reaktioita keskittyen lähinnä teoriatasolla koentsyymin, entsyymin, analyytin ja mahdollisen mediaattorin välisiin reaktioihin. Entsyymi ja koentsyymi voidaan lisätä suoraan l-fukoosia sisältävään liuokseen, mutta diagnostiikan kannalta voi olla luontevampaa käyttää niin kutsut-tuja reagentittömiä (reagentless) sähkökemiallisia menetelmiä, eli menetelmiä, joissa tutkittavaan näytteeseen ei tarvitse enää analyysivaiheessa lisätä reagensseja, kuten entsyymiä tai koentsyymiä. Käytännössä siis reagentittömissä menetelmissä käyte-tään elektrodeja, joihin voidaan ilman esivalmisteluja lisätä näyte ja suorittaa
säh-4Kunl-FDH on eristetty eläimestä. Entsymaattinen reaktio on kuitenkin nopeampaal-fukoosin kuinl-galaktoosin kanssa.[18]
5Kunl-FDH on eristettyPseudomonas -suvun bakteereista.[18]
kökemiallinen mittaus. Suotavana voidaan pitää, että entsymaattinen reaktio tapah-tuisi mahdollisimman lähellä työelektrodia, jotta entsyymireaktiosta saatu varauksen siirto olisi heti rekisteröitävissä sähkökemiallisena vasteena. Tärkeänä tekijänä saata-vaan vasteeseen on siis näin ollen myös entsyymin kiinnitys elektrodin pinnalle siten, että analyytin tunnistus ilman (suuria) esivalmisteluja olisi mahdollista (pois lukien näytteenottamisesta ja sen lisäämisestä elektrodeille aiheutuvat esivalmistelut). Erää-nä jonkin asteisena ongelmana on myös, ettei kiinnitystyylejä ole varsinaisesti stan-dardisoitu johtuen ilmeisesti entsyymien välisistä eroista ja siitä, mitä kiinnityksellä varsinaisesti halutaan.[26] Tässä tutkielmassa esitetään kaksi erillistä kiinnitysmene-telmää, joita voidaan kuitenkin käyttää myös yhtäaikaa; entsyymin vangitseminen polymeeriin sekä entsyymin adsorptio työelektrodin pinnalle.
l-fukono-1,5-laktoni
Kuva 2.7: l-fukoosin ja l-fukoosidehydrogenaasin välillä tapahtuva entsymaattinen reaktio, kun NAD+ tai NADP+ on läsnä. Entsymaattisen reaktion tuotteena syntyy NAD(P)+ -koentsyymin pelkistynyt muoto NAD(P)H, joka reagoi elektrodissa ole-van Meldolan sinisen (MB) kanssa pelkistäen Meldolan sinisen (MBH) ja hapettuen itse takaisin NAD(P)+ -koentsyymiksi. Työelektrodin pohjamateriaalina toimii esi-merkiksi hiili, kuten DRP-610-elektrodin tapauksessa (DropSens, Oviedo, Espanja).
Kuva on tehty lähteiden[19, 21, 23] avulla.
H
Kuva 2.8: NADH:n sähkökemiallisessa tunnistuksessa ja kvantitoinnissa usein me-diaattorina käytettävän Meldolan sinisen (MB) rakenne. Kuva on tehty lähtei-den[14, 24, 38] avulla.
Kiinnitys adsorptiolla ja kuivaamalla
Adsorptiivisessa kiinnitysmenetelmässä on tarkoitus kiinnittää reagenssit löyhästi elektrodin pinnalle esimerkiksi kuivaamalla. Entsyymien adsorptiivisessa kiinnitykses-sä voidaan entsyymit ristisilloittaa likiinnitykses-säksi keskenään vähentäen niiden liikkuvuutta.
Tämän tarkoituksena on yhdistää entsyymejä esimerkiksi glutaraldehydin (GA) avul-la.[25, 26]Glutaraldehydin aikaansaamat ristisillat ovat muihin aldehydeihin verrattuna kemiallisesti ja erilaisissa lämpötiloissa tasapainoisempia.[25] Vaikka glutaraldehydin käyttö on yksinkertainen tapa entsyymin kiinnittämiseen, sitä käytettäessä on kuiten-kin huomioitava entsyymin ja glutaraldehydin pitoisuudet; jos molemmat pitoisuudet ovat liuoksessa vähäisiä, on todennäköisempää, että entsyymi ristisilloittuu itsensä kuin toisen entsyymimolekyylin kanssa.[25] Sisäinen ristisilloitus aiheuttaa entsyymin aktiivisuuden laskun substraatille.[26] Tämä voidaan nähdä ilmeisen vakavana eten-kin, kun entsyymin sisäinen ristisilloitus tapahtuu aktiivisella alueella tai mahdollises-sa Rossmann -laskoksesmahdollises-sa, jolloin substraatti tai koentsyymi ei kykene kiinnittymään entsyymiin. Liian suuren glutaraldehydipitoisuuden käyttö vaikuttaa puolestaan ent-syymin kiinnityksen sijasta havaittavaan entsyymiaktiivisuuteen; kun glutaraldehy-dia on paljon, tapahtuu myös ristisilloitusta enemmän.[25]Tällöin myös ristisilloitusta ilmenee tiheämmin, mikä voi vääristää entsyymin rakennetta etenkin sen aktiivisel-la alueelaktiivisel-la.[25] Glutaraldehydin aikaansaama entsyymin ristisilloittuminen on lisäksi pH-riippuvainen ja tämä sopiva pH-arvo riippuu puolestaan kiinnitettävästä entsyy-mistä/proteiinista.[25] GA reagoi neutraalissa pH:ssa aminohapporyhmien kanssa.[25]
Glutaraldehydi toimii hyvin lysiinipitoisten proteiinien (eli myös lysiinipitoisten ent-syymien) kanssa.[25] Mikäli lysiiniä on ristisilloitettavassa proteiinissa vähän, lysiini-pitoisen proteiinin, kuten naudan seerumialbumiinin (bovine serum albumin, BSA) li-säämistä on ehdotettu parantamaan glutaraldehydin ristisilloittavaa vaikutusta.[25, 36]
Myös glutaraldehydihöyryä voidaan käyttää ristisilloituksessa.[19, 36] Glutaraldehydia on käytetty esimerkiksi sellobioosidehydrogenaasin (CDH) kiinnitykseen.[27] Kyseises-sä tutkimuksessa CDH-liuos kuivattiin ensin työelektrodin pinnalle. Tämän jälkeen kuivuneen työelektrodin pinnalle lisättiin glutaraldehydi-liuos, joka ristisilloitti CDH-molekyylit toisiinsa sekä työelektrodin pinnalle. Tämän jälkeen elektrodi kuivattiin 4◦C lämpötilassa.[27] Menetelmässä on myös käytetty ristisilloittavana tekijänä glu-taraldehydin sijasta poly(etyleeniglykoli)diglysidyylia (PEGDE). PEGDE:lla saatiin parempia vasteita verrattuna glutaraldehydiin sellobioosidehydrogenaasilla, mutta se-kä GA että PEGDE -menetelmillä saatiin parempia tuloksia, kuin vain kuivaamalla CDH elektrodin pinnalle.[27] Kyseisessä menetelmässä NAD(P)-koentsyymin kiinni-tystä ei ole tehty, koska CDH ei käytä katalysoimassaan reaktiossa kyseistä koentsyy-miä.[27] Tämä on kuitenkin hyvä esimerkki menetelmän yksinkertaisuudesta. Moni-mutkaisempiakin menetelmiä on kuitenkin kehitetty. Esimerkiksi erilaisten
hiilinano-putkien käyttöä yhdessä Meldolan sinisen kanssa on tutkittu alustana analyyttien ent-syymaattiseen tunnistukseen.[22, 23] Näiden nanoputkien päälle on kiinnitetty entsyy-mi (laktaattidehydrogenaasi[22] tai alkoholidehydrogenaasi[23]) ja NAD+-koentsyymi glutaraldehydin avulla lisäämällä nämä MB-hiilinanoputki -ainekseen. Tämän jälkeen entsyymi-GA-MB-hiilinanoputki -aines on sekoitettu grafiittijauheeseen ja mineraa-liöljyyn, jolloin saatiin muodostettua tahnaa. Työelektrodi valmistettiin lisäämällä tahna ohuen lasiputken sisään.[22, 23] Näistä kahdesta toisistaan eroavasta esitetystä menetelmästä voidaan päätellä, että myös NAD(P)+-koentsyymin kiinnitys glutaral-dehydilla on ilmeisesti mahdollista.
Kiinnitys polymerisaatiolla
Siinä missä glutaraldehydin kanssa tehtävä entsyymikiinnitys tehdään ristisilloitta-malla entsyymejä käytännössä suoraan pintoihin (esimerkiksi työelektrodin pintaan) sekä toisiin entsyymi-molekyyleihin, entsyymin vangitseminen polymeereihin perus-tuu polymeerimatriisin muodostumiseen. Tämä matriisi puolestaan estää entsyymien liiallisen liikkumisen.[26]
Polymerisaatiossa useista monomeereistä muodostetaan pitkiä polymeeriketjuja kemiallisen tai sähkökemiallisen vuorovaikutuksen seurauksena tai esimerkiksi UV-valon vaikutuksesta.[26] Usein käytettyjä monomeereja ovat pyrroli, aniliini ja tiofee-ni,[28, 29] jotka (elektro)polymerisoituessaan muodostavat sähköisesti johtavan poly-pyrrolin, polyaniliinin ja polytiofeenin.[26] Nämä kolme polymeeria on esitetty niiden monomeerien avulla kuvassa 2.9. Tässä tutkielmassa keskitytään sähkökemialliseen polymerisointiin, koska siihen tarvittavat laitteet ovat sähkökemiallisen tunnistuksen myötä joka tapauksessa jo olemassa; esimerkiksi UV-valolla polymerisoituvat (foto-polymerisoituvat) monomeerit vaatisivat käytännössä lisäinvestointeja. Lisäksi koska tarkoituksena on kiinnittää entsyymi elektrodin pinnalle, keskitytään tästäkin syystä sähkökemialliseen polymerisaatioon sen soveltuessa pinnoitukseen; kemiallinen poly-merisaatio on hyödyllinen ennemmin suurten polymeerimäärien sekä nanopartikkelien tuotantoon.[28] Elektrodeja voidaan pinnoittaa myös valmista polymeeriä sisältävien liuosten avulla; näitä menetelmiä ovat esimerkiksi elektrodin upottaminen polymeeri-liuokseen (cast coating, spin coating, dip coating, electrodeposition[11]). Monomeereja hyödyntäviä polymerisointimenetelmiä ovat lämpöpolymerisaatio, sähkökemiallinen polymerisaatio, plasmapolymerisaatio ja foto(kemiallinen) polymerisaatio.[11]
Esitetyistä monomeereista aniliini vaatii protonipitoisen liuoksen polymerisaa-tioon, mikä puolestaan tarkoittaa käytettävän monomeeriliuoksen matalaa pH-arvoa, eli hapanta liuosta.[28, 29, 37] Tämä tekee aniliinin käytöstä biomolekyylien kiinnityk-sessä haastavaa, koska esimerkiksi entsyymit voivat denaturoitua matalan pH:n vai-kutuksesta.[30] Tästä huolimatta polyaniliinia on käytetty matriisina
ksantiinioksi-N
Kuva 2.9: Sähköä johtavien polymeerien rakenteita esitettynä monomeerien avulla.
(a) Polypyrroli (PPy). (b) Polyaniliini (PANI). (c) Polytiofeeni (PT). Kuvat on tehty lähteen[26] avulla.
daasille.[26] Tiofeeni puolestaan vaatii elektropolymerisaatioon suuren ylipotentiaa-lin,[28]minkä vuoksi sitä on käytetty harvemmin verrattuna esimerkiksi pyrroliin, jo-ta voidaan elektropolymerisoida majo-talammillakin potentiaaleilla.[26] Pyrroli on eräs käytetyimmistä monomeereista bioanalyyttisissä antureissa.[28] Merkittävä syy pyr-rolin suosioon on ilmeisesti sen bioyhteensopivuus;[26, 29] pyrroli voi polymerisoitua neutraalissa pH:ssa[26, 28] sekä lisäksi muodostaa sähkökemiallisesti polymerisoituna yhdenmukaisia kalvoja.[28] Koska polypyrroli on sähköisesti johtava polymeeri, myös paksujen kalvojen valmistus on mahdollista.[26]
Sähkökemiallisessa polymerisaatiossa (eli elektropolymerisaatiossa[26]) saadaan mo-nomeerien linkittyminen aikaan sähköisten vuorovaikutusten avulla. Yksinkertaisin menetelmä entsyymin kiinnittämiseen tällä menetelmällä on kiinnittää entsyymimo-lekyylit elektropolymerisaation yhteydessä muodostuvaan polymeeritukirankaan.[29]
Tässä menetelmässä sähkökemiallinen kenno lisätään liuokseen, joka sisältää entsyymi-ja monomeerimolekyylejä. Kun kennoon ajetaan sopiva potentiaali (tai virta) tapah-tuu monomeerien yhteenlinkittyminen (polymerisaatio) työelektrodin pinnalla.[26, 29]
Pyrroli voidaan elektropolymerisoida potentiostaattisesti mille tahansa johtavalle pin-nalle[28, 29] käyttämällä potentiaalina noin 0.8 V vs. SCE;[29] potentiaalin on oltava yli 0.6 V vs.SCE, mutta varsinainen tarkka potentiaalin arvo riippuu muun muassa elektrodin pintamateriaalista, -rakenteesta ja reaktio-olosuhteista.[30] Polymeerikal-von muodostuessa elektrodin pinnalle, jäävät pinnan läheisyydessä sijaitsevat entsyy-mimolekyylit muodostuvan polymeerikalvon sisälle,[29, 31] eikä kyseisessä reaktiossa muodostu esimerkiksi kovalenttisia sidoksia.[31] Myös proteiinin koolla on merkitystä sen kiinnittymisen kannalta; 128 kDa suuremmat proteiinit kiinnittyvät merkittävästi harvemmin ainakin polypyrroli-johdannaisilla.[31]
Polypyrrolikalvojen muodostuksessa elektrodimateriaaleina on käytetty esimer-kiksi platinaa (0.61 V vs. Ag/AgCl, 0.66 V vs. Ag/AgCl, 0.65 V vs. SCE, 0.8 V vs.
SCE)[30] ja hiilipaperia (0.7 V vs. SCE).[35] Suluissa esitetyt arvot ovat tutkimuksis-sa elektropolymerisointiin käytettyjä potentiaaleja. Koska SCE vs. Ag/AgCl on 45
mV6, on SCE suhteen esitettyihin arvoihin lisättävä 0.045 V, jotta ne voidaan esittää hopea/hopeakloridi -elektrodin avulla. Näistä voidaan päätellä, että sopivaksi poten-tiaaliksi voidaan valita jokin potentiaali välillä 0.645 - 0.8 Vvs. Ag/AgCl (alaraja on aiemmin esitetty 0.6 V vs. SCE, eli 0.645 vs. Ag/AgCl) ja käyttää kyseistä potenti-aalia kaikissa elektropolymerisoinnilla tehtävissä pinnoituksissa.
Käytännössä monomeerin elektropolymerisaatio voidaan tehdä potentiostaattises-ti (vakioidulla potenpotentiostaattises-tiaalilla),[28, 30] syklisellä voltammetrialla,[28, 30, 37] pulssitetuilla tekniikoilla[28] tai galvanostaattisesti (vakioidulla virralla tai virran tiheydellä).[28]
Näistä mielekkäimpinä voidaan pitää kiinnitetyn potentiaalin menetelmää ja puls-sitettuja menetelmiä; vakioidulla potentiaalilla muodostuvan polymeerikalvon pak-suutta ja morfologiaa on helppo hallita.[30] Pulssitetuilla tekniikoilla voidaan polyme-risaatio lisäksi aloittaa korkeammilla potentiaaleilla (yli 0.6 Vvs. SCE), jonka jälkeen potentiaali siirretään pienemmälle vakiopotentiaalille entsyymin varsinaista kiinnitys-tä varten.[28] Huomioitavaa on, että elektropolymerisoinnin yhteydessä kiinni jäävän entsyymin määrää on vaikea arvioida[26] ja analyytin kvantitointivaiheessa voi po-lymeeriverkon sisälle pääsevän analyytin pitoisuus olla merkittävästi erilainen kuin alkuperäisen näyteliuoksen analyytin pitoisuus.[30] Eräs tapa arvioida kiinnittyvän entsyymin määrää, on määrittää polymerisaatiossa käytetyn liuoksen absorbanssit spektrofotometrisesti (entsyymille sopivalla aallonpituudella) ennen elektropolymeri-saatiota ja sen jälkeen.[31]Polymeerikalvon muodostumiseen vaikuttavat potentiaalin lisäksi pinnoitusnopeus, käytössä oleva elektrodi, liuoksessa olevat ionit ja liuoksen pH.[30] Polymerisaatioajan vaikutus PATP -polymeerikalvon paksuuteen on esitetty kuvassa 2.10. Esimerkiksi Pkalvoille vastaavaa kuvaajaa ei löytynyt, mutta Py-monomeerista ja sen johdannaisesta (5% Py-COOH) polymerisoidun kalvon paksuu-deksi on mitattu 9µm (needle-touch type thickness meter).[38]PPy-PPy-COOH -kalvo oli muodostettu potentiostaattisesti 1.2 Vvs. SCE -potentiaalilla, jota oli pidetty yl-lä niin kauan, että mitattu virrantiheys saavutti 240 mC·cm−2.[38] Paksuja kalvoja valmistettaessa on syytä huomioida, että analyytin tunnistusvaiheessa sähkökemialli-set vasteet saattavat olla matalampia kuin ohuemmilla kalvoilla, koska osa reaktiosta tapahtuu kaukana elektrodista (polymeeri-näyteliuos -rajapinnalla).[30] Lisäksi diag-nostisesta näkökulmasta paksujen kalvojen valmistukseen tarvitaan suurempi määrä entsyymiä ja näin myös polymerisaatiosta jäljelle jäävä hukkatilavuus on suurempi.[29]
Yhden-askeleen -menetelmään (eli entsyymi-monomeeriliuoksen elektropolymerisoin-tiin) tarvitaan noin 0.05 - 0.5 M monomeeria ja 0.2 - 3.5 mg/ml entsyymiä,[26] mutta esimerkiksi alkoholidehydrogenaasia on käytetty polypyrroliin kiinnitettynä myös
jo-6Kun kyllästetyn kalomelielektrodin (SCE) ja hopea/hopeakloridielektrodin (Ag/AgCl) poten-tiaaleja verrataan normaaliin vetyelektrodiin (NHE), on SCE:n potentiaali 0.242 V vs. NHE ja Ag/AgCl:n 0.197 V vs. NHE.[11] Tällöin VSCE - VAg/AgCl vs. NHE = 0.045 V, joka käytännössä vastaa merkintää "SCE vs. Ag/AgCl".
pa 15 mg/ml.[30] Polypyrrolikalvoihin kiinnitettyjen entsyymien entsyymiaktiivisuuk-sina on käytetty glukoosidehydrogenaasille (EC 1.1.1.47) 10 U/ml ja glutamaattide-hydrogenaasille (EC 1.4.1.3) 60 U/ml.[30] Vaihtelevuutta käytetyissä entsyymiaktii-visuuksissa ja -pitoisuuksissa on siis suuresti tutkimusten välillä.
t [min]
d [nm]
0 2 4 6 8
0 30 60 90 120
Kuva 2.10: Esimerkki elektropolymerisaatioajan t vaikutuksesta polymeerikalvon (PATP) paksuuteen d. Elektropolymerisaatio on tehty galvanostaattisesti (0.3 mA cm−2) alumiinin pinnalle 10◦C lämpötilassa. Polymerisaatioliuoksena on käytetty 1 mM ATP ja 150 mM NaNO2.[32] Paksuus on määritetty M-150i ellipsometrillä (Jasco Inc, Japani). Kuvaaja on muokattu lähteestä[32].
Pyrrolin elektropolymerisaatiossa pyrroli-monomeeri ensin hapettuu pyrroli -radi-kaaliksi. Tämän jälkeen kaksi radikalisoitunutta pyrroli-monomeeriä reagoi toistensa kanssa muodostaen dimeerin vapauttaen lisäksi ympäröivään liuokseen kaksi proto-nia.[13, 26, 30] Reaktio voi tapahtua myös radikalisoituneen monomeerin ja neutraalin monomeerin välillä.[26] Tämä reaktio jatkuu niin kauan kuin monomeerejä on jäljel-lä ja olosuhteet ovat reaktiolle suotuisat.[30] Koska reaktiossa muodostuu protoneja, muuttuu tällöin myös (puskuroimattoman) liuoksen pH matalammaksi.[28, 30] Täs-tä syysTäs-tä liuoksen puskuroiminen mukanaolevalle entsyymille suotuisaksi on eritTäs-täin varteenotettavaa entsyymin denaturoitumisen välttämiseksi. Myös polymerisaatiolle suotuisat reaktio-olosuhteet, kuten pH, on huomioitava.
Koska tässä tutkielmassa käytetään NAD(P)-riippuvaista dehydrogenaasi -entsyy-miä, on myös tämän koentsyymin kiinnitys huomioitava. NAD(P)-koentsyymin tulisi diffundoitua vapaasti entsyymin koentsyymiä sitovalle alueelle, mutta olla kuiten-kin kiinni polymeerin sisällä siten, että se ei huuhtoudu pois näytettä vaihdettaes-sa (mikäli elektrodia halutaan käyttää uudelleen ilman suurempia esivalmisteluja).
NAD(P) voidaan lisätä (i) tutkittavaan liuokseen (tällöin kyseessä ei ole enää rea-gentitön tunnistus), (ii) polymeerin sisälle samaan aikaan kuin entsyymi tai (iii) elektrodin pinnalle kiinnitettävään grafiittitahnaan (hiilitahnaan[33]).[28] Hiilitahnan
hyvänä puolena voidaan pitää sen valmistuksen yksinkertaisuutta; ainekset (entsyymi, NADP, grafiittijauhe ja parafiiniöljy) lisätään ja sekoitetaan homogeeniseksi tahnak-si.[33] Periaatteessa kyseinen järjestelmä ei ole (hieman myös tarkasta määritelmästä riippuen) reagentitön, koska se kontaminoi tutkittavan näyteliuoksen. Tällä ei kui-tenkaan ole suurta merkitystä kyseisen tutkimuksen kannalta. Koentsyymin pelkis-tynyt muoto (NADH) ja sitä hyödyntävä nitraattireduktaasi -entsyymi on onnistut-tu kiinnittämään polypyrrolikalvoon,[26] mikä ainakin osin osoittaa koentsyyminkin immobilisaation olevan mahdollista ja näin koentsyymin hapettunut muoto voi olla mahdollista kiinnittää riittävästi polymeeritukirankaan. Tietysti esimerkiksi grafiitti-tahnan käyttö koentsyymin kiinnitykseen voi olla varteenotettavaa, mutta varmuutta ei kuitenkaan ole siitä, onnistuuko koentsyymin diffuusio polymeerikalvoon entsyy-min luokse tällä menetelmällä. NAD(P) -pitoisuuksina on käytetty polypyrrolikalvoja hyödyntävissä menetelmissä 0.1 mM NAD+ (glukoosidehydrogenaasi), 3 mM NADP (glutamaattidehydrogenaasi), 25 mM NADH (alkoholidehydrogenaasi)[30] ja 0.3 mM NADH (nitraattireduktaasi).[34] NAD(P)-pitoisuus on siis elektropolymerisaatiossa myös erittäin vaihteleva.
Elektropolymerisaation jälkeen polymeeri-entsyymi-elektrodia ei voida välttämät-tä käytvälttämät-tää välittömästi analyytin sähkökemialliseen kvantitointiin; muodostetun kal-von paksuudesta riippuen on odotettava 15-30 tuntia.[28] Tämä perustuu polymeri-saatiossa ilmenevään verkoston turpoamiseen; liian tiiviissä polymeerikalvossa ent-syymi ei ole välttämättä heti polymerisaation päätyttyä natiivikonfiguraatiossa.[28]
Jopa vain 55 nm paksuja entsyymi-polypyrrolikalvoja on pystytty valmistamaan.[29]
Kuten aiemmin esitettiin, on vakioidun potentiaalin menetelmissä yli 0.6 V vs.
SCE lisäksi säädettävinä parametreina mm. pinnoitusnopeus eli käytännössä aika, jota potentiaalia pidetään yllä. Polymerisaatioajan voidaan nähdä riippuvan kiin-nitettävästä entsyymistä sekä polymerisaatiomenetelmästä; potentiostaattiseen eta-nolidehydrogenaasin kiinnitykseen on optimaaliseksi ajaksi havaittu 7 minuuttia,[35]
kun taas nitraattireduktaasin galvanostaattiseen kiinnitykseen polymerisaatioaikana on käytetty 4 minuuttia.[34] Etanolidehydrogenaasin ja polypyrrolin elektropolyme-risaatiossa on käytetty vakioituna potentiaalina 0.7 V vs. SCE. Elektropolymerisoi-tavan liuoksen monomeeripitoisuus oli 0.1 M,[35] joka on suhteellisen yleinen mono-meeripitoisuus,[29, 30, 34] vaikkakin myös esimerkiksi 0.05 M pyrrolipitoisuutta on käy-tetty.[29] Samassa tutkimuksessa on entsyymi ristisilloitettu polymerisaation jälkeen polymeerimatriisi-elektrodin pinnalle 1% glutaraldehydi -liuoksella. Entsyymiä ei siis ole välttämätöntä lisätä polymerisaatioliuokseen, vaan se voidaan lisätä jo muodostu-neen polymeerikalvon päälle joko kemiallisesti[28, 35]tai sähkökemiallisesti.[28]Jos bio-molekyyli voi laukaista polymerisaation, voidaan tämän biobio-molekyylin kiinnitys teh-dä myös niin kutsutulla itsekiinnityksellä (self entrapment).[28] Näiden menetelmien
lisäksi entsyymi voidaan todennäköisesti myös adsorboida elektrodin pinnalle ennen polymerisaatioliuoksen lisäystä ja polymerisaation käynnistystä. Polymerisaation jäl-keen elektrodien säilytys on myös otettava huomioon. Esimerkiksi pyrrolijohdannai-silla ja erilaipyrrolijohdannai-silla entsyymeillä pinnoitetun elektrodin stabiilisuus säilyi vähintään 15 päivää, kun elektrodit säilytettiin kuivassa ja kylmässä -18◦C.[31]
Kuten aiemmin todettiin, fyysisesti lähellä olevat biomolekyylit kiinnittyvät muo-dostuvan polymeerikalvon sisälle. Entsyymin kiinnittymistä voivat voimistaa lisäksi polymeerimatriisin (positiivisesti varautunut polykationi) ja entsyymin (negatiivinen varaus) välinen sähköstaattinen vuorovaikutus;[29] mikäli polymerisaatioon käytettä-vän liuoksen pH on suurempi kuin entsyymin isoelektrisen pisteen arvo, on entsyymi negatiivisesti varautunut.[29, 30]Tällä hetkellä ei ole tietoa käytössä olevan entsyymin (l-fukoosidehydrogenaasin) isoelektrisestä pisteestä (pI), mutta esimerkiksi glukoo-sioksidaasin (Aspergillus niger) pI on pH-arvossa 4.2.[30] Tällöin tätä suuremmilla pH-arvoilla siirtyvät kalvon lähellä olevat entsyymimolekyylit sähköstaattisten vuo-rovaikutusten seurauksena osaksi polymeeriverkostoa. Kun käytetään lähteessä[47] an-nettua L-fukoosidehydrogenaasin käsittelemätöntä aminohapposekvenssiä lähteen[48]
pI-laskurissa, saadaan l-FDH -entsyymin teoreettiseksi pI-arvoksi 4.83. Laskurin[49]
mukaan teoreettinen pI-arvo on 4.53. Ero näissä johtunee käytettyjen algoritmien vä-lisistä eroista. Näin ollen tätä pH-arvoa suuremmilla arvoilla saadaan polymerisaation yhteydessä hyödynnettyä myös muodostuvan polymeerin ja entsyymin väliset sähkö-staattiset vuorovaikutusmahdollisuudet. Huomioitavaa on, että tutkimuksen käytössä ei ole välttämättä sama isoentsyymimuoto kuin lähteessä[47]esitetty; on erittäin mah-dollista, että käytössä oleva entsyymi on esimerkiksi eri organismista kuin lähteen[47]
dehydrogenaasi, mikä aiheuttaa eroja aminohapposekvenssien välillä. pI-arvon mää-rityksessä käytetynl-fukoosidehydrogenaasin signaalijakson pituutta ei ole määritet-ty,[47] mikä puolestaan tarkoittaa, että nyt myös signaalijakso vaikuttaa saatuun tu-lokseen, vaikkei se valmiissa entsyymimolekyylissä olekaan mukana. Jos ensimmäiset 20 aminohappoa jätetään pois, on pI-arvo tällöin 4.87. Vastaavasti jos ensimmäiset 60 aminohappoa puuttuu sekvenssistä, on pI-arvo 5.01. Glukoosioksidaasin (Aspergillus niger) signaalipeptidi on 22 aminohappoa pitkä.[50] Tämä huomioiden, on glukoo-sioksidaasin pI-arvo 4.94, mikä on lievästi suurempi kuin lähteessä[30] esitetty arvo.
Entsyymin isoelektrisen pisteen suuruus ei kuitenkaan välttämättä ole täydellinen este entsyymin kiinnityksen onnistumiselle. Esimerkiksi 80-92 % "polymerisaatioliu-oksen" galaktoosioksidaasi -molekyyleistä (pI = 12[31]) on onnistuttu kiinnittämään pyrrolista ja sen johdannaisista muodostuvaan matriisiin, kun pH on 7.[31]