fukoosin entsymaattinen määritys sylkinäytteistä

Koska erilaisilla pinnoitusmenetelmillä ei saatu merkittäviä l-fukoosin entsymaatti-sesta reaktiosta aiheutuvia huippuja, tutkittiin HNSCC -potilaiden ja ikä- ja suku-puolisovitetun vertailuryhmän sylkinäytteitä sekoittamalla niihin entsyymi ja koent-syymi. Vaikka tämä menetelmä ei olekaan ihanteellisin verrattuna etenkin reagen-tittömiin menetelmiin (kuten juuri l-FDH-NADP⁺-PPy -elektrodit), on se vartee-notettava menetelmä sähkökemiallisten mittaustekniikoiden vahvuuksien vertaami-seen nykyisin laajalti käytössä oleviin menetelmiin, kuten NMR -tekniikkaan. Tässä tutkimuksen vaiheessa päädyttiin muodostamaan sylkinäytteille kalibraatiokuvaajat puskuroimattomilla liuoksilla, jotta mahdollisten sylkinäytteisiin lisättävien reagens-sien määrää saatiin vähennettyä ja yksinkertaistettua. Myös ilman puskuria saatiin reaktioliuoksilla erittäin lineaarinen kalibraatiokuvaaja 4.15. Reaktioliuoksilla saadut kronoamperogrammit (kuvat 4.3, 4.4 ja 4.14) osoittavat myös teorialuvussa esitetyn potentiaaliaskeleesta (eli potentiaalin muutoksesta) aiheutuvan kapasitiivisen virran;

koska 0.0 mMl-fukoosipitoisuudella ei tulisi nähdä ajasta riippuvaa virran arvon las-kua, voidaan olettaa, että näiden kronoamperogrammien virta aikavälillä t ∈ [0,2] s on seurausta juurikin kapasitiivisesta virrasta. Tämä kapasitiivisen virran merkittä-vä lasku ensimmäisillä sekunneilla on eräs syistä, minkä vuoksi kaikki tutkimuksessa esitetyt kalibraatiokuvaajat muodostettiin 5 sekunnin kohdalta.

Vaikka reaktioliuoksilla havaitaanl-fukoosin,l-fukoosidehydrogenaasin ja NADP⁺ -koentsyymin välisestä reaktiosta muodostuvan pelkistyneen NADPH-koentsyymistä aiheutuva vaste, on ongelmana virtahuipun sijainti potentiaaliakselilla. Koska huip-pu havaitaan suurella ylipotentiaalilla, olisi tämän madaltaminen suositeltavaa, jotta tunnistusta voitaisiin tehdä pienilläkin pitoisuuksilla; tällä potentiaalilla nouseva vir-ran tausta-arvo voinee aiheuttaa suurtakin virtaa analyytin läsnäolosta riippumatta.

Lisäksi suuren yli-potentiaalin käyttö saa todennäköisesti aikaan redox-aktiivisella hiilityöelektrodilla myös syljen muiden ainesosien redox-reaktioita.

Vaikka reaktioliuosten käyttö vaatiikin esivalmisteluja (NADP⁺ ja entsyymiliu-oksen lisäyksen) voidaan sen tutkimista pitää varteenotettavana saatujen l-fukoosia sisältävien vesiliuosten (kuva 4.14) kronoamperogrammien pohjalta. Lisäksi kuvan 4.13 voltammogrammissa havaittu huippu l-fukoosiliuoksella osoittaa menetelmän selektiivisyyden. Näistä positiivisista havainnoista huolimatta sylkinäytteet osoittau-tuivat kuitenkin erittäin haastaviksi; suurta korrelaatiota ei NMR-tekniikan ja sähkö-kemiallisten menetelmien välillä havaita (kuvassa 4.16) ja entsymaattisella menetel-mällä ei havaita samoja pitoisuuksia kuin NMR-tekniikalla. Lisäksi syljen sisältämät muut ainesosat voivat vaikeuttaa tulosten tulkintaa sähkökemiallisilla menetelmil-lä. Koska jokainen sylkinäyte sisältää vaihtelevan l-fukoosipitoisuuden lisäksi vaih-televan pitoisuuden kaikkia muita aineita, voi l-fukoosin tunnistus ja määritys olla tästäkin syystä haastavaa. Vaikkei l-fukoosidehydrogenaasin pitäisi vuorovaikuttaa muiden syljessä esiintyvien aineiden kanssa, voivat ne silti häiritä NADPH:n tunnis-tusta ja hapettumista takaisin NADP⁺-koentsyymiksi. Myöskään syljen sisältämästä NADPH-pitoisuudesta ei ole tässä vaiheessa tietoa. Lisäksi huomioitavaa on, ettei käy-tetty kalibraatiokuvaajakaan anna täysin todenmukaista kuvaa virran ja pitoisuuden suhteesta, koska liuos sisälsi l-fukoosin lisäksi vain ionisoimatonta vettä. Tästä syys-tä sylkeä enemmän muistuttavien kalibraatioliuosten käyttö on jatkossa suositelta-vaa. Myös esimerkiksi sylkinäytteeseen lisättävien tunnettujenl-fukoosipitoisuuksien käyttö ja tunnistus voi olla varteenotettavaa kalibraatiokuvaajia tehtäessä. Lisäksi on todennäköistä, että syljen pH vaihtelee henkilöiden välillä, etenkin suusyöpäpotilai-den tapauksessa. Sylkinäytteisuusyöpäpotilai-den pH-arvoja ei kuitenkaan määritetty niisuusyöpäpotilai-den pienten näytetilavuuksien vuoksi. Kuten kuvasta 4.16 nähdään, saadaan työssä käytetyllä ka-libraatiokuvaajalla pääsääntöisesti suurempia pitoisuuksia verrattuna NMR-tekniikan tuloksiin; esimerkiksi NMR-tekniikalla määritetyn sylkinäytteenl-fukoosipitoisuuden

ollessa noin 700 µM, on työssä määritetty pitoisuus noin 1600 µM. Kuten taulukosta 4.2 havaitaan, jokainen työssä määritetty pitoisuus on suurempi kuin NMR-tekniikan vastaava tulos. Valitettavaa on myös, että NMR-tekniikalla ja kronoamperometrialla määritettyjen l-fukoosipitoisuuksien välinen korrelaatio on heikko. Koska tutkimuk-sessa käytetyt sylkinäytteet olivat suhteellisen vanhoja ja NMR-analyysi oli tehty yli neljä vuotta sitten, voi jatkossa olla mielekästä mitata samanaikaisesti sylkinäyttei-denl-fukoosipitoisuudet jollakin referenssimenetelmällä (esimerkiksi spektrofotomet-rillä), jotta pitoisuuksien oikeellisuudesta on selvempää näyttöä. Myös tuoreempien sylkinäytteiden käyttö voi olla perusteltua. Lisäksi tässä tutkimuksessa käytettyjen sylkinäytteiden määrä on vähäinen, mikä puolestaan voi vaikuttaa osaltaan havait-tavaan korrelaatiokuvaajaan. Otannan kasvattaminen voisi myös olla jatkossa mah-dollista. Vaikkei sylkinäytteiden sähkökemiallisesti määritettyjäl-fukoosipitoisuuksia voitu yhdistää aiemmin NMR-tekniikalla määritettyihin pitoisuuksiin, voidaan säh-kökemialliset menetelmät nähdä tulevaisuudessa merkittävinä. Näytetilavuudet on osoitettu tässäkin tutkielmassa jo varsin pieniksi sähkökemiallisia vasteita mitattessa;

sylkeä tarvittiin vain 37.5µl, mikä on alle kymmenesosa NMR-tekniikan vaatimuksiin nähden. Lisäksi koska HNSCC-potilaiden syljen eritys on ainakin osin madaltunut,^[3]

ei sylkeä välttämättä saada NMR-tekniikalle riittävästi. Pienemmät näytetilavuudet ovat toisaalta juurikin sähkökemiallisille menetelmillä sopivia. Tästä syystä jatkossa pienten stimuloimattomien sylkinäytetilavuuksien kerääminen ja analysointi voi ol-la luotettavasti mahdollista suuremmalol-lakin otannalol-la etenkin, kun syljessä olevien muiden aineiden mahdolliset häiriöt saadaan minimoitua.

Tutkielmassa esitettyihin tuloksiin nojaten, voidaan sähkökemiallisia mittaustek-niikoita käyttää jatkokehityksen jälkeen vierianalytiikassa ja myös pienten näytetila-vuuksien ansiosta etenkin hyposalivaatiosta kärsivien potilaiden sylkinäytteiden ana-lysoinnissa, vaikkakin tällä hetkellä syljen muiden ainesosien aiheuttamat häiriöt ja mahdollinen pH-vaihtelu näyttävät vaikuttavan tuloksiin. Jatkossa erilaisten pinta-materiaalien ja -morfologioiden tutkiminen on erittäin varteenotettavaa, jotta työssä käytetty suuri ylipotentiaali (kaikissa kronoamperometrisissa mittauksissa yli 0.5 V vs. RE) saadaan laskettua ihanteellisemmalle tasolle lähelle nollapotentiaalia. Mor-fologian parantaminen esimerkiksi nanopartikkelipinnoitteilla lisäisi aktiivista pinta-alaa ja näin siis myös elektronin siirrosta vastaavaa pinta-pinta-alaa tekemättä silkkipainet-tujen elektrodien ulkomitoista suurempia. Näin myös menetelmät säilyvät varmem-min kannettavina ja valmistuskustannukset pysyvät järkevinä. Jatkokehityskohtei-na ovat redox-potentiaalin laskun lisäksi, erilaisten kiinnitysmenetelmien tutkiminen, mukaan lukien adsorption, ristisilloituksen ja polymerisoinnin yhdistäminen yhdek-si pinnoitusmenetelmäkyhdek-si. Nämä kaikki edesauttavat menetelmän kliinisempää käyt-töä tulevaisuudessa ja esimerkiksi riskiryhmiin kuuluvien henkilöiden seulontaa sekä

hoidonaikaista ja -jälkeistä seurantaa. Pinnoitustekniikoista ja mittausmenetelmistä saatiin myös merkittävää käytännönosaamista bioanturien valmistukseen, jota voi-daan myös hyödyntää tulevaisuudessa erilaisten anturiratkaisujen suunnittelussa ja toteutuksessa.