Digitalis lanata -solujen kasvatus suspensioviljelmänä

TAINA IDMAN

DIGITALIS LANATA -SOLUJEN KASVATUS SUSPENSIOVILJELMÄNÄ

Diplomityö, joka on jätetty opinnäytteenä tarkastettavaksi diplomi-insinöörin

tutkintoa varten Espoossa /$,%■ !9%3.

Työn valvoja:

Vs. professori Pertti Markkanen

Tämä diplomityö on tehty syksyn -82 ja kevään -83 aikana Teknillisen Korkeakoulun kemian osastolla biokemian ja elintarviketeknologian laboratoriossa. Kiitän työni valvojaa ja ohjaajaa vs. professori Markkasta hyvästä ohjauksesta ja kiinnostuksesta työtäni kohtaan ja kasvi- solutyöryhmää antoisasta yhteistyöstä ja kaikista saamis­

tani neuvoista ja avusta. Kiitän myös OY STAR AB :tä

taloudellisesta tuesta ja Anssi Talarmoa valokuvista sekä perhettäni kärsivällisyydestä.

Taina Idman

Tekijä ja työn nimi :

Taina Idman

Digitalis lanata -solujen kasvatus suspensioviljelmänä

Päivämäärä: /5.&- Sivumäärä: 89

Osasto : Professuuri :

Kemian osasto 5.30 Biokemia

Työn valvoja :

Vs. professori Pertti Markkanen

Työn ohjaaja :

Tutkittiin Digitalis lanata -solujen kasvatusta suspensio- viljelmänä eri tyyppisillä fermentoreilla. Soluja kasva­

tettiin sekä mekaanisesti sekoitetuissa että airlift- tyyppisissä fermentoreissa. Huomiota kiinnitettiin eri­

tyisesti fermentoreiden sekoitusominaisuuksiin. Kasvun kannalta parhaaksi fermentoriksi havaittiin airlift-tyyp- pinen Kluyver-kolvi. Suurin digoksiini- ja digitoksiini- ekvivalenttipitoisuus havaittiin mekaanisesti sekoite­

tussa fermentorissa kasvaneissa soluissa.

Tutkittiin myös siirrosteen koon ja gibberelliinihapon vaikutusta solukasvuun sekä solukasaumien pienentämistä.

Siirrosteen koon havaittiin vaikuttavan kasvun lag-vaiheen pituuteen merkittävästi. Gibberelliinihapon todettiin nopeuttavan kasvua ja lisäävän solusaantoja sekä solujen digoksiini- ja digitoksiiniekvivalenttipitoisuuksia.

Kirjallisuustutkimus käsittelee kasvisolujen kasvatusta yleisesti ja fermentorikasvatusten kannalta. Erilaisten fermentorien sopivuutta kasvisolukasvatuksiin on paino­

tettu.

JOHDANTO 1 KIRJALLISUUSOSA

KASVISOLUJEN KASVATTAMINEN SUSPENSIOVILJELMÄNÄ

1. YLEISTÄ 2

2. KASVISOLUJEN FYSIOLOGIASTA JA RAKENTEESTA 6 3. KASVISOLUVILJELMIEN KEMIALLISET JA FYSIKAALISET

KASVUVAATIMUKSET 7

3.1. Ravintoalustan koostumus 7

3.1.1. Epäorgaaniset suolat 8 3.1.2. Hiilen ja energian lähde 9

3.1.3. Vitamiinit 10

3.1.4. Kasvihormonit 11

3.1.5. Orgaaninen typpi 12

3.1.6. Muut orgaaniset lisäaineet 13

3.1.7. Antibiootit 13

3.1.8. Kasvisoluviljelmissä tavallisimmin

käytetyt ravintoalustat 13

3.2. Ravintoalustan pH 14

3.3. Kasvatuslämpötila 14

3.4. Valon vaikutus solukasvuun ja sekundääris­

ten metaboliatuotteiden muodostumiseen 14 3.5. Siirrosteen koon vaikutus solukasvuun 15 3.6. Ilmastuksen vaikutus solukasvuun 15 4. KASVISOLUJEN ERIKOISTUMISEN VAIKUTUS METABOLIA-

TUOTTEIDEN MUODOSTUMISEEN 17

5. FERMENTORIN VALINTA SOLUSUSPENSIOKASVATUKSIIN 18 5.1. Kasvisolu-fermentorien yleiset vaatimukset 18 5.2. Kasvisolukasvatuksissa käytettyjä

fermentoreita 19

5.2.1. Panoskasvatuksiin käytettyjä

fermentoreita 1 9

5.2.3. Kasvisolukasvatuksissa käytettyjen

fermentoreiden vertailu 35 6. KASVUN MITTAAMINEN SUSPENSIOKASVATUKSISTA 37

6.1. Solujen laskeminen 37

6.2. Solumassan tilavuuden määritys 38 6.3. Solumassan kuivapainon määritys 38

6.4. Mitoottinen indeksi . 38

6.5. Solujen kokonaisproteiinimäärä 39

6.6. Soluhengitys 39

6.7. Muut menetelmät 40

7. DIGITALIS-SUVUN KASVEISTA SAATAVAT TUOTTEET 40

7.1. Sydänglykosidit 40

7.2. Sydänglykosidien markkinat 43 7.3. Digitalis-soluviljelmien tuotteiden

analysointi 44

7.3.1. Radioimmunologinen analyysi (RIA) 44 7.3.2. Ohutlevykromatografia 45 7.3.3. Korkeapaine-nestekromatografia (HPLC) 45 KOKEELLINEN OSA

MATERIAALIT JA MENETELMÄT

1. KÄYTETYT RAVINTOALUSTAT 46

2. KÄYTETTY DIGITALIS LANATA -SOLUKANTA 48

3. KASVUN MÄÄRITYSMENETELMÄT 49

3.1. Solujen märkäpainon määrittäminen 49 3.2. Solujen kuivapainon määrittäminen 49 3.3. Kasvuliuoksen sakkaroosipitoisuuden

määrittäminen 50

4. DIGITALIS-KARDENOLIDIEN MÄÄRITTÄMINEN 52 4.1. Solunäytteiden mekaaninen käsittely ennen

määritystä 52

4.2. Tuotteen uutto solunäytteistä 52 4.3. Digoksiinipitoisuuden radioimmunologinen

määrittäminen 52

5. SIIRROSTUS 53 5.1. Siirrosteen painon määrittäminen 53

6. NÄYTTEENOTTO KASVATUKSISTA 54

6.1. Liuosnäytteet 54

6.2. Solunäytteet 54

KASVATUKSET

1. MEKAANISESTI SEKOITETUT KASVATUKSET 56

2. AIRLIFT-TYYPPISET KASVATUKSET 61

2.1. Kasvatukset Kluyver-kolveissa 61 2.2. Kasvatukset sylinterifermentoreissa 65 2.3. Putkimainen lasista valmistettu fermentori 68 3. KASVUNSEURANTAKOE RAVISTELUPULLOISSA 70

4. KASVATUSTEN KONTAMINOITUMINEN 72

5. SOLUKASAUMIEN PIENENTÄMINEN 72

5.1. Solukasaumien mekaaninen pienentäminen 73 5.2. Solukasaumien pienentäminen hiivauutteen

avulla 73

TULOSTEN TARKASTELUA

1. YHTEENVETO TULOKSISTA 74

2. MEKAANISESTI SEKOITETUT KASVATUKSET 74

3. AIRLIFT-TYYPPISET KASVATUKSET 76

3.1. Kasvatukset Kluyver-kolveissa 76 3.2. Kasvatukset sylinterifermentoreissa 76 4. pH JA SAKKAROOSIPITOISUUDET KASVATUKSISSA 77 5. TULOSTEN VERTAILU KIRJALLISUUDEN TULOKSIIN 78 YHTEENVETO JA JATKOTUTKIMUSEHDOTUKSET 79

KIRJALLISUUSLUETTELO 81

JOHDANTO

Tutkittiin Digitalis lanata -solujen kasvatusta suspensio- viljelmänä erilaisissa fermentoreissa. Tavoitteena oli vertailla mekaanisesti sekoitettujen ja airlift-tyyppisten

fermentoreiden ominaisuuksia kasvisoluviljelyn kannalta, kiinnittäen huomiota erityisesti sekoitus- ja ilmastus- ongelmiin .

Tavoitteena oli myös opetella kasvisolujen viljelytekniik­

kaa yleisesti: Kehittää siirrostus- ja näytteenottomenetel­

miä ja laitteita kasvisoluille sopiviksi sekä löytää sopi­

via menetelmiä solukasvun seuraamiseksi kasvuliuos- ja solu­

näytteiden avulla.

Kirjallisuusosassa käsitellään kokeellisessa osassa esille tulevia asioita, painottaen fermentorin valintaa solusus- pensiokasvatuksiin.

KASVISOLUJEN KASVATTAMINEN SUSPENSIOVILJELMÄNÄ

1. YLEISTÄ

Noin 30 vuotta sitten keksittiin, että kasvisoluviljelmiä voidaan käyttää vaihtoehtona kokonaisille kasveille, kun tuotetaan taloudellisesti kannattavia metaboliatuotteita kasveista. Tämä keksittiin, kun huomattiin, että kasvisolu­

ja voidaan kasvattaa suspensiossa nestemäisellä alustalla samalla tavoin kuin mikrobeja. Sekundääristen metabolia- tuotteiden tuottamista kasvisoluviljelmien avulla on vaka­

vasti tutkittu parin vuosikymmenen ajan ja vasta 70-luvulla on pystytty aikaansaamaan suurituottoisia kasvisolukantoja.

Mahdollisuus menetelmän kannattavaan teolliseen soveltami­

seen rajoittuu lähes yksinomaan spesifisiin ja kallisarvoi­

siin aineisiin, joita korkeammat kasvit pystyvät synteti­

soimaan. Näitä aineita ovat esimerkiksi lääkeaineet, aromi- ja parfyymiaineet sekä entsyymit. Soluviljelmänä kasvate­

tuilla kasveilla ovat näiden tuotteiden määrät yleensä olleet pienempiä kuin kokonaisella kasvilla, mutta joissa­

kin tapauksissa on päästy yhtäsuuriin ja jopa suurempiinkin saantoihin.

Kasvisolujen kasvattamisella teollisessa mittakaavassa luon­

nontuote synteesejä varten on useita etuja verrattuna suurien kasviviljelmien käyttöön : Soluviljelmien kasvu on riippu­

maton ilmasto-olosuhteista ja vuodenajasta. Haluttua tuo­

tetta pystytään tuottamaan valvotuissa olosuhteissa, tuot­

teen eristys ja puhdistus vaatii vähemmän kustannuksia.

Tuotantoaika on vain n. 2...3 vikkkoa.

Minkä tahansa kasvin soluja voidaan kasvattaa aseptisesti

ravintoalustalla. Kasvatus aloitetaan siirtämällä steriili kasvikudoskappale agar-alustalle. Kahdesta neljään viik­

koon kestäneen kasvatuksen jälkeen saadaan syntymään joukko erikoistumattomia soluja (= kallus-viljelmä) . Kallus-

viljelmästä voidaan edelleen tehdä siirrostuksia uusille agar-alustoille (G AMBORG 1981).

Steriili kudoskappale saadaan syntymään esimerkiksi seuraa- villa tavoilla (MANDELS 1972) : Kasvi pestään ja sen pinta steriloidaan 3...5 % : 11a natrium- tai kalsiumhypokloriitilla, 70 % :11a etanolilla tai muulla steriloivalla aineella. Kasvi huuhdotaan steriilillä vedellä ja kudoskappaleet irrotetaan aseptisesti ja siirretään agarille. Siemenet voidaan steri­

loida 15 ... 20 min:n ajan 5 % :ssa kalsiumhypokloriitissa, jonka jälkeen ne siirretään itämään agar-alustalle. Sterii­

lit idut siirretään sitten edelleen agar-alustalle, jotta saataisiin syntymään kallus-viljelmä.

Jos halutaan kasvattaa kasvisoluja suspensioviljelmänä, siirrostetaan kallus-massaa nestemäiselle ravinto-alustalle ja kasvatetaan ravistelussa. Useiden viikkojen ja siirros- tusten jälkeen saadaan syntymään solususpensioviljelmä.

Kasvatusajät siirrostusten välillä riippuvat kasvilajista, kasvikudoksen alkuperästä ja ravintoalustan koostumuksesta.

Kuvassa 1 on esitetty kaavamaisesti kasvisolukasvatuksen eteneminen kokonaisesta kasvista valmiiksi tuotteeksi

(CROCOMO 1981).

Solususpensioviljelmiä on saatu syntymään lähtien esimerkik­

si kasvin siemenistä, nuorista versoista tai silmuista, juuren kappaleista, kukan osista ja juurimukuloista. Peri­

aatteessa mikä tahansa elävän kasvin osa voi olla lähtö­

aineena (GAMBORG 1981).

KASVI i

KASVIN OSA

KASVIN OSA KIINTEÄLLE KASVUALUSTALLE KALLUS-SOLUKKO

I

1

SOLUT NESTEMÄISELLE KASVUALUSTALLE i

SOLUSUSPENSIO УУ

УУ

Solujen eristys i Suurituottoisten solukantojen valinta \

\ *

SOLUSUSPENSIO KASVUALUSTALLA l

SOLUSUSPENSIO TUOTANTOALUSTALLA 4

SUUREN MITTAKAAVAN KASVATUS 4

MUODOSTUNEEN SEKUNDÄÄRISEN TUOTTEEN TALTEENOTTO

Kuva 1 Menetelmä sekundääristen tuotteiden tuottamiseksi solususpensioviljelmän avulla (CROCOMO 1981).

Jotta kasvisolujen kasvattaminen sekundääristen metabolia- tuotteiden tuottamiseksi teollisesti olisi taloudellisesti kannattavaa, tulisi soluviljelmän täyttää TABATAN (1977) mukaan seuraavat vaatimukset:

1. Tuotteiden synteesinopeuden ja solujen kasvuno­

peuden tulee olla riittävän suuret : Solujen kasvu­

nopeutta voidaan kiihdyttää parantamalla viljely- olosuhteita ja solujen valinnan avulla.

2. Viljeltävien solujen tulee olla geneettisesti

stabiileja : Stabiilisuuden säilyttämiseksi voidaan viljelmät varastoida jäädyttämällä.

3. Tuotteet eivät saa hajota nopeasti, vaan niiden pitää jäädä soluihin tai mieluummin erittyä kasvu- liuokseen: Tuotteiden erittyminen pois soluista olisi toivottavaa, sillä ne saattavat soluihin varastoituessaan inhiboida tuotteiden muodostusta.

4. Tuotantokustannusten pitää olla riittävän alhaiset Suuri osa kustannuksista muodostuu hiililähteen hinnasta sekä sekoittamiseen, ilmastukseen ja läm­

pötilan säätöön tarvittavan sähkön hinnasta.

Näiden kustannusten alentaminen lisää mahdollisuuk siä tuottaa sekundäärisiä tuotteita teollisessa mitassa.

2. KASVISOLUJEN FYSIOLOGIASTA JA RAKENTEESTA

Kasvisoluilla on monia piirteitä jotka erottavat ne mikrobi- ja eläinsoluista. Kasvisolujen halkaisija on n. 20...1 50 yjm, joten ne ovat n. 30... 100 kertaa suurempi kuin bakteerisolut ja n. 3...10 kertaa suurempia kuin useimmat sienisolut.

Kasvisolujen koko ja muoto vaihtelee hyvin paljon kasvila­

jista riippuen.

Koska kasvisolut ovat suurikokoisia, on niillä paljon alhai­

sempi fysiologinen ja metabolinen aktiivisuus kuin mikrobi- soluilla. Kasvisolujen kahdentumisajät ovat n. 25 ... 100 h

(bakteerit jopa 20 min) ja hengitysnopeus on n. 1 yjmol 02/h 10® solua.

Kasvisolujen rakenteelle olennainen piirre on soluseinä.

On todettu, että soluseinä kestää melko huonosti leikkaus- voimia, joita syntyy esimerkiksi suspensioviljelmiä sekoi­

tettaessa. Eri kasvilajien soluilla on kuitenkin huomatta­

via eroja tässä suhteessa (FOWLER 1982a).

Suspensioviljelmissä kasvisolut pyrkivät kasvamaan solukasau- mina, jotka voivat sisältää useita satoja soluja. Kasaumien läsnäolo voi estää kasvatuksen fysiologisen ja biokemiallisen kontrolloinnin ja vaikeuttaa tietojen saantia kasvatuksista tehdessään homogeenisen näytteen saannin vaikeaksi. Fermen­

tor ikas vatuksi s sa kasaumat vaikuttavat aineensiirtoon reak­

torissa.

Solukasaumien koko saattaa vaikuttaa myös sekundääristen tuotteiden synteesiin. Kinnersley & Dougal (1981) havait­

sivat Daucus carota -soluilla, että pienillä kasaumilla oli huomattavasti suurempi antosyaniinipitoisuus kuin suurem­

milla .

Ontehty useita yrityksiä estää kasautumista ja tuottaa hieno­

jakoisia solususpensioita. Hormoni- ja entsyymikäsittelyitä on kokeiltu sekä fysikaalisia menetelmiä, kuten suodatusta.

Biokemiallisten menetelmien ei ole todettu johtavan ongelman pitkäaikaiseen ratkaisuun ja nämä menetelmät saattavat myös vaikuttaa haitallisesti solujen sekundääristen tuotteiden muodostumiseen. Fysikaalisten menetelmien haittana on, että saadaan hyvin pieniä määriä hienojakoisia suspensioita ja solujen kasautuminen uudelleen tapahtuu melko nopeasti

(FOWLER 1 982b).

FOWLERIN (1982b) mukaan hienojakoisiin suspensioihin päästään kasvattamalla soluja immobilisoituna alginaattiin. Ainakin Catharantus roseus, Daucus carota ja Nicotiana tabacum -soluil­

la on onnistuttu. Immobilisottujen solujen jakautuessa ne vähitellen vapautuvat alginaatin pinnalta ja muodostavat hienojakoisen suspension. Suspensio voidaan sitten erottaa

ja kasvattaa erikseen.

3. KASVISOLUVILJELMIEN KEMIALLISET JA FYSIKAALISET KASVUVAATIMUKSET

3.1. Ravintoalustan koostumus

Välttämättömiä ravinteita kasvisoluviljelmien kasvualustois­

sa ovat epäorgaaniset suolat, hiilen ja energian lähde, vitamiinit ja kasvihormonit. Muita aineita, joita ovat

orgaaniset typpiyhdisteet, orgaaniset hapot ja muut orgaani­

set lisäaineet, pidetään tärkeinä, mutta ei välttämättöminä.

3.1.1. Epäorgaaniset suolat

Typpi, kalium, fosfori, kalsium, rikki ja magnesium ovat

aineita, joita tarvitaan millimooleissa ilmoitettavia määriä.

Kunkin aineen optimikonsentraatio vaihtelee huomattavasti kasvilajista riippuen.

Useimmissa tapauksissa ravintoalustan pitäisi sisältää

-3 _з 3

25*10 ...60*10 mol/dm epäorgaanista typpeä. Soluille riittää pelkkä nitraattikin typenlähteeksi, mutta usein am­

moniakilla tai jollakin muulla pelkistyneellä typpiyhdis­

teellä on selvästi kasvua parantava vaikutus ja joskus ne ovat jopa välttämättömiä (GAMBORG 1981).

HAGIMORIn et ai. (1982) tutkimuksessa vaihdeltiin nitraatti- typen ja ammonium-typen suhdetta, mutta pidettiin kokonais- typpikonsentraatio vakiona. Havaittiin, että NO^-NîNH^-N = 2:1 oli optimaalinen sekä kasvuun että digitoksiinin muo­

dostumiseen Digitalis purpurea -soluilla.

Kaliumia tarvitaan vähintään 20-10 mol/dm . Sitä ei voi korvata natriumilla. Kalium lisätään yleensä nitraattina tai kloridina. Fosforin, magnesiumin, kalsiumin ja rikin optimikonsentraatiot ovat n. 1 ... 3• 1 0~3 mol/dm3, silloin kun muut solujen kasvuvaatimukset ovat täytetyt (GAMBORG 1981).

Mikromooleissa ilmoitettavia määriä tarvitaan rautaa, mangaa­

nia, sinkkiä, booria, kuparia ja molybdeeniä. Saattaa olla tarpeellista myös lisätä kobolttia. Jodia käytetään useissa alustoissa, mutta se ei ole välttämätön aine (GAMBORG 1981).

3.1.2. Hiilen ja energian lähde

Tavallisesti kasvien soluviljelmät vaativat kasvaakseen hiililähteen, joka on lisättävä ravintoalustaan. On kuiten­

kin olemassa myös viljelminä kasvavia solusukuja, joilla on fotosynteettistä kapasiteettiä, ja ne ovat siis riippumatto­

mia ulkopuolisesta hiililähteestä (CONSTABEL 19 74).

Yleisimmin hiililähteenä käytetään sakkaroosia tai glukoosia.

Sakkaroosia käytetään yleensä 2...3 %:n pitoisuuksina. Käy­

tetyllä sakkaroosikonsentraatiolla on ilmeisesti vaikutusta muodostuvien metaboliatuotteiden määrään. Glukoosin kohdal­

la ei vastaavaa ole havaittu (ZENK 1978) .

Mannoosi hiililähteenä on antanut huonoja tuloksia. Disakka- ridien, kuten maltoosin, sellobioosin ja myös laktoosin on todettu vaikuttavan positiivisesti kasvuun. Pentoosit eivät ole osoittautuneet sopiviksi hiililähteiksi. Myös sokeri- alkoholit ovat tavallisesti huonoja energialähteitä, tosin sorbitolilla on saatu joitakin hyviä tuloksia (MARETZKI 1974).

Hagimori et ai. (1982) ovat tutkineet eri hiililähteiden vai­

kutusta Digitalis purpurean kasvuun ja digitoksiinin tuottoon.

Kasvisoluja kasvatettiin Murashige-Skoog -alustalla, johon lisättiin 3 % (w/v) tutkittavia sokereita ainoaksi hiililäh- teeksi. Kasvatettiin kolme viikkoa ja määritettiin solusaan—

to ja digitoksiinipitoisuus. Kuvassa 2 näkyy eri hiililäh- teiden vaikutus.

Sakkaroosi, glukoosi ja raffinoosi olivat sopivia sekä kas­

vuun että digitoksiinin tuottoon. Maltoosi, fruktoosi ja galaktoosi olivat huonoja tuoton kannalta, mutta sopivat kasvuun. Muut tutkitut hiililähteet eivät osoittautuneet hyviksi.

Sakkn-rooSj

¿IClJ¿ooS/

Tlo-ffinoosi

Ma.L¿oojel Fnuk-Joasi Coulo-kiaosi Ma-nn OCÍL

A'sy JoO í¡

RcLsrirtOOSL

/IrCLbi'nooSl //tO£¿Jo/Í Liukoinen iirkkeJys

Soluiaajxéo (y kuuVa-ain/pu2ioy о o,f ^Ao hf 2,0

ksilnlf>ii. ^íyL¿y/j кш'ьга-сип^

Kuva 2. Eri hiililähteiden vaikutus Digitalis purpurean kasvuun ja digitoksiinin tuottoon.

Tutkittiin myös sakkaroosikonsentraation vaikutusta kasvuun ja digitoksiinin tuottoon konsentraatioilla 0...10 % (w/v).

Optimi sakkaroosikonsentraatio kasvun kannalta oli 5 % ja digitoksiinin muodostumisen kannalta 3 % (HAGIMORI 1982).

3.1.3. Vitamiinit

Kasvit syntetisoivat kasvuun ja kehitykseen tarvitsemansa vitamiinit, mutta kasvisoluviljelmissä on synteesi liian hidasta nopean kasvun ylläpitämiseksi.

tat sisältävät myös pantotenaattia ja biotiiniä, mutta näitä ja muita vitamiineja ei yleensä pidetä kasvua rajoittavina tekijöinä. Ainoa poikkeus voisi olla tapauksisa, joissa olisi edullista kasvattaa soluja pieninä pitoisuuksina.

Tällöin voitaisiin lisätä esimerkiksi p-amino-bentsoehappoa, folihappoa, koliinikloridia, riboflaviinia ja askorbiinihap- poa (GAMBORG 1981).

Hagimori et ai. (1982) tutkivat glysiinin, pyridoksiinin, nikotiinihapon, myo-inositolin ja tiamiinin vaikutusta Digitalis purpurea -solujen kasvuun ja digitoksiinin tuot­

toon. Soluja kasvatettiin kolmen sukupolven ajan. Toisen sukupolven aikana solujen digitoksiinipitoisuus väheni huomattavasti alustalla, joka ei sisältänyt tiamiinia tai myo-inositolia, kasvu sensijaan ei heikentynyt. Pyridoksii­

nin, nikotiinihapon tai glysiinin puuttumisen ei todettu vaikuttavan kasvuun tai digitoksiinin tuottoon.

3.1.4. Kasvihormonit

Auksiineja ja sytokiniinejä tarvitaan indusoimaan solujen jakautumista ja kalluksen muodostumista. Yleisimmin käytetty auksiini on 2,4-dikloorifenoksietikkahappo (2,4-D). Nafta- leenietikkahappoa, indolietikkahappoa, indolivoihappoa ja p-kloorifenoksietikkahappoa käytetään myös yleisesti.

Sytokiniinit ovat adeniinin johdannaisia. Useita sytokinii­

ne jä on kaikkien eliöiden soluissa, mutta hormonaalista aktiivisuutta on niillä havaittu olevan vain kasveissa.

Useimmin käytettyjä sytokiniinejä ovat kinetiini, bentsyl- adeniini (BA), isopentenyladenosiini ja tseatiini (GAMBORG

1981).

Gibbereiliinihappo ja abskisiinihappo pitoisuuksina 0,01...

0,1 mg/dm parantavat Hagimoren (1982) mukaan digitoksiinin 3 tuottoa Digitalis purpurean soluviljelmissä, mutta suurem­

mat pitoisuudet vähentävät sekä kasvua että digitoksiinin tuottoa.

Toisaalta on todettu, että lisättäessä 5 ppm gibberelliini- happoa Digitalis lanatan -soluviljelmään lisääntyi solujen digitoksiinipitoisuus (LUI 1981) .

Kinetiinillä ei Hagimoren (1982) mukaan ole selvää vaiku­

tusta kasvuun tai digitoksiinin tuottoon Digitalis purpurea- soluilla pitoisuuteen 1 mg/dm saakka, mutta se lisää hiukan3 digitoksiinin muodostumista pitoisuudessa 10 mg/dm .3

3.1.5. Orgaaninen typpi

Yleisiä orgaanisen typen lähteitä kasvualustoissa ovat amino­

hapot ja adeniini. Usein kasvuliuoksessa on myös 0,02...

0,1 % liuoksen tilavuudesta kaseiinihydrolysaattia. Joissa­

kin tapauksissa aminohapposeos voidaan korvata L-glutamii- nilla. Yksittäisiä amonohappoja pitää kuitenkin lisätä

varovasti, sillä ne voivat toimia inhibiittoreina (KURZ 1979).

Lisäksi on todettu, että maitohapoista pitäisi käyttää vain L-isomeereja. D-isomeereillä ei yleensä ole mitään vaiku­

tusta tai ne jopa poistavat L-isomeerien vaikutuksen, jos niitä lisätään raseemisena seoksena (MURASHIGE 1974).

Kasvisolut eivät pysty käyttämään orgaanisia happoja aino­

ana hiililähteenään. TCA-syklin happojen (sitraatti, malaat- ti, sukkinaatti ja fumaraatti) lisäys mahdollistaa kasvisolu­

jen kasvun ammonium ainoana typpilähteenään. Solujen on todettu kestävän happoja 10*10 mol/dm pitoisuuteen asti.

Pyruvaatin on todettu lisäävän kasvua, silloin kun solujen konsentraatio on pieni (GAMBORG 1981) .

Proteiinihydrolysaattia, hiivauutetta, mallasuutetta, kookos- maitoa ja tomaattimehua on käytetty kasvualustoissa. Yleensä on havaittu, että ne voidaan hyvin korvata tunnetuilla ravin­

teilla (GAMBORG 1981).

3.1.7. Antibiootit

Kontaminoitumisen estämiseksi on kasvisoluviljelmissä käy­

tetty useita antibiootteja. Ainakaan tylosiinin, mykosta- tiinin, amfoterisiinin, griseofulfiinin, oksitetrasykliinin tai basitrasiinin ei ole todettu inhiboivan solukasvua

(MANDELS 1972) .

3.1.8. Kasvisoluviljelmissä tavallisimmin käytetyt ravintoalustat

Solususpensioviljelmissä yleisesti käytettyjä kasvualustoja ovat Murashige-Skoog-, Gamborg B5-, Eriksson-, Schenk-

Hildebrandt-, Heller- ja White-alustat. Näiden alustojen koostumukset on esitetty liitteissä 1 ja 2.

3.2. Ravintoalustan pH

Kasvisolut vaativat happaman pH : n, optimin ollessa n. 5,5...

5,8. Solususpensiokasvatuksen aikana pH muuttuu : Alussa tapahtuu lasku alle pH 5:n, jonka jälkeen pH kohoaa 6 :een tai korkeammalle. Autoklavointi voi muuttaa alustan pH : ta, joten puskurointiin tulisi kiinnittää huomiota (KURZ 1979) .

3.3. Kasvatuslämpötila

Kasvunopeuden kannalta optimilämpötilaksi on useilla kasvi­

lajeilla havaittu 26 ... 28 °C. Alle 17,5 °C:een lämpötilas­

sa on havaittu n. 60...75 %:n väheneminen kasvunopeudessa.

Yli 30 °C:een lämpötilassa tapahtuu samanlainen kasvunopeu­

den väheneminen ja yli 34 °C:een lämpötilassa tapahtuu jo huomattavaa solujen tuhoutumista (FOWLER 1982a).

Kasvatuslämpötila-optimi vaihtelee huomattavasti eri kasvi­

lajeilla. Esimerkiksi Tulecke ja Nickell (I960) havaitsivat optimilämpötilaksi Lolium perennelle 20... 21 °C ja Rosa sp:lle 31. . .32 °C.

3.4. Valon vaikutus solukasvuun ja sekundääristen metaboliatuotteiden muodostumiseen

Valoa ei yleensä pidetä välttämättömänä kallus- ja solusus­

pensioviljelmille. Ilmeisesti valolla on kuitenkin merki­

tystä solujen metabolialle. BJöRKin (1981) mukaan valo, jonka aallonpituus on alle 350 nm, stimuloi fenyylipropa- noidien biosynteesiä. Fenyylipropanoideja ovat esimerkiksi

kanelihappo ja p-kumaarihappo. Näiden yhdisteiden ylituo­

tanto inhiboi kasvua ja voi johtaa jopa kasvisolujen kuole­

maan .

3.5. Siirrosteen koon vaikutus solukasvuun

Mikäli siirrosta on liian pieni, loppuu solujen jakautumi­

nen, eikä kasvu lähde käyntiin. Tämän perusteella on päätel ty, että alustan täytyy sisältää siirrosteen solujen vapaut­

tamia aineita (KURZ 1979).

MANDELSin (1972) mukaan vaaditaan n. 5...15 % (v/v) suurui­

nen siirroste, jotta kasvatuksen lag-vaihe lyhenisi.

3.6. Ilmastuksen vaikutus solukasvuun

Kasvisolujen alhaisesta metabolisesta aktiivisuudesta ja pitkistä kahdentumisajoista johtuen on kasvisoluviljelmien hapentarve varsin pieni. Suurien ilmastusnopeuksien on to­

dettu olevan vahingollisia kasvisolujen kasvulle ja aineen­

vaihdunnalle. Tämä johtuu ehkä hiilidioksidin poistumisesta kasvualustasta, suoranaisesta happimyrkytyksestä tai liuen­

neen hapen liian suuresta määrästä, joka johtaa metabolisen aktiivisuuden heikkenemiseen (SMART 1981).

SMART (1981) on tutkinut erilaisten ilmastusnopeuksien vaiku tusta solususpensioviljelmien alkukasvunopeuteen ja maksi­

maaliseen kasvunopeuteen Catharantus roseus -soluilla.

Tutkimuksessa soluja kasvatettiin lasista valmistetuissa fermentoreissa (WILSON 1971), joiden tilavuus oli 4 dm .3

ftiAa. (eí)

• = 2,o с/ъ’/жь ■ = /.ГJm3//»/* А =

Kuva 3. Catharanthus roseus -solujen kasvu erilai­

silla ilmastusnopeuksilla.

Ilmastusnopeuksia vaihdeltiin välillä 1,0...2,0 dm^/min.

Siirrosteen koko oli 10 % ja kasvualustana oli Gamborgin B5- alusta. Kuvassa 3 näkyy eri ilmastusnopeuksien vaikutus solukasvuun solujen kuivapainon perusteella.

-3 3

Tutkittiin myös hiilidioksidin lisäyksen (50.10 dm /min) vaikutusta solukasvuun ja alustavien kokeiden perusteella

lisäys paransi huomattavasti solusaantoa.

4. KASVISOLUJEN ERIKOISTUMISEN VAIKUTUS METABOLIATUOTTEIDEN MUODOSTUMISEEN 1

Sekundääristen metaboliatuotteiden muodostuminen korkeam­

milla kasveilla liittyy solujen erikoistumiseen. Sekundää­

risten tuotteiden synteeseihin tarvittavat entsyymit muodos­

tavat ilmeisesti vähitellen kasvin kehityksen aikana osana monimutkaisia geenien ilmentymisprosesseja. Kun siirrytään kasvattamaan erillisiä soluja koko kasvin sijasta, menete­

tään usein kasvin kyky syntetisoida sekundäärisiä metabolia- tuotteita. Kasvisolujen viljelytekniikka on yleensä pyrki­

nyt saamaan aikaan homogeenisia järjestäytymättömiä solu- suspensioita. Viimeisten tutkimusten mukaan ovat ne suspen­

siot, jotka ovat tuottaneet sekundäärisiä tuotteita olleet kuitenkin varsin heterogeenisiä (BARZ 1981).

Normaalien kasvien tuotto soluviljelmissä, joissa solut ovat peräisin kasvin eri osista osoittaa, että niillä on olemassa kaikki geneettinen informaatio, joka tarvitaan minkä tahansa tuotteen muodostamiseen, jota emokasvikin tuottaa. Mikäli kasvualustaan ei lisätä auksiineja, pyrkivät suspension

solut järjestäytymään uudelleen.

Digitalis gloxinefloran ja Digitalis purpurean erikoistu­

mattomien suspensioviijelmien havaittiin erikoistuneen uudel leen, kun niitä kasvatettiin alustalla, joka ei sisältänyt auksiinia. Mentha arvensis1 n juuri-kallus -suspensio pystyi muodostamaan järjestäytynyttä kudosta, kun sitä kasvatettiin alustalla, joka sisälsi vain 0,1 ppm 2,4-D:tä (STABA 1965) . On siis ilmeistä, että pystytään kasvattamaan järjestäyty­

neitä kasvikudoksia ja myös valvomaan kasvua lähtien erikois tumattomasta solumassasta. Erikoistumisen olosuhteet vaih- televat huomattavasti riippuen kasvikudoksesta ja kasvila­

jista (S TAB A 1 965).

Erikoistumiseen liittyy usein vähentynyt solujen kasvunopeus.

Yksi tapa hyödyntää kallusmassan nopeaa kasvua ja erikois­

tumisen aiheuttamaa tuotteen muodostusta on kaksivaiheinen kasvatus, jossa ensin kasvatetaan solumassaa. Toisessa vai­

heessa annetaan solujen erikoistua ja tuottaa sekundäärisiä metaboliatuotteita. Toinen mahdollisuus on lisätä haluttujen

tuotteiden prekursoreja soluviljelmiin (MANDELS 1972).

5. FERMENTORIN VALINTA SOLUSUSPENSIOKASVATUKSIIN 5.1. Kasvisolu-fermentorien yleiset vaatimukset

Solumassan kasvatuslaitteilta vaaditaan, että biomassa ja kasvuliuos saadaan riittävän hyvin sekoitetuksi, jotta pääs­

täisiin mahdollisimman lähelle homogeenisiä olosuhteita.

Mikrobikasvatuksissa pyritään yleensä tehokkaaseen sekoi­

tukseen, jotta saavutettaisiin hyvä aineensiirto kaasufaa- sista liuokseen ja mikrobien suuri hapentarve tulisi tyydy­

tetyksi. Kasvisoluviljelmät eivät kuitenkaan tarvitse teho­

kasta sekoitusta hapensaannin vuoksi. Tehokkaan sekoituksen aiheuttamat leikkausvoimat vahingoittavat kasvisoluja, sillä soluseinät rikkoutuvat helposti. Solujen kestävyys vaihte- lee kuitenkin eri kasvilajeilla suuresti.

Sekoituksen haitallisista vaikutuksista huolimatta pitää saada aikaan riittävän hyvä sekoitus, jotta solut pysyisivät suspensiossa ja tuotetta muodostuisi mahdollisimman paljon.

Kasvisolut ovat suuria ja raskaita verrattuna mikrobisolui- hin ja laskeutuvat nopeasti, jos sekoitus on puutteellinen.

Vaihtoehtona fermentoreille, joissa sekoitus tapahtuu mekaa­

nisesti esimerkiksi pyörivien lapojen avulla ovat air-lift-

leikkausvoimia, mutta vaikeutena on saavuttaa kunnollinen sekoitus ilmastamatta liikaa. Kasvatuksen aikana solusus- pension viskositeetti kasvaa ja aiheuttaa kasvatuksen loppu­

vaiheessa usein sekoitusvaikeuksia.

5.2. Kasvisolukasvatuksissa käytettyjä fermentoreita 5.2.1. Panoskasvatuksiin käytettyjä fermentoreita

Ensimmäinen tutkimus kasvisolujen kasvatuksesta isommassa kasvatusastiassa julkaistiin v. 1959 (TULECKE ja NICKELL).

Kasvatus tapahtui 20 dm : n reaktorissa, joka oli varustettu 3 neljällä putkella : ilman sisään- ja ulostuloputket, kasvu- liuoksen sisääntuloputki ja näytteenottopatki. Suodatettu paineilma sai aikaan sekä ilmastuksen että sekoituksen

(kuva 4).

Myöhemmin WANG ja STABA (1963) käyttivät samantapaista kas­

vatus järjestelyä kasvattaessaan piparminttusoluja, mutta he käyttivät kahta astiaa sarjassa yhden astian sijasta. Ilmas­

tuksen lisäksi käytettiin magneettisekoitusta ja ilmastus tapahtui huokoisen lasisuodattimen kautta. Hyöty toisesta kasvatusastiasta ei ollut ilmeinen ja toinen astia toimi yleensä huonosti (kuva 5).

Suodatin

1

Ilma Ilma

Kuva 4. Tulecken ja Nickellin 20 dm :n panosfermen­3 tor! .

f

Jäähdytin

_______ 1 I Sekoitus-

Sekoittaja sauva Wangin ja Staban kahden astian kasvatus- järjestely.

Kuva 5.

Vuonna 1971 VERMA ja VAN HUYSTEE kehittivät kasvatuslait- teen, joka heidän mukaansa vähensi ratkaisevasti kontaminaa tiomahdollisuuksia näytteenottovaiheessa ja lisättäessä kasvuliuosta. Kasvatusastiana oli 5 dm :n kolmikaulainen tislauskolvi, johon oli lisätty venttiili näytteenottoa var ten. Yhdestä kaulasta poistuivat kaasut, toisessa oli se­

koittaja ja kolmannessa oli F:n muotoinen lasiyhde ilmas­

tusta ja kasvuliuoksen lisäystä varten. Näyteventtiilinä oli kolmitievakuumihana, joka oli järjestetty siten, että venttiili ja näyteputki voitiin huuhdella steriilillä vedel lä jokaisen näytteenoton jälkeen. Näytteenottojen välillä näyteputken pää pidettiin 50 % :ssa etanolissa (kuva 6).

tfooitor/

flsnu.

Kuva 6. Verman ja van Huysteen kehittämä kasva- tuslaite.

Vuonna 1970 VELIKY ja MARTIN kehittivät kasvatuslaitteen, joka muistutti käännettyä Erlenmeyer-kolvia. Ilmastuksen lisäksi kasvatusta sekoittivat astian pohjalla olevat teflon päällysteiset magneettisekoittajät. Myös näytteenotto ta­

pahtui astian pohjalta. Paitsi panoskasvatuksiin, voidaan tätä laitetta käyttää myös puolijatkuviin kasvatuksiin, joissa ajoittain lisätään uutta kasvuliuosta ja poistetaan solumassaa. Laitetta käytettiin Ipomea-suvun -solujen kasva tukseen ja sen rakenne on esitetty kuvassa 7.

Ilma

Ilma Kasvuliuos

Jäähdytte ja

Kuva 7. Velikyn ja Martinin kehittämä kasvatus- laite (1970) .

Edellä kuvattujen kasvatuslaitteiden jälkeen siirryttiin yleisesti käyttämään tavallisia melasekoitteisia turbiini- reaktoreita (kuva 8). Esimerkiksi Wilsonin (1978) mukaan paras fermentori solususpensiokasvatuksiin on mekaanisella

sekoituksella ja erillisellä ilmastuksella varustettu laite, näyttämillään air-lift -fermentoreilla Wilson ei kasvatus­

ten loppuvaiheessa saanut aikaan riittävän hyvää sekoitusta ja muodostui sekoittumattomia vyöhykkeitä.

Myös Tanakan mukaan paras fermentori kasvisolukasvatuksiin on melatyyppisellä sekoittajalla varustettu ilmastettu lai­

te (TANAKA 1975). Kuvassa 9 on esitetty fermentorin rakenne ja kasvisolukasvatuksiin soveltuvan fermentorin mitat 1 ja 5 dm3:n fermentoreille (TANAKA 1981).

Siirrosta

—+ -

llma^ Zj

--- tr PaBP°

— 4— Emäs

ti" i--- *pH elektrodi Vesi —►

ab

X

Kuva 8. Melasekoitteinen turbiinireaktori (MARTIN 1980).

Dt = astian halkaisija Dj- = sekoittajan läpimitta

= nesteen korkeus Wd = sivulevyn leveys

= sekoittajan leveys

Nestetilavuus 1 dm3 5 dm3

Dt 11,3 cm 20,0 cm

H1 10 cm 16 cm

Ilmastus 8 reikäinen

rengas

8 reikäinen rengas

Sivulevyjen määrä 0 0

Sekoittaja muotoiltu lapa muotoiltu lapa

D.i 7,0 cm 13,3 cm

Wi 5,0 cm 8,0 cm

H .X 5,0 cm 8,0 cm

Sekoitusnopeus 225...630 rpm 60 rpm

Ilmastus 3 3

1,0 dm /dm .min 0,5 ... 1 ,5 dm3/

dm3.min

Kuva 9 Tanakan kasvisolutermentorin rakenne

Air-lift -fermentoreita suunnitellaan yleensä kahdella eri tavalla : Ylöspäin virtaavan ilmastetun liuoksen ja alaspäin virtaavan liuoksen erottaa toisistaan putki, joka on fermen-

torin keskellä tai virtaukset kulkevat kahdessa erillisessä putkessa, jotka on yhdistetty ylä- ja alaosistaan.

WAGNER (1977) käytti fermentoria, jossa sekoitus aikaan­

saadaan ilmastuksen ja sisäputken avulla (kuva 10). Pääs­

tiin varsin hyvään sekoitukseen rasittamatta soluja suuril­

la leikkausvoimilla. Kasvatettaessa Morinda citrifolia -solu­

ja todettiin antrakinonisaannon olevan 30 % parempi kuin ravistelupullokasvatuksessa ja kaksinkertainen verrattuna mekaanisesti sekoitettuihin kasvatuksiin.

Kuvassa 11 on esitetty tyypilliset kasvukäyrät optimaalisis­

sa kasvuolosuhteissa WAGNERin air-lift -fermentorissa. Solu­

jen nopea kasvu tapahtuu selvästi eri aikaan kuin antraki- nonin muodostuminen.

Jäähdytys/ lämmitys vesi

777Å--

Kuva 10. Wagnerin air-lift -fermentori.

Kuva 11. Morinda citrifolia -solujen kasvatus 10 dm :n

з

air-lift -fermentorissa. Siirrosteen koko 10 %, lämpötila 28 °C, ilmastus 0,5 dm-Vdnß-min. Fermentor in mitat: D. /D = 0,44, D /Н = 0,47.

la. ci ö.

Wagner (1977) käytti myös fermentoria, jossa oli sisäputken lisäksi turbiini. Turbiini toimii pumpun tavoin, pakottaen kasvuliuoksen nousemaan ylöspäin sisäputken ja fermentorin seinämän välissä. Liuos virtaa alaspäin sisäputken sisällä

(kuva 12).

Fermentorissa jouduttiin käyttämään suuria turbiinin pyöri­

misnopeuksia ja kasvisolut joutuivat alttiiksi suurille leik- kausvoimille.

Myös KIESEn (1980) mukaan on air-lift -fermentori parempi vaihtoehto kasvisolukasvatuksiin kuin mekaanisesti sekoi­

tettu fermentori. Hänen mukaansa huonot sekoitustulokset

WÅ

Sisaputki

Jäähdytys-/lämmitys vesi

Turbiini

Kuva 12. Fermentori, jossa on sisäputki ja turbiini (WAGNER 1977).

air-lift -reaktoreissa ovat johtuneet fermentorin korkeuden ja halkaisijan väärästä suhteesta. Kiesen mukaan korkeuden ja halkaisijan suhteen tulisi olla vähintään 5.

Kiese on suunnitellut fermentorin laboratoriokäyttöön, jonka mitat on optimoitu siten, että saavutetaan liuosnopeudet,

jotka ovat riittävät varmistamaan hyvän sekoituksen. Fer­

men torin ilmastus voi tapahtua useilla tavoilla vaihtelemalla pohjakappaleita. Kuvassa 13 on esitetty fermentorin rakenne ja mitat.

TOWNSLEY (1983) on kehittänyt pilot-plant -kasvatuksiin so­

veltuvan air-lift -fermentorin, jossa liiallinen ilmastus on vältetty kierrättämällä ilmaa uudelleen ja lisäämällä vain

Ilma

f

Laippalütos

Jäähdytys/

lämmitys

Huokoinen levy

Ilma

f

Kuva 13. Laboratoriokäyttöön suunniteltu air-lift -fermentori (KIESE 1980).

Nesteen korkeuden suhde halkaisijaan : 4,55 Käyttötilavuus 4,0 dm3

Mitat kuvassa mm:nä

vähän uutta ilmaa. Fermentorin rakenne on esitetty kuvassa 14. Fermentorissa kasvatettiin Triptergium wildordii -soluja.

Jotta päästiin hyvään sekoitukseen nestetilavuudettaan

10 dm^:n fermentorissa, kierrätetiin ilmaa nopeudella 1,1

3 3 —3 3

dm /dm •min. Uutta ilmaa lisättiin nopeudella 10*10 dm / , 3 .

dm -mm.

TOWNSLEYN 10 dm :n fermentoria käytettiin siirrostettaessa3

55 dm :n fermentoria. Solut siirrettiin ilmanpaineen avul­3 la 2,5 cm halkaisijaltaan olevan teräsputken ja pallovent- tiilin kautta suurempaan fermentoriin. Aseptiikan vuoksi oli molemmissa fermentoreissa steriloitavat venttiilit.

Kaikki kiertoilman suodattimet ja nesteloukku olivat lämmi­

tettyjä, jotta vettä ei kondensoituisi suodatusjärjestelmään.

Fermentorin sisäputki oli suunniteltu kartiomaiseksi, jotta saavutettaisiin hyvä sekoitus myös astian pohjalla.

loukku

Kuva 14. Townsleyn (1983) air-lift -fermentori.

A = vaihdettava teräsputki C = kartiomainen putki ruos­

tumattomasta teräksestä F = bakteerisuodatin

H = lämmittäjä M = virtausmittari

P = ilmapumppu T = ne s te-"1oukku"

= 1" ruostumaton palloventtiili V

ROUSSEAU'n (1980) mukaan sekoituksen tehokkuuteen vaikutta­

va suure air-lift -fermentorissa on kaasun virtausnopeuden suhde fermentorin kokonaishalkaisijaan. - Sekoitusnopeus kasvaa kaasun virtausnopeuden kasvaessa, mutta ei suoravii­

vaisesti. Havaittiin, että kriittiseen virtausnopeuteen saakka sekoittuminen parani nopeasti, mutta suuremmilla vir­

tausnopeuksilla parantuminen oli hyvin hidasta. Kriittisen virtausnopeuden arvo riippuu fermentorin yksityiskohdista ja pitää etsiä kokeilemalla.

Suunniteltaessa air-lift -fermentoria, jossa sekoituksen tehokkuus on kriittinen tekijä, pitää seuraavat seikat ottaa huomioon :

- Reaktorin korkeuden suhde halkaisijaan tulee olla riittävän suuri,

- ylöspäin virtaavan ja alaspäin virtaavan nesteen tilavuuksien pitää olla yhtäsuuret,

- pitää etsiä optimi kaasun virtausnopeudelle, jota suuremmalla nopeudella sekoitus ei enää merkittä­

västi parane.

SMARTin (1981) mukaan air-lift -fermentorissa on ristiriita hyvän sekoituksen saavuttamisessa ja ilmastuksen pitämisessä riittävän pienenä vielä osaksi selvittämättä, mutta myös hänen mukaansa air-lift -fermentorit soveltuvat paremmin kasvisolukasvatuksiin kuin tavanomaiset turbiinikäyttöiset laitteet.

5.2.2. Puolijatkuvissa ja jatkuvissa kasvatuksissa käytettyjä fermentoreita

Yksinkertaisimmillaan puolijatkuvaan kasvatukseen käytetty fermentori on panos-fermentori, josta on mahdollista poistaa ajoittain kasvuliuosta soluineen ja lisätä vastaava määrä uutta kasvuliuosta. Solujen annetaan yleensä kasvaa lähelle maksimisaantoa ennen kasvuliuoksen uudistamista. Solumassan määrä voidaan pitää lähes vakiona säätelemällä poistetun liu­

oksen määrää ja poistoväliä.

Jatkuvassa kasvatuksessa solujen jakautuminen tapahtuu määrä­

tyllä nopeudella, muuttumattomassa ympäristössä. Solujen jakautumisnopeus riippuu kasvua rajoittavan substraatin konsentraatiosta Monodin kaavan mukaan:

Monodin kaava :

kasvua rajoittavan substraatin kon- sentraatio

tasapainovakio

kasvunopeuskerroin rajoitetulla substraattikonsentraatiolla maksimikasvunopeuskerroin

Yleensä jatkuvatoimiset fermentorit toimivat parhaiten kun solutiheys on melko pieni, esimerkiksi 4 g kuiva-ainetta/

dm3 (WILSON 1980).

MILLER (1968) käytti jatkuvatoimista kasvatuslaitetta (kuva 15). Mielenkiintoinen piirre laitteessa oli automaattinen poistoventtiili, joka toimi ajastimen ja releen ohjaamana.

Kasvuliuosta syötettiin fermentoriin jatkuvasti ja poistet­

tiin 20 min : n välein.

Jossa

K

Г

J1 max

J1max

K + S

/?av/nnc^va ras toon

Moottori

Kuva 15. Millerin käyttämä jatkuvatoiminen fermen- tori (KURZ 1979).

KURZin (1973) käyttämässä jatkuvatoimisessa kasvatuslait- teessa saadaan sekä ilmastus että sekoitus aikaan paine- ilman avulla. Ilmaa päästetään kasvatusastiaan säännölli­

sinä pulsseina ja syntyy suuria kuplia, jotka liikkuvat hitaasti ylöspäin. Synkronoitu pumppu huolehtii kasvuliu- oksen virtauksesta fermentoriin ja sieltä pois. Kuvassa 16 on esitetty fermentorin rakenne.

h'uoS

/Ímaj^íuo с/a. Asi

Kuva 16. Kurzin käyttämä jatkuvatoiminen fermentori (KURZ 1979) .

WILSON (1980) kehitti jatkuvatoimisen fermentorin, jonka rakenne on esitetty kuvassa 17. Tämän tyyppistä fermento­

ria on käytetty paljon Acer-suvun solujen tutkimiseen.

Epäilemättä jatkuvatoimiset kasvatukset ovat erittäin hyö­

dyllisiä tutkittaessa kasvisolujen kasvatuksen biokemiaa, kyseenalaista on kuitenkin soveltuvatko ne sekundääristen metaboliatuotteiden tuottoon suuressa mittakaavassa. Puoli-

jatkuvien kasvatusten soveltaminen sen sijaan saattaisi hyvinkin tulla kysymykseen (FOWLER 1982b).

Swi

U PEL

P!

Kuva 17. Wilsonin kehittämä jatkuvatoiminen fermentori A = ilmastaja, AI = ilman sisääntulo, AO = ilman ulostulo, CL = kierrätys, CLD = nestepinnan säätö­

laite, CRV = kasvuliuossäiliö, CW = puuvilla- suodatin, DD = solutiheyden mittaus, F = ilman- suodatin, FI = virtausmittari, GC = lasiputki lämpötilansäätöä varten, IMR = kasvuliuoksen välivarasto, MCL = elohopeakloridipesulinja, MFU = kasvuliuoksen suodatusyksikkö, MS = mag- neettisekoittajan moottori, MSL = uuden kasvu- liuoksen lisäyslinja, OS = liuoksen ulostulo- venttiili, PEL = paineentasauskierrätys, SR = näytevarasto, SWL = steriilivesilinja, ST = näyteputki, TCW = lämpötilansäätövesi.

Toisaalta jatkuvatoimiset kasvatukset voivat sopia hyvin kaksivaiheisiin prosesseihin. ALFERMAN ( 1977) kehitti kaksi vaiheisen prosessin ß-metyldigitoksiinin biotransformaatioon ß-metyldigoksiiniksi Digitalis lanata -soluviljelmän avulla.

Ensimmäisessä vaiheessa tapahtui jatkuvatoiminen kasvatus, ja saatiin muodostumaan biomassaa hyvällä saannolla. Toises sa vaiheessa tehtiin biotransformaatio panosprosessina.

5.2.3. Kasvisolukasvatuksissa käytettyjen fermentereiden vertailu

WAGNER ( 1977) on tutkinut Morinda citrifolian solukasvua ja antrakinonin tuottoa erilaisissa fermentoreissa. Tutki­

muksen perusteella sekä solusaanto, että antrakinonin tuotto vaihtelee huomattavasti riippuen fermentorista. Kuvassa 18 on esitetty vertailun tulokset.

4 5

ä~°

■u aidrn* /0 dm1

Oi 5 dm/jmtrift IOO rprn

10cLa?

O. f ein?/d/t?rmn

IOO Грт

7 5cLr?

0,33 Jrn/dthmtA 350 rpm

todjyi

0.3 4'tm/

(L/rimi*

1

Ц

1

Ш MutlUL-СЧ'лА ЦШ Tccoit SCLCLnto

D Kuiva -Omit I Tuolle.

Tuottavuus

Kuva 18. Solukasvun ja antrakinonien saannon ja

tuottavuuden vertailu erilaisissa kasvatus- laitteissa :

1: ravistelupullo, 2: turbiinityyppisesti sekoitettu fermentori, 3: reikälevyn avulla sekoitettu fermentori, 4: turbiinilla varus­

tettu sisäputkellinen fermentori, 5: air­

lift -fermentori.

Antrakinonin saanto air-lift -fermentorissa on n. 30 % suu­

rempi kuin ravistelupullossa, ja verrattuna muihin fermen- toreihin on saanto melkein kaksinkertainen.

Fermentorille, jossa on kaksi pyörivää sekoittajaa (kuva 18, no. 2) on ominaista turbulentin alueen muodostuminen lähelle sekoittajia. Kauempana sekoittajista ovat leikkausvoimat melko pieniä, ja kasvatuksen aikana havaittiinkin paikallaan pysyviä vyöhykkeitä. Pieni antrakinonisaanto sekoitusnopeu- della 100 rpm onkin selitettävissä hapenpuutteella paikal- laanpysyvissä vyöhykkeissä ja solujen rikkoutumisella turbu­

lentissa alueessa (WAGNER 1977).

On ilmeistä, että leikkausvoimien vaikutus solujen tuotta­

vuuteen ja elinkykyyn vaihtelee huomattavasti kasvilajista riippuen. Catharanthus roseus -solujen on todettu pysyvän elinkykyisinä mekaanisesti sekoitetussa fermentorissa, jossa oli lapasekoitin, vielä sekoitusnopeudella 300 rpm. Toisaalta Nicotiana tabacumin ja Daucus carotan solut, joita kasvatet­

tiin samoissa olosuhteissa, menettivät nopeasti elinkykynsä jo sekoitusnopeudella 150 rpm (FOWLER 1982a).

TANAKA (1981) totesi mekaanisesti sekoitetut fermentorit parhaiksi kasvisolukasvatuksiin. Tanaka käytti tutkimukses­

saan Cudrania tricuspidata -soluja, jotka ovat varsin heik­

koja kestämään leikkausvoimia.

Käytetyt fermentorit olivat: Kuusilapaisella turbiinityyp- pisellä sekoittajalla varustettu fermentori, melatyyppisellä sekoittajalla varustettu fermentori, WAGNERin (1977) air­

lift -fermentori sekä kupla-kolonni -fermentori. Liitteessä 3 on esitetty käytettyjen fermentoreiden mitat ja koeolosuh­

teet. Fermentoreiden vertailussa kiinnitettiin huomiota solujen riittävään hapensaantiin, leikkausvoimien vaikutuk­

seen, sekoitukseen ja ilmakuplien dispersioon.

Parhaisiin tuloksiin päästiin melatyyppisellä sekoittajalla varustetulla fermentorilla. Liuostilavuus oli 5 dm , sekoi-3

3 3

tusnopeus 60 rpm ja ilmastusnopeus 0,5...1,5 dm /dm «min.

Turbiinityyppisellä sekoittajalla varustetussa fermentorissa oli sekoitus epätäydellinen silloin, kun solut kasvoivat suuressa tiheydessä. Ilmakuplien dispersio ei ollut tyydyt­

tävä, ja solujen hapensaanti heikkeni. Kuplakolonnissa vain n. 2/3 soluista pysyi suspensiossa ja air-lift -fermentorissa vain sisäputken sisällä päästiin hyvään sekoittumiseen.

6. KASVUN MITTAAMINEN SUSPENSIOKASVATUKSISTA 6.1. Solujen laskeminen

Koska kasvisolut kasvavat suspensioviljelmässä solukasaumina, pitää solut erottaa toisistaan ennen solujen laskemista.

Erottuminen saadaan aikaan esimerkiksi 5... 15 % :11a kromi- trioksidiliuoksella tai pektinaasilla.

Solukasaumien hajotuksen jälkeen suspensio laimennetaan so­

pivasti ja solut lasketaan laskemislevyllä. Yleensä laske­

taan kaksikymmentä satunnaisesti valittua kenttää yhtä levyä kohti ja valmistetaan viisi levyä jokaisesta suspensiosta.

Solujen lukumäärä ml:ssa alkuperäistä kasvuliuosta pysty­

tään laskemaan, kun laskettujen kenttien tilavuus tiedetään (STREET 1973).

6.2. Solumassan tilavuuden määritys

Tietty tilavuus solususpensiota sentrifugoidaan ja tuloksena

-3 3 —3 3

ilmoitetaan 10 dm solumassaa/10 dm kasvuliuosta (STEET 1 973) .

6.3. Solumassan kuivapainon määritys

Tietty tilavuus solususpensiota kuivataan lämpökaapissa ja

— 3 3 tuloksena ilmoitetaan solumassan kuivapaino g/10 dm kasvuliuosta.

6.4. Mitoottinen indeksi (= MI)

Mitoottisen indeksin määrittäminen mahdollistaa interfaasin ja myös muiden mitoosin vaiheiden suhteellisen pituuden mää­

rityksen. Solujen kokonais-kahdentumisajasta saadaan myös tietoa tämän indeksin avulla. GAMBORGin (1975) mukaan mi­

toottinen indeksi määritetään seuraavalla tavalla :

1 ml kiinnitysainetta (jääetikka + 95 % etanoli 1:3) sekoi­

tetaan 5 ml : aan solususpensiota. Kiinnitetyt solut siirre­

tään mikroskooppilevylle ja värjätään fuksiini-liuoksella.

Fuksiiniliuos valmistetaan seuraavalla tavalla: Valmistetaan varastoliuos A: 3 g fuksiinia 100 ml :ssa 70 % :sta etanolia sekä varastoliuos В : 10 ml liuosta A lisätään 90 ml : aan 5 % :sta fenolia tislatussa vedessä. Lisätään 45 ml liuosta В 6 ml : aan jääetikkaa ja 6 ml : aan 37 % :sta formaldehydiä.

Värjäyksen jälkeen odotetaan muutama minuutti, peitetään preparaatti levyllä ja kuumennetaan, kunnes ilmestyy pieniä

kuplia. Peitetään levyt paperilla ja muserretaan preparaat­

tia varovasti rullan avulla.

Lasketaan esimerkiksi 2000 tumaa ja määritetään mitoosissa olevien tumien lukumäärä. Mitoottinen indeksi lasketaan prosentteina seuraavan kaavan avulla :

„T Mitoosissa olevien tumien määrä

MI = — ———:--- Ï T--- X 1 00 Laskettujen solujen maara

Nopeasti kasvavilla solukoilla mitoottisen indeksin arvo on keskimäärin 3...5 %.

6.5. Solujen kokonaisproteiinimäärä

Solujen kokonaisproteiinimäärä voidaan määrittää seuraaval- la tavalla (STREET 1973): Kasvisolut kerätään suodattimetle ja pestään kahdesti kiehuvalla 70 % :11a etanolilla, kuivataan asetonilla ja siirretään suodatin soluineen tiettyyn tila­

vuuteen 1 N NaOH:a. Hydrolysoidaan 85 °C:ssa 100 minin ajan.

Liuos suodatetaan ja määritetään proteiinipitoisuus LOWRYn (1951) mukaan käyttäen standardina seerumin albumiiniä.

6.6. Soluhengitys

Kun solususpensiota ilmastetaan tietyllä nopeudella, voidaan solujen hengitysnopeus mitata ulostulevan ilman CC>2-pitoi- suutena (STREET 1973).

6.7. Muut menetelmät

Muita mahdollisia solukasvun määritysmenetelmiä ovat:

solujen DNA ja RNA-pitoisuuksien määrittäminen (STREET 1973), orgaanisen hiilen kokonaismäärän määrittäminen (KATZ 1954), sekä solurakenteen tutkiminen histologian ja histokemian keinoin.

7. DIGITALIS-SUVUN KASVEISTA SAATAVAT TUOTTEET 7.1. Sydänglykosidit

Kasvavan hyvinvoinnin mukana ovat erilaiset sydänsairaudet (esim. sydämen vajaatoiminta, kammiovärähtely, rytmihäiriöt, sydämen tiheälyöntisyys) huomattavasti lisääntyneet. Näihin tautitiloihin voidaan vaikuttaa lääkeaineilla, jotka kuuluvat steroideihin ja näiden glykosideihin. Synteettisiä prepa­

raatteja ei näiden lääkeaineiden valmistukseen käytetä, vaan ne eristetään kasveista (BJÖRK 1981).

Sydänaktiivistila glykosideillä on 17-asemassa tyydyttymätön laktonirengas, johon sydänaktiivinen vaikutus on sitoutunut.

Mikäli tämä laktonirengas on viisirengas, kutsutaan glykosi- dia kardenoliksi, jos taas kyseessä on kuusirengas, bufano- lideiksi.

Digitalis lanata on yleisimmin käytetty kasvi josta valmis­

tetaan sydänglykosideja. Sen lehdet sisältävät lanatosideja А, В ja C, joista saadaan valmistetuksi digoksiinia, digitok-

siinia ja gitoksiiniä, jotka ovat rakenteeltaan kardenolidejä, joihin on liittynyt kolmesta digitoksoositähteestä muodostu­

nut trisakkaridiryhmä. Kuvassa 19 on esitetty digitalis- kardenolidien rakenne (ALFERMAN 1980) .

Dia o ksünl Dicjiioksiini

dioksiini

A A

он н

H H H on

Kuva 19. Digitaliskardenolidien rakenne.

Digitalis-kasvi tuottaa steroidinsa pääasiassa lehden meso- fyllisoluissa. Tämä on solutyyppi, jossa on paljon kloro- plasteja. Normaalikasvi tuottaa n. 50/50 digoksiinia ja digitoksiinia. Digoksiinia pidetään tällä hetkellä arvok­

kaimpana tuotteena. Digitalis-kasveja kasvatetaan koko Keski-Euroopassa ja lääkeaineet eristetään kasvin lehdistä, sadonkorjauksen vaatiessa paljon käsityötä (BJÖRK 1981).

Kun Digitalis lanata -soluja on kasvatettu suspensioviljel- mänä, on havaittu solujen digoksiinipitoisuuden olevan huo­

mattavasti pienemmän kuin normaalikäsvin lehdissä (LUI, 1980) . Liitteessä 4 on esitetty erilaisten kasvisoluviljelmien ja kokonaisten kasvin osien digoksiinipitoisuudet ja nk. kasvu-

kerroin. Taulukosta voidaan havaita, että ylivoimaisesti suurin digoksiinipitoisuus on havaittu luonnossa kasvaneen Digitalis lanatan lehdistä.

Luin mukaan prekursoriksi lisätty progesteroni lisää digok- siinin tuoton solususpensioviljelmässä suunnilleen kaksin­

kertaiseksi. Kasvuhormoneista 2,4-D estää kardenolidien muodostumista, gibberelliinihappo ja mefluididi lisäävät viljelmien digoksiinipitoisuuksia.

Kahdeksan ja kaksitoista viikkoa vanhojen lehtiviljelmien todettiin sisältävän enemmän primäärisiä glykosideja kuin neljän viikon ikäisten viljelmien. Tuloksien perusteella on arveltu, että kasvi syntetisoi jo varhaisessa vaiheessa geniinit, joista sekundääriset ja primääriset sydänglykosi- dit syntetisoituvat ja että nuorten lehtien alhaiset glyko-

sidipitoisuudet aiheutuvat niiden nopeasta kasvusta (LUI 1981) Jotta solususpensioviljelmät saataisiin kannattavalle tuo­

tantotasolle, pitäisi suorittaa selektio-ohjelma, sillä uudet solususpensioviljelmät ovat varsin heterogeenisiä metaboliatuotteiden tuottamisen suhteen.

Digitalis lanata -soluviljelmillä on havaittu, että eri solu- kannat tekevät biotransformaatioreaktioita aivan eri tavalla.

BARTZ (1981) suoritti selektion lähtien kasveista, joiden lehtien digoksiinipitoisuus oli suuri ja sai tulokseksi jou­

kon soluja, joiden ainoa biotransformaatioreaktio oli ß- metyldigitoksiinin 12-ß-hydroksylaatio, sekä joukon soluja,

jotka tuottivat ainoastaan purpurea-glykosidi-A: ta. Muuta­

milla soluviljelmillä ei ollut lainkaan biotransformaatio- kykyä. Tämä soluviljelmien heterogeenisyys osoittaa selväs­

ti kasvikantojen selektion tarpeellisuuden, kun kehitellään biokemiallisia prosesseja sekundääristen metaboliatuotteiden tuottamiseksi.

7.2. Sydänglykosidien markkinat

Digitalis-glykosidien kulutus on maantieteellisesti melko rajoittunutta ollen suurinta Keski-Euroopassa (taulukko 1).

Digoksiinin kulutus maailmassa on n. 1000 kg vuodessa.

Kulutuksen arvioidaan pienenevän vuoteen 1990 mennessä 700 kg : aan vuodessa. Digitalis-glykosidien käytön vähene­

minen johtuu mm. uusien spesifimpien lääkeaineiden tulosta markkinoille. Johdannaisten, kuten ß-metyylidigoksiinin, kulutus näyttää kuitenkin olevan lisääntymässä (LAAKSO 1982b) . Suomessa käytettiin vuonna 1977 sydänaktiivisia glykosideja

(annosmuodossa) 4 108 000 mk:n arvosta. Digoksiinia käytet­

tiin 73 61 9 000 annosta, mikä vastaa 19,7 kg : aa digoksiinia.

Digitoksiinia käytettiin 440 000 annosta, joka vastaa 44 g : aa digitoksiinia (Nordisk läkemedelsstatistik 1975-1977).

Taulukko 1. Digitalis-glykosidien kulutuksen jakautuminen maailmassa prosentteina kokonaiskulutuksesta

(SRI 1981).

digoksiini (%)

digitoksiini (%)

johdannaiset (%)

USA 25 15 10

Länsi-Eurooppa 60 65 80

Muut 15 20 10

7.3. Digitalis-soluviljelmien tuotteiden analysointi 7.3.1. Radioimmunologinen analyysi (RIA)

Spesifisellä radioimmunologisella menetelmällä pystytään määrittämään tutkittava yhdiste suoraan kasvinäytteistä.

RIA-menetelmällä on mitattu mm. ajmalisiinin, digoksiinin, ergokristiinin, ergotamiinin, limoniinin, lysergihapon, nikotiinin, serpentiinin ja vindoliinin pitoisuuksia.

RIA-menetelmä perustuu merkkaamattoman ja radioaktiivisesti merkatun antigeenin väliseen kilpailuun vasta-aineen (anti- bodin) sitoutumiskohdista, joita on rajoitetusti tarjolla.

Menetelmä rakentuu siis suurelta osin korkea-affiinisen ja spesifisen antiseerumin varaan. Tästä johtuen radioimmuno­

logisten menetelmien kehittyminen on tiiviisti sitoutunut antiseerumin tuottamiseen (LEHTOLA 1981).

Ensimmäinen farmakognostinen RIA-menetelmän sovellutus oli digoksiinipitoisuuden määrittäminen Digitalis lanata -kasvis­

ta (WEILER 1976). Digitalis lanatan digoksiinipitoisuuksia ovat tutkineet RIA-menetelmällä myös: WEILER (1977), WEILER &

WESTEKEMPER (1979), LEHTOLA (1980, 1981).

RIA-menetelmä on erittäin herkkä ja spesifinen. VOGELin (1981) mukaan digoksigeniinin johdannaisten havaittavuusraja oli 0,5 ng/tutkittava näyte. Koska valittu antiseerumi oli hyvin spesifinen tutkituille digitoksigeniini- ja gitoksi- geniinijohdannaisille, ei kasviuutteita tarvinnut lainkaan puhdistaa ennen analysointia. Tuotteiden uuttamiseen kasvi- solunäytteistä voidaan käyttää esimerkiksi 70 %:sta etanoli- liuosta .

7.3.2. Ohutlevykromatografia

Ohutlevykromatografia mahdollistaa kardenolidien ja geniinien tutkimisen, sillä primääriset glykosidit (lanatosidit А, В ja C), sekundääriset glykosidit (digoksiini, digitoksiini ja gitoksiini) ja geniinit (digoksigeniini, digitoksigeniini ja gitoksigeniini) eroavat kromatografisesti ryhmiin (LUI 1981).

Menetelmän ohutlevykromatografia-ajon suorittamiseksi on esittänyt mm. BÖHME (1979).

7.3.3. Korkeapainenestekromatografia (HPLC)

Sydänglykosidien kvalitatiiviseen ja kvantitatiiviseen analysointiin soveltuu myös korkeapainenestekromatografia.

Tätä menetelmää on käytetty sydänglykosidien erottamiseen mm. Nerum-lajeista, käyttämällä gradienttieluointia kään-

teisfaasikolonnissa (TITTEL 1981).

MATERIAALIT JA MENETELMÄT 1. KÄYTETYT RAVINTOALUSTAT

Kaikissa kasvatuksissa käytettiin mukaeltua Murashige-Skoog ravintoalustaa (taulukko 2). Tähän perusalustaan lisättiin Kluyver-kasvatukeissa 4 ja 5 gibberelliinihappoa (Sigma, grade III) 5 mg/dm . Solukasaumien hajotuskokeissa lisät­

tiin 0,5 % hiivauutetta. Valmiin ravintoliuoksen pH säädet tiin 6:een 0,5 M:11a NaOH:11a ennen autoklavointia. Ravin toliuokset steriloitiin autoklavissa 107,87 kPa:n paineessa 20 min:n ajan ennen kasvatuksia. Kaikki käytetyt yhdisteet olivat pro analyse -laatua.

Taulukko 2. Mukaeltu Murashige-Skoog (III) -ravintoalusta.

Yhdiste Valmistaja Määrä (g/dm3)

C.aCl2* 2H20 Mere 0,444

kh2po4 Merc 0,340

Na2EDTA-2H20 J.T.Baker Chemicals 0,037

нзвоз Merc 0,006

Mnso4-h2o Merc 0,017

ZnS04-7H20 Merc 0,009

K1 Merc 0,0008

Na2Mo04-2H20 Merc 0,00025

nh4no3 J.T.Baker Chemicals 0,090

KNO3 Merc 4,591

MgS04-7H20 Merc 0,370

FeS04-7H20 Merc 0,028

Tiamiini-HC1 Merc 0,05-10-2

Pyridoksiini-HCl Merc

CM0

1Л

0

Nikotiinihappoamidi Merc

cm

10

0

0

m-inositoli Fluka 0,10

Taulukko 2 jatkuu :

Yhdiste Valmistaja 3

Määrä (g/dm ) L-alaniini Sigma 2,97 • 1 О*"2

L-arginiini Fluka 0,31-1 о-2

L-asparagiini Fluka о ы 00 о 1 1ч)

L-asparagiinihappo Mere 0,17•1 О-2

L-glutamiini Merc 0,03‘Ю"2

L-glutamiinihappo Merc ¹,58•10~2

L-glysiini Merc ⁰,47•10~2

L-histidiini Merc 0,005 * 1 О-2

L-hydroksiprOliini Merc 0,13-Ю"2

L-leusiini Fluka 0,50•1 О-2

L-lysiini Fluka ⁰,20•1 О-2

L-metioniini Fluka 0,005•1 О-2

L-fenylalaniini Merc 0,005 * 1 0~2

L-proliini Fluka ⁰,20-10"2

L-serini Merc 1 , 28•1 О-2

L-treoniini Merc 0,41 * 1 О™2

L-tyrosiini Merc 0,005-10"2

L-valiini Merc ⁰,23•10~2

Sakkaroosi Suomen Sokeri 30

Bentsyladeniini Sigma

(N

1О

(NОО

2. KÄYTETTY DIGITALIS LANATA -SOLUKANTA

Kaikissa kasvatuksissa käytettiin Digitalis lanata -solukan- taa, joka oli saatu Tukholman teknillisen korkeakoulun bio­

kemian ja biotekniikan osastolta. Soluviljelmä oli valmis­

tettu GARVEn (1980) mukaan.

Solukanta oli kasvatettu Murashige-Skoog alustalla ja säi­

lytetty ravistelussa (175 rpm) 20 °C:ssa 12+12 tunnin jaksoja pimeässä ja valoisassa.

Kuva 20. Digitalis lanata kailus-solukkoa agar- alustalla.

3. KASVUN MÄÄRITYSMENETELMÄT

3.1. Solujen märkäpainon määrittäminen

Märkäpainon määrittämiseksi solut suodatettiin kasvuliuok- sesta metallisuodattimella, jonka "silmäkoko" oli 0,5 mm.

Solut pestiin vedellä ja siirrettiin huokoisen paperikerrok­

sen päälle, jossa suuri osa solukasautumien pintaan tarttu­

neesta vedestä imeytyi pois. Tämän jälkeen solut siirret­

tiin maljalle ja punnittiin.

3.2. Solujen kuivapainon määrittäminen Vakuumikuivaus:

Märkäpainomäärityksen jälkeen solut kuivattiin vakuumissa 60 °C:een lämpötilassa 12 tunnin ajan, jonka jälkeen solut punnittiin.

Pakastekuivaus:

Märkäpainomäärityksen jälkeen solut jäädytettiin -20 °C:ssa ja jäätyneet solut kuivattiin kylmäkuivaajassa, jonka jäl­

keen ne punnittiin. Tätä menetelmää käytettiin useimpiin määrityksiin, sillä oletettiin sen olevan vakuumikuivausta parempi menetelmä solujen metaboliatuotteiden säilymisen kannalta.

3.3. Kasvuliuoksen sakkaroosipitoisuuden määrittäminen

Kasvuliuoksen sakkaroosi hajotettiin ensin invertaasientsyy­

niin avulla glukoosiksi, jonka jälkeen glukoosipitoisuus määritettiin entsymaattisella määritysmenetelmällä.

Glukoosin määritysmenetelmä perustuu glukoosioksidaasin glu­

koosin hapetuksessa synnyttämän vetyperoksidin hapetusreak- tioon o-dianisidiinin kanssa. O-dianisidiinin hapetus tapah­

tuu peroksidaasin välityksellä. Reaktiossa o-dianisidiinistä syntyy värillinen tuote, joka määritetään spektrofotometri- sesti.

Sakkaroosin hajotus glukoosiksi:

Reagenssit:

- Invertaasi

- 0,1 M asetaattipuskuri pH 4,5 Suoritus :

Kasvuliuosnäytteet laimennettiin veteen suhteessa 1/30, jolloin niiden sakkaroosipitoisuudet olivat n. 0,5 . . . 1 g sakkaroosia/dm . Invertaasi liuotettiin asetaattipuskuriin 3 ja tätä liuosta pipetoitiin näytteisiin siten, että kon- sentraatioksi tuli 1 mg invertaasia/ml näytettä. Liuosten annettiin seistä koeputkissa huoneenlämpötilassa yli yön.

Glukoosipitoisuuden määritys:

Reagenssit:

- entsyymiliuos: 10 mg glukoosioksidaasia ja 4 mg peroksidaasia 100 ml:ssa 0,5 M TRIS-HCl -puskuria, pH 7,0

-0,4 % о-dianisidiini etanolissa

- reagenssiliuos: entsyymiliuosta ja o-dianisidiini- liuosta sekoitetaan tilavuussuhteessa 50:1 juuri ennen käyttöä.

- 5 M H2S04

Suoritus :

Koeputkiin pipetoitiin 0,2 ml invertaasilla käsiteltyjä näytteitä ja temperoitiin 5 min:n ajan vesihauteessa 30

°C:een lämpötilassa. Tämän jälkeen lisättiin 2 ml reagens- siliuosta ja inkuboitiin 5 min:n ajan vesihauteessa 30 °C:ssa.

Reaktio pysäytettiin lisäämällä 5 ml 5 M H2S04:a koeputkiin.

Liuosten absorbanssit mitattiin spektrofotometrillä aallon­

pituudella 525 nm.

Sakkaroosipitoisuuden määritys :

Näytteiden sakkaroosipitoisuudet määritettiin standardisuo- ralta, joka oli saatu käsittelemällä pitoisuudeltaan tunnet­

tuja sakkaroosiliuoksia samalla tavalla kuin näytteitä.

4. DIGITALIS-KARDENOLIDIEN MÄÄRITYS

4.1. Solunäytteiden mekaaninen käsittely ennen määritystä

Kardenolidipitoisuuden määritystä varten solumassa kuivat­

tiin kylmäkuivaajassa, jonka jälkeen solut jauhettiin huhma­

ressa ja siivilöitiin homogeeniseksi jauheeksi metallisiivi- lällä, jonka silmäkoko oli 0,2 mm.

4.2. Tuotteen uutto solunäytteistä

- Homogeenistä solujauhetta uutettiin 80 % :11a eta­

nolilla neljän tunnin ajan 74 °C:ssa vesihauteessa, käyttäen pystyjäähdyttäjää. Kun .seos oli jäähty­

nyt suodatettiin solumassa pois ja käytettiin liuos digoksiinipitoisuuden määritykseen.

- Homogeenista solujauhetta uutettiin 20 % :11a eta­

nolilla neljän tunnin ajan 74 °C:ssa, välillä se­

koittaen. Uuton jälkeen seos sentrifugoitiin ja supernatantti käytettiin digitoksiiniekvivalent- tien määritykseen.

4.3. Digoksiinipitoisuuden radioimmunologinen määritys Sopivasti vedellä laimennetuista näytteistä suoritettiin digoksiinipitoisuuden määritys Farmoksen digoksiinikitillä, kittipakkauksen ohjeen mukaan. Laskulaitteenä oli Nuclear enterprices, NE 1612.

4.4. Digitoksiininsukuisten aineiden radioimmunologinen määritys

Sopivasti vedellä laimennetuista näytteistä tehtiin digitok- siiniekvivalentti -määritys VOGELin (1979), WEILERin (1976) ja NICKELin (1977) mukaan. Digitoksiiniekvivalenttien määrä ilmaisee digitoksigeniinin glykosidien pitoisuuden solu- massassa. Lasku laitteena oli Beckmanin CPM-100.

5. SIIRROSTUS

Siirrostettaessa soluja agarin pinnalta suspensiokasvatuk- seen ravistelupulloon käytettiin pinsettejä, joiden avulla siirrettiin muutamia solukasaumia nestemäiselle kasvualus­

talle. Veistä käytettiin apuna solukasaumien pienentämiseksi.

Siirrostettaessa solususpensiosta toiseen käytettiin siir- rostusväliä, joka vaihteli 10 d:sta 14 d:een. Menetelmä oli seuraava:

Kasvuliuos soluineen kaadettiin metallisiivilälle, jonka

"silmäkoko" oli 0,5 mm. Solukasaumia hajotettiin pienemmäk­

si lusikan avulla ja tummat, kuolleen näköiset solut poimit­

tiin pois. Tämän jälkeen soluja pestiin steriilillä vedel­

lä ja siirrostettiin sitten lusikalla uuteen kasvuliuokseen.

5.1. Siirrosteen painon määrittäminen

Siirryttäessä ravistelupulloista suurempiin kasvatuksiin määritettiin siirrosteen paino seuraavasti: