Solumassan kasvatuslaitteilta vaaditaan, että biomassa ja kasvuliuos saadaan riittävän hyvin sekoitetuksi, jotta pääs
täisiin mahdollisimman lähelle homogeenisiä olosuhteita.
Mikrobikasvatuksissa pyritään yleensä tehokkaaseen sekoi
tukseen, jotta saavutettaisiin hyvä aineensiirto kaasufaa- sista liuokseen ja mikrobien suuri hapentarve tulisi tyydy
tetyksi. Kasvisoluviljelmät eivät kuitenkaan tarvitse teho
kasta sekoitusta hapensaannin vuoksi. Tehokkaan sekoituksen aiheuttamat leikkausvoimat vahingoittavat kasvisoluja, sillä soluseinät rikkoutuvat helposti. Solujen kestävyys vaihte- lee kuitenkin eri kasvilajeilla suuresti.
Sekoituksen haitallisista vaikutuksista huolimatta pitää saada aikaan riittävän hyvä sekoitus, jotta solut pysyisivät suspensiossa ja tuotetta muodostuisi mahdollisimman paljon.
Kasvisolut ovat suuria ja raskaita verrattuna mikrobisolui- hin ja laskeutuvat nopeasti, jos sekoitus on puutteellinen.
Vaihtoehtona fermentoreille, joissa sekoitus tapahtuu mekaa
nisesti esimerkiksi pyörivien lapojen avulla ovat
air-lift-leikkausvoimia, mutta vaikeutena on saavuttaa kunnollinen sekoitus ilmastamatta liikaa. Kasvatuksen aikana solusus- pension viskositeetti kasvaa ja aiheuttaa kasvatuksen loppu
vaiheessa usein sekoitusvaikeuksia.
5.2. Kasvisolukasvatuksissa käytettyjä fermentoreita 5.2.1. Panoskasvatuksiin käytettyjä fermentoreita
Ensimmäinen tutkimus kasvisolujen kasvatuksesta isommassa kasvatusastiassa julkaistiin v. 1959 (TULECKE ja NICKELL).
Kasvatus tapahtui 20 dm : n reaktorissa, joka oli varustettu 3 neljällä putkella : ilman sisään- ja ulostuloputket, kasvu- liuoksen sisääntuloputki ja näytteenottopatki. Suodatettu paineilma sai aikaan sekä ilmastuksen että sekoituksen
(kuva 4).
Myöhemmin WANG ja STABA (1963) käyttivät samantapaista kas
vatus järjestelyä kasvattaessaan piparminttusoluja, mutta he käyttivät kahta astiaa sarjassa yhden astian sijasta. Ilmas
tuksen lisäksi käytettiin magneettisekoitusta ja ilmastus tapahtui huokoisen lasisuodattimen kautta. Hyöty toisesta kasvatusastiasta ei ollut ilmeinen ja toinen astia toimi yleensä huonosti (kuva 5).
Suodatin
1
Ilma Ilma
Kuva 4. Tulecken ja Nickellin 20 dm :n panosfermen3 tor! .
f
IlmaJäähdytin
_______ 1 I
Sekoitus-Sekoittaja sauva Wangin ja Staban kahden astian kasvatus- järjestely.
Kuva 5.
Vuonna 1971 VERMA ja VAN HUYSTEE kehittivät kasvatuslait- teen, joka heidän mukaansa vähensi ratkaisevasti kontaminaa tiomahdollisuuksia näytteenottovaiheessa ja lisättäessä kasvuliuosta. Kasvatusastiana oli 5 dm :n kolmikaulainen tislauskolvi, johon oli lisätty venttiili näytteenottoa var ten. Yhdestä kaulasta poistuivat kaasut, toisessa oli se
koittaja ja kolmannessa oli F:n muotoinen lasiyhde ilmas
tusta ja kasvuliuoksen lisäystä varten. Näyteventtiilinä oli kolmitievakuumihana, joka oli järjestetty siten, että venttiili ja näyteputki voitiin huuhdella steriilillä vedel lä jokaisen näytteenoton jälkeen. Näytteenottojen välillä näyteputken pää pidettiin 50 % :ssa etanolissa (kuva 6).
tfooitor/
flsnu.
Kuva 6. Verman ja van Huysteen kehittämä kasva- tuslaite.
Vuonna 1970 VELIKY ja MARTIN kehittivät kasvatuslaitteen, joka muistutti käännettyä Erlenmeyer-kolvia. Ilmastuksen lisäksi kasvatusta sekoittivat astian pohjalla olevat teflon päällysteiset magneettisekoittajät. Myös näytteenotto ta
pahtui astian pohjalta. Paitsi panoskasvatuksiin, voidaan tätä laitetta käyttää myös puolijatkuviin kasvatuksiin, joissa ajoittain lisätään uutta kasvuliuosta ja poistetaan solumassaa. Laitetta käytettiin Ipomea-suvun -solujen kasva tukseen ja sen rakenne on esitetty kuvassa 7.
Ilma
Ilma Kasvuliuos
Jäähdytte ja
Kuva 7. Velikyn ja Martinin kehittämä kasvatus- laite (1970) .
Edellä kuvattujen kasvatuslaitteiden jälkeen siirryttiin yleisesti käyttämään tavallisia melasekoitteisia turbiini- reaktoreita (kuva 8). Esimerkiksi Wilsonin (1978) mukaan paras fermentori solususpensiokasvatuksiin on mekaanisella
sekoituksella ja erillisellä ilmastuksella varustettu laite, näyttämillään air-lift -fermentoreilla Wilson ei kasvatus
ten loppuvaiheessa saanut aikaan riittävän hyvää sekoitusta ja muodostui sekoittumattomia vyöhykkeitä.
Myös Tanakan mukaan paras fermentori kasvisolukasvatuksiin on melatyyppisellä sekoittajalla varustettu ilmastettu lai
te (TANAKA 1975). Kuvassa 9 on esitetty fermentorin rakenne ja kasvisolukasvatuksiin soveltuvan fermentorin mitat 1 ja 5 dm3:n fermentoreille (TANAKA 1981).
Siirrosta
—+ -
llma^ Zj
--- tr PaBP°
— 4— Emäs
ti" i--- *pH elektrodi Vesi —►
ab
X
SekoittajaKuva 8. Melasekoitteinen turbiinireaktori (MARTIN 1980).
Dt = astian halkaisija Dj- = sekoittajan läpimitta
= nesteen korkeus Wd = sivulevyn leveys
= sekoittajan leveys
Nestetilavuus 1 dm3 5 dm3
Dt 11,3 cm 20,0 cm
H1 10 cm 16 cm
Ilmastus 8 reikäinen
rengas
8 reikäinen rengas
Sivulevyjen määrä 0 0
Sekoittaja muotoiltu lapa muotoiltu lapa
D.i 7,0 cm 13,3 cm
Wi 5,0 cm 8,0 cm
H .X 5,0 cm 8,0 cm
Sekoitusnopeus 225...630 rpm 60 rpm
Ilmastus 3 3
1,0 dm /dm .min 0,5 ... 1 ,5 dm3/
dm3.min
Kuva 9 Tanakan kasvisolutermentorin rakenne
Air-lift -fermentoreita suunnitellaan yleensä kahdella eri tavalla : Ylöspäin virtaavan ilmastetun liuoksen ja alaspäin virtaavan liuoksen erottaa toisistaan putki, joka on fermen-
torin keskellä tai virtaukset kulkevat kahdessa erillisessä putkessa, jotka on yhdistetty ylä- ja alaosistaan.
WAGNER (1977) käytti fermentoria, jossa sekoitus aikaan
saadaan ilmastuksen ja sisäputken avulla (kuva 10). Pääs
tiin varsin hyvään sekoitukseen rasittamatta soluja suuril
la leikkausvoimilla. Kasvatettaessa Morinda citrifolia -solu
ja todettiin antrakinonisaannon olevan 30 % parempi kuin ravistelupullokasvatuksessa ja kaksinkertainen verrattuna mekaanisesti sekoitettuihin kasvatuksiin.
Kuvassa 11 on esitetty tyypilliset kasvukäyrät optimaalisis
sa kasvuolosuhteissa WAGNERin air-lift -fermentorissa. Solu
jen nopea kasvu tapahtuu selvästi eri aikaan kuin antraki- nonin muodostuminen.
Jäähdytys/ lämmitys vesi
777Å--Kuva 10. Wagnerin air-lift -fermentori.
Kuva 11. Morinda citrifolia -solujen kasvatus 10 dm :n
з
air-lift -fermentorissa. Siirrosteen koko 10 %, lämpötila 28 °C, ilmastus 0,5 dm-Vdnß-min. Fermentor in mitat: D. /D = 0,44, D /Н = 0,47.
la. ci ö.
Wagner (1977) käytti myös fermentoria, jossa oli sisäputken lisäksi turbiini. Turbiini toimii pumpun tavoin, pakottaen kasvuliuoksen nousemaan ylöspäin sisäputken ja fermentorin seinämän välissä. Liuos virtaa alaspäin sisäputken sisällä
(kuva 12).
Fermentorissa jouduttiin käyttämään suuria turbiinin pyöri
misnopeuksia ja kasvisolut joutuivat alttiiksi suurille leik- kausvoimille.
Myös KIESEn (1980) mukaan on air-lift -fermentori parempi vaihtoehto kasvisolukasvatuksiin kuin mekaanisesti sekoi
tettu fermentori. Hänen mukaansa huonot sekoitustulokset
WÅ
—Sisaputki
Jäähdytys-/lämmitys vesi
Turbiini
Kuva 12. Fermentori, jossa on sisäputki ja turbiini (WAGNER 1977).
air-lift -reaktoreissa ovat johtuneet fermentorin korkeuden ja halkaisijan väärästä suhteesta. Kiesen mukaan korkeuden ja halkaisijan suhteen tulisi olla vähintään 5.
Kiese on suunnitellut fermentorin laboratoriokäyttöön, jonka mitat on optimoitu siten, että saavutetaan liuosnopeudet,
jotka ovat riittävät varmistamaan hyvän sekoituksen. Fer
men torin ilmastus voi tapahtua useilla tavoilla vaihtelemalla pohjakappaleita. Kuvassa 13 on esitetty fermentorin rakenne ja mitat.
TOWNSLEY (1983) on kehittänyt pilot-plant -kasvatuksiin so
veltuvan air-lift -fermentorin, jossa liiallinen ilmastus on vältetty kierrättämällä ilmaa uudelleen ja lisäämällä vain
Ilma
f
Laippalütos
Jäähdytys/
lämmitys
Huokoinen levy
Ilma
f
Kuva 13. Laboratoriokäyttöön suunniteltu air-lift -fermentori (KIESE 1980).
Nesteen korkeuden suhde halkaisijaan : 4,55 Käyttötilavuus 4,0 dm3
Mitat kuvassa mm:nä
vähän uutta ilmaa. Fermentorin rakenne on esitetty kuvassa 14. Fermentorissa kasvatettiin Triptergium wildordii -soluja.
Jotta päästiin hyvään sekoitukseen nestetilavuudettaan
10 dm^:n fermentorissa, kierrätetiin ilmaa nopeudella 1,1
3 3 —3 3
dm /dm •min. Uutta ilmaa lisättiin nopeudella 10*10 dm / , 3 .
dm -mm.
TOWNSLEYN 10 dm :n fermentoria käytettiin siirrostettaessa3
55 dm :n fermentoria. Solut siirrettiin ilmanpaineen avul3 la 2,5 cm halkaisijaltaan olevan teräsputken ja pallovent- tiilin kautta suurempaan fermentoriin. Aseptiikan vuoksi oli molemmissa fermentoreissa steriloitavat venttiilit.
Kaikki kiertoilman suodattimet ja nesteloukku olivat lämmi
tettyjä, jotta vettä ei kondensoituisi suodatusjärjestelmään.
Fermentorin sisäputki oli suunniteltu kartiomaiseksi, jotta saavutettaisiin hyvä sekoitus myös astian pohjalla.
loukku
Kuva 14. Townsleyn (1983) air-lift -fermentori.
A = vaihdettava teräsputki C = kartiomainen putki ruos
tumattomasta teräksestä F = bakteerisuodatin
H = lämmittäjä M = virtausmittari
P = ilmapumppu T = ne s te-"1oukku"
= 1" ruostumaton palloventtiili V
ROUSSEAU'n (1980) mukaan sekoituksen tehokkuuteen vaikutta
va suure air-lift -fermentorissa on kaasun virtausnopeuden suhde fermentorin kokonaishalkaisijaan. - Sekoitusnopeus kasvaa kaasun virtausnopeuden kasvaessa, mutta ei suoravii
vaisesti. Havaittiin, että kriittiseen virtausnopeuteen saakka sekoittuminen parani nopeasti, mutta suuremmilla vir
tausnopeuksilla parantuminen oli hyvin hidasta. Kriittisen virtausnopeuden arvo riippuu fermentorin yksityiskohdista ja pitää etsiä kokeilemalla.
Suunniteltaessa air-lift -fermentoria, jossa sekoituksen tehokkuus on kriittinen tekijä, pitää seuraavat seikat ottaa huomioon :
- Reaktorin korkeuden suhde halkaisijaan tulee olla riittävän suuri,
- ylöspäin virtaavan ja alaspäin virtaavan nesteen tilavuuksien pitää olla yhtäsuuret,
- pitää etsiä optimi kaasun virtausnopeudelle, jota suuremmalla nopeudella sekoitus ei enää merkittä
västi parane.
SMARTin (1981) mukaan air-lift -fermentorissa on ristiriita hyvän sekoituksen saavuttamisessa ja ilmastuksen pitämisessä riittävän pienenä vielä osaksi selvittämättä, mutta myös hänen mukaansa air-lift -fermentorit soveltuvat paremmin kasvisolukasvatuksiin kuin tavanomaiset turbiinikäyttöiset laitteet.
5.2.2. Puolijatkuvissa ja jatkuvissa kasvatuksissa käytettyjä fermentoreita
Yksinkertaisimmillaan puolijatkuvaan kasvatukseen käytetty fermentori on panos-fermentori, josta on mahdollista poistaa ajoittain kasvuliuosta soluineen ja lisätä vastaava määrä uutta kasvuliuosta. Solujen annetaan yleensä kasvaa lähelle maksimisaantoa ennen kasvuliuoksen uudistamista. Solumassan määrä voidaan pitää lähes vakiona säätelemällä poistetun liu
oksen määrää ja poistoväliä.
Jatkuvassa kasvatuksessa solujen jakautuminen tapahtuu määrä
tyllä nopeudella, muuttumattomassa ympäristössä. Solujen jakautumisnopeus riippuu kasvua rajoittavan substraatin konsentraatiosta Monodin kaavan mukaan:
Monodin kaava :
kasvua rajoittavan substraatin kon- sentraatio
tasapainovakio
kasvunopeuskerroin rajoitetulla substraattikonsentraatiolla maksimikasvunopeuskerroin
Yleensä jatkuvatoimiset fermentorit toimivat parhaiten kun solutiheys on melko pieni, esimerkiksi 4 g kuiva-ainetta/
dm3 (WILSON 1980).
MILLER (1968) käytti jatkuvatoimista kasvatuslaitetta (kuva 15). Mielenkiintoinen piirre laitteessa oli automaattinen poistoventtiili, joka toimi ajastimen ja releen ohjaamana.
Kasvuliuosta syötettiin fermentoriin jatkuvasti ja poistet
tiin 20 min : n välein.
/?av/nnc^va ras toon
Moottori
Kuva 15. Millerin käyttämä jatkuvatoiminen fermen- tori (KURZ 1979).
KURZin (1973) käyttämässä jatkuvatoimisessa kasvatuslait- teessa saadaan sekä ilmastus että sekoitus aikaan paine- ilman avulla. Ilmaa päästetään kasvatusastiaan säännölli
sinä pulsseina ja syntyy suuria kuplia, jotka liikkuvat hitaasti ylöspäin. Synkronoitu pumppu huolehtii kasvuliu- oksen virtauksesta fermentoriin ja sieltä pois. Kuvassa 16 on esitetty fermentorin rakenne.
h'uoS
/Ímaj^íuo с/a. Asi
Kuva 16. Kurzin käyttämä jatkuvatoiminen fermentori (KURZ 1979) .
WILSON (1980) kehitti jatkuvatoimisen fermentorin, jonka rakenne on esitetty kuvassa 17. Tämän tyyppistä fermento
ria on käytetty paljon Acer-suvun solujen tutkimiseen.
Epäilemättä jatkuvatoimiset kasvatukset ovat erittäin hyö
dyllisiä tutkittaessa kasvisolujen kasvatuksen biokemiaa, kyseenalaista on kuitenkin soveltuvatko ne sekundääristen metaboliatuotteiden tuottoon suuressa mittakaavassa. Puoli-
jatkuvien kasvatusten soveltaminen sen sijaan saattaisi hyvinkin tulla kysymykseen (FOWLER 1982b).
Swi
U PEL
P!
Kuva 17. Wilsonin kehittämä jatkuvatoiminen fermentori A = ilmastaja, AI = ilman sisääntulo, AO = ilman ulostulo, CL = kierrätys, CLD = nestepinnan säätö
laite, CRV = kasvuliuossäiliö, CW = puuvilla- suodatin, DD = solutiheyden mittaus, F = ilman- suodatin, FI = virtausmittari, GC = lasiputki lämpötilansäätöä varten, IMR = kasvuliuoksen välivarasto, MCL = elohopeakloridipesulinja, MFU = kasvuliuoksen suodatusyksikkö, MS = mag- neettisekoittajan moottori, MSL = uuden kasvu- liuoksen lisäyslinja, OS = liuoksen ulostulo- venttiili, PEL = paineentasauskierrätys, SR = näytevarasto, SWL = steriilivesilinja, ST = näyteputki, TCW = lämpötilansäätövesi.
Toisaalta jatkuvatoimiset kasvatukset voivat sopia hyvin kaksivaiheisiin prosesseihin. ALFERMAN ( 1977) kehitti kaksi vaiheisen prosessin ß-metyldigitoksiinin biotransformaatioon ß-metyldigoksiiniksi Digitalis lanata -soluviljelmän avulla.
Ensimmäisessä vaiheessa tapahtui jatkuvatoiminen kasvatus, ja saatiin muodostumaan biomassaa hyvällä saannolla. Toises sa vaiheessa tehtiin biotransformaatio panosprosessina.
5.2.3. Kasvisolukasvatuksissa käytettyjen fermentereiden vertailu
WAGNER ( 1977) on tutkinut Morinda citrifolian solukasvua ja antrakinonin tuottoa erilaisissa fermentoreissa. Tutki
muksen perusteella sekä solusaanto, että antrakinonin tuotto vaihtelee huomattavasti riippuen fermentorista. Kuvassa 18 on esitetty vertailun tulokset.
4 5
ä~°
■u aidrn* /0 dm1
Oi 5 dm/jmtrift IOO rprn
10cLa?