VESISTÖT JA KIINTOAINEEN MERKITYS eDNA-NÄYTTEENOTOSSA

Rapuruttoitiöiden suodatuskokeita ja tunnistusta luonnonvesinäytteistä häiritsee luonnonvesien korkeat kiintoainepitoisuudet. Mitä sameampaa suodatettava vesi on, sitä pienemmiksi lopulliset näytemäärät jäävät. (Wittwer ym. 2018b).

Suomen järvet ovat tyypillisesti vähävetisiä, matalia ja syvänteiden pinta-alalta niukkoja, mutta voivat erota ominaisuuksiltaan toisistaan hyvinkin paljon. Järvien luokittelu tapahtuu

perustuotannon, planktonin klorofyllin määrän, rehevyysasteen, humuspitoisuuden ja happamuuden määrittelyn avulla. Humuskuorma johtuu valumista ympäristöstä, kuten maaperästä, kallioperästä, sekä jäteveden valumista. Eloperäisen aineksen lisäksi voivat savimaan liuennut kiintoaines ja ravinteet aiheuttaa veden samentumista. Järven trofia-aste määritetään planktonin perustuottajien määrän tai aktiivisuuden perusteella. Perustuottajiin eli kasviplanktonin biomassaan kuuluvat eri planktonlajit, koloniat ja rihmat. Eläinplanktonia ovat hankajalkaiset (Copepoda), vesikirput (Cladocera), rataseläimet (Rotifera), alkueläimet (Protozoa) ja esimerkiksi kalan toukka-asteet. Eläinplanktonin koko vaihtelee tavallisesti 0,1-5 mm välillä (Kuva 7). (Kobayashi ym. 2009). Kasviplanktoneihin kuuluvat mikroskooppiset levät voivat ovat kooltaan 0,2-2,0 µm (pikofytoplankton; eräät syanobakteerit) tai makrolevistä yli 100 µm (panssarilevät) (Kuva 7). Lajeja on arvioitu löytyvän 36 000 – 10 miljoonaa.

(Graham ym. 2009). Biomassan määrä voi vaihdella saman järven sisällä vuodenaikojen mukaan, jopa yhden vuodenajan sisällä. Biomassan hetkelliseen tilaan vaikuttavat muun muassa levien määrä, sääolosuhteet ja veden lämpötila. (Eloranta 2005). Keskimääräinen biomassa järvessä voi olla jopa 4 mg/L ja sen sisältämä lajimäärä runsas (Niemi ym. 2004).

Kuva 7. Vesistöissä elävien mikrobien ja planktoneläinten kokoluokat, alkaen pienimmästä 0,02-0,2 µm (Johnson & Allen 2012 mukaan)

2.5. eDNA-MENETELMÄ

emenetelmä tutkii ympäristöstä (kuten vesi, maa tai ilma) kerättyjen näytteiden DNA-jälkiä, joita eliöt ovat jättäneet. eDNA tarkoittaa kokonaisia organismeja ja vapaita, vaihtelevan kokoisia DNA-kappaleita. (Minamoto ym. 2016). Menetelmä on herkkyydeltään soveltuva muun muassa tulokaslajien, sekä uhanalaisten lajien tutkimiseen ja valvontaan (Hinlo ym.

2017). Esimerkiksi vieraslajien levinneisyyden selvittämisen tarkkuus ja nopeus paranevat, koska ei tarvitse kerätä tutkittavien lajien yksilöitä (Minamoto ym. 2016). eDNA-tutkimus ei täysin korvaa lajien yksilöitä koskevia menetelmiä, kuten sähkökalastusta ja pyydyksiä, koska se ei anna tietoa populaatioiden ominaisuuksista tai yksiköistä (esimerkiksi sukupuoli, massa, koko, ulkoinen olemus) (Olds ym. 2016). Vesieliöitä tutkittaessa eDNA-näytteitä voidaan kerätä joko vedestä tai sedimentistä. Vesinäytteet edustavat paremmin näytteenkeruun aikaista paikallista eliöstön tilaa, kun taas sedimenttinäytteissä yhdistyy ajan kuluessa sinne kerääntynyt eDNA-aines. (Mächler ym. 2016). Menetelmän etuna on, että se voi paljastaa vesistöstä rapuruton aiemmin kuin perinteinen mertapyynnillä tapahtuva havainnointi. eDNA-näytteet voivat antaa tietoa rapujen levinneisyydestä ja mahdollisesta populaation häviämisestä, sekä rapuruttoinfektioista ja sen laajuudesta. Lisäksi vesistöjen välinen taudin leviäminen näytteenoton vuoksi on helpommin kontrolloitavissa kuin mertapyynnissä. (Strand ym. 2019)

eDNA-menetelmä soveltuu A. astaci-itiöiden tunnistukseen (Strand ym. 2011, 2012, 2014, 2019, Wittwer ym. 2018a, 2018b). eDNA tunnistuksen avulla voidaan jäljittää jopa erittäin pienten rapupopulaatioiden (<0,5 yksikkösaalis) levittämää rapuruttoa (Wittwer ym. 2018b).

Kerätyt itiötiheydet ovat vaihdelleet välillä; alle 1 itiötä/litra – useita satoja itiöitä/litra (Strand ym. 2014). Menetelmällä määritetty A. astaci-itiötiheys ympäristössä on vastannut myös hyvin infektoitunutta rapupopulaatiota (Wittwer ym. 2018b).

Rapujen levittämään eDAN:n määrään vaikuttavat yksilöiden tiheys ympäristössä, sekä niiden koko ja aktiivisuus. Vesistöt, joissa rapupopulaatiot ovat suuremmat, myös havaittu eDNA-kopioiden määrä on suurempi (Agersnap ym. 2017). Lisäksi aktiiviset yksilöt vapauttavat ja levittävät ajan kuluessa enemmän eDNA:ta. (Dunn ym. 2017). Lämpötila vaikuttaa sekä rapujen aktiivisuuteen, että rapuruttoitiöiden esiintymiseen eDNA-näytteissä. Veden lämpötilan ollessa huhti-lokakuussa keskimäärin 12-16℃, myös rapuruton luontainen itiöinti on huipussaan ja siten itiömäärät eDNA-näytteissä korkeimmillaan. (Wittwer ym. 2018b).

Lämpötila on myös merkittävä tekijä eDNA-näytteen säilymiselle. eDNA säilyy

määrityskelpoisena, kun kylmäketju on ollut katkeamaton näytteenoton jälkeen ja näytteen säilytysaika mahdollisimman lyhyt. (Hinlo ym. 2017)

Käytettävien näytteiden DNA-palat ovat usein lyhyitä tai hajonneita, joten näytteenkäsittelyn tarkoitus on saada kerättyä mahdollisimman paljon eDNA:ta. Liian pieneen näytetilavuuteen ei välttämättä saada tarpeeksi tutkittavaa DNA:ta, jolloin voidaan saada virheellinen negatiivinen tulos. Näytemäärän kasvattaminen vähentää virheellisten negatiivisten tulosten määrää (Takahara ym. 2015). Näytteenkäsittelyyn kuuluvia työvaiheita sen keräämisen jälkeen voivat muun muassa olla säilytys, erotus ja sekvensointi. Jokaisessa työvaiheessa DNA:ta voi mennä hukkaan, minkä vuoksi työvaiheiden suorittaminen tarkasti ja tehokkaasti on erityisen tärkeää.

eDNA hajoaa eksponentiaalisesti näytteen keruun jälkeen. Hajoamiseen vaikuttavat käsittelyn lisäksi fysikaaliskemialliset olosuhteet, kuten lämpötila, valo, pH, johtokyky ja entsyymiaktiivisuus. (Hinlo ym. 2017). Humuspitoisten vesistöjen humushapot tai humusaines voivat inhiboida PCR-reaktioita, jolloin määritetty DNA:n määrä jää alhaiseksi.

Laimentaminen vähentää entsyymien inhibitiota humuksesta, mutta samalla vaikeuttaa eDNA:n analysointia. (Agersnap ym. 2017)

2.5.1. eDNA näytteenotto ja käsittely nykymenetelmin

eDNA:n näytteenkeräys voidaan suorittaa suodattamalla. Näytteenotto tapahtuu sen mukaan, mitä suodatintyyppiä käytetään. Myös suodatettavissa oleva näytemäärä riippuu suodatintyypistä. Suodattimen huokoskoosta ja hydrofiilisistä ominaisuuksista riippuen ovat tavallisesti eDNA:n näytemäärät vaihdelleet välillä 15 ml – 10 L. (Wittwer ym. 2018a).

Vesistöjen eDNA-näytteiden keräämiseen ja esikäsittelyyn ei ole vielä saatavilla eDNA:ta varten suunniteltua laitteistoa (Thomas ym. 2018).

Näytteenottoajankohta vaikuttaa paljon näytteen käsiteltävyyteen ja A. astaci-itiöiden erotuskykyyn. Veden sameus vaihtelee vuodenaikojen mukaan, esimerkiksi keväällä sadanta on runsasta, jolloin myös veden sameus on korkea. Veden korkean vuodenaikaissameuden myötä myös kerättyjen vesinäytteiden kiintoainespellettien massat ovat suurempia.

Käytettäessä suodatusta erotusmenetelmänä, veden sameus vaikuttaa A. astaci-itiöiden havaitsemiseen. (Wittwer ym. 2018a).

Rapuruttoitiöiden määrä ja sijoittuminen vesistössä ei ole tasaista, mikä luo haasteita edustavan eDNA-näytteen keräämiselle (Strand ym. 2011). A. astaci-itiöiden määrittäminen suurista vesistöistä vaatii mahdollisimman suuria näytetilavuuksia (Strand ym. 2014). Strand ym.

(2013) tekemissä kokeissa alle 1 L järvivesinäyte ei ollut riittävä itiöiden löytämiseen (Strand ym. 2014 mukaan).

2.5.1.1. eDNA:n erotus suodattamalla

Vesinäytteiden eDNA erotellaan suodattimen avulla, jolloin voidaan käsitellä suurempia vesimääriä (Hinlo ym 2017). Käytettävä suodatintyyppi valitaan tutkittavan eDNA:n partikkelikoon mukaan (Wittwer ym. 2018a). Rapuruttoitiöiden erotteluun ei ole näytteen suodatuksen yhteydessä aikaisemmin käytetty perusteellista esisuodatusta (Strand ym. 2011, 2012, 2014, 2019, Wittwer ym. 2018a, 2018b).

Strand ym. (2019) on testannut rapuruttoitiöiden eDNA-näytteenotossa suodattamista.

Maastossa suodatettujen vesinäytteiden määrä oli tutkimusjaksolla 55-120 kappaletta, riippuen olosuhteista. Suodatetun näytteen koko oli välillä 1-10 L, veden sameuden mukaan. Loka-marraskuun näytemäärät olivat noin 6,9 L/suodatin, kun taas kahden eri vuoden kesä-elokuun näytemäärät olivat noin 3,3 ja 4,0 L/suodatin. Näytteet kerättiin pumpun avulla noin 7 cm pohjan yläpuolelta ja 2-5 m etäisyydeltä rantaviivasta. Suodattimena käytettiin 2 µm huokoskoon Millipore-lasikuitusuodatinta. A. astaci-itiöt tutkittiin laboratoriossa suodattimelta. (Strand ym. 2019)

Strand ym. (2011) aikaisemmissa itiökokeissa rapuruton tunnistamiseksi luonnonvesistä PCR-diagnostiikalla, käytettiin luonnonvesinäytteen suodatusta. Suodattimen tukkeutuminen rajoitti Strand ym. (2011) suodatusten näytemäärää, niin että suodatettava vesimäärä oli 0,3-1 L.

Suodatukset tehtiin 3 μm huokoskoon Millipore Isopore -membraani polykarbonaatti suodattimella. (Strand ym. 2011). A. astaci -eDNA näytteitä suodattivat myös Wittwer ym.

(2018b) käyttäen 2 μm Millipore-lasikuitusuodatinta. Virtaveden partikkeleiden mukaan näytemäärä oli välillä 1,6-10 L. (Wittwer ym. 2018b)

Rapuruttoitiöiden suodatukseen on kokeiltu käytettäväksi DF (Depth filtration) ja DEUF (dead-end ultrafiltration) suodatusta. Strand ym. (2014) testasi DF- ja DEUF-menetelmien toimivuutta kenttäolosuhteissa suuremmille luonnonvesinäytetilavuuksille. DF- suodatuksella

pystyttiin suodattamaan 2-15 L näytemääriä, riippuen veden sameudesta. DEUF-suodatuksella saatiin suodatettua suurempi näytemäärä (100 L), mutta suodatusaika oli 60-90 minuuttia.

DEUF-suodatuksessa suurten partikkeleiden aiheuttamaa ultrasuodattimen tukkeutumista yritettiin estää käyttämällä 90 µm planktonverkkoa. DEUF-menetelmän heikkoutena oli, että suodatetut näytteet eivät täysin soveltuneet PCR-diagnostiikkaan, vaan osa itiöistä hukattiin näytteen loppukäsittelyssä. Näytteiden keskimääräinen itiötiheys vaihteli välillä; alle 1 itiö/L – useita satoja itiöitä/L. Jopa 54% täplärapuvesistöjen näytteissä itiötiheys oli alle 1 itiö/L.

DEUF-tekniikalla saatu itiömäärä oli heikko, vaikka näytemäärä olikin suuri. (Strand ym.

2014)

Wittwer ym. (2018a) vertasi DF- ja DEUF-suodatusmenetelmien käyttökelpoisuutta ja herkkyyttä A. astaci-itiöiden tunnistamiseen. Molemmat menetelmät soveltuivat A. astaci-itiöiden keruuseen. Suurilla näytetilavuuksilla DEUF-menetelmä oli DF-menetelmää tarkempi, mutta oli käytössä työläämpi. DF-menetelmällä saatiin suodatettua Wittwer ym. (2018a) kokeissa korkeintaan 10 L luonnonvesinäytteitä, jolloin kerätty A. astaci-itiöiden määrä oli pieni. DEUF-menetelmällä suodatettu näytemäärä oli 100 L, mutta samalla kasvoi myös kiintoaineksen määrä suhteessa eDNA:an. DF-suodatuksessa samea vesi aiheutti nopeaa suodattimen tukkeutumista ja suodatettavat vesimäärät jäivät tällöin pienemmiksi. DEUF- menetelmässä suodatetun pelletin massa oli suurempi, jolloin itiöiden erottelu muista partikkeleista hankaloitui ja itiöitä saatiin talteen vähemmän. (Wittwer ym. 2018a)