6.1. RAPURUTTOITIÖN KOKO
Aphanomyces astaci itiöiden halkaisijat laskettiin ImageJ-ohjelman pinta-alatietojen mukaan (Kuva 11). UEF-At1D-kannan itiöiden halkaisija ja pinta-ala oli tilastollisesti merkitsevästi suurempi kuin UEF-SATR1- ja UEF-T16b-kannalla. Tutkittu UEF-At1D-kanta on eristetty jokiravusta, kun taas UEF-SATR1 ja UEF-T16b isäntänä on ollut täplärapu. UEF-SATR1- ja UEF-T16b-kannan itiöiden halkaisijan välillä ei ollut kokoeroa, mutta pienet partikkelikoot olivat enemmän painottuneita kuin UEF-At1D-kannalla.
PAMAS-partikkelilaskurilla analysoidut rapuruttokantojen itiöiden laskennalliset halkaisijat (Kuva 13) olivat pienemmät kuin mikroskooppikuvantaen määritetyt (Kuva 12). Toisin kuin ImageJ-ohjelmalla määritetyillä itiöillä, oli PAMAS-mittauksen mukaan UEF-SATR1 itiökoko muita kantoja pienempi, ja At1D ja T16b itiökoko samankaltainen. Kannoilla UEF-At1D ja UEF-T16b ei ollut yhteistä taustatekijää (alkuperä, isäntä, genotyyppi).
ImageJ-ohjelmalla analysoidut rapuruttoitiöiden halkaisijat olivat keskimäärin välillä 9-12 µm ja olivat samaa kokoluokkaa kirjallisuudessa aiemmin esitettyihin verrattuna. partikkelilaskurilla määritetyt halkaisijat taas olivat kirjallisuusarvoja pienempiä. PAMAS-analysoidulla UEF-SATR1-kannalla oli enemmän 5,0-6,9 µm kokoisia itiöitä verrattuna muihin tutkittuihin kantoihin. Kirjallisuudessa A. astaci-itiön halkaisijaksi on ilmoitettu 8,1-9,5 µm (Rennerfelt 1936). Alderman & Polglase (1986) mukaan itiön halkaisija on tavallisesti 9-11 µm, mutta vaihteluväli voi olla jopa 8-15 µm (OIE 2018).
Itiöiden koon määrittämiseen kuvantamalla voivat vaikuttaa muun muassa itiöväri, ImageJ:n kontrasti, itiöiden kasvatusliuoksen taustapartikkelit ja itiöiden osittainen päällekkäisyys.
Kuvantaminen ja ImageJ-ohjelma voivat myös luoda varjoa itiön ympärille, mikä kasvattaa sen analysoitua kokoa. PAMAS-partikkelilaskurilla analysoitujen partikkeleiden absoluuttisen koon määrittämistä voi haitata päällekkäin kasaantuneet pienet partikkelit (<5 µm), jotka muodostavat siten ryppäitä. PAMAS-partikkelilaskurin käyttöön itiökoon määrityksessä liittyi vähemmän epävarmuustekijöitä ja virhelähteen mahdollisuuksia, kuin ImageJ-kuvantamiseen.
Mikroskooppikuvien on oltava tarpeeksi tarkkoja, jotta ImageJ-ohjelma tunnistaa partikkelit niistä. Lisäksi mikroskooppikuvantamisessa satunnaisesti valitut ruudukon alueet eivät
välttämättä aina edusta näytettä tarpeeksi hyvin. PAMAS-partikkelilaskuri tunnistaa myös pienimmät partikkelit (<3 µm), joita ImageJ-ohjelman resoluutio ei erota. Luonnonvesissä olevien pienimpien partikkeleiden suhteellinen määrä kuitenkin korostuu PAMAS-partikkelilaskurilla tarkasteltaessa, mikä hankaloittaa muiden kokoluokkien erojen tulkintaa.
6.1.1. Rapuruttoitiöiden laskeutuminen sentrifugoimalla
Sentrifugointi noin 300 x g nopeudella vähensi rapuruttoitiöiden määrää 1 min ja 2 min ajalla noin kolmanneksen (Kuva 14). Sentrifugointi noin 600 x g nopeudella sai puolet alkuperäisistä itiöistä laskeutumaan. Noin 3000 x g nopeudella sentrifugoinnilla yli 90% itiöistä laskeutui ja viimeinen testattu nopeus 6000 x g saavutti kaikkien itiöiden laskeutumisen. Rapuruttoitiöitä on sentrifugoitu kirjallisuuden perusteella pienemmillä nopeuksilla. Cerenius & Söderhäll eristivät kasvatusliemestä pipetoidut A. astacin primaarikystat sentrifugoimalla 400 g nopeudella, 15 min ajan (Cerenius & Söderhäll 1984b).
Molemmat testatut sentrifugointiajat antoivat saman suuntaiset tulokset, kuitenkin niin että kahden minuutin sentrifugoinneissa itiöt laskeutuivat hieman tehokkaammin 1000-1200 x g välillä. Itiöiden laskeutumisessa tapahtui heikkenemistä nopeuksien 1000-1500 x g välillä, ilmiö oli havaittavissa molemmilla testiajoilla. Itiöiden laskeutumisessa havaittava poikkeama noin x 1000 g kohdalla, voi johtua itiöiden hajoamisesta tai erilaisesta sijoittumisesta nestefaasissa lukumäärän vähennyttyä reilusti puoleen alkuperäisestä.
Partikkeleiden kokoon perustuvaa erottelua käytetään myös tutkittaessa vesivälitteisiä epidemioita aiheuttavia Cryptosporidium- ja Giardia- alkueläimiä. Ne esiintyvät rapuruttoitiöiden tavoin pieninä pitoisuuksina vesissä, muiden saman suuruisten partikkeleiden joukossa ja ovat partikkelikooltaan lähellä A. astaci-itiön kokoa. Cryptosporidiumin ookystat ovat kooltaan 3x5 μm ja Giardian kystat 7x12-15 μm. Cryptosporidiumin ja Giardian ookystien erotteluun on käytetty 1000-1200 x g sentrifugointinopeuksia ja 5-15 min aikoja. (Efstratiou ym. 2017). Rapuruttoitiöiden laskeutuminen heikkeni 1000-1200 x g kohdalla, kun yli 50%
itiöistä oli laskeutunut. Itiön koko ja massa vaikuttavat sen sentrifugoitumiseen.
6.1.2. Rapuruttoitiöiden esisuodatus
Rapuruttoitiöiden ja taustapartikkeleiden määrään muutosta esisuodatuksen neljässä vaiheessa analysoitiin ImageJ-ohjelmalla (Kuva 15). Esisuodatusta ei ole aikaisemmin käytetty A.astacin erottelussa suodattamalla luonnonvesinäytteestä (Strand ym. 2011, 2012, 2014, 2019, Wittwer ym. 2018a, 2018b), joten saatuja esisuodatuksen tuloksia ei ole mahdollista vertailla kirjallisuuden lähteisiin.
Mikroskooppikuvatun 0-näytteen itiömäärä oli 83 itiötä/ml ja esisuodatuksen jälkeen itiömäärä oli 65 itiötä/ml. Esisuodatuksen läpi kulkeutui suurin osa itiöstä. Itiömäärä väheni 0-näytteen ja II-suodattimen välillä noin 20%, vähenemä oli tilastollisesti merkitsevä.
Esisuodatus vähensi tehokkaasti halkaisijaltaan rapuruttoitiötä suurempien (yli 20,0 µm) partikkeleiden määrää. Rapuruttoitiötä halkaisijalta pienempien (alle 5,9 µm) partikkeleiden määrä väheni myös tilastollisesti merkitsevästi. Partikkelimäärien vähentäminen tutkittavasta näytteestä on tärkeää, koska se on aikaisemmin haitannut rapuruttoitiöiden erottelua. Vesistöjen eDNA-näytteiden esikäsittelyyn ei ole vielä saatavilla rapuruttoitiöiden erotukseen suunniteltua laitteistoa (Thomas ym. 2018).
Esisuodatuksen alussa partikkelimäärä kasvoi tilastollisesti merkitsevästi 0-näytteen ja pumppunäytteen välillä. Eniten lisääntyi rapuruttoitiötä pienenpien partikkeleiden määrä.
Pumpun läpi kulkevat partikkelit voivat hajota pienemmiksi tai pumpusta voi irrota ylimääräistä sakkaa. Esisuodatus kuitenkin vähensi pumppunäytteen partikkeleiden kokonaismäärää tilastollisesti merkitsevästi. Pumppunäytteen ja II-suodattimen välillä partikkeleiden vähenemä oli lähes 50%. Suodatussysteemin 20 µm huokoskoon suodatin vähensi partikkeleiden kokonaismäärää, sekä eri kokoluokkien partikkeleiden määrää tehokkaammin kuin 60 µm suodatin. Luonnonvesinäytteen on oltava riittävän suuri, jotta siinä olisi tarpeeksi A. astaci-itiöitä määritettäväksi (Strand ym. 2014). Koska itiöiden määrä vähenee esisuodatuksen myötä, on näytetilavuuksien oltava mahdollisimman suuria ja esisuodatuksen tapahduttava suoraan maastossa.
6.2. JÄRVIVEDEN PARTIKKELEIDEN ESISUODATUS JA ANALYSOINTI
Järviveden partikkeleiden määrää esisuodatuksen neljässä vaiheessa analysoitiin Savilahden ja Neulalahden vesinäytteistä ImageJ-ohjelmalla (Kuva 16). Savilahden ja Neulalahden partikkelimäärien väheneminen esisuodatuksen myötä oli samankaltainen.
Neulalahden kokonaispartikkelimäärä oli suurempi kuin Savilahden (Kuva 16). Halkaisijalta pienimpien partikkeleiden (alle 3 µm) osuutta, jota mikroskooppikuvantamalla ei ollut mahdollista tarkastella, analysoitiin PAMAS-partikkelilaskurilla (Kuva 17). Halkaisijaltaan pienimpien mitattujen partikkeleiden (alle 2 µm) suhteellinen määrä oli kaikissa esisuodatuksen vaiheissa suurin. Kasviplanktonit, kuten mikroskooppiset levät voivat ovat kooltaan 0,2-2,0 µm (Graham ym. 2009). Biomassan määrä voi olla järven vuodenajan olosuhteiden mukaan jopa 4 mg/l ja lajimonimuotoisuus suuri (Niemi ym. 2004). Esisuodatuslaitteiston tulisi kyetä vähentämään myös pienten partikkeleiden määrä näytteestä, niin että rapuruttoitiöitä ei hukattaisi.
Esisuodatuksen avulla saadaan vähennettyä rapuruttoitiön halkaisijaa suurempien partikkeleiden määrä 0-näytteestä 70-100%. Eläinplankton voi olla kooltaan 100-5000 µm välillä (Kobayashi ym. 2009) ja kasviplanktonien makrolevät yli 100 µm (Graham ym. 2009).
Suuret partikkelit, joiden rakenne on heikompi, voivat hajota esisuodatuksen vedenpaineessa.
Pumpun tehon nostaminen tai voimakkaan sekoituksen lisääminen esisuodatuksen nopeuttamiseksi voi siten huonontaa suodatustulosta. Esisuodatus vähensi myös rapuruttoitiön halkaisijaa vastaavien partikkeleiden määrä noin 60%. Rapuruttoitiötä halkaisijalta pienimpien partikkeleiden määrä oli alkuperäisessä näytteessä suurin ja se väheni esisuodatuksen myötä jopa yli 50%.
Samoin kuin rapuruttoitiöiden esisuodatuksessa, partikkelimäärä kasvoi 0-näytteen ja pumppunäytteen välillä. Rapuruttoitiöiden esisuodatuskokeissa kasvoi pienimpien partikkeleiden määrä selkeästi eniten, kun taas järviveden esisuodatuksissa kasvoi sekä suurimpien partikkeleiden määrä, että pienimpien partikkeleiden määrä. Lisääntynyt partikkelimäärä kuitenkin pieneni esisuodatuksessa. Esisuodatus vähensi pumppunäytteen partikkeleiden kokonaismäärää noin 70%. Ensimmäinen 60 µm huokoskoon suodatin vähensi kokonaispartikkelimäärää enemmän kuin toinen 20 µm huokoskoon suodatin.
ImageJ-ohjelman kuvien (Kuva 18a-d) tarkastelu osoittaa samansuuntaisia tuloksia kuin partikkelilaskenta. Suurimpien partikkeleiden halkaisija oli noin 100 µm ja niiden muoto oli vaihtelevaa. Molemmat suodattimet (60 µm ja 20 µm) vähensivät kuvien perusteella partikkeleiden kokonaismäärä tehokkaasti, mutta päästivät läpi huokoskoon ylittäviä partikkeleita (noin 50-100 µm ja 40-50 µm). Suodatinten läpi kulkeutuneet partikkelit voivat olla rakenteeltaan sellaisia, että ne puristuvat vedenpaineen voimasta suodatinten huokosten läpi. Mikroskopoinnissa havaitsin näytteissä vihreitä ja hyytelömäisiä suuria partikkeleita, jotka olivat todennäköiseesti leviä. Näytteistä erottui myös pitkiä rihmamaisia partikkeleita (mahdollisia syanobakteereita tai piileviä), liikkuvaa eläinplanktonia (kuten rataseläimiä).
Levien määrään järvivedessä vaikuttavat sääolosuhteet ja lämpötila (Eloranta 2005).
Näytteenottoajankohta vaikuttaa näytteen laatuun ja suodatettavuuteen. Runsas levän määrä esisuodatuksessa voi heikentää näytteen suodatusta.