RAPURUTTOITIÖIDEN TUNNISTUS LUONNONVESISTÄ:
eDNA:n TEHOKAS ERISTÄMINEN ESISUODATUKSELLA
Elina Rönkkö Pro gradu -tutkielma Ympäristötiede Itä-Suomen yliopisto Ympäristö- ja biotieteiden laitos Huhtikuu 2020
ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, Luonnontieteiden ja metsätieteiden tiedekunta Ympäristö- ja biotieteiden laitos, ympäristötiede
Elina Rönkkö: Rapuruttoitiöiden tunnistus luonnonvesistä: eDNA:n tehokas eristäminen esisuodatuksella
Pro gradu -tutkielma: 63 sivua, 2 liitettä (2 sivua)
Tutkielman ohjaajat: Japo Jussila (FT, dosentti) ja Jenny Makkonen (FT) Huhtikuu 2020
Avainsanat: Aphanomyces astaci, rapurutto, jokirapu, täplärapu, eDNA, näytteenkeräys, esisuodatus
TIIVISTELMÄ
Rapurutto on vakava rapujen sairaus, joka voi tuhota kokonaisia kotoperäisen jokiravun (Astacus astacus) populaatioita. Rapuruttoa aiheuttava itiöimällä leviävä Aphanomyces astaci on maailman 100 haitallisimman vieraslajin listalla, samoin kuin sen usein krooninen kantaja täplärapu (Pacifastacus leniusculus). Rapuruttoepidemian toteaminen vesistöstä mahdollisimman aikaisessa vaiheessa edellyttää menetelmää, jossa ei tarvitse pyydystää tai seurata infektoituneita rapuja. Siihen soveltuu eDNA-menetelmä, joka tutkii ympäristöstä kokonaisia organismeja tai DNA-kappaleita. Menetelmän etu verrattuna esimerkiksi rapujen sumputuskokeisiin, on sen nopeus ja eettisyys.
Tämän työn tavoitteena oli kehittää ja testata eDNA-näytteen keräykseen soveltuva esisuodatusmenetelmä, jonka avulla saadaan eroteltua rapuruttoitiöt luonnonveden taustapartikkeleista. Rapuruttoitiöiden näytteenottoon ei ole aikaisemmin käytetty esisuodatusta ja ongelmana on ollut näytteenkeräyssuodatinten nopea tukkeutuminen, jolloin suodatetut näytemäärät ovat myös jääneet liian pieniksi. Käyttökelpoisen menetelmän on oltava tarpeeksi nopea ja tehokas, jotta suurten vesimäärien (~100 L) suodatus onnistuu.
Esisuodatuskokeita varten rakennettiin suodatuslaitteisto, jossa näyte kulki ensin pumpun kautta 60 µm ja 20 µm huokoskoon patruunasuodatinten läpi. Esisuodatettujen vesinäytteiden partikkelimääriä analysoitiin PAMAS-partikkelilaskurilla, sekä mikroskooppikuvista ImageJ- ohjelmalla. Lisäksi työssä selvitettiin näytteen jatkokäsittelyyn soveltuvaa sentrifugointia.
Työssä tutkittiin myös rapuruttoitiön halkaisijan vaihtelua kolmen eri rapuruttokannan välillä, ja sen merkitystä esisuodatukseen käytettävien suodattimien valintaan.
Tämän tutkimuksen tulosten mukaan on esisuodatus suositeltava käytettäväksi luonnonvesien näytteenottoon ja eDNA:n käsittelyyn. Esisuodatuksen avulla oli mahdollista käsitellä suuria näytemääriä kenttäkäyttöön soveltuvassa ajassa. Kaksivaiheinen esisuodatus vähensi järvivesinäytteen taustapartikkeleiden kokonaismäärää, etenkin suurimpien partikkeleiden osalta. Rapuruttoitiöt kulkeutuivat erotuskelpoisina esisuodatusmekanismin läpi, mutta tehokas esisuodatus vähensi niiden määrää viidesosan. Suodatussysteemin pumppu lisäsi partikkeleiden määrää näytteeseen, minkä vuoksi pumppu tulisi sijoittaa jatkossa systeemin loppupäähän.
Esisuodatetusta näytteestä on mahdollista erotella itiöitä edelleen sentrifugoinnin avulla.
Rapuruttoitiöiden sentrifugoimiseksi tarvittava kierrosnopeus oli maksimissaan 3000 x g. Itiön koko vaikuttaa sen erotteluun suodatuksella ja sentrifugaatiolla. Itiöiden halkaisijoissa oli eroja rapuruttokantojen välillä, ja halkaisijat olivat joissakin tapauksissa pienempiä kuin kirjallisuudessa esitetyt halkaisijat. Tulevaisuuden rapuruttoitiön suodatuskokeissa tulisi ottaa huomioon itiökoon vaihtelu. Lisäksi suodatussysteemiä ja menetelmää tulisi kehittää hyödyntäen poikkitieteellistä tietoa partikkelitutkimuksesta, sekä kokeilla esimerkiksi hydrosyklonin toimivuutta näytteen jatkokäsittelyssä.
UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND, Faculty of Science and Forestry Department of Environmental and Biological Sciences, Environmental Science
Elina Rönkkö: Crayfish plague spores detection from natural waters: efficient detection of eDNA by pre-filtration
Master's thesis: 63 pages, 2 annex (2 pages)
Instructors of thesis: Japo Jussila (PhD, docent), Jenny Makkonen (PhD) April 2020
Keywords: Aphanomyces astaci, crayfish plague, noble crayfish, signal crayfish, eDNA, sampling, pre-filtration
ABSTRACT
Crayfish plague is a serious crayfish disease that can destroy entire populations of native noble crayfish (Astacus astacus). Crayfish plague is caused by a sporadic Aphanomyces astaci and it is on the list of the 100 most invasive alien species in the world, as well as the carrier signal crayfish (Pacifastacus leniusculus). Rapid detection of an epidemic in the watercourse demands a method that does not require catching or monitoring of infected crayfishes. The eDNA method, which studies whole organisms or fragments of DNA in the environment, is suitable for this. The advantage of the method over the crayfish cage surveillance is its speed and ethics.
The aim of this work was to develop and test a pre-filtration method for eDNA sample collection, which can separate A. astaci spores from natural water background particles. Pre- filtration has not been used previously for the sampling of A. astaci spores. The problem has been the rapid clogging of the sample collection filters, which has led to low volume of the filtered samples. A practical method must be rapid and efficient enough to successfully filter large water volumes (100 L). For prefiltering experiments, a filtration system was assembled with two cartridge filters of different pore sizes. In filtration system sample was first passed through a pump and then through 60 µm and 20 µm pore size cartridge filters. The particle counts of the water samples from the pre-filtrations were analyzed with a PAMAS -particle counter and from the microscopic images with the ImageJ program. In addition, centrifugation suitability for further processing of the sample was experimented. This thesis also investigated the variation in the diameter of A. astaci spores between different A. astaci strains and its importance in the selection of pre-filtration filters.
According to the results of this study, pre-filtration is recommended for use in the sampling of natural waters and for the treatment of eDNA. Pre-filtration made possible to process large numbers of samples in a time suitable for field use. Two-stage pre-filtration reduced the total number of background particles in the lake water sample, especially of the largest particles. A.
astaci spores went through the pre-filtration mechanism, but effective pre-filtration reduced their number by a fifth. The filtration system pump increased the number of particles in the sample and pump should therefore be placed at the end of the system. It is possible to further separate spores from the pre-filtered sample by centrifugation. The rotational speed required for centrifugation of the A. astaci spores was 3000 x g maximum. The size of the spore affects its separation by filtration and centrifugation. Spore diameters varied between A. astaci strains and in some cases were smaller than those reported in the literature. Future A. astaci pre- filtration tests should take into account variation in spore size. In addition, the filtration system and method should be developed utilizing interdisciplinary information on particle studies, as well as testing the functionality of the hydrocyclone in sample processing, for example.
ESIPUHE
Tässä pro gradu -tutkielmassa selvitettiin esisuodatuksen toimivuutta luonnonvesinäytteiden käsittelyyn rapuruttoitiöiden keräämiseksi. Rapurutto on kotiperäistä jokirapua uhkaava raputauti, jonka leviäminen on estettävä kaikin tavoin. Tutkimusmenetelmien kehittäminen nopeuttaa ja helpottaa tehtävää diagnostiikkaa. Esisuodatuskokeet suoritettiin vuoden 2019 aikana Itä-Suomen yliopiston Ympäristö- ja biotieteiden laitoksella ja tutkielman kirjoitus 2018-2020.
Kiitos Etelä-Karjalan kalatalouskeskus ry:lle henkilökohtaisesta apurahasta, jonka turvin pystyin keskittymään pro gradu-työn tekemiseen. Erityiskiitos Luonnononvarakeskuksen tutkija Esa Erkamolle jokiravun tilanteeseen perehdyttämisestä, Savonian testausinsinööri Antti Koskenlahdelle PAMAS-mittausten opastuksesta ja Itä-Suomen yliopiston nuorempi tutkija Lars Granlundille ImageJ-ohjelmassa käytettävän makron laatimisesta. Kiitän ohjaajiani Japo Jussilaa ja Jenny Makkosta ehtymättömistä neuvoista, tuesta ja innostamisesta.
Rakkaat kiitokset perheelle ja ystäville ainaisesta ymmärryksestä. Kiitos myös omille Ellun Kanoille riemukkaista opiskeluajoista!
Kuopiossa 03.04.2020 Elina Rönkkö
LYHENTEET JA MÄÄRITELMÄT
CFC Continous-flow centrifuge. Jatkuvaan näytevirtaukseen perustuva sentrifugointi.
DEUF Dead-End ultrafiltration. Suuren tilavuuden näytteenotto.
DF Depth filtration. Menetelmä partikkeleiden suodatukseen nesteestä.
eDNA Environmental DNA. Ympäristöstä kerätty vapaa DNA.
ICS Indigenous crayfish species. Kotoperäinen rapulaji.
NICS Non-indigenous crayfish species. Vierasperäinen rapulaji, vieraslaji.
PCR Polymeraasiketjureaktio. Molekyylibiologian tutkimusmenetelmä.
qPCR Quantitative PCR. Reaaliaikainen PCR.
RAPD Random Amplified Polymorphic DNA. Satunnaisia DNA segmenttejä.
SISÄLLYSLUETTELO
1. JOHDANTO ... 8
2. KIRJALLISUUSKATSAUS ... 10
2.1. RAPURUTTO ... 10
2.1.1. Rapuruton elinkierto ... 12
2.1.2. Rapuruton merkitys rapukauppaan ja jokirapukantojen romahdus ... 14
2.1.3. Rapuruton leviäminen ja torjunta ... 14
2.2. TÄPLÄRAPU ... 17
2.3. JOKIRAPU ... 19
2.3.1. Jokiravun uhanalaisuuden tila ... 21
2.3.2. Suojelutyö ja istutukset ... 21
2.4. VESISTÖT JA KIINTOAINEEN MERKITYS eDNA-NÄYTTEENOTOSSA 22 2.5. eDNA-MENETELMÄ ... 24
2.5.1. eDNA näytteenotto ja käsittely nykymenetelmin ... 25
2.6. MENETELMIEN TAUSTAA ... 27
2.6.1. Suodatussysteemit ... 27
2.6.2. Muut vaihtoehtoiset erotusmenetelmät ... 29
2.6.3. PCR ... 30
3. TYÖN TAVOITTEET ... 31
4. AINEISTO JA MENETELMÄT ... 32
4.1. ESISUODATUSSYSTEEMI ... 32
4.2. RAPURUTTOITIÖIDEN JA JÄRVIVEDEN ESISUODATUS ... 33
4.2.1. Rapuruttoitiöiden ja järviveden imusuodatus ... 33
4.3. MIKROSKOPOINTI, KUVANTAMINEN JA IMAGE-J ... 34
4.4. RAPURUTTOITIÖIDEN HALKAISIJOIDEN MITTAAMINEN, PAMAS ... 35
4.5. RAPURUTTOITIÖIDEN SENTRIFUGOIMINEN ... 36
4.6. TILASTOLLINEN TULKINTA ... 36
5. TULOKSET ... 37
5.1. RAPURUTTOITIÖN KOKO ... 37
5.1.1. Rapuruttokantojen itiöiden pinta-ala ja halkaisija, ImageJ-analyysi ... 37
5.1.2. Rapuruttokantojen itiöiden halkaisija ja pinta-ala, PAMAS-
partikkelilaskuri ... 39
5.1.3. Rapuruttoitiöiden laskeutuminen sentrifugoimalla ... 40
5.1.4. Rapuruttoitiöiden esisuodatus luonnonvesitaustalla, ImageJ-analyysi ... 41
5.2. JÄRVIVEDEN PARTIKKELEIDEN ANALYSOINTI ... 43
5.2.1. Järviveden partikkeleiden suodattuminen, ImageJ-analyysi ... 43
5.2.2. Järviveden halkaisijalta alle 3 µm partikkeleiden määrittäminen, PAMAS- partikkelilaskuri ... 47
5.2.3. Esisuodatettujen järviveden partikkeleiden kuvantaminen ... 49
6. TULOSTEN TARKASTELU ... 51
6.1. RAPURUTTOITIÖN KOKO ... 51
6.1.1. Rapuruttoitiöiden laskeutuminen sentrifugoimalla ... 52
6.1.2. Rapuruttoitiöiden esisuodatus ... 53
6.2. JÄRVIVEDEN PARTIKKELEIDEN ESISUODATUS JA ANALYSOINTI .. 54
7. JOHTOPÄÄTÖKSET ... 56
LÄHDELUETTELO ... 58 LIITTEET
Liite 1. Rapuruttokantojen itiöiden halkaisija ja pinta-ala, PAMAS-partikkelilaskuri Liite 2. Järviveden partikkeleiden määrittäminen PAMAS-partikkelilaskurilla
1. JOHDANTO
Rapurutto on rapujen tauti, jonka aiheuttaa itiöimällä leviävä oomykeetti Aphanomyces astaci (Evans & Edgerton 2002). Se saapui Euroopan kotoperäisten rapulajien haitaksi ensimmäisen kerran 1860-luvun tienoilla. Myöhemmin rapuruton havaittiin leviävän Pohjois-Amerikasta tuotujen täplärapujen (Pacifastacus leniusculus) mukana (Souty-Grosset ym. 2006). Suomen kotoperäiselle jokiravulle (Astacus astacus), rapurutto on yleensä tappava (Kilpinen 2003, Souty-Grosset ym. 2006). Rapurutto leviää infektiota kantavien rapujen lisäksi esimerkiksi kalastusvälineiden mukana, jotka ovat olleet kosketuksissa itiölliseen veteen (Evans &
Edgerton 2002).
Rapuruton aktiivinen leviäminen johtuu runsaasta itiöiden tuotosta. Rapuruton elinkierrossa uimaitiöt hakeutuvat ravun kuorelle ja alkavat tunkeutua rihmaston avulla kuoren läpi.
Jokiravulla rihmasto tunkeutuu syvälle kuoren läpi, aina sisäelimiin asti. Täpläravulla rapurutto ei yleensä ole yhtä vakava. Kuorikerroksen läpi levittäytynyt rihmasto alkaa tuottaa lopulta uusia uimaitiöitä. (Souty-Grosset ym. 2006). Yhdestä sairastuneesta ravusta voi vapautua ympäröivään vesistöön jopa miljoonia itiöitä (Makkonen ym. 2013). Rapuruton uimaitiö kykenee selviytymään liikuntakykyisenä maksimissaan kolme päivää (Unestam 1966).
Pidempiä aikoja A. astaci ei kuitenkaan selviä ilman isäntää, vaan uimaitiö koteloituu kystaksi, joka voi uusiutua uimaitiöksi korkeintaan kolme kertaa (Cerenius & Söderhäll 1984b, Souty- Grosset ym. 2006).
Rapurutto havaitaan vesistöstä tavallisesti sattumalta löytyneiden kuolleiden rapujen perusteella tai sumputtamalla terveitä rapuja samasta vesistöstä ja seuraamalla sairastavuutta (Jussila 2019). Lopullinen rapuruttodiagnoosi on tehty kudosnäytteistä molekyylibiologisin menetelmin (OIE 2018). Vesistöjen rapuruttotilanteen määritystä varten kaivataan nopeaa ja tehokasta menetelmää, johon ei tarvitse pyydystää infektoituneita rapuja. Luotettavaa menetelmää tarvitaan erityisesti jokirapujen istutuksien yhteydessä, kun halutaan varmistaa kohdevesistön taudittomuus. (Jussila ym. 2008)
eDNA-menetelmän (environmental DNA) on todettu soveltuvan rapuruton tutkimiseen itiöiden perusteella suoraan vesinäytteestä (Strand ym. 2011, 2012, 2014, 2019, Wittwer ym. 2018a, 2018b). eDNA-menetelmä tutkii ympäristöstä kerättyjen näytteiden DNA-jälkiä, joita eliöt ovat
jättäneet. eDNA eli ympäristö-DNA tarkoittaa kokonaisia organismeja ja vapaita, vaihtelevan kokoisia DNA-kappaleita. (Minamoto ym. 2016). Näytteitä voidaan kerätä joko vedestä tai sedimentistä. Vesinäytteet edustavat hyvin näytteenkeruun aikaista, paikallista eliöstön tilaa.
(Mächler ym. 2016). eDNA-näytteenotto ei perustu elävien rapujen käsittelyyn, jolloin se on eettisempi käyttää kuin perinteinen sumputus. Lisäksi sen kautta rapurutto ei pääse leviämään eteenpäin kovin todennäköisesti. (Strand ym. 2019). eDNA-menetelmän käytettävyyden ongelma on näytesuodatinten nopea tukkeutuminen, jolloin suodatetut vesinäytemäärät ovat olleet keskimäärin vain 1-10 L (Strand ym. 2011, 2014, 2019, Wittwer ym. 2018a, 2018b).
Luonnonvesissä itiöt jakaantuvat epätasaisesti ja näytteiden itiöpitoisuudet voivat jäädä jatkoanalyysien kannalta liian pieniksi (Strand ym. 2014, Wittwer ym. 2018a). Esisuodatuksen avulla voitaisiin estää luonnonveden partikkeleiden aiheuttamaa suodatinten nopeaa tukkeutumista. Rapuruttoitiöiden näytteenotossa vesistöstä ei kuitenkaan ole käytetty aikaisemmin perusteellista esisuodatusta (Strand ym. 2011, 2012, 2014, 2019, Wittwer ym.
2018a, 2018b).
Tutkimuksen tavoitteena on testata ja kehittää esisuodatusmenetelmää, jonka avulla pystytään erottamaan kokonaiset eDNA-organismit eli rapuruttoitiöt tutkittavasta luonnonvedestä.
Suodatuslaitteiston täytyy pystyä suodattamaan alkuun halkaisijalta yli 20 µm partikkelit tutkimuksia haittaavien taustapartikkeleiden joukosta, jotta noin 10 µm kokoiset rapuruttoitiöt saadaan kerättyä. Toimivan esisuodatusmenetelmän tutkimisen jälkeen etsitään mahdollisuutta jatkaa partikkelierottelua soveltuvien menetelmien avulla. Lisäksi työssä selvitetään rapuruttoitiökoon vaihtelua ja sen merkitystä suodatussysteemiin.
2. KIRJALLISUUSKATSAUS
2.1. RAPURUTTO
Rapuruton aiheuttaja Aphanomyces astaci on munasieniin (Oomycetes) kuuluva rapujen loinen (Evans & Edgerton 2002). A. astaci on maailmanlaajuisesti 100 haitallisimman vieraslajin listalla (Lowe ym. 2000). Suomen kansallinen vieraslajistrategia on määritellyt rapuruton As- ja PsI –genotyypit erityisen haitallisiksi vieraslajeiksi (MMM 2012). Siimallisten uimaitiöidensä ansiosta A. astaci on hyvin sopeutunut elämään ja leviämään vesiympäristössä.
Itiöt suunnistavat lyhyitä matkoja vedessä rapujen kemiallisten ärsykkeiden houkuttamina (Cerenius & Söderhäll 1984a). Ravussa vakavan infektiotilan saa aikaan itiön sienirihman tunkeutuminen sen kudokseen. Rapurutto kykenee tappamaan sille alttiit ravut ja voi saada aikaan vesistössä rapujen joukkokuoleman. Pohjois-Amerikan rapulajeihin kuuluva täplärapu on usein rapuruton oireeton levittäjä. Rapuruttoitiöt voivat levitä niitä kantavien rapujen lisäksi, ravustus- ja kalastusvälineiden, sekä veneiden mukana. Vesilinnut ja villieläimet voivat myös kantaa itiöitä vesistöstä toiseen. Jokirapu ja muut Euroopan alkuperäiset rapulajit ovat erittäin alttiita vieraslajin kantamalle taudille. (Evans & Edgerton 2002)
Ensimmäiset rapuruton aiheuttamat rapujen kuolemat tapahtuivat vuonna 1859 Pohjois- Italiassa, mistä se alkoi levitä lähialueille. Myöhemmin rapurutto puhkesi myös Ranskassa (1874) ja levisi Euroopassa rapukaupan myötä. Vasta vuonna 1903 Schikora identifioi Aphanomyces astacin rapuruton aiheuttajaksi. Rapurutto eristettiin ja viljeltiin laboratorio- olosuhteissa vuonna 1931 (Nybelin 1931). (Souty-Grosset ym. 2006). Suomeen rapurutto saapui oletettavasti Venäjän kautta. Suomen ensimmäiset rapuruttotapaukset ajoittuvat vuodelle 1893, Saimaan ja sen lähivesien alueelle. Rapurutto puhkesi seuraavan kerran 1907- 1908. (Kilpinen 2003).
Euroopan ravuilla tavataan A. astacin viittä eri RAPD -genotyyppiä: As (Huang ym. 1994), PsI (Huang ym. 1994), PsII (Huang ym. 1994), Pc (Diéguez-Uribeondo ym. 1995) ja Or (Kozubíková ym. 2011). Suomessa rapuruton aiheuttaa, joko As- tai PsI -genotyyppi (Makkonen ym. 2012a). As-genotyyppi on peräisin Pohjois-Amerikasta Eurooppaan tuoduista täpläravuista. PsI-genotyyppi on yhteydessä ensimmäisiin täplärapuistutuksiin, joissa istutettiin Pohjois-Amerikasta (Tahoe- ja Hennessey-järvestä) suoraan tuotuja täplärapuja. PsI- genotyyppiä tavataan myös jokirapuepidemioiden yhteydessä. (Jussila ym. 2014a). Täplärapua
pidettiin pitkään täysin immuunina rapurutolle, ja siksi hyvänä istutuslajina. Euroopassa vieraslajina elävät täpläravut eivät ole kuitenkaan turvassa rapurutolta, vaan voivat sairastua ja kuolla siihen. Molemmat kannoista (As- ja PsI-genotyyppi) voivat aiheuttaa kuolleisuutta täplärapupopulaatioissa. Erilaiset stressitekijät altistavat myös täplärapua rapurutolle. (Aydin ym. 2014)
PCR- ja qPCR-tekniikan kehittymisen myötä A. astaci on luokiteltu geenisekvenssien fylogeneettisen analysoinnin perusteella neljään haploryhmään (A, B, D, E). Aikaisemmin yleisesti käytössä ollut genotyypitys voidaan suhteuttaa haploryhmiin siten, että A-haploryhmä pitää sisällään genotyypit As ja PsII, B-haploryhmä PsI-genotyypin, D-haploryhmä Pc- genotyypin ja E-haploryhmä Or-genotyypin. RAPD-genotyyppiryhmittely on vanhentunut käytäntö, koska se viittaa aikoinaan RAPD-PCR-testattuihin A. astaci -kantojen nimiin.
Genotyyppi-termiä tulisi käyttää vain microsatelliittianalyysein kerätyn datan kohdalla.
Haploryhmät jaetaan vielä haplotyyppien mukaan vielä viiteen ryhmään (a, b, d1, d2 ja e).
(Panteleit 2019)
Aphanomyces astacin genotyyppien välisellä virulenssilla on eroa. PsI-genotyyppi on virulenssiltaan tappavampi, kun taas As-genotyypin virulenssissa on vaihtelua. As-genotyyppi ei välttämättä ole aina tappava. (Makkonen ym. 2012b). Jokirapu voikin joissakin tapauksissa olla vastustuskykyinen As-genotyypin rapurutolle (Makkonen ym. 2012b) tai se voi kantaa piilevää rapuruttoa, kun virulenssi on alhainen (Jussila ym. 2011). Rapurutto esiintyy rapupopulaatiossa piilevänä silloin, kun ei ole merkkejä mistään sen tunnusomaisista oireista tai joukkokuolemista, mutta A. astaci pystytään molekyylibiologisesti diagnosoimaan ravuista.
Krooninen rapurutto taas on kyseessä, kun rapupopulaatiossa havaitaan jatkuvaa rapuruton oireilua ja rapukuolemia, muttei lopullista joukkokuolemaa. Nykytiedon mukaan latentin tai kroonisen rapuruton infektoimat ravut eivät voi koskaan parantua taudistaan. Rapuruton kantojen sisäinen virulenssi voi vaihdella ja mukautua olosuhteiden mukaa, samoin kuin jokiravun vastustuskyky voi vaihdella populaatioiden välillä. Ilmiötä kutsutaan koevoluutioksi eli yhteisevoluutioksi. Yhteisevoluutio on mahdollistanut, että joissakin tapauksissa rapurutto ja jokirapu voivat elää tasapainossa keskenään. (Jussila ym. 2014b). Rapupopulaatioiden ja eri epidemioiden rapuruttokantojen sekoittumisen myötä A. astaci on joutunut mukautumaan ja muuntumaan vallitsevan tilanteen mukaan. Virulenssi ja itiöinti voivat mukautua, niin että jatkossakin A. astacin elinkyky leviämisympäristössä säilyy. (Jussila ym. 2014a)
Rapuruttoa sairastavasta yksittäisestä jokiravusta voi irtautua sairauden aikana jopa 3,2 miljoonaa infektiokykyistä itiötä (Makkonen ym. 2013). Itiöiden määrä vaikuttaa siihen kuinka tappava infektio on; korkeimmilla itiömäärillä ravut kuolevat nopeammin (Makkonen ym.
2014). Rapuruttoitiöt voivat säilyä vedessä (10℃) elinkykyisinä ja infektoivina 6-9 päivää (Matthews & Reynolds 1990). Veden lämpötila vaikuttaa itiöintiin, uimaitiöiden lukumäärään ja rapuruttoinfektion etenemiseen (Diéguez-Uribendo ym. 1995).
A. astaci-itiö on halkaisijaltaan noin 10 µm. Esimerkiksi Kansainvälinen eläinten tartuntatautien toimisto (OIE 2018) ja Kansainvälinen maatalouden ja biotieteiden keskus (CABI 2020) viittaavat A. astacin itiön halkaisijaksi 9–11 μm (8-15 μm) (Alderman & Polglase (1986) tutkimuksen mukaan). Suomen Kalojen loiset teoksessa uimaitiön kooksi kerrotaan 8- 12 µm (Henttonen 2012).
Aphanomyces astaci-infektion leviämistä vesistössä voidaan vahvasti epäillä, jos löydetään useita kuolleita saman populaation rapuja. Rapurutto on ravuille spesifi sairaus eikä vahingoita alueen muita vesieliöitä. Muut vesivälitteiset infektiot tai altisteet vahingoittavat rapujen lisäksi muitakin vesieliöitä. Rapujen kliinisissä tutkimuksissa A. astaci-infektion oireita ovat rapujen epätavallinen käyttäytyminen ja erinäiset ulkoiset vauriot. Lopullinen todennus tehdään molekyylibiologisin menetelmin (PCR). PCR-analytiikkaa varten näytteiden on oltava hyväkuntoisia. Kuolleista ja hiljalleen hajoavista ravuista ei pystytä varmuudella toteamaan A.
astaci-infektiota. (OIE 2018)
2.1.1. Rapuruton elinkierto
Rapuruton elinkierto kulkee suvuttoman lisääntymisen vaiheiden kautta (Kuva 1). Suvullinen, sekä suvuton lisääntyminen on tavallista muilla samaan lahkoon kuuluvilla Aphanomyces- lajeilla (Cerenius ym. 1988). Rapuruton suvullista lisääntymistä ei ole voitu todistaa tapahtuvan, mutta ei myöskään täysin pois sulkea. Rapuruttoinfektiossa ravun kuoreen [5.]
tunkeutunut sienirihma [6a. ja 6b.] alkaa tuottaa siimallisia, pyöreitä uimaitiöitä [1.]. Infektio voi aiheuttaa melanisaatioläikkiä [6c. ja 6d.] täpläravun kuoreen merkkinä immuunipuolustusreaktioista. Itiöt muodostuvat rihmaston soluliman rajautuessa [7.] ja ryhmittyvät 15-30 itiön itiötertuiksi [8.], ennen kuin irtaantuvat uimaitiöiksi. Infektiokykyiset uimaitiöt irrottavat kaksi uintisiimaansa isäntäeläimen kohdattuaan [2a], koteloituvat ravun kuoreen [3.] tartuttuaan ja alkavat itämään [4.] eli tuottamaan rihmastoa kuorikerroksen läpi.
Vieraalle alustalle päätynyt siimansa irrottanut itiö (kysta) valmistautuu uusiutumaan [2b.].
Kysta uusiutuu uimaitiöksi [9.] yrittäen löytää infektoitavaa rapua. Uimaitiöt ovat lyhytikäisiä ja pysyvät uimakykyisinä korkeintaan muutamia päiviä. Saman kystan uusiutuminen uimaitiöksi voi tapahtua jopa kolme kertaa ja ellei uimaitiö ehdi löydä isäntää, se lopulta kuolee [10]. (Pursiainen & Viljamaa-Dirks 2014, Souty-Crosset ym. 2006)
Kuva 1. Rapuruton elinkierto (Pursiainen & Viljamaa-Dirks 2014; viitattu lähteeseen Souty- Crosset ym. 2006)
2.1.2. Rapuruton merkitys rapukauppaan ja jokirapukantojen romahdus
Ravut ovat olleet Euroopassa yleistä kauppatavaraa vuosisatojen ajan, mutta suosio kasvoi nykyisiin mittoihinsa vasta 1800-luvulla. Kysyntä ja kaupallinen pyynti kehittyivät niin, että rapujen vienti ja istutustoiminta sai lopulta rapuruton leviämään tuhoisasti. (Skurdal & Taugbøl 2002). Kaikki makeanveden ravut on luokiteltu alttiiksi rapurutolle (OIE 2018), joten yksikään rapualue ei ole ollut turvassa. Rapukauppa siirtyi Euroopassa aina pohjoisemmaksi rapuruton leviämisen myötä (Skurdal & Taugbøl 2002). Pohjoismaat joutuivat myös kärsimään tappiot rapusaalin vähenemisessä rapuruton vuoksi (Taulukko 1). Jokiravun saalismäärät pienentyivät useassa maassa jopa yli 90%.
Taulukko 1. Jokirapusaalin muutos rapuruton vaikutuksesta Euroopassa (Skurdal & Taugbøl 2002 [Kossakowski 1973, Cukerzis 1988, Skurdal & Taugbøl 1994, Kulesh ym. 1999 ja Skurdal ym. 1999 mukaan])
Jokiravun saalis tonneina
ennen rapuruttoa rapuruton jälkeen muutos%
Suomi >650 80-160 -82 %
Ruotsi 600-1000 20-50 -96 %
Norja >40 10 -75 %
Viro >31 1 -97 %
Liettua 250 4 -98 %
Puola 363 25-50 -90 %
2.1.3. Rapuruton leviäminen ja torjunta
Rapuruton PsI-genotyyppi on aiheuttanut epidemioita etenkin Etelä-Suomessa (Kuva 2), täplärapujen elinalueella (Kuva 4), jonne niitä on laajasti istutettu laillisesti ja laittomasti.
Suomessa PsI-genotyyppi aiheuttaa enemmän epidemioita kuin As-genotyyppi. As-genotyypin epidemiatapaukset (Kuva 2) ovat keskittyneet enemmän jokirapualueille Pohjois- ja Itä- Suomeen. (Jussila ym. 2014a)
Kuva 2. Kahden rapuruton genotyypin (As ja PsI) tautitapaukset Suomessa vuosina 1990-2017, sekä rapurutot, joiden genotyyppiä ei ole voitu määrittää (MMM 2019, Luken tietojen mukaan) Rapuruttotapausten määrä Suomessa vuosina 1890-1990 on vaihdellut vuosittain 13-321 tapauksen välillä (Kuva 3). Ensimmäiset tapaukset sijoittuivat lounaiseen Etelä-Suomeen.
1930-luvulta eteenpäin rapurutto oli jo tavoittanut Keski-Suomen ja jokirapujen oli arvioitu kadonneen noin 170:stä vesistöstä. 1950-luvun tapaukset keskittyivät Järvi-Suomeen. Vain 15 Suomen 74:stä päävesistöstä on säilynyt rapurutottomina (2006). (Mannonen ym. 2006). Eniten kirjattuja tapauksia on 1950 ja 1960 luvuilta. Tapausten määrän jyrkkä lisääntyminen johtuu osittain rapuruttotietouden heräämisestä ja kyselytutkimusten lisäämisestä. Rapujen
joukkokuolemien perusteella määritetyt rapuruttotapaukset eivät ole välttämättä aina johtuneet rapurutosta. Voimakas teollistuminen ja virtavesien muokkaus on voinut myös aiheuttaa merkittäviä rapukuolemia. (Kilpinen 2003). Tapaukset voivat olla myös samasta vesistöstä, kuten vuosina 1907-1914 ilmoitetuista 96 rapurutosta oli 52 tapausta Kokemäenjoesta (Mannonen ym. 2006).
Kuva 3. Rapuruton tautitapausten historia Suomessa (Mannonen ym. 2006)
Suomessa todetut vuosittaiset uudet, kirjatut rapuruttotapaukset ovat vaihdelleet 3-14 tapauksen välillä (vuosina 1990-2010), niin että vuosikohtainen keskiarvo on ollut 9 tapausta. 2000-luvun alussa vuosittaisia rapuruttotapauksia on ollut enemmän kuin 90-luvun puolella.
Rapuruttotapauksia on kaikkialla jokiravun levinneisyysalueella (Kuva 5). Vuonna 2010 rapuruttohavainnot painottuivat enemmän Järvi-Suomen pohjois- ja koillisosaan. Selityksenä pidettiin jokiravun vähenemistä etelän täplärapualueilta. Rapuruton eteneminen ja tapausten toistuminen pohjoisessa on myös hitaampaa kuin Etelä-Suomen epidemioissa. (Viljamaa-Dirks ym. 2011)
2.2. TÄPLÄRAPU
Täplärapu (Pacifastacus leniusculus) on vieraslaji koko Euroopassa. Alun perin sitä tuotiin Pohjois-Amerikasta täydentämään Euroopan rapuruttoon kuolevia rapukantoja. Sen luultiin olevan samankaltainen kotoperäisen lajin (A. astacus) kanssa. Täplärapua tuotiin esimerkiksi vuonna 1960 Kaliforniasta Ruotsiin. Onnistuneiden istutusten jälkeen tuotiin Tahoe-järvestä 10 000 yksilöä lisää, jotka istutettiin Ruotsissa 67 vesistöön (vuonna 1969). Suomessa täplärapuistutukset alkoivat vuosina 1967-1968, jolloin istutettiin Tahoe- ja Hennessey-järven täplärapuja, sekä myöhemmin Ruotsissa kasvaneita poikasia. (Souty-Grosset ym. 2006)
Kansallinen vieraslajistrategia on määritellyt täpläravun sisävesistöjen haitalliseksi vieraslajiksi, jonka leviäminen ja kauttakulku Suomen rajojen yli on estettävä (MMM 2012).
Euroopan Unionin asetuksen 1143/2014 mukaan vieraslaji on haitaksi biodiversiteetille, kotoperäisille lajeille, ekosysteemin rakenteelle ja toiminnalle, sekä ekosysteemipalveluille, joista voi aiheutua myös taloudellisia tappioita. Asetuksessa esitetään kieltoa kaikenlaiselle vieraslajien levittämiselle. Täplärapua ei saa EU:n alueella viljellä, eikä istuttaa. Suomessa täplärapua ei saa enää istuttaa uusiin, eikä vanhoihin täplärapuvesistöihin. Niitä ei saa myöskään siirtää vesistön niihin osiin, joissa sitä ei ole aikaisemmin esiintynyt. (MMM 2019).
Täplärapu on vahingollinen vieraslaji ja se voi aiheuttaa elinympäristössä suurta haittaa kotoperäiselle jokiravulle. Täpläravun vieraslajipiirteisiin kuuluvat sen kyky vallata elinympäristöä, kilpailla resursseista ja tuottaa runsaasti elinkelpoisia poikasia. Täplärapu suosii samanlaista elinympäristöä kuin jokirapu, joten samalla alueella elävät täplärapu- ja jokirapupopulaatiot kilpailevat ravinnosta ja elintilasta. Täplärapu on lisääntymiskykyisempi ja voi olla kooltaan suurempi kuin jokirapu. Se voi munia kerralla 200-400 munaa, kun jokirapu
vastaavasti munii keskimäärin 90-260 munaa. Käytökseltään täplärapu voi olla myös aggressiivisempi ja sietää paremmin ympäristön muutoksia kuin jokirapu. Se pystyy elämään myös murtovesissä, toisin kuin jokirapu. Täplärapu voi saavuttaa vesistössä nopeasti suuren lajirunsauden. Harvinaisemmissa tapauksissa täplärapu ja jokirapu ovat kyenneet elämään samassa vesistössä yhtä aikaa useita vuosia. (Souty-Grosset ym. 2006)
Täplärapua on istutettu Etelä-Savossa, sekä Etelä-Suomessa luvanvaraisesti vesistöihin, joihin on aikaisemmin tehty koeistutuksia. Luvattomia täplärapuistutuksia on paljastunut tapahtuneen muun muassa Saimaan selkävesiin. Luvattomat istutukset reittivesistöihin lisäävät täplärapujen ja rapuruton leviämisen riskiä latvavesiin. (Erkamo ym. 2011). Suomen vesitöihin oli ehditty istuttaa vuodesta 1989 vuoteen 2015 mennessä lähes yhtä paljon täplärapuja (2,1 milj.), kuin jokirapuja (2,32 milj.) Kansallisen rapustrategian 2019-2022 tietojen perusteella täplärapuja esiintyy noin 836:ssa vesistössä. Tietoja täplärapujen esiintymisestä saadaan yleensä kalatalousalan toimijoiden ja kansalaisten ilmoituksista, sekä aikaisemmin kirjatuista istutuksista. (MMM 2019). Täplärapua tavataan nykyisin (Kuva 4) samoilla alueilla kuin jokirapua (Kuva 5), sekä myös jokiravun suojelualueella.
Kuva 4. Täplärapuhavaintojen tilanne vuonna 2019 (Luke 2019)
2.3. JOKIRAPU
Jokirapu (Astacus astacus) on yksi Euroopan viidestä alkuperäisestä rapulajista (ICS), joiden tila on heikentynyt vierasperäisten lajien (NICS) leviämisen myötä (Agersnap ym. 2017).
Jokiravun levinneisyys kattaa Skandinavian ja Keski-Euroopan (Souty-Grosset ym. 2006).
Suomessa jokirapu on kotoperäinenlaji ja sen vanhimmat fossiililöydöt ovat ajalta 3000-1000 eaa. Alkuun jokiravun elinympäristöä (Kuva 5) oli vain Etelä-Suomi (Kristiinankaupunki-
Savonlinna-Sortavala). Jokirapu levisi muuallekin Suomeen 1800-luvun siirtoistutusten myötä ja nykyinen lisääntyvien kantojen levinneisyysalue kulkee Napapiirin kohdalla (Kuva 5).
(Kilpinen 2003). Yksipuolisten jokirapuistutusten takia Suomen jokirapupopulaatioiden geneettinen eroavaisuus on vähäinen. Suurin osa jokiravuista kuuluu joko alkuperäiseen populaatioon tai ovat jollain tapaa siitä lähtöisin. (Alaranta ym. 2006). Suomen kotoperäisenä lajina jokirapu on tärkeä sekä ruokakulttuurin, että vesiympäristön biodiversiteetin kannalta (Kilpinen 2003). Jokirapua voidaan pitää myös vesiympäristöjen avainlajina (Holdich 2002).
Kuva 5. Jokiravun levinneisyys (Pursiainen ym. 2009; viitattu lähteisiin Järvi 1910 ja Hyytinen ym. 2000)
2.3.1. Jokiravun uhanalaisuuden tila
Jokiravun uhanalaisuusluokitus Suomessa Uhanalaisuuden Punaisen kirjan 2019 mukaan on erittäin uhanalainen (EN A2abce) ja maailman Global Red List mukaan vaarantunut (VU A2ad) (Hyvärinen ym. 2019). Jokirapu on rauhoitettu Suomessa 1.11.-21.7. välisen ajan.
Ravustuskauden ulkopuolelle sille on määritetty suojeluarvo eli sakko (50€/jokirapuyksilö), joka on maksettava laittomasta pyydystämisestä. (Kalatalouden Keskusliitto 2019)
Jokirapujen määrän vähenemisen arviointi perustuu saalistietoihin (Kuva 6). Rapukantojen alueellinen kirjaaminen on riippunut vuosikymmenestä ja vesienomistajien asenneilmapiiristä (Erkamo 2019). Arvioiden mukaan Suomen jokirapukannat ovat viimeisen sadan vuoden aikana tuhoutuneet alle kymmenesosaan alkuperäisestä määrästä ja muuttuneet sijainniltaan hajanaisiksi (Erkamo & Tulonen 2019). Rapusaaliiden jyrkkä romahdus 1910-1920 aikana, johtui rapuruton leviämisestä tuottoisimpiin rapuvesiin (Westman 1992). Etenkin Hämeen ja Pirkanmaan seudulla tunnetut jokirapukannat ovat hävinneet vain murto-osaan jo pelkästään 1980-luvulta alkaen (Erkamo 2019).
Kuva 6. Suomen keskimääräinen jokirapusaalis vuosikymmenittäin. Koottu tilastoitujen vientiin pyydettyjen jokirapu- ja 1980-luvun jälkeen rapusaalistilastojen pohjalta. (Westman 1992, Savolainen & Moilanen 2010)
2.3.2. Suojelutyö ja istutukset
Rapurutto aiheutti merkittäviä jokirapukuolemia etenkin vuosien 1907-1908 jälkeen. Jokiravun heikkenevää tilannetta haluttiin parantaa istutusten avulla. Jokirapua istutettiin takaisin
vesistöihin, joista rapurutto oli kantaa heikentänyt, sekä uusille vesistöalueille. Istutuksiin käytettiin 1900-luvun alussa jokirapuja, jotka olivat alkuperäiseltä, pieneltä jokiravun elinalueelta (Kuva 5). Istutettavat jokiravut olivat peräisin alueilta, joilla myös rapurutto oli vieraillut. (Kilpinen 2003). Jokirapua on istutettu vuosittain 8 000-51 000 yksilöä (1995-2008) (Savolainen & Moilanen 2010). Suurin osa jokiravun istukkaista on ollut siirtoistukkaita (MMM 2019).
Jokiravun suojelemiseksi lukuisat pienet ja erilliset populaatiot voivat olla tärkeitä, koska niiden avulla voidaan turvata lajin säilymistä (Erkamo ym. 2011). Pienten jokirapukantojen alueilla tehtävää ravustusta tulisi välttää. Pyyntiajan kestoon tai mertalupien määrään vaikuttamalla voidaan hallita rapukantoja. (Erkamo & Tulonen 2019). Kalatalousalueilla on vastuu laatia jokiravulle suojelusuunnitelma, joka on osa vesistön käyttö- ja hoitosuunnitelmaa (MMM 2019). Täpläravun leviämisen estäminen, laittomien täplärapukantojen hävittäminen ja suunnitelmallisuus rapuruton ehkäisemiseksi ovat myös tärkeä osa jokiravun suojelutyötä, vaikka vesistössä ei tavattaisikaan jokirapua tai niiden palauttaminen ei olisi alueella vielä ajankohtaista. Kaikenlainen tiedotustyö ja informoiminen muun muassa rapupyydysten desinfioimisesta edesauttaa jokiravun suojelua. Jokiravulle tunnetusti huonosti soveltuvat vesistöt on perusteltu pitää kokonaan ravuttomina, koska ne voivat katkaista rapuruton leviämisen reittivesistöissä. (Erkamo & Tulonen 2019)
Jokiravulle on määrätty suoja-alue, jonka vesistöissä jokirapukantoja pyritään elvyttämään ja täpläravun leviämistä rajoitetaan. Jokiravun suoja-alue kattaa pääosin Keski- ja Etelä-Suomen täplärapualueiden ulkopuolella olevat vesistöt, jotka ovat Länsi- ja Pohjois-Suomessa.
Jokiravun alkuperäinen elinalue (1900-luvun alussa) Etelä-Suomessa on nykyistä täpläravun levinneisyysaluetta, eikä kuulu suojelualueeseen. (MMM 2019)
2.4. VESISTÖT JA KIINTOAINEEN MERKITYS eDNA-NÄYTTEENOTOSSA
Rapuruttoitiöiden suodatuskokeita ja tunnistusta luonnonvesinäytteistä häiritsee luonnonvesien korkeat kiintoainepitoisuudet. Mitä sameampaa suodatettava vesi on, sitä pienemmiksi lopulliset näytemäärät jäävät. (Wittwer ym. 2018b).
Suomen järvet ovat tyypillisesti vähävetisiä, matalia ja syvänteiden pinta-alalta niukkoja, mutta voivat erota ominaisuuksiltaan toisistaan hyvinkin paljon. Järvien luokittelu tapahtuu
perustuotannon, planktonin klorofyllin määrän, rehevyysasteen, humuspitoisuuden ja happamuuden määrittelyn avulla. Humuskuorma johtuu valumista ympäristöstä, kuten maaperästä, kallioperästä, sekä jäteveden valumista. Eloperäisen aineksen lisäksi voivat savimaan liuennut kiintoaines ja ravinteet aiheuttaa veden samentumista. Järven trofia-aste määritetään planktonin perustuottajien määrän tai aktiivisuuden perusteella. Perustuottajiin eli kasviplanktonin biomassaan kuuluvat eri planktonlajit, koloniat ja rihmat. Eläinplanktonia ovat hankajalkaiset (Copepoda), vesikirput (Cladocera), rataseläimet (Rotifera), alkueläimet (Protozoa) ja esimerkiksi kalan toukka-asteet. Eläinplanktonin koko vaihtelee tavallisesti 0,1- 5 mm välillä (Kuva 7). (Kobayashi ym. 2009). Kasviplanktoneihin kuuluvat mikroskooppiset levät voivat ovat kooltaan 0,2-2,0 µm (pikofytoplankton; eräät syanobakteerit) tai makrolevistä yli 100 µm (panssarilevät) (Kuva 7). Lajeja on arvioitu löytyvän 36 000 – 10 miljoonaa.
(Graham ym. 2009). Biomassan määrä voi vaihdella saman järven sisällä vuodenaikojen mukaan, jopa yhden vuodenajan sisällä. Biomassan hetkelliseen tilaan vaikuttavat muun muassa levien määrä, sääolosuhteet ja veden lämpötila. (Eloranta 2005). Keskimääräinen biomassa järvessä voi olla jopa 4 mg/L ja sen sisältämä lajimäärä runsas (Niemi ym. 2004).
Kuva 7. Vesistöissä elävien mikrobien ja planktoneläinten kokoluokat, alkaen pienimmästä 0,02-0,2 µm (Johnson & Allen 2012 mukaan)
2.5. eDNA-MENETELMÄ
eDNA-menetelmä tutkii ympäristöstä (kuten vesi, maa tai ilma) kerättyjen näytteiden DNA- jälkiä, joita eliöt ovat jättäneet. eDNA tarkoittaa kokonaisia organismeja ja vapaita, vaihtelevan kokoisia DNA-kappaleita. (Minamoto ym. 2016). Menetelmä on herkkyydeltään soveltuva muun muassa tulokaslajien, sekä uhanalaisten lajien tutkimiseen ja valvontaan (Hinlo ym.
2017). Esimerkiksi vieraslajien levinneisyyden selvittämisen tarkkuus ja nopeus paranevat, koska ei tarvitse kerätä tutkittavien lajien yksilöitä (Minamoto ym. 2016). eDNA-tutkimus ei täysin korvaa lajien yksilöitä koskevia menetelmiä, kuten sähkökalastusta ja pyydyksiä, koska se ei anna tietoa populaatioiden ominaisuuksista tai yksiköistä (esimerkiksi sukupuoli, massa, koko, ulkoinen olemus) (Olds ym. 2016). Vesieliöitä tutkittaessa eDNA-näytteitä voidaan kerätä joko vedestä tai sedimentistä. Vesinäytteet edustavat paremmin näytteenkeruun aikaista paikallista eliöstön tilaa, kun taas sedimenttinäytteissä yhdistyy ajan kuluessa sinne kerääntynyt eDNA-aines. (Mächler ym. 2016). Menetelmän etuna on, että se voi paljastaa vesistöstä rapuruton aiemmin kuin perinteinen mertapyynnillä tapahtuva havainnointi. eDNA-näytteet voivat antaa tietoa rapujen levinneisyydestä ja mahdollisesta populaation häviämisestä, sekä rapuruttoinfektioista ja sen laajuudesta. Lisäksi vesistöjen välinen taudin leviäminen näytteenoton vuoksi on helpommin kontrolloitavissa kuin mertapyynnissä. (Strand ym. 2019)
eDNA-menetelmä soveltuu A. astaci-itiöiden tunnistukseen (Strand ym. 2011, 2012, 2014, 2019, Wittwer ym. 2018a, 2018b). eDNA tunnistuksen avulla voidaan jäljittää jopa erittäin pienten rapupopulaatioiden (<0,5 yksikkösaalis) levittämää rapuruttoa (Wittwer ym. 2018b).
Kerätyt itiötiheydet ovat vaihdelleet välillä; alle 1 itiötä/litra – useita satoja itiöitä/litra (Strand ym. 2014). Menetelmällä määritetty A. astaci-itiötiheys ympäristössä on vastannut myös hyvin infektoitunutta rapupopulaatiota (Wittwer ym. 2018b).
Rapujen levittämään eDAN:n määrään vaikuttavat yksilöiden tiheys ympäristössä, sekä niiden koko ja aktiivisuus. Vesistöt, joissa rapupopulaatiot ovat suuremmat, myös havaittu eDNA- kopioiden määrä on suurempi (Agersnap ym. 2017). Lisäksi aktiiviset yksilöt vapauttavat ja levittävät ajan kuluessa enemmän eDNA:ta. (Dunn ym. 2017). Lämpötila vaikuttaa sekä rapujen aktiivisuuteen, että rapuruttoitiöiden esiintymiseen eDNA-näytteissä. Veden lämpötilan ollessa huhti-lokakuussa keskimäärin 12-16℃, myös rapuruton luontainen itiöinti on huipussaan ja siten itiömäärät eDNA-näytteissä korkeimmillaan. (Wittwer ym. 2018b).
Lämpötila on myös merkittävä tekijä eDNA-näytteen säilymiselle. eDNA säilyy
määrityskelpoisena, kun kylmäketju on ollut katkeamaton näytteenoton jälkeen ja näytteen säilytysaika mahdollisimman lyhyt. (Hinlo ym. 2017)
Käytettävien näytteiden DNA-palat ovat usein lyhyitä tai hajonneita, joten näytteenkäsittelyn tarkoitus on saada kerättyä mahdollisimman paljon eDNA:ta. Liian pieneen näytetilavuuteen ei välttämättä saada tarpeeksi tutkittavaa DNA:ta, jolloin voidaan saada virheellinen negatiivinen tulos. Näytemäärän kasvattaminen vähentää virheellisten negatiivisten tulosten määrää (Takahara ym. 2015). Näytteenkäsittelyyn kuuluvia työvaiheita sen keräämisen jälkeen voivat muun muassa olla säilytys, erotus ja sekvensointi. Jokaisessa työvaiheessa DNA:ta voi mennä hukkaan, minkä vuoksi työvaiheiden suorittaminen tarkasti ja tehokkaasti on erityisen tärkeää.
eDNA hajoaa eksponentiaalisesti näytteen keruun jälkeen. Hajoamiseen vaikuttavat käsittelyn lisäksi fysikaaliskemialliset olosuhteet, kuten lämpötila, valo, pH, johtokyky ja entsyymiaktiivisuus. (Hinlo ym. 2017). Humuspitoisten vesistöjen humushapot tai humusaines voivat inhiboida PCR-reaktioita, jolloin määritetty DNA:n määrä jää alhaiseksi.
Laimentaminen vähentää entsyymien inhibitiota humuksesta, mutta samalla vaikeuttaa eDNA:n analysointia. (Agersnap ym. 2017)
2.5.1. eDNA näytteenotto ja käsittely nykymenetelmin
eDNA:n näytteenkeräys voidaan suorittaa suodattamalla. Näytteenotto tapahtuu sen mukaan, mitä suodatintyyppiä käytetään. Myös suodatettavissa oleva näytemäärä riippuu suodatintyypistä. Suodattimen huokoskoosta ja hydrofiilisistä ominaisuuksista riippuen ovat tavallisesti eDNA:n näytemäärät vaihdelleet välillä 15 ml – 10 L. (Wittwer ym. 2018a).
Vesistöjen eDNA-näytteiden keräämiseen ja esikäsittelyyn ei ole vielä saatavilla eDNA:ta varten suunniteltua laitteistoa (Thomas ym. 2018).
Näytteenottoajankohta vaikuttaa paljon näytteen käsiteltävyyteen ja A. astaci-itiöiden erotuskykyyn. Veden sameus vaihtelee vuodenaikojen mukaan, esimerkiksi keväällä sadanta on runsasta, jolloin myös veden sameus on korkea. Veden korkean vuodenaikaissameuden myötä myös kerättyjen vesinäytteiden kiintoainespellettien massat ovat suurempia.
Käytettäessä suodatusta erotusmenetelmänä, veden sameus vaikuttaa A. astaci-itiöiden havaitsemiseen. (Wittwer ym. 2018a).
Rapuruttoitiöiden määrä ja sijoittuminen vesistössä ei ole tasaista, mikä luo haasteita edustavan eDNA-näytteen keräämiselle (Strand ym. 2011). A. astaci-itiöiden määrittäminen suurista vesistöistä vaatii mahdollisimman suuria näytetilavuuksia (Strand ym. 2014). Strand ym.
(2013) tekemissä kokeissa alle 1 L järvivesinäyte ei ollut riittävä itiöiden löytämiseen (Strand ym. 2014 mukaan).
2.5.1.1. eDNA:n erotus suodattamalla
Vesinäytteiden eDNA erotellaan suodattimen avulla, jolloin voidaan käsitellä suurempia vesimääriä (Hinlo ym 2017). Käytettävä suodatintyyppi valitaan tutkittavan eDNA:n partikkelikoon mukaan (Wittwer ym. 2018a). Rapuruttoitiöiden erotteluun ei ole näytteen suodatuksen yhteydessä aikaisemmin käytetty perusteellista esisuodatusta (Strand ym. 2011, 2012, 2014, 2019, Wittwer ym. 2018a, 2018b).
Strand ym. (2019) on testannut rapuruttoitiöiden eDNA-näytteenotossa suodattamista.
Maastossa suodatettujen vesinäytteiden määrä oli tutkimusjaksolla 55-120 kappaletta, riippuen olosuhteista. Suodatetun näytteen koko oli välillä 1-10 L, veden sameuden mukaan. Loka- marraskuun näytemäärät olivat noin 6,9 L/suodatin, kun taas kahden eri vuoden kesä-elokuun näytemäärät olivat noin 3,3 ja 4,0 L/suodatin. Näytteet kerättiin pumpun avulla noin 7 cm pohjan yläpuolelta ja 2-5 m etäisyydeltä rantaviivasta. Suodattimena käytettiin 2 µm huokoskoon Millipore-lasikuitusuodatinta. A. astaci-itiöt tutkittiin laboratoriossa suodattimelta. (Strand ym. 2019)
Strand ym. (2011) aikaisemmissa itiökokeissa rapuruton tunnistamiseksi luonnonvesistä PCR- diagnostiikalla, käytettiin luonnonvesinäytteen suodatusta. Suodattimen tukkeutuminen rajoitti Strand ym. (2011) suodatusten näytemäärää, niin että suodatettava vesimäärä oli 0,3-1 L.
Suodatukset tehtiin 3 μm huokoskoon Millipore Isopore -membraani polykarbonaatti suodattimella. (Strand ym. 2011). A. astaci -eDNA näytteitä suodattivat myös Wittwer ym.
(2018b) käyttäen 2 μm Millipore-lasikuitusuodatinta. Virtaveden partikkeleiden mukaan näytemäärä oli välillä 1,6-10 L. (Wittwer ym. 2018b)
Rapuruttoitiöiden suodatukseen on kokeiltu käytettäväksi DF (Depth filtration) ja DEUF (dead- end ultrafiltration) suodatusta. Strand ym. (2014) testasi DF- ja DEUF-menetelmien toimivuutta kenttäolosuhteissa suuremmille luonnonvesinäytetilavuuksille. DF- suodatuksella
pystyttiin suodattamaan 2-15 L näytemääriä, riippuen veden sameudesta. DEUF-suodatuksella saatiin suodatettua suurempi näytemäärä (100 L), mutta suodatusaika oli 60-90 minuuttia.
DEUF-suodatuksessa suurten partikkeleiden aiheuttamaa ultrasuodattimen tukkeutumista yritettiin estää käyttämällä 90 µm planktonverkkoa. DEUF-menetelmän heikkoutena oli, että suodatetut näytteet eivät täysin soveltuneet PCR-diagnostiikkaan, vaan osa itiöistä hukattiin näytteen loppukäsittelyssä. Näytteiden keskimääräinen itiötiheys vaihteli välillä; alle 1 itiö/L – useita satoja itiöitä/L. Jopa 54% täplärapuvesistöjen näytteissä itiötiheys oli alle 1 itiö/L.
DEUF-tekniikalla saatu itiömäärä oli heikko, vaikka näytemäärä olikin suuri. (Strand ym.
2014)
Wittwer ym. (2018a) vertasi DF- ja DEUF-suodatusmenetelmien käyttökelpoisuutta ja herkkyyttä A. astaci-itiöiden tunnistamiseen. Molemmat menetelmät soveltuivat A. astaci- itiöiden keruuseen. Suurilla näytetilavuuksilla DEUF-menetelmä oli DF-menetelmää tarkempi, mutta oli käytössä työläämpi. DF-menetelmällä saatiin suodatettua Wittwer ym. (2018a) kokeissa korkeintaan 10 L luonnonvesinäytteitä, jolloin kerätty A. astaci-itiöiden määrä oli pieni. DEUF-menetelmällä suodatettu näytemäärä oli 100 L, mutta samalla kasvoi myös kiintoaineksen määrä suhteessa eDNA:an. DF-suodatuksessa samea vesi aiheutti nopeaa suodattimen tukkeutumista ja suodatettavat vesimäärät jäivät tällöin pienemmiksi. DEUF- menetelmässä suodatetun pelletin massa oli suurempi, jolloin itiöiden erottelu muista partikkeleista hankaloitui ja itiöitä saatiin talteen vähemmän. (Wittwer ym. 2018a)
2.6. MENETELMIEN TAUSTAA
2.6.1. Suodatussysteemit
Partikkeleiden erotteluun käytettävät suodatussysteemit voidaan jakaa membraanisuodattimiin, ultrasuodattimiin, patruunamallin suodattimiin ja muihin käytettäviin suodattimiin (Kuva 8).
Yleisesti partikkeleiden rakenne, koko ja muoto vaikuttavat niiden suodatettavuuteen ja soveltuvan suodattimen valintaan. Membraanisuodatin tukkeutuu patruunasuodatinta herkemmin, mikä vaikuttaa suodatettavissa olevaan näytemäärään. Ultrasuodatuksen etu verrattuna patruunasuodatukseen, on sen käyttönopeus ja taloudellisuus. (Efstratiou ym. 2017)
Kuva 8. Tavallisimmat näytteen suodatusmenetelmät (Efstratiou ym. 2017 mukaaan)
Patruunasuodattimet ovat kevyitä ja rakenteeltaan yksinkertaisia. Ne soveltuvat käytettäväksi laajasti erilaisissa suodatussysteemeissä. Tyypillisesti suodatettava neste kulkee patruunasuodattimessa ylhäältä alas. (Steward & Arnold 2009). Niitä voidaan käyttää pysty- ja vaaka-asennossa. Suodatinten kuitumateriaalit voivat olla erilaisia muoviseoksia (Kuva 8) tai esimerkiksi varauksellisia, mikä edesauttaa suodattumista. (Perlmutter 2015).
Patruunasuodattimien toiminta perustuu umpiperärakenteeseen, jossa koko nestekuorma kulkeutuu suodattimen läpi, niin että suodatettavat partikkelit jäävät suodattimeen.
Patruunasuodattimet jaotellaan yleensä absoluutti- ja nominaaliluokituksella.
Absoluuttiluokiteltujen suodattimien ominaisuudet kuvataan sen mukaan, mikä on suurin partikkelikoko, joka pystyy kulkemaan suodattimen läpi. Nominaaliluokan patruunasuodattimien taso määritetään sitä vastoin partikkelikoon mukaan, jonka kulkeutumisen suodatin kykenee estämään. (Farhat ym. 2020; viitattu lähteeseen Williams
suodatus membraani
polykarbonaatti
(PC), uritettu polykarbonaatti
selluloosa-
asetaatti selluloosanitraatti
selluloosaesteriseos polytetrafluorieteeni (PTFE)
metalli erilaiset
virtaussovellutukset ristivirtaus pyörrevirtaus
jatkuva virtaus
patruuna
akryyli polypropyleeni (PP)
vaahtomuovi polyeetterisulfoni
polyesteri polykarbonaatti, uritettu
ultrasuodatus
ontelokuitu
umpiperä ristivirtaus
muut ARAD
mikrokuitu mikro- /nanosuodatus
1992). Patruunasuodattimien kapasiteetti yltää suurista partikkeleista, jopa 0,25 µm kokoisiin.
Patruunasuodattimet, joissa on useampi kerros huokoista materiaalia tai suodatinkerroksissa vaihteleva huokoskoko kykenevät absorboimaan enemmän partikkeleita. Virtausnopeus suodattimessa vaihtelee valmistajan ja materiaalin mukaan. Suuret painevaihtelut voivat aiheuttaa patruunasuodattimissa absorboituneen kiintoaineen irtoamista.
Vedenkäsittelyjärjestelmissä patruunasuodatinta ennen systeemissä voi olla joko hydrosykloni tai hiekkasuodatus poistamassa suurempikokoisia partikkeleita. (Steward & Arnold 2009)
2.6.2. Muut vaihtoehtoiset erotusmenetelmät
Partikkeleiden erottelua voidaan tehdä suodatuksen lisäksi myös aineen tiheyteen perustuvien kerrosgradienttien ja jatkuvan sentrifugaation avulla. Partikkeleiden erottelussa sentrifugointia käytetään usein välivaiheena, kun käsitellään suodattimelta uutettua ainesta. Tavallinen sentrifugointi pystyy käsittelemään kerrallaan vain pieniä näytemääriä. Suurille näytemäärille käytetään jatkuvaan sentrifugointiin perustuvaa menetelmää (CFC), jonka etuina ovat helppous ja taloudellisuus. Ilman suodatusta toimiva jatkuva sentrifugointi ei kuitenkaan ole yleispätevä kaikkien vesinäytteiden analysointiin, joten menetelmää ei hyödynnetä yleisesti. (Efstratiou ym. 2017)
Hydrosyklon on jatkuvaan sentrifugaatioon perustuva partikkeleiden erotin. Hydrosyklonin rakenteeseen kuuluu yleensä suljettu sylinteriosa, jonka kartionmuotoisessa alakappaleessa nesteen muodostama ylöspäin kiertävä voimakas virtauspyörre saa aikaan kiintoaineksen erottumisen. Syötetty kiintoainesta sisältävä nestekuorma kulkee suurella nopeudella sykloniin, muodostaen kaksoispyörteen, jossa sisäpyörre virtaa syklonin alaosan poistoputkelle poistaen raskaimmat partikkelit. Pyörteessä kulkevat partikkelit altistuvat kahdelle vastakkaisvoimalle:
ulospäin suuntautuvalle sentrifugaaliselle voimalle ja pyörteen sisäänpäin suuntautuvalle vetovoimalle. Erityisesti sentrifugaalinen voima on tärkeä partikkeleiden erottelussa, sillä se vaikuttaa partikkeleiden säteittäiseen laskeutumistahtiin. Partikkelit saadaan erottumaan eri laskeutumisen vuoksi koon, muodon ja ominaisen gravitaatiovoiman mukaan. Hydrosyklonin toimintaperiaate on yksinkertainen, mutta sitä ohjaavat nesteen dynamiikan lainalaisuudet ja pyörimisliikkeen fysiikka separaatiossa ovat monimutkaisia. Esimerkiksi sylinterin sisällä olevan syklonin halkaisijalla on vaikutus pyörteen ominaisuuksiin. (Murthy & Bhaskar 2012)
2.6.3. PCR
PCR-menetelmä soveltuu käytettäväksi näytteiden analysointiin, joissa DNA on hajonnut tai sitä on jäljellä vain vähän. Tutkittaessa eDNA-näytteitä, joissa DNA on pieninä kappaleina tai erittäin vähäisinä konsentraatioina, tulisi tehdä useita rinnakkaismäärityksiä. Sisäinen positiivikontrolli paljastaa potentiaalisesti väärät negatiiviset tulokset. (Takahara ym. 2015) Näytteiden kontaminoituminen PCR-työskentelyn jossain vaiheessa voi antaa virheellisen positiivituloksen. Erityisesti määritettäessä alueilla asuvaa lajistoa tulisi olla tarkkana kontaminaatiosta, ettei virheellisiä päätelmiä lajiston koostumuksesta synny. (Olds ym. 2016)
PCR-vaiheessa analysoidaan lopulta pieneen näytemäärään sisältyvä laaja joukko alkuperäisen näytteen eDNA:ta. Erotettua DNA:ta voi olla lopulta PCR-reaktioita varten 1-128 μl. Eri lajien tarkka havaitseminen voi vaatia eri määrät eroteltua DNA:ta, joten näytteen käsitellyllä on tärkeä rooli, jotta oikea määrä saavutetaan. (Mächler ym. 2016). qPCR-tutkimuksissa on tiedettävä tarkalleen mitä lajia tutkitaan, jotta reaktioita varten osataan valita muun muassa soveltuvat alukkeet (Agersnap ym. 2017).
3. TYÖN TAVOITTEET
Työn tavoitteena on kehittää ja testata esisuodatusmenetelmää, jonka avulla voidaan eristää A.
astacin itiöt vesinäytteestä rapuruton diagnostista PCR-määritystä varten. A. astacin itökoon mahdollinen vaihtelu selvitetään halkaisijan ja pinta-alan suhteen. Itiöiden ja eDNA:n erottelemiseen vesinäytteestä tarvitaan esisuodatusmenetelmä ja soveltuva laitteisto, jonka erotustarkkuus ja tehokkuus soveltuvat pienten partikkeleiden (~10 µm) erottamiseen suurista näytetilavuuksista (>100 L). Vesinäytteissä suuri näytetilavuus on ratkaiseva, koska pienillä näytetilavuuksilla A. astaci voi jäädä määritysten ulkopuolelle. Luonnonvesien tutkimuksen haastavuutta lisäävät pienien A. astaci itiöpitoisuuksien lisäksi myös häiritsevät muut aineet, kuten humuspartikkelit. Toimivan esisuodatusmenetelmän testaamisen jälkeen tutkitaan mahdollisuutta jatkaa partikkelierottelua jatkuvan sentrifugaation avulla.
työn tarkoituksen 5 pääkohtaa:
1. Kehittää ja rakentaa pintaveden esisuodatukseen soveltuva laitteisto, jolla saadaan kerättyä eDNA:ta. Laitteiston on kyettävä erottamaan A. astaci kokoluokan partikkelit (d ~10 µm), sekä käsittelemään yli 100 L näytemääriä kenttäolosuhteissa. Apuna käytetään kirjallisuudessa jo olemassa olevaa tietoa partikkelisuodatuksesta.
2. Tarkoituksena tehokkaasti suodattaa vesinäytteestä halkaisijaltaan > 20 µm partikkelit, hukkaamatta analysoitavaksi tulevaa ~10 µm halkaisijakokoa.
3. Selvittää rapuruttoitiökoon vaihtelua ja kehittää sen perusteella suodatussysteemiä.
4. Hakea perusteita jatkuvan sentrifugaation käyttämiseen esisuodatuksen jälkeen.
5. Hakea suosituksia eDNA:n näytteenkeruun jatkosuodatuksen, sekä yleisen kehittämisen tueksi.
4. AINEISTO JA MENETELMÄT
4.1. ESISUODATUSSYSTEEMI
Esisuodatettavaa vesinäytettä suodatetaan tiheämpien suodattimien avulla niin, että jäljelle jää näyte, jossa ei ole häiritseviä partikkeleja ja jossa eDNA on säilynyt määrityskelpoisena.
Suodatinten tarkoitus on erotella tutkittavasta luonnonvedestä kaikki rapuruttoitiötä (noin 10 µm) suuremmat partikkelit.
Esisuodatusta varten rakennettiin suodatuslaitteisto (Kuva 9), joka mahdollisti näytteiden ottamisen suodatuksen eri vaiheista (näytteet 0-3). Suodatuslaitteiston osat ovat uppopumppu (Royal RSP 2562, ISC GmbH, Germany), letkut (Ø 25 mm), liittimet, säätöhana, painemittari, sekä kaksi mikrokuitupatruunasuodatinta patruunarungoissa. Käytettyjen patruunasuodatinten erotusaste oli 60 µm (WatMan patruuna pestävä nylon 9 3/4 60 mic, Suomi) ja 20 µm (WatMan kiintoainepatruuna 20-9 7/8 20 mic, Suomi). Suodattimet valittiin niin, että suurempi huokoskoko erottaa näytteestä kaikista suurimmat partikkelit ja pienempi huokoskoko päästää rapuruttoitiön läpi. Virtausnopeus suodatuksessa 0,5 bar paineella oli 8,41 m³/s.
Kuva 9. Esisuodatuslaitteiston rakenne. Näyte-0 on alkuperäinen käsittelemätön näyte, näyte-1 on pumppunäyte, näyte-2 on I-suodatinnäyte ja näyte-3 on II-suodatinnäyte.
4.2. RAPURUTTOITIÖIDEN JA JÄRVIVEDEN ESISUODATUS
Rapuruttoitiöiden suodatuskokeita varten A. astaci itiöt tuotettiin Cerenius ym. (1988) menetelmän mukaan. Itiöiden halkaisijan tutkimiseen käytettiin kolmea mahdollisimman erilaista A. astaci kantaa: UEF-At1D, UEF-SATR1 ja UEF-T16b. Kanta UEF-At1D on As- genotyyppiä ja sen isäntänä on ollut Venesjärven jokirapu. UEF-SATR1 on PsI-genotyyppiä ja isäntänä ollut Saimaan täplärapu. UEF-T16b on PsI-genotyyppiä ja isäntänä ollut Pohjois- Amerikan Tahoe järven täplärapu.
Itiöt värjättiin sinisellä väriaineella (Lactophenol Blue-solution, Fluka Analytical).
Alkuperäisen suspension itiötiheys oli 38 000 itiötä/ml. Itiöt lisättiin 10 litraan tislattua vettä, jolloin suodatuksiin käytetyn itiönäytteen teoreettinen tiheys oli 1520 itiötä/ml.
Itiötiheys laskettiin kaavalla (1):
!"#$%&'& #)!'&
!"#$%&'& *+,''-'& x 104 (1)
Järviveden partikkeleiden esisuodatusta varten käytettiin vesinäyteitä Kallaveden Neulalahdesta (avovesi, näytteenottoaika kesä) ja Savilahdesta (pintanäyte, ranta, näytteenottoaika kevät). Vesinäytteiden keräyspaikat valittiin niiden läheisen sijainnin mukaan.
Kokonaisnäytemäärä oli noin 25 L.
Analysoitavat näytteet otettiin suodatussysteemistä pumpun jälkeen, I-suodattimen ja II- suodattimen jälkeen (Kuva 9), ja niitä verrattiin alkuperäisen 0-näytteen partikkelimääriin.
4.2.1. Rapuruttoitiöiden ja järviveden imusuodatus
Esisuodatetut vesinäytteet imusuodatettiin ruudukkosuodattimelle mikroskooppikuvausta varten. Imusuodatukseen käytettiin imupulloa (Duran Schott Mainz vakuumfest 250ml), büchnersuppiloa (Haldenwanger 127 C-1, 55 mm) ja 0,45 µm huokoskoon ristikkosuodatinta (Sartorius Gridded Membrane Filters, Cellulose Nitrate, 50 mm, 11406-50-N, Germany).
Imusuodatuksen ja partikkeleiden laskemisen suodatinpaperilta katsottiin olevan yksinkertaisin ja taloudellisin tapa tutkia partikkeleita.
Ristikkosuodattimelle pipetoitiin esisuodatettua rapuruttoitiönäytettä 100 ml ja esisuodatettua järvivesinäytettä 5 ml. Järviveden partikkelitiheys oli suurempi kuin rapuruttoitiönäytteessä, joten mikroskooppikuvantamista varten täytyi käyttää erotettavissa olevia näytemääriä.
4.3. MIKROSKOPOINTI, KUVANTAMINEN JA IMAGE-J
Esisuodatuslaitteiston tehokkuutta mallinnettiin mikroskooppikuvantamalla. Lisäksi kuvantaminen antoi tietoa partikkeleiden muodosta ja ulkonäöstä. Itiöiden tai luonnonveden partikkelikokoluokkien muutos laskettiin käyttämällä Dino-eyepiece 1,3 mpx 5 mpx mikroskooppikameraa ja ImageJ (FIJI, GNU General Public License) -tietokoneohjelmaa.
Suodatetut partikkelit kuvattiin satunnaisilta suodatinpaperin ruudukon ruuduilta mikroskoopilla (Olympus-CK40-trinocular, Japan), kuvat analysoitiin sitä varten ohjelmoidun makron avulla (Kuva 10) ja lopuksi partikkelimäärät siirrettiin taulukkolaskentaohjelmaan.
ImageJ:n analysoimat pinta-alat muutettiin µm²-yksikköön lasketun korjauskertoimen avulla (imageJ-mittakaava/mittakaava todellisuudessa= 3,22). ImageJ-ohjelmaa käytettiin selvittämään itiökohtaista tietoa pinta-alasta. ImageJ-ohjelma määrittää vain partikkelin pinta- alan, mutta tulosten tulkintaa ja vertailua varten laskettiin myös teoreettinen halkaisija.
Jokaiselle kannalle laskettiin pinta-alan keskiarvo, keskihajonta ja mediaani. Rapuruttokantojen itiöiden alkuperäinen mittausdata rajattiin kirjallisuuden perusteella pinta-alan välille 20,0- 199,0 µm² ja halkaisijan mittausdata välille 5,0-15,9 µm. Menetelmän tarkkuutta verrattiin Savonian ympäristöanalytiikan laboratorion PAMAS-partikkelilaskurilla suoritettuihin mittauksiin.
Kuva 10. Merkittyjen satunnaisten itiöiden pinta-alat (A) ja lasketut halkaisijat (d). Kuvasta on valittu kolme erilaista itiötä ulkonäön mukaan. Itiöt on kuvattu mikroskoopin avulla suodatinpaperilta ja niiden koko määritetty ImageJ-ohjelmalla. Kuvassa kolme UEF-At1D- kannan itiötä ovat kooltaan: 1. A=221 µm², d=16-17 µm, 2. A=88 µm², d=10-11 µm, 3. A=134 µm², d= 13-14 µm.
4.4. RAPURUTTOITIÖIDEN HALKAISIJOIDEN MITTAAMINEN, PAMAS
Rapuruttoitiöiden lukumäärä, pinta-ala, tilavuus ja halkaisija määritettiin PAMAS S40- partikkelilaskurilla (PAMAS Partikelmess- und Analysesysteme GmbH, Germany). PAMAS- laskuri on suunniteltu öljynäytteiden hiukkaslaskentaan. Maksimikonsentraatio laitteen sensorille on 24 000 partikkelia/ml. Partikkelilaskurilla analysoidaan näytteen kokonaispartikkelimäärä ja niiden jakauma halkaisijan mukaan. PAMAS määrittää vain partikkeleiden halkaisijakokoluokat, joten tuloksista laskettiin teoreettinen pinta-ala vertailua varten. Laitteen mittaustarkkuus on 1µm-70µm ja analysointinopeus jatkuvalla virtauksella 25 ml/min. (PAMAS 2019)
PAMAS-partikkelilaskuria käytettiin lisäämään tarkkuutta itiömittauksiin. Järviveden halkaisijalta alle 3 µm partikkeleita ei ollut mahdollista tarkastella mikroskooppikuvantamalla, joten pienten partikkeleiden osuus selvitettiin PAMAS-laskurilla, jonka määritystarkkuus oli 1 µm. PAMAS-laskuri mittaa partikkeleista vain yhden suunnan halkaisijan. Rapuruttoitiöiden analysointia varten näytetilavuudeksi asetettiin 10,0 ml ja tutkittavat partikkelin kokoluokat 1 µm tarkkuudella 10 µm asti, josta suurempaan 5 µm ja 20 µm tarkkuudella. Jokaiselle kannalle laskettiin halkaisija ja pinta-ala.
4.5. RAPURUTTOITIÖIDEN SENTRIFUGOIMINEN
Sentrifugointinopeuden vaikutusta rapuruttoitiöiden laskeutumiseen testattiin kahdella rinnakkaisella 10 ml rapuruttoitiöliuoksella (UEF-SATR1 A. astaci zoospores), joiden itiöpitoisuus oli 60 555 itiötä/ml. Näytteitä sentrifugoitiin sentrifugilla (Eppendorf Centrifuge 5810R, Germany) 15 ml:n eppendorf-näyteputkissa laitteen 200, 500, 650, 850, 1050, 1500, 2000, 3000 ja 4000 rpm nopeuksilla. Tuloksia varten nopeudet muutettiin muotoon 300, 750, 1000, 1300, 1600, 2200, 3000, 4500, 6000 x g. Sentrifugointinopeudet testattiin yhden ja kahden minuutin ajoilla. Jokaisesta tehdystä ajosta pipetoitiin 0,5 ml rinnakkaisnäytteet kuoppalevyille. Itiöt laskettiin myöhemmin kuoppalevyiltä solulaskukammiolla (Hirschmann, Bürker Bright-Line EM Techcolor, tiefe 0,100 mm, 0,0025 mm²).
4.6. TILASTOLLINEN TULKINTA
Rapuruttokantojen itiöiden pinta-alan ja halkaisijan vertailun tilastollinen tulkinta tehtiin kaksisuuntaisella Studentin t-testillä (two-tailed distributions, two-sample unequal variance).
Rapuruttoitiöiden ja järviveden partikkeleiden esisuodatusten tilastollinen tulkinta tehtiin yksisuuntaisella Anovalla Post Hoc Test, LSD (0,05) testillä.
5. TULOKSET
5.1. RAPURUTTOITIÖN KOKO
5.1.1. Rapuruttokantojen itiöiden pinta-ala ja halkaisija, ImageJ-analyysi
Kolmen rapuruttokannan itiöiden pinta-ala määritettiin ImageJ-ohjelman avulla (Kuva 11).
Kannan UEF-At1D pinta-alan keskiarvo oli 115,8±49,1 µm² ja mediaani 124,2 µm². Kannan UEF-SATR1 pinta-alan keskiarvo oli 79,4±48,2 µm² ja mediaani 69,6 µm². Kannan UEF-T16b pinta-alan keskiarvo oli 76,6±49,3 µm² ja mediaani 60,9 µm². UEF-At1D-kannan itiön pinta- alan keskiarvo oli tilastollisesti merkitsevästi suurempi (t-testi, p>0,001) kuin UEF-SATR1 ja UEF-T16b -kannoilla. SART1 ja UEF-T16b kantojen itiöiden pinta-ala oli lähes saman suuruinen, eikä kantojen välillä ollut tilastollisesti merkitsevää kokoeroa (p>0,05).
Kuva 11. Kolmen rapuruttokannan (UEF-At1D, UEF-SATR1 ja UEF-T16b) itiöiden pinta-alat.
Pinta-alat (µm²) määritetty mikroskooppikuvasta ImageJ-ohjelmalla laskemalla. Kuvassa 50%
tutkituista itiöistä sijoittuu laatikon alueelle, mediaani merkitty laatikon keskelle poikkiviivalla, keskiarvo x:llä ja kantojen pienimmät, sekä suurimmat arvot janapääteviivalla.
pinta-ala (µm²)
0 50 100 150 200 250
UEF-At1D UEF-SATR1 UEF-T16b
Kolmen rapuruttokannan itiöiden halkaisija määritettiin laskennallisesti ImageJ-ohjelman pinta-alatietojen avulla, jotta määritettyjä itiökokoja voitaisiin verrata kirjallisuusarvoihin sekä PAMAS-tuloksiin (Kuva 12). Kannan UEF-At1D halkaisijan keskiarvo oli 11,7±2,9 µm ja mediaani 12,4 µm. Kannan UEF-SATR1 halkaisijan keskiarvo oli 9,5±3,1 µm ja mediaani 9,4 µm. Kannan UEF-T16b halkaisijan keskiarvo oli 9,3±3,1 µm ja mediaani 8,8 µm. UEF-At1D- kannan itiöiden halkaisija oli tilastollisesti merkitsevästi suurempi kuin UEF-SATR1 (t-testi, p<0,001) ja T16b (p<0,001) kannoilla. SATR1 ja UEF-T16b kantojen itiöiden pinta-ala oli lähes saman suuruinen, eikä kantojen välillä ollut tilastollisesti merkitsevää kokoeroa (p>0,05).
Kuva 12. Kolmen rapuruttokannan (UEF-At1D, UEF-SATR1 ja UEF-T16b) itiöiden halkaisijat. Pinta-alat (µm²) määritetty mikroskooppikuvasta ImageJ-ohjelmalla ja halkaisija laskemalla. Kuvassa 50% tutkituista itiöistä sijoittuu laatikon alueelle, mediaani merkitty laatikon keskelle poikkiviivalla, keskiarvo x:llä ja kantojen pienimmät, sekä suurimmat arvot janapääteviivalla.
halkaisija (µm)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
UEF-At1D UEF-SATR1 UEF-T16b
