Spektrin laskenta

Syntyv¨an s¨ateilyn voimakkuus vaihtelee sinimuotoisella tavalla. Kun s¨ateily vuorovai-kuttaa n¨aytemateriaalin kanssa, s¨ateilyn intensiteetti muuttuu s¨ateilylain mukaisesti ja t¨aten interferogrammi muuttuu, kun n¨ayte absorboi IR-s¨ateily¨a. Lopuksi interfero-grammi mitataan pisteitt¨ain detektorilla. Koska laitteen muodostama interferogam-mi ei ole s¨ateilyn intensiteetti taajuuden funktiona, vaan saatu signaali on aikata-sossa, on hy¨odynnett¨av¨a matemaattista kuvausta, Fourier-muunnosta, jonka avulla saatu interferogrammi muunnetaan taajuustason spektriksi. [31] Ennen varsinaista FT-muunnosta tehd¨a¨an apodisointi, jossa interferogrammia k¨asitell¨a¨an matemaatti-silla funktioilla niin, ett¨a saadaan melko symmetrinen interferogrammi. Apodisoin-nissa poistetaan ep¨asymmetriat, kuten sivuosat. Haittana on kuitenkin spektrin re-soluution huononeminen.[31]

jossaf(ξ) on taajuustason vaste,ˆ ion imagin¨a¨ariyksikk¨o jaf(x)on aikatason funktio.

[32] FTIR-spektrometri ker¨a¨a ja muokkaa interferogrammin, suorittaa FT-muunnoksen kahdesti ja antaa lopullisen n¨aytteen IR-spektrin. [25] Tavallisessa FTIR-mittauksessa tuloksena muodostuu kaksiulotteinen spektri, jossa x-koordinaatti ilmaisee aaltoluvun ja y-koordinaatti absorbtion intensiteetin. Kuvantavassa FTIR-mittauksessa, jossa FTIR-laite on yhdistettyn¨a mikroskooppiin on tavallisen FTIR-mittauksen erikois-muoto. Kuvantavassa FTIR-mittauksessa muodostuu kolmiulotteinen datamatriisi, jonka x- ja y- koordinaatit tarjoavat spatiaalista tietoa molekyylist¨a, kun taas z-koordinaatti kertoo intensiteetin arvon kyseisell¨a aaltoluvun kohdalla. N¨aiden para-metrien avulla pystyt¨a¨an visualisoimaan hyperspektrikuvina jokaisen luukudoksen pa-rametrit tutkittavasta n¨aytteest¨a. [33, 34] Kuvassa 3 on havainnollistettu IR-spektrin mittaamista ja kuvantavalla FTIR:ll¨a muodostuneen datamatriisin ja FTIR-spektrin yhteys.

Kuva 3: Havainnollistettu kuva IR-spektrin mittaamisesta. Kuvan oikeassa yl¨ akul-massa on kuvantavalla FTIR:ll¨a muodostunut datamatriisi.

Koska luun IR-spektrist¨a on helposti saatavissa tietoa molekyylist¨a ja sen naapu-rustosta, useimmat FTIR-v¨ar¨ahdysspektroskooppiset kaistat ovat yhdistelm¨akaistoja, jotka koostuvat tietyn molekyylin ja sen naapuritilan spesifisist¨a piikeist¨a. [7] Jotta voitaisiin m¨a¨aritt¨a¨a taustalla olevien absorptiokaistojen tarkat sijainnit ja intensitee-tit, on IR-kaistojen p¨a¨allekk¨aisyytt¨a v¨ahennett¨av¨a pienent¨am¨all¨a niiden leveyden ja intensiteetin suhdetta muuttamatta kaistan sijaintia ja pinta-alaa. T¨am¨a spektrin kor-jaus voidaan tehd¨a hy¨odynt¨am¨all¨a erilaisia matemaattisia menetelmi¨a kuten Fourierin dekonvoluutiota (engl. Fourier self-deconvolution, FSD), toisen derivaatan spektros-kopiaa (engl.second derivative spektroscopy) ja k¨ayr¨ansovitusta (engl.curve fitting).

[8, 19, 51] Kuvassa 4 on esimerkiksi, jossa CO²⁻₃ -ionille ominainen kaista on v¨ alil-l¨a 890-850 cm⁻¹, joka sis¨alt¨a¨a kolme erilaista absorptiopiikki¨a riippuen CO²⁻₃ -ionin substituutiosta.

Kuva 4: Esimerkki v2CO⁻²₃ -ionin absorptiopiikkien dekonvoluutiosta. Punaisella k¨ ay-r¨all¨a on summa absorptiopiikeist¨a, mutta data-analyysill¨a saadaan selville sen koostu-van kolmesta erilaisesta absorptiopiikist¨a riippuen CO²⁻₃ -ionin substituutioista. Muo-kattu kuva [8].

FTIR-spektroskopiassa molekyyliv¨ar¨ahtelyjen absorbanssit ovat suoraan verran-nollisia pitoisuuden kanssa. T¨at¨a tapahtumaa mitataan s¨ateilyn intensiteetin heikke-nemisen avulla, jolloin kiinnostavan yhdisteen pitoisuus voidaan m¨a¨aritt¨a¨a hy¨ odyn-t¨am¨all¨a Beer-Lambertin lakia

A = − log

I

I

= cl, (1)

miss¨aA on n¨aytteen absorbanssi, I on mitattu intensiteetti,I₀ on s¨ateilyn alkuper¨ ai-nen intensiteetti, on molaarinen absorptiokerroin, c on n¨aytteen konsentraatio ja l on valon kulkema matka n¨aytteess¨a. [24, 35, 36]

3 Luukudoksen FTIR-spektroskopia

FTIR on laajasti k¨aytetty erilaisten biologisten n¨aytteiden, kuten luun ja ruston tut-kimuksissa, koska se tarjoaa samanaikaisesti kvantitatiivista ja kvalitatiivista tietoa kudoksessa tapahtuvien rakenteellisten ja spatiaalisten koostumusten muutoksien ha-vaitsemisesta. Lis¨aksi spektrien yksityiskohtaisemman analyysin avulla voidaan saa-da tietoa molekyylin vuorovaikutussuhteista ymp¨ar¨oivien funktionaalisten ryhmien kanssa. [7, 15, 28]

3.1 Luukudos

Luukudos on el¨av¨a¨a, jatkuvasti uusiutuvaa heterogeenist¨a komposiittimateriaalia, jo-ka koostuu mineraaleista, soluv¨aliaineesta eli matriksista, vedest¨a, lipideist¨a ja erilai-sista soluista. N¨aiden komponenttien suhteelliset osuudet kuitenkin vaihtelevat riip-puen muun muassa kudoksen i¨ast¨a, kudostyypist¨a ja -paikasta ja terveydentilasta.[1, 3, 7, 37, 38, 39]

Ihmisen luustosta voidaan erottaa kahden tyyppist¨a luuta, tiivis- ja hohkaluuta.

Tiivisluu kattaa luuston massasta noin 80 prosenttia, ja se on tihe¨a¨a, kovaa ja kest¨av¨a¨a sek¨a muodostaa luun kuorikerroksen. T¨am¨an kerroksen alla on hohkaluuta, joka kat-taa noin 20 prosenttia luuston massasta. Se on huokoista, kevyemp¨a¨a ja joustavampaa materiaalia, jonka v¨aleiss¨a on luuydint¨a. [4, 19] Molemmat luulajit sis¨alt¨av¨at samat peruskomponentit, joiden avulla ne kehittyv¨at melko erilaisiksi luiksi. Tiivisluu ra-kentuu useista pienist¨a tiivisti pakatuista sylinterim¨aisist¨a luun rakenneyksik¨oist¨a eli osteoneista, joiden keskell¨a kulkee Haverisian kanavassa verisuonia ja hermoja. Hoh-kaluu muodostuu huomattavasti eri tavalla, sen pinnalla olevat rakenteet hallitsevat luun muodostumisprosessia, mik¨a johtaa huokoiseen avoimeen rakenteeseen. [1, 4, 38]

Kuvassa 5 on havainnollistettu luun rakennetta.

Kuva 5: Luun rakenne. Muokattu kuva [1].

Luu muodostuu nelj¨ast¨a erilaisesta luusolusta: osteoblasteista, -klasteista ja -syyteist¨a sek¨a pintasoluista (engl. bone lining cells). Luusoluilla on t¨arke¨a merkitys luun uusiutumisessa, sill¨a luu on hyvin aktiivinen el¨av¨a kudos. Luun uusiutuminen on kuitenkin eritt¨ain monimutkainen jatkuva prosessi, jossa vanha luu korvataan uu-della luulla syklisesti. Sykli koostuu kolmesta eri vaiheesta, jotka tapahtuvat kaikkien nelj¨an eri luusolun koordinoidun toiminnan ansiosta. Luun uusiutuminen alkaa, kun osteoklastit tuhoavat vanhaa luuta, jolloin kiinte¨a aines imeytyy verenkiertoon (re-sorptio). Seuraavaksi on siirtym¨ajakso resorptiosta uuden luun muodostumiseen, jon-ka j¨alkeen osteoblasteilla on t¨arke¨a rooli uuden luun muodostamisessa. Lopulta sykli saadaan p¨a¨at¨okseen osteosyyttien eli kypsien luusolujen ja pintasolujen koordinoidul-la toiminnalkoordinoidul-la. [2] Luun uusiutuminen on pintailmi¨o luun onteloissa, ja sit¨a esiintyy kortikaalisessa luussa periosteaalisesti, endosteaalisesti ja Haversian kanavan pinnoil-la, joissa se on my¨os hidasta, kun taas trabekulaarisilla pinnoilla uusiutuminen on no-peampaa. [1, 7, 15, 19] Luun jatkuvasta uusiutumisesta johtuen luukudos sis¨alt¨a¨a kah-dentyyppisi¨a kehitysvaiheita, kypsi¨a ja kehittym¨att¨omi¨a. Kyps¨a luu on j¨arjest¨aytynyt ja suuntautunut kuormituksen mukaisesti, kun taas kehittym¨at¨on luu on rakenteel-taan v¨ahemm¨an j¨arjest¨aytynytt¨a ja sis¨alt¨a¨a korkeammat solu- ja vesipitoisuudet.[1, 4]

Luukudoksen matriksi voidaan jakaa ep¨aorgaanisen ja orgaanisen osan kompo-nentteihin. Matriksin ep¨aorgaaninen mineraalifaasi on suurimmaksi osaksi kalsium-ja fosfaatti-ioneita (Ca²⁺, PO³⁻₄ ), josta suurin osa on heikosti kiteytynytt¨a kalsium-hydroksiapatiittia ([Ca₁₀(P O₄)₆(OH)₂], HA), joka on luonnossa esiintyv¨an apatiitti-mineraalin analogi.[5, 6, 7, 33, 37] Lis¨aksi ep¨aorgaaninen faasi sis¨alt¨a¨a merkitt¨avi¨a m¨a¨ari¨a erilaisia ioneja, kuten magnesiumia (Mg²⁺), kaliumia (K⁺), natriumia (Na⁺), fluoridia (F⁻), strontiumia (Sr²⁺), sinkki¨a (Zn²⁺), sitraattia ([C₆H₅O₇]³⁻) ja vetykar-bonattia (HCO⁻₃). [4, 38] T¨aysin puhtaat apatiitit koostuvat Ca²⁺- , PO³⁻₄ - ja hydrok-sidi (OH⁻) -ioneista, joista OH⁻ tai PO³⁻₄ voivat substioitua erilaisilla ioneilla, kuten vetyfosfaatti (HPO²⁻₄ ) tai karbonaatti (CO²⁻₃ ), riippuen kuitenkin kudoksen kemial-lisesta ymp¨arist¨ost¨a. [1, 4, 7, 8] T¨am¨an takia luun HA:lle on tunnusomaista erilaiset kidehilan substituutio- eli korvautumisreaktiot, joiden ansiosta luun ep¨aorgaanisessa matriksissa on merkitt¨avi¨a m¨a¨ari¨a ep¨apuhtauksia. [7, 19, 40] Jos substituutioreaktio kohdistuu HA-kiteen OH⁻-ioniin on kyse A-tyypin substituutiosta, jos PO³⁻₄ -ioniin on kyse B-tyypin substituutiosta. Mahdollista on my¨os, ett¨a substioituvat ionit kiin-nittyv¨at l¨oyh¨asti HA-kiteen pintaan, jolloin kyseess¨a on labiili muoto. Substituution tyypill¨a ja laajuudella on vaikutusta mineraalikiteen liukoisuuteen, kokoon ja muo-toon, jotka muuttuvat luun kypsymisen aikana.[4, 7, 8, 40]

Luun orgaanisesta matriksista suurin osa (n. 90 %) on tyypin 1 kollageenia, jo-ka on my¨os suurin kuituproteiini.[7, 22] Kollageenikuidut ovat j¨arjest¨aytyneet solun ulkoiseen tilaan rakenteena, joka on riippuvainen luukudoksen toiminnasta. Lis¨aksi ep¨aorgaanisen matriksin mineraalikiteet ovat muodostuneet kollageenis¨aikeiden v¨ a-liin, mink¨a ansiosta kollageenis¨aikeet tarjoavat tukimatriisin mineraalikiteiden muo-dostukselle. Kollageenis¨aikeiden v¨aliin muodostuvat my¨os ristiliitokset (engl. cross-links), jotka j¨aykist¨av¨at rakennetta ja antavat luulle sen lujuuden.[1, 4, 8, 16, 22]

Ristiliitokset muuttuvat ep¨akypsist¨a kypsiksi spontaanisti tai katalyyttien avulla. Li-s¨aksi ristiliitoksien laatu on erilainen riippuen siit¨a, onko sidekudos mineralisoitunut vai ei. [1, 22] Loppu 10%orgaanisesta matriksista on p¨a¨aasiassa ei-kollageenisia pro-teiineja kuten kasvutekij¨oit¨a, osteokalsiinia, lipidej¨a ja erilaisia solukomponentteja, ja n¨aill¨a on t¨arke¨a rooli luun metaboliassa ja uudelleenmuodostumisessa. [2, 8, 37, 41]