FTIR on eritt¨ain herkk¨a luun kemiallisille komponenteille ja tarjoaa runsaasti bioke-miallista tietoa luusta. [8, 15] Luukudoksen IR-spektrien absorptiopiikit muodostuvat molekyyliv¨ar¨ahtelyjen kvantisoitujen energitasojen v¨alisist¨a siirtymist¨a ja vastaavat molekyylin sidosv¨ar¨ahtelytaajuutta. N¨am¨a v¨ar¨ahtelyt riippuvat molekyylien kemial-lisesta luonteesta, joten ne paikantuvat molekyylien spesifisiin osiin, joita kutsutaan funktionaalisiksi ryhmiksi. Eri funktionaalisilla ryhmill¨a on erilaiset absorptiopiikin intensiteetit, leveydet ja tyypillisesti erilaiset sijainnit ts. ne absorboivat eri infrapuna-alueilla, mik¨a antaa n¨ayteelle oman ainutlaatuisen profiilin eli sormenj¨aljen. [8, 19]
T¨aten jokaisen hyperspektrikuvan pikselin IR-absorptiospektrist¨a voidaan analysoi-malla saada tietoa biokemiallisesta koostumuksesta, eri molekyylien konsentraatiois-ta, konformaatioiskonsentraatiois-ta, molekyylirakenteista ja hienovaraisista vuorovaikutuksista mole-kyyli¨a ymp¨ar¨oivien funktionaalisten ryhmien kanssa. [15] Tyypillinen luun IR-spektri t¨arkeimpien molekyylien osalta on esitetty kuvassa 6.
Kuva 6: Luun IR-spektri. T¨arkeimm¨at luun molekyylit ovat amidi I-III, fosfaatti ja karbonaatti. Muokattu kuva [3].
Luusta johdettu IR-spektri on kaikkien mitatun n¨aytteen erilaisten molekyylien v¨ar¨ahtelymoodien summa, mink¨a takia osa absorptikaistoista on p¨a¨alleekk¨ain. Jo-kaisen yksitt¨aisen absorptiokaistan sijainti, leveys ja intensiteetti johtuvat l¨asn¨a ole-vien molekyylisidoksien erilaisista v¨ar¨ahtelymoodeista ja vierekk¨aisten atomien tai molekyylien vuorovaikutuksista, mik¨a antaa mahdollisuuden identifioida kemialliset funktionaaliset ryhm¨at n¨aytteest¨a tai tarkkailla tiettyjen alueiden muutoksia. Piikin leveys antaa arvion molekyylien v¨alisist¨a vuorovaikutuksista ja intensiteetti kemial-listen osien konsentraatiosta. Lis¨aksi IR-spektrej¨a voidaan verrata tunnettuihin refe-renssispektreihin ja n¨ain saada lis¨a¨a tietoa analysoitavasta yhdisteest¨a. [3, 8, 19]
Yleisimm¨at signaalit luun FTIR-spektriss¨a ovat per¨aisin HA-kiteiden ep¨ aorgaa-nisten komponenttien ja luun orgaaaorgaa-nisten komponenttien kemiallisista funktionaali-suuksista, kuten amidi-, fosfaatti- ja karbonaattiryhmist¨a. Kaikilla komponenteilla on
erityisi¨a kemiallisia ominaisuuksia, joiden ansiosta ne erottuvat IR-spektriss¨a erillisi-n¨a absorptiopiikkein¨a eri aaltolukujen kohdilla. Huomattavaa on, ett¨a IR-spektriss¨a veden absorbanssi ei n¨ay, vaikkakin vedell¨a on voimakas absorptio kyseisell¨a alueella, sill¨a n¨aytteet dehydratoidaan ennen analyysej¨a.[3, 7, 8]
IR-spektrist¨a pystyt¨a¨an havaitsemaan kolme erilaista amidikaistaa. Amidi I-kaista, joka absorboi v¨alill¨a 1700-1600 cm−1, syntyy p¨a¨aasiassa tyypin 1 kollageenin pepti-disidoksen C=O ja C-N venytysv¨ar¨ahtelyst¨a. [23, 42] FTIR on erityisen herkk¨a kol-lageenin proteiinin sekundaarirakenteelle, mink¨a takia absorptiopiikin paikkaan vai-kuttavat muun muassa C-N-venytysv¨ar¨ahtely, C-C-N-muodonmuutos ja erilaiset ve-ty¨a sitovat ymp¨arist¨ot. [19, 24, 41] Amidi II-kaista 1550 cm−1 tienoilla johtuu N-H-taivutus- ja C-N-venytysv¨ar¨ahtelyist¨a tasossa funktionaalisessa ryhm¨ass¨a. Pient¨a vai-kutusta kaistaan tuo C-O-tasotaivutus, C-C- ja N-C-venytysv¨ar¨ahtelyt. [19, 24, 42]
Amidi III-kaista, joka absorboi v¨alill¨a 1400-1200 cm−1, liittyy N-H-taivutus- ja C-N-venytysv¨ar¨ahtelyihin, joihin on pient¨a vaikutusta C-O-tasotaivutuksella ja C-C-venytysv¨ar¨ahtelyll¨a. N¨am¨a absorptiokaistat syntyv¨at luun proteiiniosista niiss¨a ta-pahtuvien muutosten vuoksi johtuen p¨a¨aasiassa tyypin 1 kollageenista.[24, 42]
Vapaalla PO3−4 -ionilla voi olla nelj¨a erilaista v¨ar¨ahtelymoodia: v1 (symmetrinen venytys), v2 (symmetrinen taivutus), v3 (P-O ep¨asymmetrinen venytys) ja v4 (ep¨ a-symmetrinen taivutus). Kuitenkaan kaikkia fosfaatin mahdollisia kaistoja ei havaita johtuen v1 ja v2 tetraedrisymmetriasta, n¨ain vain v3 ja v4 ovat IR-aktiivisia. [8] Ta-sotaivutus v¨ar¨ahtelymoodi v4 on heikompi, mutta paikallisten anisotrooppisten kide-kenttien vaikutusten vuoksi se voi n¨aky¨a hyvin m¨a¨ariteltyn¨a kohdilla 561 cm−1, 580 cm−1 ja 604 cm−1. On kuitenkin mahdollista havaita v1 ja v2 v¨ar¨ahtelymoodeja, jos molekyyli j¨arjest¨aytyy itse pienemm¨alle symmetrialle. N¨am¨a vuorovaikutukset johta-vat heikkoihin kaistoihin 957 cm−1ja 473 cm−1kohdilla vastaavasti. [8, 43] Yleisemmin luun IR-spektriss¨a fosfaattikaistan absorptio kohdalla 1200-900 cm−1 johtuu HA:n PO3−4 -ionin normaalimoodeista v1 ja v3. Vetyfosfaatista johtuva kaista 1163 cm−1 kohdalla liittyy ei-stoikometriseen HA:n ja orgaanisen aineen pitoisuuteen.[3, 7, 8]
IR-spektreiss¨a on tavallisesti kaksi eri aluetta, jotka ovat per¨aisin karbonaatin substituutiosta: ensimm¨ainen on 890-850 cm−1 ja toinen on 1500-1400 cm−1 koh-dalla. Molemmat n¨aist¨a alueista ovat yhdistelm¨avy¨ohykkeit¨a, jotka ovat p¨a¨allekk¨ain joko vetyfosfaattipiikkien (ensimm¨ainen alue) tai ei-kollageenisten proteiinipiikkien (toinen alue) kanssa. [7] T¨arke¨ampi on ensimm¨ainen alue, joka sis¨alt¨a¨a kolme alikais-taa kohdilla 879, 871 ja 866 cm−1. N¨aist¨a kaksi ensimm¨aist¨a kaistaa osoittavat sek¨a A-ett¨a B-tyypin karbonaattisubstituutiot HA-kiteen kahdessa anionisessa kohdassa vas-taavasti. B-tyypin substituution intensiteetti on huomattavasti isompi (kuva4), mik¨a osoittaa, ett¨a biologiset apatiitit ovat suurimmaksi osaksi B-tyypin karbonaattiapa-tiitteja. Kolmas kaista kohdalla 866 cm−1 viittaa labiiliin karbonaattiin. [8, 20, 40]
Luun IR-spektrej¨a analysoitaessa voidaan n¨aiden kemiallisten komponenttien avul-la muodostaa useita eriavul-laisia luuparametrej¨a, joita yleisesti k¨aytet¨a¨an luukudoksen spatiaalisen molekyylikoostumuksen karakterisointiin ja kuvaamaan luumineraalien kiteisyytt¨a ja m¨a¨ar¨a¨a. N¨ait¨a parametrej¨a ovat mineralisaatio, mineraalin
kypsyys/kiteisyys, karbonaattipitoisuus, kollageenin kypsyys ja vetyfosfaatin substi-tuutio. [16, 20, 21] Seuraavaksi kuvaillaan luuparametrej¨a yksityiskohtaisemmin.
1. Mineralisaatio
Analysoitaessa luun kemiallista koostumusta mineralisaatio eli mineraali/matriksi -suhde on yleisimmin ilmoitettu luuparametri. Kvantitatiivinen arvio saadaan integroimalla IR-spektrist¨a v1v3-fosfaatin (1200 - 900 cm−1) ja amidi I (1700 -1600 cm−1) absorptiopiikkien suhde. [7, 43] Fosfaattikaista edustaa fosfaattisia funktionaalisia ryhmi¨a, joita esiintyy luun mineraalikiteess¨a ja amidi I-kaista or-gaanisissa osissa esiintyvi¨a funktionaalisia karbonyyliryhmi¨a. Suhde siis antaa tietoa analysoidusta mineraalin m¨a¨ar¨ast¨a orgaanisen matriksin m¨a¨ar¨a¨an analy-soitua tilavuutta kohden, toisin sanoen edustaa suhteellista mineralisoitumista kollageenimatriksiin eli on mineralisaatioasteen mittari ja korreloi my¨os luun tuhkapitoisuuden (mineraalitiheys) kanssa.[20, 34, 43, 44]
2. Mineraalin kypsyys/kiteisyys
Tarkasteltaessa luun mineraalien laatua on otettava huomioon kaksi erillist¨a parametri¨a: mineraalien kypsyysaste ja mineraalien kiteisyysindeksi. Mineraa-likiteiden kemiallista rakennetta kutsutaan kidekypsyydeksi, joka kuvastaa ei-apatiittisten esiasteiden muuttumista apatiittiseksi mineraaliksi, kun taas mi-neraalikiteen koko ja muoto viittaavat kidehilan kiteisyyteen. Kuitenkin muu-tokset kemiallisessa rakenteessa vaikuttavat mineraalikiteen koon ja muodon muutoksiin, mink¨a takia parametrej¨a ei erotella toisistaan vaan yhdistet¨a¨an yh-deksi mineraalin kypsyys/kiteisyys -luuparametriksi. [7, 6] Luuparametri tarjo-aa tietoa minertarjo-aalikiteiden kemiallisesta koostumuksesta eli toisin sanoen ep¨ a-puhtauksien l¨asn¨aolosta. Normaalien mineraalikiteiden koko vaihtelee ja poik-keavuuksia on olemassa, siksi my¨os luuparametri on merkitt¨av¨asti riippuvainen luun¨aytteen paikasta, laadusta sek¨a luukudoksen i¨ast¨a. [19] Mineralisoituneis-sa biologisisMineralisoituneis-sa kudoksisMineralisoituneis-sa t¨am¨a luuparametri lasketaan analysoimalla fosfaatti-kaistalla olevien alikaistojen 1030 cm−1ja 1020 cm−1intensiteettipiikkien suhde.
Piikki 1030 cm−1 liittyy fosfaattiin eritt¨ain kiteisess¨a apatiitissa, kun taas piik-ki 1020 cm−1 huonosti kiteiseen apatiittiin, joka sis¨alt¨aa HPO2−4 ja/tai CO2−3 . N¨ain saadaan tietoa HA-kiteiden koosta, t¨aydellisyydest¨a ja mineraalin i¨ast¨a.
[22, 27, 43, 45]
3. Karbonaattipitoisuus
Yleisin karbonaatin liittyminen mineraalikiteeseen on B-tyypin substituutio, vaikka A-tyypin substituutiotakin tapahtuu pieniss¨a m¨a¨arin. Molemmilla on vaikutusta luumineraalin kokoon ja t¨aydellisyyteen ja n¨ain materiaalin ominai-suuksiin erilaisissa ymp¨arist¨oolosuhteissa. B-tyypin karbonaatti hallitsee apa-tiitin muodostumista biomineraaleissa, kun taas A-tyypin karbonaatti hallit-see apatiittimineraalien ominaisuuksia ei-fysiologisissa olosuhteissa. [40] Kar-bonaattipitoisuuden suhteellinen osuus voidaan laskea v2CO3-kaistan (890-850 cm−1) ja v1v3PO4-kaistan (1200-900 cm−1 ) piikkien integroitujen pinta-alojen suhteesta, joka edustaa sek¨a A- ett¨a B-karbonaattisubstituutioiden m¨a¨ar¨a¨a HA-kiteeksi. [22, 27, 34, 46]
4. Kollageenin kypsyys
Tyypin 1 kollageeni on suurin s¨aieproteiini luun orgaanisessa matriksissa, ja sill¨a on hyvin toistuva aminohapposekvenssi. Mineralisoituneissa kudoksissa, kuten
luussa, kollageenin erottuvimmat piirteet ovat molekyylin pakkausrakenne ja sen ristiliitoksien kemia. [7, 47] Luonnossa esiintyy seitsem¨an erilaista ristilii-tosta molekyylien v¨alill¨a, mutta n¨aist¨a vain kolme ovat pelkistyvi¨a. Kuitenkaan FTIR-spektroskopia ei pysty tunnistamaan kuin kahden tyyppisten kollagee-nin ristiliitoksien alueellisia jakautumia. Toinen n¨aist¨a ristiliitoksista on pelkis-t¨am¨at¨on kolmenarvoinen pyridinoliini (PYR) ja toinen pelkistyv¨a kaksiarvoi-nen dehydrodihydroksinorleusiini (deH-DHLNL).[7, 19, 41] Tutkittaessa kolla-geenia, mielenkiintoisimmat alueet IR-spektriss¨a ovat amidi I-kaistan alikaistat kohdilla 1660 cm−1 ja 1690 cm−1, sill¨a amidi I-kaista on erityisen herkk¨a mo-lekyylin sekundaarisille rakenteille. Luuparametri kertoo enemm¨an sekundaari-rakenteen muutoksista suhteessa mineralisaatioprosessiin eik¨a entsymaattisten ristiliitoksien muutoksista. N¨aiden absorptiokaistoilla olevien piikkien intensi-teettisuhde liittyy luun orgaaniseen matriksiin, joka edustaa luun pelkist¨am¨ at-t¨omien eli kypsien ristiliitosten suhdetta pelkistyviin eli kypsym¨att¨omiin ristilii-toksiin, joten t¨am¨a luuparametri on herkk¨a kollageenin kypsyyden indikaattori.
[12, 48, 49, 50]
5. Vetyfosfaatin substituutio
FTIR-spektroskopialla ei kyet¨a havaitsemaan vetyfosfaatille tyypillist¨a kaistaa 560-530 cm−1, mink¨a takia tietojen tuottamiseen tarvitaan useita erilaisia luu-parametreja. FTIR-tutkimuksissa onkin k¨aytetty erilaisia luuparametreja ar-vioimaan HPO2−4 substituutiota HA-kiteess¨a. Er¨as tapa on arvioida HPO2−4 substituutiota erilaisten suhteiden avulla perustuen alikaistoihin 1150-1100 cm−1 v¨alill¨a. [51] Suositeltu tapa on laskea alikaistojen 1128 cm−1 ja 1096 cm−1 in-tensiteettien suhde, jossa kaista 1128 cm−1 viittaa HPO2−4 sis¨alt¨avien lajien l¨ as-n¨aoloon ja kaista 1096 cm−1 apatiittiin. [27, 34] T¨am¨a suhde edustaa HP O2−4 -ionin mineralisoitumista kidehilaan, mik¨a on tyypillist¨a nuoremmalle mineraa-lille. T¨am¨an luuparametrin on osoitettu olevan k¨a¨ant¨aen verrannollinen kitei-syyteen, mik¨a viittaa luun uudelleenmuodostumisen aktiivisuuteen ja mineraa-lien liukenemiseen. [7, 19, 34]
4 Ty¨ on tavoitteet
FTIR-laitteistolla on mahdollista mitata erilaisilla mittausmenetelmill¨a samoja luu-parametrej¨a. Aikaisemmissa mittauksissa on havaittu, ett¨a FTIR-laite antaa erilais-ta spektritietoa erilaisiserilais-ta miterilais-tausmenetelm¨ast¨a riippuen (mosaiikkikuvaus vs. loka-lisoitu alue). T¨am¨a ilmi¨o esiintyy varsinkin luun¨aytteiss¨a alueilla, joissa on suuria vaihteluita absorbanssissa. T¨am¨an ty¨on tarkoituksena on tehd¨a vertailua luun pe-rusparametreist¨a n¨aiden kahden mittausmenetelm¨an v¨alill¨a, kun vaikutusta on my¨os leikkeen paksuudella. Lis¨aksi tarkoituksena on arvioida s¨adehoidon aiheuttamia muu-toksia luukudokseen perustuen m¨a¨aritettyihin luuparametreihin.
5 Materiaalit ja menetelm¨ at
5.1 N¨ aytteet ja niiden esivalmistelut
Kaikki potilasn¨aytteet oli ker¨atty alaleuan kulmahampaiden kohdilta hammasimplant-tileikkauksen yhteydess¨a. Leikkauksessa talteen otetut luun¨aytteet olivat noin 3.5 mm paksuisia ja 10 mm pituisia biopsioita. N¨aytteet s¨ail¨ottiin ensin 60%etanoliin ja pro-sessoitiin valamalla muoviin (polymetyylimetakrylaatti, PMMA). N¨ayteleikkeet oli leikattu 3 µm ja 2 µm paksuisiksi ohutleikkeiksi mikrotomilla (Polycut, Reichert-Jung, Wien, It¨avalta) ja asetettu pisaralla etanolia joko ZnSe- tai BaF2 -ikkunalle FTIR-analyysia varten. Leikkeet muodostivat kolme erilaista tutkimusryhm¨a¨a, jois-sa jokaisesjois-sa oli kolme eri leikett¨a. Kontrolliryhm¨an leikkeet olivat potilailta, jotka olivat t¨aysin terveit¨a. Ryhm¨a 1 sis¨alsi leikkeet potilailta, joiden kasvain oli poistettu kirurgisesti, kun taas ryhm¨an 2 leikkeet olivat potilailta, joiden kasvainta oli hoidet-tu s¨adehoidolla. Potilaiden sy¨op¨akudos ei ole ollut otetun luubiopsian kohdalla, vaan esimerkiksi nen¨anielussa, kielen pohjalla tai muualla suussa. Kokonaiss¨ateilyannokset potilailla olivat 70Gy, 62,5Gy ja40Gy ja s¨ateilytekniikoina oli k¨aytetty joko inten-siteettimuokattua s¨adehoitoa (engl.intensity-modulated radiotion therapy, IMRT) tai kolmiulotteista konformaalista s¨adehoitoa (engl. three-dimensional conformal radia-tion therapy, 3D-CRT). Ryhm¨an 2 biopsiat olivat otettu 119, 198 tai 72 kuukauden j¨alkeen s¨adehoidosta. Taulukkoon 3 on koottu eri tutkimusryhmien tiedot. Kaikki po-tilaat olivat antaneet suostumuksensa osallistua tutkimukseen ja eettiset toimikunnat ovat hyv¨aksyneet ty¨on (Medisch Ethische Toetsingscommissie, Amsterdam UMC, si-jainti VUmc, Amsterdam, Alankomaat; 2011/220 ja Pohjois-Savon sairaanhoitopiirin tutkimuseettinen komitea; 754/2018)
Taulukko 3: Tutkimusryhmien tiedot
Kontrolliryhm¨a Ryhm¨a 1 Ryhm¨a 2
N¨aytteiden lukum¨a¨ar¨a 3 3 3
Sukupuoli (nainen/mies) 1/2 1/2 1/2
Ik¨ajakauma 33 - 67 60 - 69 66 - 80