Leukaluun kemiallisen koostumuksen määrittäminen Fourier-muunnosinfrapunaspektroskopian (FTIR) avulla

Leukaluun kemiallisen koostumuksen m¨ a¨ aritt¨ aminen

Fourier-muunnosinfrapunaspektroskopian (FTIR) avulla

Isa Lyijynen Pro gradu -tutkielma Sovelletun fysiikan koulutusohjelma It¨a-Suomen yliopisto, Sovelletun fysiikan laitos 18. kes¨akuuta 2021

It¨a-Suomen yliopisto, Luonnontieteiden ja mets¨atieteiden tiedekunta Sovelletun fysiikan koulutusohjelma, l¨a¨aketieteellinen fysiikka

Lyijynen, Isa N.A.: Leukaluun kemiallisen koostumuksen m¨a¨aritt¨aminen Fourier- muunnosinfrapunaspektroskopian (FTIR) avulla

Luonnontieteiden Pro gradu -tutkielma, 51 sivua

Tutkielman ohjaajat: dosentti Arto Koistinen, professori Arja Kullaa 18. kes¨akuuta 2021

Avainsanat: Fourier-muunnosinfrapunaspektroskopia (FTIR), luu, s¨adehoito

Tiivistelm¨ a

S¨adehoito on t¨arke¨a hoitovaihtoehto sy¨ov¨an hoidossa, vaikka s¨adehoidossa k¨aytett¨av¨a ionisoiva s¨ateily vaikuttaa biologisiin kudoksiin haitallisesti. S¨ateily voi aiheuttaa sek¨a varhais- ett¨a my¨oh¨aisvaiheen komplikaatioita, joista osa voi kehitty¨a vasta vuosia s¨a- teilyaltistuksen j¨alkeen. Luussa havaitut muutokset liittyv¨at luusolujen toimintaan ja edelleen luun uudelleenmuodostumiseen, luun kemiallisen koostumuksen muutoksiin sek¨a luun laadun ett¨a tiheyden heikentymiseen.

Fourier-muunnosinfrapunaspektroskopia (FTIR) on er¨as menetelm¨a biologisten kudosten analyyseissa. T¨ass¨a ty¨oss¨a menetelm¨a¨a k¨aytettiin havaitsemaan kemialli- sen koostumuksen muutoksia leukaluussa s¨ateilyaltistuksen ja sy¨op¨ahoitojen j¨alkeen.

Luun kemiallisen koostumuksen m¨a¨aritt¨amiseksi, voidaan FTIR-mittaukset suorittaa kahdella erilaisella mittausmenetelm¨all¨a, joko koko leikkeen tai lokalisoidun alueen mittauksilla.

Tiivisluun luun¨aytteet ker¨attiin alaleukaluusta potilailta, joilla oli kirurgisesti (3 kpl) tai s¨adehoidolla (3 kpl) hoidettu p¨a¨an ja kaulan alueen sy¨op¨a¨a. Lis¨aksi luun¨ayt- teet ker¨attiin vastaavilta alueilta terveilt¨a kontrollipotilailta (3 kpl). Kaikki luun¨ayt- teet ker¨attiin hammasimplanttikirurgisen toimenpiteen yhteydess¨a

N¨aytteist¨a mitattiin sek¨a koko leikkeen ett¨a lokalisoidun alueen mittausmenetel- mill¨a infrapunaspektrit, joiden avulla laskettiin luun koostumusta kuvaavat paramet- rit, kuten mineralisaatio (M/M), mineraalin kypsyys/kiteisyys (K/K), karbonaatti- pitoisuus (K/F), kollageenin kypsyys (KOL) ja vetyfosfaatin substituutio (VFS).

Tulosten mukaan eri mittausmenetelmill¨a saadaan erilaista spektritietoa luupa- rametreist¨a. Luotettavimmat tulokset saatiin, kun n¨aytepaksuus oli mahdollisimman ohut ja mittaukset kohdistettiin pienelle alueelle kerrallaan. Kun mittaukset suori- tettiin paksummalle leikkeelle ja koko leikkeen alue kuvattiin, FTIR-spektreiss¨a oli havaittavissa saturaatiota etenkin fosfaattipiikeiss¨a. S¨ateilylle altistuminen ja sy¨op¨a vaikuttivat luuparametreihin hiukan, mutta vahvoja johtop¨a¨at¨oksi¨a ei voitu tehd¨a pienen otannan vuoksi.

University of Eastern Finland, Faculty of Natural and forest sciences Training program in Applied Physics, medical physics

Lyijynen, Isa N.A.: Determination of chemical composition of manibular by Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR)

Natural sciences Pro gradu -thesis, 51 pages

Supervisors: docent Arto Koistinen, professor Arja Kullaa 18. kes¨akuuta 2021

Keywords: Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), bone, radiotherapy

Abstract

Radiotherapy is an important form of treament in the treament of cancer although the ionizing radiation used in radiotherapy affects biological systems adversely. Radiation has numerous early and late phase complications, some of which may develop only years after radiation exposure. The changes observed in bone are related to bone cell functions and further bone remodeling, changes in bone chemical composition and impairment of bone quality and density.

Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) is an excellent method for bio- logical tissue analysis and was used in this thesis to detect chemical changes in the mandibular bone after radiation exposure and cancer. To determine the chemical com- position of bone, FTIR measurements can be made using two different measurement techniques, either whole sample or localized area measurements.

Cortical bone samples were collected from mandibular dental implant sites from patients with surgically (3 pcs.) or radiotherapeutically (3 pcs.) treated head and neck cancer. In addition, bone samples were collected from healthy control patients (3 pcs.). Both techniques obtained infrared spectra for each sample from two different bone regions to calculate bone parameters such as mineralization (M/M), mineral ma- turity/crystallinity (K/K), carbonate substitution (K/F), collagen maturity (KOL) and acid phosphate substitution (VFS).

As a result, different measurement techniques provide slightly different spectral in- formation on bone parameters. More realiable results were obtained when the sample thickness was as thin as possible and the measurements were focused on a small area at a time. If measurements were performed on a thicker samples and the entire sample area was imaged, saturation was observed in the IR-spectra, espesially in the phosp- hate peaks. Bone parameters were slighty affected by radiation and tumor, but strong conclusions could not be made due to small sample set size.

Symbolit ja lyhenteet

Ca

Kalsium-ioni CO

Karbonaattti-ioni FT Fourier-muunnos

FTIR Fourier-muunnosinfrapunaspektroskopia HA Hydroksiapatiitti

HPO

Vetyfosfaatti-ioni IR- Infrapuna-

OH

Hydroksidi-ioni OPD Optinen matkaero

PMMA Polymetyylimetakrylaatti PO

Fosfaatti-ioni

v1-v3 Erilaisia v¨ ar¨ ahtelymoodeja

ESIPUHE

Edess¨asi on Pro gradu -ty¨o, joka toteutettiin Kuopiossa It¨a-Suomen yliopiston luon- nontieteiden ja mets¨atieteiden tiedekunnan infrastruktuuriyksik¨oss¨a SIB Labs:ssa vuo- sina 2020 ja 2021. Ty¨on mittaukset suoritettiin loppuvuodesta 2020 ja kev¨a¨all¨a 2021 SIB labs:ssa. Ty¨on tulokset, data ja materiaalit j¨a¨av¨at SIB Labsin k¨aytt¨o¨on mahdol- lisia jatkotutkimuksia varten. Ty¨o oli hyvin opettavainen prosessi, joka opetti minulle paljon luututkimuksista, data-analyysist¨a ja tieteellisen tutkimuksen tekemisest¨a ja siin¨a esille tulevista mahdollisista ongelmista ja niiden ratkaisemisesta.

Haluan kiitt¨a¨a ty¨oni ohjaajia dosentti Arto Koistista ja professori Arja Kullaa ohjeistaan ja tuesta t¨am¨an ty¨on aikana. Dosentti Koistinen ehdotti ty¨on aihetta, ja professori Kullaan kanssa perehdyttiv¨at minut ty¨on aiheeseen. Haluan my¨os kiitt¨a¨a Ritva Savolaista n¨ayteleikkeiden ty¨ost¨amisest¨a sek¨a nuorempaa tutkijaa Emilia Uu- rasj¨arve¨a, joka perehdytti minut k¨aytt¨am¨a¨an ty¨on mittalaitetta ja opasti mittausten k¨ayt¨ann¨on toteuttamisessa. Lis¨aksi haluan kiitt¨a¨a tohtori Laure Fauchia ja yliopisto- tutkijaa Mikael Turusta erinomaisesta opastuksesta data-analyysien teossa. Lopuksi haluan my¨os kiitt¨a¨a kaikkia yst¨avi¨ani, jotka tekiv¨at opiskeluvuosistani mahtavia so- velletulla fysiikalla.

Kuopiossa

18. kes¨akuuta 2021

Isa Lyijynen

Sis¨ alt¨ o

1 Johdanto 7

2 Spektroskopia 9

2.1 Infrapunaspektroskopia . . . 9

2.2 FTIR-spektroskopia . . . 11

2.2.1 FTIR-spektrometri . . . 11

2.2.2 Spektrin laskenta . . . 13

3 Luukudoksen FTIR-spektroskopia 16 3.1 Luukudos . . . 16

3.2 FTIR-spektroskopian t¨arkeimm¨at luuparametrit . . . 18

4 Ty¨on tavoitteet 22 5 Materiaalit ja menetelm¨at 23 5.1 N¨aytteet ja niiden esivalmistelut . . . 23

5.2 FTIR -kuvantaminen . . . 23

5.3 Spektrien data-analyysi . . . 24

6 Tulokset 26 6.1 Mittausmenetelm¨a 1 - mosaiikkikuvaus . . . 26

6.2 Mittausmenetelm¨a 2 - lokalisoidun alueen mittaus . . . 32

6.3 Menetelmien vertailu . . . 37

7 Pohdinta 41

1 Johdanto

Luukudos on pitk¨alle erikoistunutta el¨av¨a¨a tukikudosta, jolla on t¨arkeit¨a teht¨avi¨a:

tarjota kudosten tuki, mahdollistaa liikkuminen ja toimia magnesiumin, kalsiumin ja fosfaatin varastona. [1, 2] Luu koostuu ep¨aorgaanisista mineraaleista, orgaanisesta matriksista, vedest¨a, lipideist¨a ja erilaisista soluista, joiden suhteelliset osuudet vaih- televat. Matriksi jakaantuu orgaanisen ja ep¨aorgaanisen osan komponentteihin, jotka koostuvat p¨a¨aasiassa tyypin 1 kollageenist¨a ja huonosti kiteytyneest¨a kalsiumhydrok- siapatiitist¨a vastaavasti. [3, 4, 5, 6] Vaikka luusta voidaan erotella kahta eri tyyppist¨a luuta, tiivis- ja hohkaluuta, sis¨alt¨av¨at ne kuitenkin samat peruskomponentit. Luun uudelleen muodostuminen on monimutkainen prosessi, joka perustuu luusolujen koor- dinoituun toimintaan. T¨am¨a on v¨altt¨am¨at¨ont¨a luun kyvylle sopeutua kuormittaviin olosuhteisiin ja korjata vaurioitunut kudos esimerkiksi s¨adehoidon j¨alkeen. Luussa tapahtuvat muutokset kehittyv¨at hitaasti s¨ateilytyksen j¨alkeen, mitk¨a johtuvat p¨a¨a- asiassa luun uusiutumisj¨arjestelm¨an vahingoittumisesta. Kuitenkin monet muuttujat yhdess¨a vaikuttavat luun lopulliseen koostumukseen, muodostumiseen ja lujuuteen.

[2, 4, 7, 8, 9]

S¨adehoidoissa k¨aytet¨a¨an ionisoivaa r¨ontgens¨ateily¨a, jonka vuorovaikutus soluissa ja kudoksissa voi tapahtua joko suoraan tai ep¨asuorasti molekyylitasolla. Suorassa ta- pauksessa s¨ateily on suoraan vuorovaikutuksissa biologisen kudoksen makromolekyy- lien, esimerkiksi proteiinien, kanssa ionisoimalla atomeja ja molekyylej¨a. Ep¨asuorassa tapauksessa s¨ateily on vuorovaikutuksessa p¨a¨aasiassa vain vesimolekyylien kanssa, jolloin muodostuu vapaita radikaaleja. N¨am¨a vapaat radikaalit puolestaan reagoivat biologisen kudoksen makromolekyylien kanssa vahingoittaen niit¨a. [10]

S¨adehoidolla on kuitenkin t¨arke¨a rooli sy¨ov¨an hoidossa. Suurin osa sy¨op¨atapauk- sista tarvitseekin s¨adehoitoa ensisijaisena hoitona leikkauksen lis¨aksi ja se on my¨os mahdollista yhdist¨a¨a kemoterapian kanssa. S¨adehoidossa annettava s¨ateilyannos riip- puu kasvaimen sijainnista ja pahanlaatuisuudesta sek¨a siit¨a, k¨aytet¨a¨ank¨o s¨adehoitoa yksin vai muiden menetelmien kanssa. [9, 11] Tavallisesti p¨a¨an ja kaulan alueen kas- vaimet saavat s¨ateilyannoksen v¨alill¨a 50-70 Gy, joka annetaan yleens¨a pienemmiss¨a 2 Gy:n osissa hoitojakson aikana. Vaikka s¨adehoito on osoittautunut menestyksek- k¨a¨aksi paikallisten sek¨a laajempien vaurioiden hoidossa, se my¨os altistaa kasvainta ymp¨ar¨oiv¨at terveet kudokset s¨ateilylle, sill¨a s¨adehoitoa ei pystyt¨a kohdistamaan tar- peeksi tarkasti vain hoidettavaan kohtaan. [9, 12, 13, 14] T¨an¨a p¨aiv¨an¨akin ionisoi- van s¨ateilyn vaikutukset terveeseen kudokseen ovat huolestuttavia ja vaikeita hallita, vaikka n¨aiden minimoimiseksi ja hallitsemiseksi on kehitetty erilaisia protokollia. On my¨os vaikea tulkita s¨ateilyn vaikutuksia terveisiin kudoksiin, sill¨a kaikki s¨ateily¨a saa- vat kudokset eiv¨at koe yht¨a suurta s¨ateilyannosta ja s¨ateilyn aiheuttamiin seurauksiin vaikuttaa lis¨aksi s¨ateily- ja kudostyyppi sek¨a s¨ateilyohjelma. [9, 12, 14]

S¨ateilyn vaikutus biologisiin j¨arjestelmiin on valtava. On lukuisia sek¨a varhais- ett¨a my¨oh¨aisvaiheen komplikaatioita, joista osa voi kehitty¨a vasta vuosia s¨ateilyaltistuksen j¨alkeen. [10, 12] Vakavin p¨a¨an ja kaulan s¨ateilytyksen komplikaatio on osteonekroo- si, mutta on my¨os muita muutoksia kuten verisuonten ja luun uudelleenmuodostu- misen v¨ahentyminen, patologiset murtumat ja s¨ateilyn aiheuttamat pahanlaatuiset kasvaimet. [9, 11, 13] Tiedet¨a¨an, ett¨a paikallisesti s¨ateily tuhoaa luuydint¨a, aiheuttaa luukatoa ja vaikuttaa luun koostumukseen, vaikka prosesseihin on lis¨aksi vaikutus- ta erilaisilla biologisilla prosesseilla ja fysikaaliskemiallisilla muutoksilla elimist¨oss¨a.

[5, 13]

Infrapunaspektroskopia (engl.infrared spectroscopy, IR-spectroscopy) on v¨ar¨ahte- lyspektroskooppinen menetelm¨a, joka on yksi k¨aytetyimmist¨a analyyttisista menetel- mist¨a tieteen saralla luun komponenttien ominaisuuksien ja koostumuksen tutkimi- seen. [10, 15] Suurimpana etuna on se, ett¨a k¨ayt¨ann¨oss¨a voidaan tutkia mit¨a tahan- sa n¨aytett¨a miss¨a olomuodossa tahansa. Infrapunaspektroskopian juuret ulottuvat 1940-luvulle saakka ja ensimm¨aisen kerran infrapuna-analyysia sovellettiiin luuhun yli 50 vuotta sitten, mutta t¨am¨an j¨alkeen on tapahtunut useita edistysaskelia tie- toteniikan kehittymisen my¨ot¨a. [3, 16] Merkitt¨avin edistys on tapahtunut Fourier- muunnosinfrapunaspektroskopiassa (engl. Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR), joka hy¨odynt¨a¨a matemaattista funktiota, Fourier-muunnosta, muuntamaan saadun interferogrammin IR-spektriksi.[17] T¨am¨an menetelm¨an avulla on pystytty pa- rantamaan spektrien laatua ja minimoimaan datan keruuaikaa. Lis¨aksi menetelm¨a ei tuhoa n¨aytett¨a ja on suhteellisen edullinen ja nopea. Siksi t¨am¨a on tullut ihanteellisek- si ty¨okaluksi biologisten n¨aytteiden molekyylien, solujen ja kudosten rakenteellisten, toiminnallisten ja koostumuksillisten muutosten havaitsemiseksi. 1980-luvun loppu- puolella FTIR-spektrometrin yhdist¨aminen optiseen mikroskooppiin mullisti luututki- muksia edelleen mahdollistaen spektrien saamisen kudoksen eri anatomisilta alueilta ja ottaen huomioon kudoksen alueellisen vaihtelun. [7, 15, 18]

Infrapunas¨ateily on ionisoimaton energiatyyppi, joka voi tunkeutua biologisen ku- doksen l¨api siirt¨aen osan energiastaan tai koko energiansa vuorovaikutuksien kaut- ta molekyylisidoksille. FTIR-spektroskopiassa hy¨odynnet¨a¨an keski-IR aluetta, sill¨a suurin osa orgaanisten materiaalien molekyylisidoksista voi absorboida t¨all¨a alueella vain tietyt s¨ahk¨omagneettisen s¨ateilyn taajuudet, jotka ovat riippuvaisia molekyylin kemiallisesta luonteesta. N¨ain jokaisella molekyylill¨a on sille ominainen v¨ar¨ahtely- ominaisuus muodostaen ainutlaatuisen absorptiokaistan IR-spektriin. [4, 7, 8, 10, 19]

Erilaisista kaistoista muodostunut IR-spektri tarjoaa samanaikaisesti kvantitatiivis- ta ja kvalitatiivist¨a molekyylirakennetietoa luukudoksen mineralisoituneista ja ei- mineralisoituneista kudoskomponenteista. Absorptiopiikkien voimakkuudet ja pinta- alat riippuvat l¨asn¨a olevien funktionaalisten ryhmien pitoisuuksista, kun taas kais- tan sijainti ja leveys antavat tietoa rakenteellisista ja toiminnallisista muutoksista.

[3, 8, 19]

Luun IR-spektrej¨a analysoitaessa voidaan luun kemiallisten komponenttien avulla muodostaa erilaisia luuparametrej¨a, jotka kuvaavat luun molekyylikoostumusta, mi- neraalien m¨a¨ar¨a¨a, kokoa ja kiteisyytt¨a. [16, 20, 21] Yleisempi¨a luuparametrej¨a luuta tutkittaessa ovat mineralisaatio, mineraalin kypsyys/kiteisyys, karbonaattipitoisuus, vetyfosfaatin substituutio ja kollageenin kypsyys, jotka t¨ass¨a ty¨oss¨a tullaan my¨os m¨a¨aritt¨am¨a¨an. [7, 8, 15, 22] IR-spektrien saamiseksi FTIR-spektroskooppinen mit- taus voidaan suorittaa kahdella eri mittausmenetelm¨all¨a. Ikkunalla oleva leike voi- daan kuvata joko kokonaan tai leikkeest¨a valitaan rajatun kokoinen alue, joka kuva- taan. T¨ass¨a ty¨oss¨a tullaan vertaamaan n¨ait¨a kahta eri mittausmenetelm¨a¨a ja niiden avulla m¨a¨aritettyj¨a luuparametreja.

2 Spektroskopia

2.1 Infrapunaspektroskopia

Infrapunas¨ateily on ionisoimaton energiatyyppi, joka on vain pieni osa s¨ahk¨omagneet- tisen s¨ateilyn spektrist¨a. Yleens¨a s¨ahk¨omagneettinen s¨ateily m¨a¨aritell¨a¨an aallonpituu- den tai taajuuden avulla

c=f λ,

miss¨acon valon nopeus tyhji¨oss¨a2,99·10^{8 m}_s,f on taajuus jaλ on aallonpituus. [10, 17, 23] Kuitenkin IR-spektrometriassa yleisemmin s¨ateilyn kuvailemiseen k¨aytet¨a¨an aallonpituuden k¨a¨anteisarvoa eli aaltolukua, sill¨a aaltoluku on lineaarinen IR-s¨ateilyn energian kanssa. Aaltoluku m¨a¨aritell¨a¨an [17]

v = f c = 1

λ .

IR-s¨ateilyn aallonpituus on v¨alill¨a 780 nm - 1 mm, joka jaetaan kolmeen osaan tau- lukon 1 mukaisesti. K¨ayt¨ann¨oss¨a eniten hy¨oty¨a sek¨a biofysiikassa ett¨a orgaanisessa kemiassa on keski-IR alueesta, sill¨a suurimmalla osalla orgaanisten aineiden molekyy- liv¨ar¨ahtelyist¨a absorboi t¨all¨a alueella. [24, 25]

Taulukko 1: IR-s¨ateilyn aallonpituus voidaan jakaa kolmeen osaan.

IR-alue Aallonpituus (µm) Aaltoluku (cm⁻¹) L¨ahi-IR 0.8 - 2.5 12800 - 4000 Keski-IR 2.5 - 50.0 4000 - 200 Kauko-IR 50.0 - 1000.0 200 - 10

S¨ahk¨omagneettinen s¨ateily sis¨alt¨a¨a aina energiaa, joka koostuu energiayksik¨oist¨a foto- neista eli energiakvanteista. Planckin s¨ateilylain mukaan s¨ahk¨omagneettisen s¨ateilyn taajuus on verrannollinen sen energiaanE, joka saadaan laskettua yht¨al¨oll¨a

E =hf = hc λ , miss¨a h on Planckin vakio6,63·10⁻³⁴ Js. [26]

Spektroskopian perustana on s¨ahk¨omagneettisen s¨ateilyn vuorovaikutus materi- aalin kanssa. Molekyylispektroskopia perustuu kvanttifysiikan ilmi¨o¨on, jonka mukaan osa IR-s¨ateilyn fotoneista absorboituu molekyyliin ja viritt¨a¨a molekyylin energian kor- keammalle kvantisoituneelle energiatasolle. [8, 10, 27] Jotta fotoni voi absorboitua, on fotonin energian oltava t¨asm¨alleen energiatasojen erotuksen suuruinen

∆E =E_n−E_m,

miss¨a n > m, m, n ∈ R. T¨am¨a energia vastaa n¨aytemolekyylin v¨ar¨ahtelytaajuutta ja johtaa molekyylin v¨ar¨ahtelytaajuuden muutoksiin, mink¨a seurauksena molekyylin sidokset alkavat v¨ar¨ahdell¨a edestakaisin aiheuttaen muutoksen molekyylin s¨ahk¨oisess¨a dipolimomentissa eli varausten jakautumisessa. [8, 27, 28]

Kaikilla molekyyleill¨a esiintyy v¨ar¨ahtelysiirtymi¨a energiatilojen v¨alill¨a absoluut- tisen nollal¨amp¨otilan yl¨apuolella. Jokaisella molekyylill¨a on erilaisia energiatasoja,

Siirtymisi¨a s¨a¨atelev¨at kuitenkin molekyylien vapausasteet. Polyatomisilla molekyy- leill¨a, joilla on N m¨a¨ar¨a atomeja, on 3N vapausastetta. N¨aist¨a vapausasteista kolme kuvaa translaatiota, kaksi tai kolme rotaatiota ja j¨aljelle j¨a¨av¨at vapausasteet anta- vat v¨ar¨ahtelymoodien lukum¨a¨ar¨an. [28] Taulukko 2esitt¨a¨a erilaisten molekyylien va- pausasteiden lukum¨a¨ar¨at.

Taulukko 2: Lineaaristen ja ep¨alineaaristen molekyylien vapausasteiden lukum¨a¨ar¨at.

Lineaariset molekyylit Ep¨alineaariset molekyylit

Translaatio 3 3

Rotaatio 2 3

V¨ar¨ahtely 3N - 5 3N - 6

Yhteens¨a 3N 3N

Kaikissa atomien v¨alill¨a olevissa kemiallisissa sidoksissa tapahtuu v¨ar¨ahtely¨a, jo- ka sis¨alt¨a¨a monenlaisia atomiryhmien liikkeit¨a. V¨ar¨ahtely voi liitty¨a sidoksen pituu- den (engl.streching) tai kahden sidoksen v¨alisen kulman muutoksiin (engl.bending).

[15, 25, 28] Symmetrisess¨a venytyksess¨a samanlaiset sidokset, jotka ovat kiinni yhtei- sess¨a atomissa, liikkuvat poisp¨ain ja kohti yhteist¨a atomia samanaikaisesti. Ep¨asym- metrinen venytys on samanlaista kuin symmetrinen venytys, mutta t¨ass¨a vain yksi tai useampi sidos siirtyy poisp¨ain yhteisest¨a atomista, kun taas toinen sidos tai toiset sidokset liikkuvat yhteist¨a atomia kohti. Taivutusv¨ar¨ahtely¨a voi esiinty¨a nelj¨all¨a eri tavalla: wagging, twisting, rocking ja scissoring. [15, 17, 28] V¨ar¨ahtelyj¨a on havain- nollistettu kuvassa 1. Yleens¨a venytysv¨ar¨ahtelyt tarvitsevat enemm¨an energiaa, min- k¨a vuoksi venytysv¨ar¨ahtely¨a esiintyy lyhyemmill¨a aallonpituuksilla (ts. suuremmilla aaltoluvuilla) kuin venytysv¨ar¨ahtelyit¨a. Voimakkaimpia v¨ar¨ahtelij¨oit¨a ovat erilaiset ep¨asymmetriat. [3, 25]

Kuva 1: Erilaisia mahdollisia v¨ar¨ahtelyj¨a IR-aktiivisilla molekyyleill¨a.

IR-absorption venytystaajuus voidaan approksimoida k¨aytt¨am¨all¨a yksinkertaisen harmonisen oskillaattorin mallia, vaikka todellisuudessa tilanne on monimutkaisempi, varsinkin polyatomisilla molekyyleill¨a. Jos molekyylin atomeja pidet¨a¨an tietyn mas- san hiukkasina, niin kaksiatomisen molekyylin v¨ar¨ahtely voidaan kuvata seuraavasti.

Jos molekyyli koostuu massoista m₁ ja m₂, jotka on yhdistetty jousella, niin tasa- painossa massojen v¨alinen et¨aisyys on r. Jos jousta venytet¨a¨an ∆r verran, syntyy palautusvoima F. Hooken lain mukaan pienill¨a venymill¨a palautusvoima on suoraan verrannollinen jousen venym¨a¨an eli

F =−k∆r ,

miss¨ak on voimavakio. Molekyyliss¨a voimavakiokon atomien v¨alisen sidoksen lujuu- den mitta. Klassisen fysiikan mukaan harmonisesta v¨ar¨ahtelyst¨a saadaan laskettua venytysv¨ar¨ahtelyn taajuus

f = 1 2π

sk µ

miss¨a µon redusoitu massa, joka saadaan laskettua yht¨al¨oll¨a µ= m₁·m₂

m1+m2

.

Yll¨a olevan yht¨al¨on mukaan voidaan sanoa, ett¨a mit¨a suurempi on sidoslujuus, si- t¨a korkeampi on v¨ar¨ahtelytaajuus ja mit¨a suurempi on v¨ar¨ahtelev¨an atomin massa, sit¨a matalampi on v¨ar¨ahtelytaajuus. [17, 28] Lis¨aksi v¨ar¨ahtelytaajuuteen vaikuttaa kemiallisten sidoksien luonne ja kemiallinen ymp¨arist¨o.[7]

Huomattavaa on, ett¨a yksinkertaisella molekyylill¨a on kuitenkin monia erilaisia v¨a- r¨ahtelytaajuuksia, sill¨a jokaisella molekyylin sidoksella on oma ainutlaatuinen v¨ar¨ah- telytaajuutensa, joka riippuu atomien v¨alisten kemiallisten sidoksien lujuudesta k ja kunkin atomin massastam.[25] Jotta molekyylien kemialliset sidokset pystyt¨a¨an tun- nistamaan, on molekyylin oltava IR-aktiivinen eli on tapahduttava muutos molekyy- lin dipolimomentissa sen absorboiden tietyn IR-s¨ateilyn taajuuden v¨ar¨ahtelyn aikana.

Vain n¨am¨a v¨ar¨ahtelymoodit ovat kvantitatiivisesti mitattavissa IR-spektroskopialla, jossa mitataan s¨ateilyn sitoutumista molekyylien v¨ar¨ahtelyyn.[15, 28, 29] Lis¨aksi mit¨a suurempi dipolimomentin muutos on, sit¨a voimakkaampi absorptiokaista syntyy. Jos molekyylin nettodipolimonetti on nolla, molekyyli on IR-inaktiivinen, jolloin molekyy- li ei siirry energiatilalta toiselle eik¨a IR-spektriin synny absorptiokaistaa. [25, 29, 30]

2.2 FTIR-spektroskopia

Fourier-muunnos infrapunaspektroskopia (engl.Fourier Transform infrared spectrosco- py, FTIR) on v¨ar¨ahdysspektroskooppinen menetelm¨a, jota pidet¨a¨an yhten¨a tehok- kaimmista kemiallisen analyysin tekniikoista. [8, 31] Tekniikassa keskeisint¨a on Mic- helsonin interferometri, s¨ateilyn interferenssi ja Fourier-muunnos (engl.Fourier trans- form, FT), jota sovelletaan interferogrammeihin lopullisen IR-spektrin saavuttamisek- si. [24, 31]

2.2.1 FTIR-spektrometri

FTIR-laitteistossa infrapunas¨ateily johdetaan s¨ateilyl¨ahteest¨a n¨aytteen l¨api ilmaisi-

kentuu useista erilaisista komponenteista, joista t¨arkeimm¨at ovat Michelsonin interfe- rometri, ilmaisin ja laser. Lis¨aksi FTIR-laitteisto sis¨alt¨a¨a heijastavia peilej¨a IR-polun ohjaamiseksi laitteiston l¨api ja ilmaisimen. [31]

Interferometri on optinen laite, joka koostuu valonl¨ahteest¨a, s¨ateenjakajasta ja kahdesta peilist¨a, joista toinen liikkuu. L¨ahde s¨ateilee valoa s¨ahk¨omagneettisella in- frapunas¨ateilyn alueella, ja saapuessaan s¨ateenjakajalle se jakautuu kahdelle eri rei- tille kulkeakseen interferometrin l¨api. Toinen osa IR-valosta jatkaa s¨ateenjakajan l¨api yl¨apuolella paikallaan olevaan peiliin, josta se heijastuu takaisin s¨ateenjakajaan. Toi- nen osa IR-valosta heijastuu s¨ateenjakajasta vasemmalla olevalle liikkuvalle peilille, josta se heijastuu takaisin s¨ateenjakajaan. S¨ateenjakajassa peileist¨a heijastuneet IR- valons¨ateet yhdistyv¨at, mink¨a j¨alkeen ne kulkevat n¨aytteen l¨api ilmaisimelle. Yksin- kertaistettu kuva interferometrist¨a on esitetty kuvassa 2.[24, 31]

Kuva 2: Yksinkertaistettu periaate interferometrist¨a FTIR-laitteistossa. Liikkuva peili pystyy liikkumaan akselia pitkin s¨ateenjakajaa kohti ja poisp¨ain. Muokattu kuva [31].

Interferometrin ideana on, ett¨a liikuttamalla toista peili¨a saadaan muutettua kul- kevan valons¨ateen optista matkaa. N¨ain pystyt¨a¨an muokkaamaan yhdistetyn valon eri reiteill¨a kulkeneiden s¨ateiden v¨alist¨a matkaeroa (engl.optical path difference, OPD).

Kun peilit ovat samalla et¨aisyydell¨a s¨ateenjakajasta, molemmille s¨ateille optinen mat- ka on sama ja matkaero on nolla, jolloin s¨ateet ovat samassa vaiheessa ja vahvistavat toisiaan eli tapahtuu konstruktiivinen interferenssi. T¨all¨oin superpositioperiaatteen mukaisesti ilmaisimella havaitaan saapuvan s¨ateen intensiteetin maksimisignaali. Sa- ma ilmi¨o havaitaan matkaeron ollessa s¨ateilyn aallonpituuden moninkerta, ja t¨at¨a peilien asemaa kutsutaan nolla-polkueroksi (engl.zero path difference). [31]

Jos polkuero kiinte¨ast¨a ja liikkuvasta peilist¨a on (n + 1/2) -kerrannainen aallon- pituudesta, s¨ateet ovat vastakkaisissa vaiheissa saapuessaan s¨ateenjakajalle, jolloin

tapahtuu destruktiivinen eli vaimentava interferenssi ja ilmaisimelle ei saavu lain- kaan s¨ateily¨a. Koska peilej¨a liikutellaan ja dataa ker¨at¨a¨an jatkuvasti, eri polkueroissa tapahtuu sek¨a konstruktiivisi¨a ett¨a destruktiivisi¨a interferenssej¨a ja tuloksena oleva valon voimakkuus vaihtelee sini-funktion muodossa.[31]

Ilmaisimen teht¨av¨an¨a on muuntaa vastaanotetun s¨ateilyn intensiteetti s¨ahk¨oiseksi signaaliksi. Aluksi saatu interferogrammi kuvaa s¨ateilyn kokonaisintensiteetti¨a OPD:n funktiona ja on spektrin k¨a¨anteinen Fourier-muunnos. Jotta saataisiin interferogram- mista data takaisin spektriksi, on suoritettava Fourier-muunnos. [24]

2.2.2 Spektrin laskenta

Syntyv¨an s¨ateilyn voimakkuus vaihtelee sinimuotoisella tavalla. Kun s¨ateily vuorovai- kuttaa n¨aytemateriaalin kanssa, s¨ateilyn intensiteetti muuttuu s¨ateilylain mukaisesti ja t¨aten interferogrammi muuttuu, kun n¨ayte absorboi IR-s¨ateily¨a. Lopuksi interfero- grammi mitataan pisteitt¨ain detektorilla. Koska laitteen muodostama interferogam- mi ei ole s¨ateilyn intensiteetti taajuuden funktiona, vaan saatu signaali on aikata- sossa, on hy¨odynnett¨av¨a matemaattista kuvausta, Fourier-muunnosta, jonka avulla saatu interferogrammi muunnetaan taajuustason spektriksi. [31] Ennen varsinaista FT-muunnosta tehd¨a¨an apodisointi, jossa interferogrammia k¨asitell¨a¨an matemaatti- silla funktioilla niin, ett¨a saadaan melko symmetrinen interferogrammi. Apodisoin- nissa poistetaan ep¨asymmetriat, kuten sivuosat. Haittana on kuitenkin spektrin re- soluution huononeminen.[31]

Fourier-muunnos on kuvaus fˆ: R →C,

f ˆ (ξ) = 1

√ 2π

Z∞

−∞

f (x)

jossaf(ξ) on taajuustason vaste,ˆ ion imagin¨a¨ariyksikk¨o jaf(x)on aikatason funktio.

[32] FTIR-spektrometri ker¨a¨a ja muokkaa interferogrammin, suorittaa FT-muunnoksen kahdesti ja antaa lopullisen n¨aytteen IR-spektrin. [25] Tavallisessa FTIR-mittauksessa tuloksena muodostuu kaksiulotteinen spektri, jossa x-koordinaatti ilmaisee aaltoluvun ja y-koordinaatti absorbtion intensiteetin. Kuvantavassa FTIR-mittauksessa, jossa FTIR-laite on yhdistettyn¨a mikroskooppiin on tavallisen FTIR-mittauksen erikois- muoto. Kuvantavassa FTIR-mittauksessa muodostuu kolmiulotteinen datamatriisi, jonka x- ja y- koordinaatit tarjoavat spatiaalista tietoa molekyylist¨a, kun taas z- koordinaatti kertoo intensiteetin arvon kyseisell¨a aaltoluvun kohdalla. N¨aiden para- metrien avulla pystyt¨a¨an visualisoimaan hyperspektrikuvina jokaisen luukudoksen pa- rametrit tutkittavasta n¨aytteest¨a. [33, 34] Kuvassa 3 on havainnollistettu IR-spektrin mittaamista ja kuvantavalla FTIR:ll¨a muodostuneen datamatriisin ja FTIR-spektrin yhteys.

Kuva 3: Havainnollistettu kuva IR-spektrin mittaamisesta. Kuvan oikeassa yl¨akul- massa on kuvantavalla FTIR:ll¨a muodostunut datamatriisi.

Koska luun IR-spektrist¨a on helposti saatavissa tietoa molekyylist¨a ja sen naapu- rustosta, useimmat FTIR-v¨ar¨ahdysspektroskooppiset kaistat ovat yhdistelm¨akaistoja, jotka koostuvat tietyn molekyylin ja sen naapuritilan spesifisist¨a piikeist¨a. [7] Jotta voitaisiin m¨a¨aritt¨a¨a taustalla olevien absorptiokaistojen tarkat sijainnit ja intensitee- tit, on IR-kaistojen p¨a¨allekk¨aisyytt¨a v¨ahennett¨av¨a pienent¨am¨all¨a niiden leveyden ja intensiteetin suhdetta muuttamatta kaistan sijaintia ja pinta-alaa. T¨am¨a spektrin kor- jaus voidaan tehd¨a hy¨odynt¨am¨all¨a erilaisia matemaattisia menetelmi¨a kuten Fourierin dekonvoluutiota (engl. Fourier self-deconvolution, FSD), toisen derivaatan spektros- kopiaa (engl.second derivative spektroscopy) ja k¨ayr¨ansovitusta (engl.curve fitting).

[8, 19, 51] Kuvassa 4 on esimerkiksi, jossa CO²⁻₃ -ionille ominainen kaista on v¨alil- l¨a 890-850 cm⁻¹, joka sis¨alt¨a¨a kolme erilaista absorptiopiikki¨a riippuen CO²⁻₃ -ionin substituutiosta.

Kuva 4: Esimerkki v2CO⁻²₃ -ionin absorptiopiikkien dekonvoluutiosta. Punaisella k¨ay- r¨all¨a on summa absorptiopiikeist¨a, mutta data-analyysill¨a saadaan selville sen koostu- van kolmesta erilaisesta absorptiopiikist¨a riippuen CO²⁻₃ -ionin substituutioista. Muo- kattu kuva [8].

FTIR-spektroskopiassa molekyyliv¨ar¨ahtelyjen absorbanssit ovat suoraan verran- nollisia pitoisuuden kanssa. T¨at¨a tapahtumaa mitataan s¨ateilyn intensiteetin heikke- nemisen avulla, jolloin kiinnostavan yhdisteen pitoisuus voidaan m¨a¨aritt¨a¨a hy¨odyn- t¨am¨all¨a Beer-Lambertin lakia

A = − log

I

I

= cl, (1)

miss¨aA on n¨aytteen absorbanssi, I on mitattu intensiteetti,I₀ on s¨ateilyn alkuper¨ai- nen intensiteetti, on molaarinen absorptiokerroin, c on n¨aytteen konsentraatio ja l on valon kulkema matka n¨aytteess¨a. [24, 35, 36]

3 Luukudoksen FTIR-spektroskopia

FTIR on laajasti k¨aytetty erilaisten biologisten n¨aytteiden, kuten luun ja ruston tut- kimuksissa, koska se tarjoaa samanaikaisesti kvantitatiivista ja kvalitatiivista tietoa kudoksessa tapahtuvien rakenteellisten ja spatiaalisten koostumusten muutoksien ha- vaitsemisesta. Lis¨aksi spektrien yksityiskohtaisemman analyysin avulla voidaan saa- da tietoa molekyylin vuorovaikutussuhteista ymp¨ar¨oivien funktionaalisten ryhmien kanssa. [7, 15, 28]

3.1 Luukudos

Luukudos on el¨av¨a¨a, jatkuvasti uusiutuvaa heterogeenist¨a komposiittimateriaalia, jo- ka koostuu mineraaleista, soluv¨aliaineesta eli matriksista, vedest¨a, lipideist¨a ja erilai- sista soluista. N¨aiden komponenttien suhteelliset osuudet kuitenkin vaihtelevat riip- puen muun muassa kudoksen i¨ast¨a, kudostyypist¨a ja -paikasta ja terveydentilasta.[1, 3, 7, 37, 38, 39]

Ihmisen luustosta voidaan erottaa kahden tyyppist¨a luuta, tiivis- ja hohkaluuta.

Tiivisluu kattaa luuston massasta noin 80 prosenttia, ja se on tihe¨a¨a, kovaa ja kest¨av¨a¨a sek¨a muodostaa luun kuorikerroksen. T¨am¨an kerroksen alla on hohkaluuta, joka kat- taa noin 20 prosenttia luuston massasta. Se on huokoista, kevyemp¨a¨a ja joustavampaa materiaalia, jonka v¨aleiss¨a on luuydint¨a. [4, 19] Molemmat luulajit sis¨alt¨av¨at samat peruskomponentit, joiden avulla ne kehittyv¨at melko erilaisiksi luiksi. Tiivisluu ra- kentuu useista pienist¨a tiivisti pakatuista sylinterim¨aisist¨a luun rakenneyksik¨oist¨a eli osteoneista, joiden keskell¨a kulkee Haverisian kanavassa verisuonia ja hermoja. Hoh- kaluu muodostuu huomattavasti eri tavalla, sen pinnalla olevat rakenteet hallitsevat luun muodostumisprosessia, mik¨a johtaa huokoiseen avoimeen rakenteeseen. [1, 4, 38]

Kuvassa 5 on havainnollistettu luun rakennetta.

Kuva 5: Luun rakenne. Muokattu kuva [1].

Luu muodostuu nelj¨ast¨a erilaisesta luusolusta: osteoblasteista, -klasteista ja -syyteist¨a sek¨a pintasoluista (engl. bone lining cells). Luusoluilla on t¨arke¨a merkitys luun uusiutumisessa, sill¨a luu on hyvin aktiivinen el¨av¨a kudos. Luun uusiutuminen on kuitenkin eritt¨ain monimutkainen jatkuva prosessi, jossa vanha luu korvataan uu- della luulla syklisesti. Sykli koostuu kolmesta eri vaiheesta, jotka tapahtuvat kaikkien nelj¨an eri luusolun koordinoidun toiminnan ansiosta. Luun uusiutuminen alkaa, kun osteoklastit tuhoavat vanhaa luuta, jolloin kiinte¨a aines imeytyy verenkiertoon (re- sorptio). Seuraavaksi on siirtym¨ajakso resorptiosta uuden luun muodostumiseen, jon- ka j¨alkeen osteoblasteilla on t¨arke¨a rooli uuden luun muodostamisessa. Lopulta sykli saadaan p¨a¨at¨okseen osteosyyttien eli kypsien luusolujen ja pintasolujen koordinoidul- la toiminnalla. [2] Luun uusiutuminen on pintailmi¨o luun onteloissa, ja sit¨a esiintyy kortikaalisessa luussa periosteaalisesti, endosteaalisesti ja Haversian kanavan pinnoil- la, joissa se on my¨os hidasta, kun taas trabekulaarisilla pinnoilla uusiutuminen on no- peampaa. [1, 7, 15, 19] Luun jatkuvasta uusiutumisesta johtuen luukudos sis¨alt¨a¨a kah- dentyyppisi¨a kehitysvaiheita, kypsi¨a ja kehittym¨att¨omi¨a. Kyps¨a luu on j¨arjest¨aytynyt ja suuntautunut kuormituksen mukaisesti, kun taas kehittym¨at¨on luu on rakenteel- taan v¨ahemm¨an j¨arjest¨aytynytt¨a ja sis¨alt¨a¨a korkeammat solu- ja vesipitoisuudet.[1, 4]

Luukudoksen matriksi voidaan jakaa ep¨aorgaanisen ja orgaanisen osan kompo- nentteihin. Matriksin ep¨aorgaaninen mineraalifaasi on suurimmaksi osaksi kalsium- ja fosfaatti-ioneita (Ca²⁺, PO³⁻₄ ), josta suurin osa on heikosti kiteytynytt¨a kalsium- hydroksiapatiittia ([Ca₁₀(P O₄)₆(OH)₂], HA), joka on luonnossa esiintyv¨an apatiitti- mineraalin analogi.[5, 6, 7, 33, 37] Lis¨aksi ep¨aorgaaninen faasi sis¨alt¨a¨a merkitt¨avi¨a m¨a¨ari¨a erilaisia ioneja, kuten magnesiumia (Mg²⁺), kaliumia (K⁺), natriumia (Na⁺), fluoridia (F⁻), strontiumia (Sr²⁺), sinkki¨a (Zn²⁺), sitraattia ([C₆H₅O₇]³⁻) ja vetykar- bonattia (HCO⁻₃). [4, 38] T¨aysin puhtaat apatiitit koostuvat Ca²⁺- , PO³⁻₄ - ja hydrok- sidi (OH⁻) -ioneista, joista OH⁻ tai PO³⁻₄ voivat substioitua erilaisilla ioneilla, kuten vetyfosfaatti (HPO²⁻₄ ) tai karbonaatti (CO²⁻₃ ), riippuen kuitenkin kudoksen kemial- lisesta ymp¨arist¨ost¨a. [1, 4, 7, 8] T¨am¨an takia luun HA:lle on tunnusomaista erilaiset kidehilan substituutio- eli korvautumisreaktiot, joiden ansiosta luun ep¨aorgaanisessa matriksissa on merkitt¨avi¨a m¨a¨ari¨a ep¨apuhtauksia. [7, 19, 40] Jos substituutioreaktio kohdistuu HA-kiteen OH⁻-ioniin on kyse A-tyypin substituutiosta, jos PO³⁻₄ -ioniin on kyse B-tyypin substituutiosta. Mahdollista on my¨os, ett¨a substioituvat ionit kiin- nittyv¨at l¨oyh¨asti HA-kiteen pintaan, jolloin kyseess¨a on labiili muoto. Substituution tyypill¨a ja laajuudella on vaikutusta mineraalikiteen liukoisuuteen, kokoon ja muo- toon, jotka muuttuvat luun kypsymisen aikana.[4, 7, 8, 40]

Luun orgaanisesta matriksista suurin osa (n. 90 %) on tyypin 1 kollageenia, jo- ka on my¨os suurin kuituproteiini.[7, 22] Kollageenikuidut ovat j¨arjest¨aytyneet solun ulkoiseen tilaan rakenteena, joka on riippuvainen luukudoksen toiminnasta. Lis¨aksi ep¨aorgaanisen matriksin mineraalikiteet ovat muodostuneet kollageenis¨aikeiden v¨a- liin, mink¨a ansiosta kollageenis¨aikeet tarjoavat tukimatriisin mineraalikiteiden muo- dostukselle. Kollageenis¨aikeiden v¨aliin muodostuvat my¨os ristiliitokset (engl. cross- links), jotka j¨aykist¨av¨at rakennetta ja antavat luulle sen lujuuden.[1, 4, 8, 16, 22]

Ristiliitokset muuttuvat ep¨akypsist¨a kypsiksi spontaanisti tai katalyyttien avulla. Li- s¨aksi ristiliitoksien laatu on erilainen riippuen siit¨a, onko sidekudos mineralisoitunut vai ei. [1, 22] Loppu 10%orgaanisesta matriksista on p¨a¨aasiassa ei-kollageenisia pro- teiineja kuten kasvutekij¨oit¨a, osteokalsiinia, lipidej¨a ja erilaisia solukomponentteja, ja n¨aill¨a on t¨arke¨a rooli luun metaboliassa ja uudelleenmuodostumisessa. [2, 8, 37, 41]

3.2 FTIR-spektroskopian t¨ arkeimm¨ at luuparametrit

FTIR on eritt¨ain herkk¨a luun kemiallisille komponenteille ja tarjoaa runsaasti bioke- miallista tietoa luusta. [8, 15] Luukudoksen IR-spektrien absorptiopiikit muodostuvat molekyyliv¨ar¨ahtelyjen kvantisoitujen energitasojen v¨alisist¨a siirtymist¨a ja vastaavat molekyylin sidosv¨ar¨ahtelytaajuutta. N¨am¨a v¨ar¨ahtelyt riippuvat molekyylien kemial- lisesta luonteesta, joten ne paikantuvat molekyylien spesifisiin osiin, joita kutsutaan funktionaalisiksi ryhmiksi. Eri funktionaalisilla ryhmill¨a on erilaiset absorptiopiikin intensiteetit, leveydet ja tyypillisesti erilaiset sijainnit ts. ne absorboivat eri infrapuna- alueilla, mik¨a antaa n¨ayteelle oman ainutlaatuisen profiilin eli sormenj¨aljen. [8, 19]

T¨aten jokaisen hyperspektrikuvan pikselin IR-absorptiospektrist¨a voidaan analysoi- malla saada tietoa biokemiallisesta koostumuksesta, eri molekyylien konsentraatiois- ta, konformaatioista, molekyylirakenteista ja hienovaraisista vuorovaikutuksista mole- kyyli¨a ymp¨ar¨oivien funktionaalisten ryhmien kanssa. [15] Tyypillinen luun IR-spektri t¨arkeimpien molekyylien osalta on esitetty kuvassa 6.

Kuva 6: Luun IR-spektri. T¨arkeimm¨at luun molekyylit ovat amidi I-III, fosfaatti ja karbonaatti. Muokattu kuva [3].

Luusta johdettu IR-spektri on kaikkien mitatun n¨aytteen erilaisten molekyylien v¨ar¨ahtelymoodien summa, mink¨a takia osa absorptikaistoista on p¨a¨alleekk¨ain. Jo- kaisen yksitt¨aisen absorptiokaistan sijainti, leveys ja intensiteetti johtuvat l¨asn¨a ole- vien molekyylisidoksien erilaisista v¨ar¨ahtelymoodeista ja vierekk¨aisten atomien tai molekyylien vuorovaikutuksista, mik¨a antaa mahdollisuuden identifioida kemialliset funktionaaliset ryhm¨at n¨aytteest¨a tai tarkkailla tiettyjen alueiden muutoksia. Piikin leveys antaa arvion molekyylien v¨alisist¨a vuorovaikutuksista ja intensiteetti kemial- listen osien konsentraatiosta. Lis¨aksi IR-spektrej¨a voidaan verrata tunnettuihin refe- renssispektreihin ja n¨ain saada lis¨a¨a tietoa analysoitavasta yhdisteest¨a. [3, 8, 19]

Yleisimm¨at signaalit luun FTIR-spektriss¨a ovat per¨aisin HA-kiteiden ep¨aorgaa- nisten komponenttien ja luun orgaanisten komponenttien kemiallisista funktionaali- suuksista, kuten amidi-, fosfaatti- ja karbonaattiryhmist¨a. Kaikilla komponenteilla on

erityisi¨a kemiallisia ominaisuuksia, joiden ansiosta ne erottuvat IR-spektriss¨a erillisi- n¨a absorptiopiikkein¨a eri aaltolukujen kohdilla. Huomattavaa on, ett¨a IR-spektriss¨a veden absorbanssi ei n¨ay, vaikkakin vedell¨a on voimakas absorptio kyseisell¨a alueella, sill¨a n¨aytteet dehydratoidaan ennen analyysej¨a.[3, 7, 8]

IR-spektrist¨a pystyt¨a¨an havaitsemaan kolme erilaista amidikaistaa. Amidi I-kaista, joka absorboi v¨alill¨a 1700-1600 cm⁻¹, syntyy p¨a¨aasiassa tyypin 1 kollageenin pepti- disidoksen C=O ja C-N venytysv¨ar¨ahtelyst¨a. [23, 42] FTIR on erityisen herkk¨a kol- lageenin proteiinin sekundaarirakenteelle, mink¨a takia absorptiopiikin paikkaan vai- kuttavat muun muassa C-N-venytysv¨ar¨ahtely, C-C-N-muodonmuutos ja erilaiset ve- ty¨a sitovat ymp¨arist¨ot. [19, 24, 41] Amidi II-kaista 1550 cm⁻¹ tienoilla johtuu N-H- taivutus- ja C-N-venytysv¨ar¨ahtelyist¨a tasossa funktionaalisessa ryhm¨ass¨a. Pient¨a vai- kutusta kaistaan tuo C-O-tasotaivutus, C-C- ja N-C-venytysv¨ar¨ahtelyt. [19, 24, 42]

Amidi III-kaista, joka absorboi v¨alill¨a 1400-1200 cm⁻¹, liittyy N-H-taivutus- ja C- N-venytysv¨ar¨ahtelyihin, joihin on pient¨a vaikutusta C-O-tasotaivutuksella ja C-C- venytysv¨ar¨ahtelyll¨a. N¨am¨a absorptiokaistat syntyv¨at luun proteiiniosista niiss¨a ta- pahtuvien muutosten vuoksi johtuen p¨a¨aasiassa tyypin 1 kollageenista.[24, 42]

Vapaalla PO³⁻₄ -ionilla voi olla nelj¨a erilaista v¨ar¨ahtelymoodia: v1 (symmetrinen venytys), v2 (symmetrinen taivutus), v3 (P-O ep¨asymmetrinen venytys) ja v4 (ep¨a- symmetrinen taivutus). Kuitenkaan kaikkia fosfaatin mahdollisia kaistoja ei havaita johtuen v1 ja v2 tetraedrisymmetriasta, n¨ain vain v3 ja v4 ovat IR-aktiivisia. [8] Ta- sotaivutus v¨ar¨ahtelymoodi v4 on heikompi, mutta paikallisten anisotrooppisten kide- kenttien vaikutusten vuoksi se voi n¨aky¨a hyvin m¨a¨ariteltyn¨a kohdilla 561 cm⁻¹, 580 cm⁻¹ ja 604 cm⁻¹. On kuitenkin mahdollista havaita v1 ja v2 v¨ar¨ahtelymoodeja, jos molekyyli j¨arjest¨aytyy itse pienemm¨alle symmetrialle. N¨am¨a vuorovaikutukset johta- vat heikkoihin kaistoihin 957 cm⁻¹ja 473 cm⁻¹kohdilla vastaavasti. [8, 43] Yleisemmin luun IR-spektriss¨a fosfaattikaistan absorptio kohdalla 1200-900 cm⁻¹ johtuu HA:n PO³⁻₄ -ionin normaalimoodeista v1 ja v3. Vetyfosfaatista johtuva kaista 1163 cm⁻¹ kohdalla liittyy ei-stoikometriseen HA:n ja orgaanisen aineen pitoisuuteen.[3, 7, 8]

IR-spektreiss¨a on tavallisesti kaksi eri aluetta, jotka ovat per¨aisin karbonaatin substituutiosta: ensimm¨ainen on 890-850 cm⁻¹ ja toinen on 1500-1400 cm⁻¹ koh- dalla. Molemmat n¨aist¨a alueista ovat yhdistelm¨avy¨ohykkeit¨a, jotka ovat p¨a¨allekk¨ain joko vetyfosfaattipiikkien (ensimm¨ainen alue) tai ei-kollageenisten proteiinipiikkien (toinen alue) kanssa. [7] T¨arke¨ampi on ensimm¨ainen alue, joka sis¨alt¨a¨a kolme alikais- taa kohdilla 879, 871 ja 866 cm⁻¹. N¨aist¨a kaksi ensimm¨aist¨a kaistaa osoittavat sek¨a A- ett¨a B-tyypin karbonaattisubstituutiot HA-kiteen kahdessa anionisessa kohdassa vas- taavasti. B-tyypin substituution intensiteetti on huomattavasti isompi (kuva4), mik¨a osoittaa, ett¨a biologiset apatiitit ovat suurimmaksi osaksi B-tyypin karbonaattiapa- tiitteja. Kolmas kaista kohdalla 866 cm⁻¹ viittaa labiiliin karbonaattiin. [8, 20, 40]

Luun IR-spektrej¨a analysoitaessa voidaan n¨aiden kemiallisten komponenttien avul- la muodostaa useita erilaisia luuparametrej¨a, joita yleisesti k¨aytet¨a¨an luukudoksen spatiaalisen molekyylikoostumuksen karakterisointiin ja kuvaamaan luumineraalien kiteisyytt¨a ja m¨a¨ar¨a¨a. N¨ait¨a parametrej¨a ovat mineralisaatio, mineraalin

kypsyys/kiteisyys, karbonaattipitoisuus, kollageenin kypsyys ja vetyfosfaatin substi- tuutio. [16, 20, 21] Seuraavaksi kuvaillaan luuparametrej¨a yksityiskohtaisemmin.

1. Mineralisaatio

Analysoitaessa luun kemiallista koostumusta mineralisaatio eli mineraali/matriksi -suhde on yleisimmin ilmoitettu luuparametri. Kvantitatiivinen arvio saadaan integroimalla IR-spektrist¨a v1v3-fosfaatin (1200 - 900 cm⁻¹) ja amidi I (1700 - 1600 cm⁻¹) absorptiopiikkien suhde. [7, 43] Fosfaattikaista edustaa fosfaattisia funktionaalisia ryhmi¨a, joita esiintyy luun mineraalikiteess¨a ja amidi I-kaista or- gaanisissa osissa esiintyvi¨a funktionaalisia karbonyyliryhmi¨a. Suhde siis antaa tietoa analysoidusta mineraalin m¨a¨ar¨ast¨a orgaanisen matriksin m¨a¨ar¨a¨an analy- soitua tilavuutta kohden, toisin sanoen edustaa suhteellista mineralisoitumista kollageenimatriksiin eli on mineralisaatioasteen mittari ja korreloi my¨os luun tuhkapitoisuuden (mineraalitiheys) kanssa.[20, 34, 43, 44]

2. Mineraalin kypsyys/kiteisyys

Tarkasteltaessa luun mineraalien laatua on otettava huomioon kaksi erillist¨a parametri¨a: mineraalien kypsyysaste ja mineraalien kiteisyysindeksi. Mineraa- likiteiden kemiallista rakennetta kutsutaan kidekypsyydeksi, joka kuvastaa ei- apatiittisten esiasteiden muuttumista apatiittiseksi mineraaliksi, kun taas mi- neraalikiteen koko ja muoto viittaavat kidehilan kiteisyyteen. Kuitenkin muu- tokset kemiallisessa rakenteessa vaikuttavat mineraalikiteen koon ja muodon muutoksiin, mink¨a takia parametrej¨a ei erotella toisistaan vaan yhdistet¨a¨an yh- deksi mineraalin kypsyys/kiteisyys -luuparametriksi. [7, 6] Luuparametri tarjo- aa tietoa mineraalikiteiden kemiallisesta koostumuksesta eli toisin sanoen ep¨a- puhtauksien l¨asn¨aolosta. Normaalien mineraalikiteiden koko vaihtelee ja poik- keavuuksia on olemassa, siksi my¨os luuparametri on merkitt¨av¨asti riippuvainen luun¨aytteen paikasta, laadusta sek¨a luukudoksen i¨ast¨a. [19] Mineralisoituneis- sa biologisissa kudoksissa t¨am¨a luuparametri lasketaan analysoimalla fosfaatti- kaistalla olevien alikaistojen 1030 cm⁻¹ja 1020 cm⁻¹intensiteettipiikkien suhde.

Piikki 1030 cm⁻¹ liittyy fosfaattiin eritt¨ain kiteisess¨a apatiitissa, kun taas piik- ki 1020 cm⁻¹ huonosti kiteiseen apatiittiin, joka sis¨alt¨aa HPO²⁻₄ ja/tai CO²⁻₃ . N¨ain saadaan tietoa HA-kiteiden koosta, t¨aydellisyydest¨a ja mineraalin i¨ast¨a.

[22, 27, 43, 45]

3. Karbonaattipitoisuus

Yleisin karbonaatin liittyminen mineraalikiteeseen on B-tyypin substituutio, vaikka A-tyypin substituutiotakin tapahtuu pieniss¨a m¨a¨arin. Molemmilla on vaikutusta luumineraalin kokoon ja t¨aydellisyyteen ja n¨ain materiaalin ominai- suuksiin erilaisissa ymp¨arist¨oolosuhteissa. B-tyypin karbonaatti hallitsee apa- tiitin muodostumista biomineraaleissa, kun taas A-tyypin karbonaatti hallit- see apatiittimineraalien ominaisuuksia ei-fysiologisissa olosuhteissa. [40] Kar- bonaattipitoisuuden suhteellinen osuus voidaan laskea v2CO₃-kaistan (890-850 cm⁻¹) ja v1v3PO₄-kaistan (1200-900 cm⁻¹ ) piikkien integroitujen pinta-alojen suhteesta, joka edustaa sek¨a A- ett¨a B-karbonaattisubstituutioiden m¨a¨ar¨a¨a HA- kiteeksi. [22, 27, 34, 46]

4. Kollageenin kypsyys

Tyypin 1 kollageeni on suurin s¨aieproteiini luun orgaanisessa matriksissa, ja sill¨a on hyvin toistuva aminohapposekvenssi. Mineralisoituneissa kudoksissa, kuten

luussa, kollageenin erottuvimmat piirteet ovat molekyylin pakkausrakenne ja sen ristiliitoksien kemia. [7, 47] Luonnossa esiintyy seitsem¨an erilaista ristilii- tosta molekyylien v¨alill¨a, mutta n¨aist¨a vain kolme ovat pelkistyvi¨a. Kuitenkaan FTIR-spektroskopia ei pysty tunnistamaan kuin kahden tyyppisten kollagee- nin ristiliitoksien alueellisia jakautumia. Toinen n¨aist¨a ristiliitoksista on pelkis- t¨am¨at¨on kolmenarvoinen pyridinoliini (PYR) ja toinen pelkistyv¨a kaksiarvoi- nen dehydrodihydroksinorleusiini (deH-DHLNL).[7, 19, 41] Tutkittaessa kolla- geenia, mielenkiintoisimmat alueet IR-spektriss¨a ovat amidi I-kaistan alikaistat kohdilla 1660 cm⁻¹ ja 1690 cm⁻¹, sill¨a amidi I-kaista on erityisen herkk¨a mo- lekyylin sekundaarisille rakenteille. Luuparametri kertoo enemm¨an sekundaari- rakenteen muutoksista suhteessa mineralisaatioprosessiin eik¨a entsymaattisten ristiliitoksien muutoksista. N¨aiden absorptiokaistoilla olevien piikkien intensi- teettisuhde liittyy luun orgaaniseen matriksiin, joka edustaa luun pelkist¨am¨at- t¨omien eli kypsien ristiliitosten suhdetta pelkistyviin eli kypsym¨att¨omiin ristilii- toksiin, joten t¨am¨a luuparametri on herkk¨a kollageenin kypsyyden indikaattori.

[12, 48, 49, 50]

5. Vetyfosfaatin substituutio

FTIR-spektroskopialla ei kyet¨a havaitsemaan vetyfosfaatille tyypillist¨a kaistaa 560-530 cm⁻¹, mink¨a takia tietojen tuottamiseen tarvitaan useita erilaisia luu- parametreja. FTIR-tutkimuksissa onkin k¨aytetty erilaisia luuparametreja ar- vioimaan HPO²⁻₄ substituutiota HA-kiteess¨a. Er¨as tapa on arvioida HPO²⁻₄ substituutiota erilaisten suhteiden avulla perustuen alikaistoihin 1150-1100 cm⁻¹ v¨alill¨a. [51] Suositeltu tapa on laskea alikaistojen 1128 cm⁻¹ ja 1096 cm⁻¹ in- tensiteettien suhde, jossa kaista 1128 cm⁻¹ viittaa HPO²⁻₄ sis¨alt¨avien lajien l¨as- n¨aoloon ja kaista 1096 cm⁻¹ apatiittiin. [27, 34] T¨am¨a suhde edustaa HP O²⁻₄ -ionin mineralisoitumista kidehilaan, mik¨a on tyypillist¨a nuoremmalle mineraa- lille. T¨am¨an luuparametrin on osoitettu olevan k¨a¨ant¨aen verrannollinen kitei- syyteen, mik¨a viittaa luun uudelleenmuodostumisen aktiivisuuteen ja mineraa- lien liukenemiseen. [7, 19, 34]

4 Ty¨ on tavoitteet

FTIR-laitteistolla on mahdollista mitata erilaisilla mittausmenetelmill¨a samoja luu- parametrej¨a. Aikaisemmissa mittauksissa on havaittu, ett¨a FTIR-laite antaa erilais- ta spektritietoa erilaisista mittausmenetelm¨ast¨a riippuen (mosaiikkikuvaus vs. loka- lisoitu alue). T¨am¨a ilmi¨o esiintyy varsinkin luun¨aytteiss¨a alueilla, joissa on suuria vaihteluita absorbanssissa. T¨am¨an ty¨on tarkoituksena on tehd¨a vertailua luun pe- rusparametreist¨a n¨aiden kahden mittausmenetelm¨an v¨alill¨a, kun vaikutusta on my¨os leikkeen paksuudella. Lis¨aksi tarkoituksena on arvioida s¨adehoidon aiheuttamia muu- toksia luukudokseen perustuen m¨a¨aritettyihin luuparametreihin.

5 Materiaalit ja menetelm¨ at

5.1 N¨ aytteet ja niiden esivalmistelut

Kaikki potilasn¨aytteet oli ker¨atty alaleuan kulmahampaiden kohdilta hammasimplant- tileikkauksen yhteydess¨a. Leikkauksessa talteen otetut luun¨aytteet olivat noin 3.5 mm paksuisia ja 10 mm pituisia biopsioita. N¨aytteet s¨ail¨ottiin ensin 60%etanoliin ja pro- sessoitiin valamalla muoviin (polymetyylimetakrylaatti, PMMA). N¨ayteleikkeet oli leikattu 3 µm ja 2 µm paksuisiksi ohutleikkeiksi mikrotomilla (Polycut, Reichert- Jung, Wien, It¨avalta) ja asetettu pisaralla etanolia joko ZnSe- tai BaF₂ -ikkunalle FTIR-analyysia varten. Leikkeet muodostivat kolme erilaista tutkimusryhm¨a¨a, jois- sa jokaisessa oli kolme eri leikett¨a. Kontrolliryhm¨an leikkeet olivat potilailta, jotka olivat t¨aysin terveit¨a. Ryhm¨a 1 sis¨alsi leikkeet potilailta, joiden kasvain oli poistettu kirurgisesti, kun taas ryhm¨an 2 leikkeet olivat potilailta, joiden kasvainta oli hoidet- tu s¨adehoidolla. Potilaiden sy¨op¨akudos ei ole ollut otetun luubiopsian kohdalla, vaan esimerkiksi nen¨anielussa, kielen pohjalla tai muualla suussa. Kokonaiss¨ateilyannokset potilailla olivat 70Gy, 62,5Gy ja40Gy ja s¨ateilytekniikoina oli k¨aytetty joko inten- siteettimuokattua s¨adehoitoa (engl.intensity-modulated radiotion therapy, IMRT) tai kolmiulotteista konformaalista s¨adehoitoa (engl. three-dimensional conformal radia- tion therapy, 3D-CRT). Ryhm¨an 2 biopsiat olivat otettu 119, 198 tai 72 kuukauden j¨alkeen s¨adehoidosta. Taulukkoon 3 on koottu eri tutkimusryhmien tiedot. Kaikki po- tilaat olivat antaneet suostumuksensa osallistua tutkimukseen ja eettiset toimikunnat ovat hyv¨aksyneet ty¨on (Medisch Ethische Toetsingscommissie, Amsterdam UMC, si- jainti VUmc, Amsterdam, Alankomaat; 2011/220 ja Pohjois-Savon sairaanhoitopiirin tutkimuseettinen komitea; 754/2018)

Taulukko 3: Tutkimusryhmien tiedot

Kontrolliryhm¨a Ryhm¨a 1 Ryhm¨a 2

N¨aytteiden lukum¨a¨ar¨a 3 3 3

Sukupuoli (nainen/mies) 1/2 1/2 1/2

Ik¨ajakauma 33 - 67 60 - 69 66 - 80

5.2 FTIR -kuvantaminen

Ihmisen luuleikkeiden FTIR-spektroskooppiset mittaukset suoritettiin kuvantavalla FTIR-mikroskoopilla (Agilent Cary 620/670, Santa Clara, CA, USA), joka on esitetty kuvassa 7.

Jokainen ty¨on leike (9 kappaletta) mitattiin kahdella eri mittausmenetelm¨all¨a. Toi- sessa mittausmenetelm¨ass¨a, mosaiikkikuvausessa, mittaukset suoritettiin koko leik- keen alueelle, kun taas toisessa mittausmenetelm¨ass¨a n¨aytteest¨a rajattiin 200×200 µm kokoinen alue, joka kuvattiin. Lokalisoidut alueet valittiin mahdollisimman ho- mogeenisilt¨a tiivisluun alueilta.

Molemmilla mittausmenetelmill¨a mittaukset suorittettiin spektrialueelle 3800-800 cm⁻¹ transmission kuvaustilassa k¨aytt¨aen pikselin kokoa 5,5 µm, spektriresoluutio- ta 4 cm⁻¹, 8 skannausta ja 15-kertaista IR-objektiivia. Taustan mittaus suoritettiin puhtaalta ikkunalta k¨aytt¨aen samoja parametrej¨a kuin yll¨a kiinnitysalustan ominai-

todellisesta luuspektrist¨a. Suurimmalle osalle leikkeist¨a muovi (polymetyylimetakry- laatti, PMMA) -mittaus suoritettiin mahdollisimman sile¨alt¨a ja ehj¨alt¨a pelk¨an PMMA:n alueelta.

Kuva 7: Luuleikkeiden FTIR-spektrokooppiset mittaukset suoritettiin kuvan laitteel- la.

5.3 Spektrien data-analyysi

Spektrien esik¨asittelyt ja analyysit tehtiin spektrialueelle 2000-800 cm⁻¹ k¨aytt¨aen Matlab-ohjelmistoa (Matlab R2018b, Mathworks Corp., Brentwood, CA). Ennen spekt- rianalyysej¨a FTIR-absorbanssispektrit normalisoitiin k¨aytt¨am¨all¨a PMMA:ta (1730 cm⁻¹), mink¨a j¨alkeen PMMA-spektri v¨ahennettiin matemaattisesti luuspektrist¨a. Mo- saiikkimittauksissa datasta rajattiin pelk¨an PMMA:n alue, kun taas lokalisoidun alu- een mittauksissa jokaiselle leikkeelle PMMA mitattiin erikseen. Lis¨aksi spektrit kor- jattiin l¨aht¨otasolle.

Absorptiopiikin integroitu pinta-ala on suoraan verrannollinen molekyylin funk- tionaalisen ryhm¨an pitoisuuteen, joka aiheuttaa kyseisen kaistan. T¨aten on mahdol- lista approksimoida pinta-alan avulla leikkeess¨a olevan tietyn molekyylin konsentraa- tio yht¨al¨on (1) mukaisesti. [7, 19] Pinta-alan m¨a¨aritt¨amiseksi muodostettiin Matlab -koodi, joka etsi halutut indeksit ja laski t¨am¨an j¨alkeen pinta-alan perustuen trapetsi -menetelm¨a¨an. Samoin meneteltiin m¨a¨aritt¨aess¨a halutut indeksit intensiteettiarvojen laskemiseen.

Luun p¨a¨akomponentit ja niiden aineelliset ominaisuudet laskettiin hy¨odynt¨am¨all¨a tarkkojen absorptiopiikkien integroituja pinta-aloja ja intensiteettiarvoja. Luun mine- ralisaation analysoimiseksi FTIR-spektroskopialla laskettiin mineraali-matriksi suhde

M/M = A(1200 − 900) cm

A(1720 − 1585) cm

, (2)

miss¨a integroidut alueetA(1200−900)cm⁻¹jaA(1720−1585)cm⁻¹edustavat vastaa- vasti fosfaatin ja amidi I:n molaarisuuksia luussa. My¨os luun karbonaattipitoisuuden

analysoimiseksi hy¨odynnettiin absorptiopiikkien integroitujen alueiden suhteita

K/F = A(890 − 850) cm

A(1200 − 900) cm

, (3)

miss¨a alueet A(890−850)cm⁻¹ ja A(1200−900)cm⁻¹ liittyv¨at karbonaattiin ja fos- faattiin vastaavasti. Puolestaan luun mineraalin kypsyys/kiteisyys, kollageenin kyp- syys ja vetyfosfaatin substituutio analysoitiin laskemalla fosfaatti tai amidi I-kaistalla olevien kahden alikaistan intensiteettien suhde seuraavilla yht¨al¨oill¨a vastaavasti.

K/K = 1030 cm

1020 cm

(4)

KOL = 1660 cm

1690 cm

(5)

V F S = 1127 cm

1096 cm

. (6)

6 Tulokset

Luuleikkeiden biokemiallista koostumusta analysoitiin kahdella eri mittausmenetel- m¨all¨a kolmelle eri tutkimusryhm¨alle (kontrolli, sy¨op¨a, sy¨op¨a + s¨adehoito). Toises- sa mittausmenetelm¨ass¨a FTIR-spektrometrill¨a mitattiin koko leikkeen alue, kun taas toisessa mittausmenetelm¨ass¨a leikkeest¨a rajattiin pienempi alue mitattavaksi. Molem- milla mittausmenetelmill¨a mitattiin samat luuparametrit, jotka olivat mineralisaatio (M/M), karbonaattipitoisuus (K/F), mineraalin kypsyys/kiteisyys (K/K), kollagee- nin kypsyys (KOL) ja vetyfosfaatin substituutio (VFS).

6.1 Mittausmenetelm¨ a 1 - mosaiikkikuvaus

T¨ass¨a mittausmenetelm¨ass¨a jokaisesta 3 µm paksuisesta leikkeest¨a mitattiin FTIR- spektrometrill¨a koko alue. Kuvissa 8 - 10 on esitetty jokaisen leikkeen kaksi valittua aluetta, joihin data-analyysi suoritettiin. Alueet valittiin sattumanvaraisesti leikkeen alueelta. Kuvissa on my¨os n¨aht¨aviss¨a rajattu pelk¨an PMMA:n alue, jota tarvittiin PMMA:n vaikutusten poistamiseen todellisesta luuspektrist¨a datan esik¨asittelyss¨a.

Kuvat muodostettiin tyypin 1 kollageenin kaistan avulla (1660 cm⁻¹), sill¨a suurin osa luun orgaanisesta matriksista on tyypin 1 kollageenia.

Kuva 8: Kontrolliryhm¨an leikkeet. Jokaisessa leikkeess¨a on esitetty kaksi rajattua luualuetta, johon data-analyysi suoritettiin sek¨a rajattu pelk¨an PMMA:n alue, jo- ta hy¨odynnettiin spektrin esik¨asittelyss¨a. Sinert¨av¨at s¨avyt edustavat PMMA:ta ja punertavat s¨avyt itse leikett¨a.

Kuva 9: Ryhm¨an 1 (sy¨op¨a) leikkeet. Jokaisessa leikkeess¨a on esitetty kaksi rajattua luualuetta, johon data-analyysi suoritettiin sek¨a rajattu pelk¨an PMMA:n alue, jo- ta hy¨odynnettiin spektrin esik¨asittelyss¨a. Sinert¨av¨at s¨avyt edustavat PMMA:ta ja punertavat/kellert¨av¨at s¨avyt itse leikett¨a.

Kuva 10: Ryhm¨an 2 (sy¨op¨a + s¨adehoito) leikkeet. Jokaisessa leikkeess¨a on esitetty kaksi rajattua luualuetta, johon data-analyysi suoritettiin sek¨a rajattu pelk¨an PMMA:n alue, jota hy¨odynnettiin spektrin esik¨asittelyss¨a. Sinert¨av¨at s¨avyt edustavat PMMA:ta ja punertavat/kellert¨av¨at s¨avyt itse leikett¨a.

Data-analyysi suoritettiin leikkeiden rajatuille alueille ja yht¨al¨oiden (2)-(6) avulla laskettiin luuparametrit. Tulokset on esitetty taulukoissa 4- 6.

Taulukko 4: Kontrolliryhm¨an leikkeiden luuparametrit. Leikkeist¨a m¨a¨aritetyt luu- parametrit ovat mineralisaatio (M/M), karbonaattipitoisuus (K/F), mineraalin kyp- syys/kiteisyys (K/K), kollageenin kypsyys (KOL) ja vetyfosfaatin substituutio (VFS).

Arvot on laskettu yht¨al¨oill¨a (2)-(6) ja esitetty muodossa tulos ± keskihajonta.

M/M K/K K/F KOL VFS

Leike 1 3.273± 1.995 0.825± 0.508 0.008 ±0.005 1.418± 0.861 0.417 ±0.254 0.052± 0.407 0.015± 0.122 0.001 ±0.003 0.023± 0.184 0.011 ±0.086 Leike 2 1.073± 1.947 0.261± 0.475 0.003 ±0.005 0.484± 0.878 0.111 ±0.201 1.375± 1.775 0.410± 0.530 0.004 ±0.005 0.763± 0.985 0.193 ±0.249 Leike 3 1.097± 2.028 0.260± 0.480 0.002 ±0.004 0.473± 0.869 0.115 ±0.212 3.763± 2.110 0.903± 0.502 0.007 ±0.004 1.552± 0.859 0.383 ±0.212

Taulukko 5: Ryhm¨an 1 (sy¨op¨a) leikkeiden luuparametrit. Leikkeist¨a m¨a¨aritetyt luu- parametrit ovat mineralisaatio (M/M), karbonaattipitoisuus (K/F), mineraalin kyp- syys/kiteisyys (K/K), kollageenin kypsyys (KOL) ja vetyfosfaatin substituutio (VFS).

Arvot on laskettu yht¨al¨oill¨a (2)-(6) ja esitetty muodossa tulos ± keskihajonta.

M/M K/K K/F KOL VFS

Leike 1 0.183± 0.783 0.057± 0.246 0.001 ±0.002 0.104± 0.444 0.028 ±0.118 0.427± 1.024 0.152± 0.363 0.004 ±0.008 0.235± 0.562 0.096 ±0.229 Leike 2 0.602± 1.551 0.138± 0.355 0.002 ±0.004 0.226± 0.582 0.081 ±0.209 2.247± 2.611 0.442± 0.514 0.005 ±0.006 0.820± 0.953 0.219 ±0.254 Leike 3 3.860± 0.380 1.149± 0.038 0.010 ±0.002 2.106± 0.076 0.568 ±0.058 5.313± 0.399 1.147± 0.092 0.010 ±0.001 2.059± 0.152 0.480 ±0.038

Taulukko 6: Ryhm¨an 2 (sy¨op¨a + s¨adehoito) leikkeiden luuparametrit. Leikkeist¨a m¨a¨a- ritetyt luuparametrit ovat mineralisaatio (M/M), karbonaattipitoisuus (K/F), mine- raalin kypsyys/kiteisyys (K/K), kollageenin kypsyys (KOL) ja vetyfosfaatin substi- tuutio (VFS). Arvot on laskettu yht¨al¨oill¨a (2)-(6) ja esitetty muodossa tulos ± kes- kihajonta.

M/M K/K K/F KOL VFS

Leike 1 3.094± 2.226 0.754± 0.545 0.007 ±0.005 1.476± 1.062 0.297 ±0.214 4.011± 0.448 1.107± 0.103 0.010 ±0.001 2.163± 0.188 0.500 ±0.045 Leike 2 4.587± 0.287 1.151± 0.078 0.010 ±0.001 2.154± 0.121 0.500 ±0.028 4.426± 0.310 1.090± 0.073 0.012 ±0.004 1.967± 0.158 0.573 ±0.060 Leike 3 3.095± 1.825 0.858± 0.507 0.007 ±0.004 1.608± 0.948 0.372 ±0.219 3.079± 0.400 1.111± 0.053 0.010 ±0.002 1.890± 0.069 0.672 ±0.069

Jokaista luuparametri¨a havainnollistettiin my¨os visuaalisesti hyperspektrikuvina sek¨a muutaman hyperspektrikuvan pikselin muodostunut spektri esitettiin. Saman mittauksen visuaaliset kuvat k¨aytt¨aytyiv¨at samalla tavalla eri parametrien v¨alill¨a, jo- ten tulokset on esitetty vain M/M-parametrin avulla. Visuaalisiin kuviin on valittu jokaisesta leikkeest¨a huonompi mittaustulos, vaikka suoritettujen mittauksien v¨alill¨a kyseisest¨a leikkeest¨a ei ollut paljon eroa (paremmassa mittauksessa oli muutama pik-

on esitetty kuvassa11. Jokaisen ryhm¨an leikkeest¨a valittiin sattumanvaraisesti yhden pikselin spektri, joka esitettiin. Pikselien spektrit on esitetty kuvissa 12- 14.

Kuva 11: M/M-parametrin visuaaliset kuvat. Jokaisesta leikkeest¨a on valittu huonom- pi mittaus. Sininen arvo kuvan pikseliss¨a viittaa, ett¨a mittaus on ep¨aonnistunut, kun taas muun v¨arinen pikseli kertoo mittauksen onnistuneen kyseisen pikselin kohdalla.

Kuva 12: Kontrolliryhm¨an jokaisen leikkeen hyperspektrikuvasta valittiin sattuman- varaisesti yhden pikselin spektri.

Kuva 13: Ryhm¨an 1 (sy¨op¨a) jokaisen leikkeen hyperspektrikuvasta valittiin sattuman- varaisesti yhden pikselin spektri.

Kuva 14: Ryhm¨an 2 (sy¨op¨a + s¨adehoito) jokaisen leikkeen hyperspektrikuvasta valit- tiin sattumanvaraisesti yhden pikselin spektri.

6.2 Mittausmenetelm¨ a 2 - lokalisoidun alueen mittaus

T¨ass¨a mittausmenetelm¨ass¨a jokaisesta noin 2µm paksuisesta leikkeest¨a valittiin kaksi mahdollisimman homogeenist¨a 200×200 µm kuvattavaa aluetta sattumanvaraisesti.

Jokaiselle mittaukselle mitattiin PMMA alueelta, jossa muovi oli ehj¨a ja sile¨a. T¨am¨a v¨ahennettiin spektrist¨a datan esik¨asittelyss¨a. Esimerkkialue on esitetty kuvassa 15.

Kuva 15: Leikkeen kuvattava alue. Mittauksia varten jokaisesta leikkeest¨a etsittiin kaksi rajattua 200×200 µm homogeenist¨a aluetta, jotka mittattiin FTIR:ll¨a.

Data-analyysi suoritettiin koko mittauksesta saadulle datalle ja yht¨al¨oiden (2)-(6) avulla laskettiin luuparametrit. Ryhm¨an 2 toiselle leikkeelle ei pystynyt suorittamaan kuin yhden mittauksen, sill¨a n¨ayte ei pysynyt ikkunalla. Tulokset on esitetty taulu- koissa 7- 9.

Taulukko 7: Kontrolliryhm¨an leikkeiden luuparametrit. Leikkeist¨a m¨a¨aritetyt luu- parametrit ovat mineralisaatio (M/M), karbonaattipitoisuus (K/F), mineraalin kyp- syys/kiteisyys (K/K), kollageenin kypsyys (KOL) ja vetyfosfaatin substituutio (VFS).

Arvot on laskettu yht¨al¨oill¨a (2)-(6) ja esitetty muodosssa tulos ±keskihajonta.

M/M K/K K/F KOL VFS

Leike 1 4.119± 0.165 1.153± 0.053 0.010 ±0.001 2.347± 0.089 0.502 ±0.012 3.810± 0.280 1.189± 0.075 0.009 ±0.001 2.198± 0.134 0.569 ±0.042 Leike 2 4.216± 0.336 1.190± 0.029 0.009 ±0.002 2.158± 0.093 0.543 ±0.032 4.665± 0.413 1.192± 0.036 0.009 ±0.002 2.061± 0.103 0.524 ±0.025 Leike 3 5.649± 0.192 1.161± 0.047 0.009 ±0.001 2.173± 0.053 0.467 ±0.017 5.184± 0.386 1.175± 0.086 0.009 ±0.001 2.177± 0.128 0.463 ±0.026

Taulukko 8: Ryhm¨an 1 (sy¨op¨a) leikkeiden luuparametrit. Leikkeist¨a m¨a¨aritetyt luu- parametrit ovat mineralisaatio (M/M), karbonaattipitoisuus (K/F), mineraalin kyp- syys/kiteisyys (K/K), kollageenin kypsyys (KOL) ja vetyfosfaatin substituutio (VFS).

Arvot on laskettu yht¨al¨oill¨a (2)-(6) ja esitetty muodosssa tulos ±keskihajonta.

M/M K/K K/F KOL VFS

Leike 1 3.589± 0.237 1.198± 0.026 0.010 ±0.002 1.992± 0.112 0.564 ±0.017 4.240± 0.117 1.216± 0.030 0.009 ±0.002 2.239± 0.049 0.447 ±0.008 Leike 2 3.875± 0.219 1.227± 0.026 0.007 ±0.002 2.197± 0.056 0.563 ±0.019 3.613± 0.150 1.231± 0.026 0.007 ±0.002 2.087± 0.045 0.605 ±0.018 Leike 3 5.039± 0.275 1.215± 0.032 0.010 ±0.004 1.938± 0.055 0.485 ±0.021 5.447± 0.393 1.223± 0.032 0.008 ±0.003 1.894± 0.048 0.478 ±0.013

Taulukko 9: Ryhm¨an 2 (sy¨op¨a + s¨adehoito) leikkeiden luuparametrit. Leikkeist¨a m¨a¨a- ritetyt luuparametrit ovat mineralisaatio (M/M), karbonaattipitoisuus (K/F), mine- raalin kypsyys/kiteisyys (K/K), kollageenin kypsyys (KOL) ja vetyfosfaatin subs- tituutio (VFS). Arvot on laskettu yht¨al¨oill¨a (2)-(6) ja esitetty muodosssa tulos ± keskihajonta.

M/M K/K K/F KOL VFS

Leike 1 4.990± 0.110 1.197± 0.038 0.010 ±0.001 1.946± 0.028 0.497 ±0.012 5.091± 0.134 1.192± 0.035 0.009 ±0.002 1.909± 0.029 0.488 ±0.010 Leike 2 5.797± 0.131 1.181± 0.049 0.011 ±0.002 1.932± 0.029 0.436 ±0.010

- - - - -

Leike 3 4.510± 0.397 1.110± 0.052 0.010 ±0.002 1.869± 0.125 0.495 ±0.016 5.537± 0.309 1.194± 0.072 0.011 ±0.001 1.881± 0.095 0.473 ±0.047

My¨os t¨ass¨a mittausmenetelm¨ass¨a jokaista luuparametri¨a havainnollistettiin visu- aalisesti kuten mosaiikkimittauksien tapauksessa sek¨a muutaman hyperspektrikuvan pikselin muodostunut spektri esitettiin kuten mosaiikkimittauksien kohdalla. Visuaa- lisiin kuviin valittiin sattumanvaraisesti vain toinen mittaus, paitsi kahdelle kontrolli- ryhm¨an leikkeelle valittiin huonommin onnistunut mittaus. M/M-parametrin visuaa- liset kuvat jokaiselle mittaukselle on esitetty kuvassa16. Pikselien spektrit on esitetty kuvissa 17- 19.

Kuva 16: M/M-parametrin visuaaliset kuvat. Kontrolliryhm¨an kahdesta leikkeest¨a on valittu huonommin onnistunut mittaus, mutta muuten valittiin sattumanvaraisesti vain toinen leikkeen mittauksista. Kontrolliryhm¨an kahdessa leikkeess¨a sininen pik- selin arvo viittaa ep¨aonnistuneeseen mittaukseen kyseisen pikselin kohdalla, muissa leikkeiss¨a pikselin v¨ari antaa arvon M/M-parametrille.

Kuva 17: Kontrolliryhm¨an jokaisen leikkeen hyperspektrikuvasta valittiin sattuman- varaisesti yhden pikselin spektri.

Kuva 18: Ryhm¨an 1 (sy¨op¨a) jokaisen leikkeen hyperspektrikuvasta valittiin sattuman- varaisesti yhden pikselin spektri.

Kuva 19: Ryhm¨an 2 (sy¨op¨a + s¨adehoito) jokaisen leikkeen hyperspektrikuvasta valit- tiin sattumanvaraisesti yhden pikselin spektri.

6.3 Menetelmien vertailu

Taulukoista 4-6ja7- 9on laskettu jokaiselle luuparametrille keskiarvo. Tulokset on esitetty taulukossa10.

Taulukko 10: Molemmilla menetelmill¨a on laskettu keskiarvo jokaisen ryhm¨an luupa- rametreille taulukoiden4 -6ja 7-9pohjalta. Tulokset on esitetty muodossa tulos ± keskihajonta ja kyseisen ryhm¨an/luuparametrin ylempi arvo on saatu koko leikkeen mittauksesta ja alempi arvo lokalisoidun alueen mittauksesta.

Luuparametri Kontrolliryhm¨a Ryhm¨a 1 (sy¨op¨a) Ryhm¨a 2 (sy¨op¨a + s¨adehoito) M/M 1.772±1.710 2.105 ±1.710 3.715 ±0.916

4.607±0.295 4.301 ±0.232 5.185 ±0.216 K/K 0.446±0.436 0.514 ±0.268 1.012 ±0.227 1.177±0.054 1.218 ±0.029 1.175 ±0.049 K/F 0.004±0.004 0.005 ±0.004 0.009 ±0.003 0.009±0.001 0.009 ±0.003 0.010 ±0.002 KOL 0.786±0.773 0.925 ±0.462 1.876 ±0.424 2.186±0.100 2.058 ±0.061 1.907 ±0.061 VFS 0.205±0.202 0.245 ±0.151 0.486 ±0.106 0.511±0.026 0.524 ±0.016 0.478 ±0.019

Taulukon 10tulokset on havainnollistettu my¨os visuaalisesti kuvassa 20.

Kuva 20: Taulukon 10tulokset on havainnollistettu visuaalisesti.

Molemmilla mittausmenetelmill¨a mitattiin samasta kontrolliryhm¨an leikkeest¨a 3 spektrit, jotka on esitetty kuvissa 21 ja 22. Kuvassa 21 on esitetty pikseleist¨a saa- dut keskiarvospektrit, kun taas kuvaan 22 valittiin sattumanvaraisesti molemmista mittauksista kahden eri pikselin spektrit.

Kuva 21: Molemmilla mittausmenetelmill¨a laskettiin keskiarvospektrit samasta kont- rolliryhm¨an leikkeest¨a.

Kuva 22: Samasta kontrolliryhm¨an leikkeest¨a molemmilla mittausmenetelmill¨a ha- vainnollistettiin kahden pikselin spektrit, jotka valittiin sattumanvaraisesti.