6.4 DQB1- GEENIN PROMOOTTORIN METYLAATIO
6.4.3 Muutokset metylaatiossa gluteenialtistuksen jälkeen
Hypoteesina oli, että gluteenille altistuminen vähentäisi DQB1-geenin promoottorialu-een metylaatiota. Vertailtavia näytteitä hoidolla olon ajalta sekä glutpromoottorialu-eenialtistuksen jäl-keen oli molempia kolme. Lisäksi mukana oli kaksi sellaista gluteenialtistuksen jälkeis-tä näytetjälkeis-tä, joilla ei ollut vertailunäytetjälkeis-tä ennen altistusta. Vertailtavien näytteiden kaik-ki CpG-dinukleotidit olivat metyloitumattomia, joten eroja ei ollut havaittavissa. Sen sijaan yksi ilman vertailukohdetta oleva gluteenialtistuksen jälkeinen näyte oli metyloi-tunut kohdassa +103. Ei voida kuitenkaan sanoa, johtuuko tämä metylaatio gluteenial-tistuksesta, koska vertailukohdetta ei ole.
7 JOHTOPÄÄTÖKSET
Tämän tutkimuksen yhtenä tavoitteena oli tutkia DQ2-positiivisten keliaakikkojen ja ei-keliaakikkojen DQ2-geenien (DQB1 ja DQA1) promoottorialueiden metylaatiostatusta.
Tätä varten täytyi kuitenkin ensin identifioida näiden geenien promoottorialueet sekä niissä mahdollisesti olevat CpG-saarekkeet sekä pystyttää menetelmä metylaatiostatuk-sen tutkimiseen.
DQB1-geenin promoottorialueelta löytyi yksi CpG-saareke, mutta DQA1-geenistä ei löytynyt yhtään. Lisäksi DQA1-geenille PCR-menetelmää ei saatu toimimaan todennä-köisesti alukkeiden liian erilaisten Ta-arvojen vuoksi. Näin ollen metylaatiota tutkittiin vain DQB1-geenin promoottorin osalta bisulfiittisekvensoinnin avulla. Näytteitä oli yhteensä vain seitsemältä eri henkilöltä, joten tilastollisia analyysejä ei tuloksista voitu tehdä. Kaikissa kolmessa vertailuryhmässä eroavaisuuksia löytyi vain yksi jokaisesta eli lymfosyytti- vs. kokoverinäyte-, ei-keliaakikko vs. keliaakikko- ja ennen gluteenialtis-tusta vs. gluteenialtistuksen jälkeen -vertailuryhmistä. Ainoa mielenkiintoa herättävä tulos oli, että metyloitunut CpG-dinukleotidi, joka löytyi kahdesta näytteestä, oli kum-massakin samassa kohdassa. Näin ollen on mahdollista, että metylaatiolla on jonkinlai-nen epigeneettijonkinlai-nen rooli keliakiassa. Tätä voisi tutkia tulevaisuudessa isommalla näy-temäärällä, jotta tulokset olisivat luotettavia sekä tilastollisesti analysoitavissa. Jatkotut-kimuksissa tutkittavien näytteiden genotyyppi täytyisi myös selvittää sekvensoimalla kymmenen kloonia per näyte, jotta mahdolliset heterotsygotiasta johtuvat virheet saatai-siin rajattua pois.
Lisäksi tulevaisuudessa metylaatiostatusta voisi tutkia myös DQA1-geenin osalta, mikä tässä tutkimuksessa täytyi rajata pois käytettävissä olevan rajallisen ajan vuoksi. CpG-saarekkeita voisi etsiä molempien geenien kohdalla myös muilla ohjelmilla ja algorit-meilla, ja yksi vaihtoehto olisi tutkia mahdollisia intrageenisia saarekkeita, koska nii-denkin metylaatiostatus voi vaikuttaa geeniekspressioon. Ja jos mahdollista, jatkotutki-muksia voisi tehdä myös käyttäen eri solulähteitä eli esimerkiksi ohutsuolen dendriit-tisoluja ja makrofageja, jotka keliakiassa ilmentävät DQ2-molekyylejä.
LÄHDELUETTELO
Adamovic S, Amundsen SS, Lie BA, Hellqvist Å, Gudjónsdóttir AH, Ek J, Nilsson S, Wahlström J, Ascher H, Sollid LM, Naluai ÅT. Fine mapping study in Scandinavian families suggests association between coeliac disease and haplotypes in chromosome region 5q32. Tissue Antigens 2007; 71:27–34.
Antequera F. Structure, function and evolution of CpG island promoters. CMLS, Cellu-lar and MolecuCellu-lar Life Sciences 2003; 60:1647–1658.
Barros SP, Offenbacher S. Epigenetics: Connecting environment and genotype to phe-notype and disease. Journal of Dental Research 2009; 88(5):400–408.
Beaty JS, West KA, Nepom GT. Functional effects of a natural polymorphism in the transcriptional regulatory sequence of HLA-DQB1. Molecular and Cellular Biology 1995; 15(9):4771–4782.
van Belzen MJ, Vrolijk MM, Meijer JWR, Crusius JBA, Pearson PL, Sandkuijl LA, Houwen RHJ, Wijmenga C. A genomewide screen in a four-generation Dutch family with celiac disease: evidence for linkage to chromosomes 6 and 9. American Journal of Gastroenterology 2004; 99:466–471.
van Belzen MJ, Meijer JWR, Sandkuijl LA, Bardoel AFJ, Mulder CJJ, Pearson PL, Houwen RHJ, Wijmenga C. A major non-HLA locus in celiac disease maps to chromo-some 19. Gastroenterology 2003; 125:1032–1041.
Bock C, Reither S, Mikeska T, Paulsen M, Walter J, Lengauer T. BiQ Analyzer: visu-alization and quality control for DNA methylation data from bisulfite sequencing. Bio-informatics 2005; 21(21):4067–4068.
Boss JM. Regulation of transcription of MHC class II genes. Current Opinion in Immu-nology 1997; 9:107–113.
Boyes J, Bird A. Repression of genes by DNA methylation depends on CpG density and promoter strength: evidence for involvement of a methyl-CpG binding protein. The EMBO Journal 1992; 11(1):327–333.
Brown JA, Rogers EM, Boss JM. The MHC class II transactivator (CIITA) requires conserved leucine charged domains for interactions with the conserved W box promoter element. Nucleic Acids Research 1998; 26(18):4128–4136.
Caillat-Zucman S. Molecular mechanisms of HLA association with autoimmune dis-eases. Tissue Antigens 2008; 73:1–8.
Choi JK, Bae J-B, Lyu J, Kim T-Y, Kim Y-J. Nucleosome deposition and DNA methy-lation at coding region boundaries. Genome Biology 2009; 10:R89.
Christensen BC, Houseman EA, Marsit CJ, Zheng S, Wrensch MR, Wiemels JL, Nel-son HH, Karagas MR, Padbury JF, Bueno R, Sugarbaker DJ, Yeh R-F, Wiencke JK, Kelsey KT. Aging and environmental exposures alter tissue-specific DNA methylation dependent upon CpG island context. PLoS Genetics 2009; 5(8):e1000602.
Cooney CA, Dave AA, Wolff GL. Maternal methyl supplements in mice affect epige-netic variation and DNA methylation. The Journal of Nutrition 2002; 132:2393–2400.
Cross SH, Bird AP. CpG islands and genes. Current Opinion in Genetics and Develop-ment 1995; 5:309–314.
Curradi M, Izzo A, Badaracco G, Landsberger N. Molecular mechanisms of gene si-lencing mediated by DNA methylation. Molecular and Cellular Biology 2002;
22(9):3157–3173.
Djilali-Saiah I, Schmitz J, Hammoud-Harfouch E, Mougenot J-F, Bach J-F, Caillat-Zucman S. CTLA-4 gene polymorfism is associated with predisposition to coeliac dis-ease. Gut 1998; 43:187–189.
Docherty SJ, Davis OSP, Haworth CMA, Plomin R, Mill J. Bisulfite-based epityping on pooled genomic DNA provides an accurate estimate of average group DNA methylation.
Epigenetics & Chromatin 2009; 2:3.
van den Elsen PJ, Holling TM, Kuipers HF, van der Stoep N. Transcriptional regulation of antigen presentation. Current Opinion in Immunology 2004; 16:67–75.
Fallang L-E, Bergseng E, Hotta K, Berg-Larsen A, Kim C-Y, Sollid LM. Differences in the risk of celiac disease associated with HLA-DQ2.5 or HLA-DQ2.2 are related to sus-tained gluten antigen presentation. Nature Immunology 2009; 10:1096–1101.
Feil R. Environmental and nutritional effects on the epigenetic regulation of genes. Mu-tation Research 2006; 600:46–57.
Frommer M, McDonald LE, Millar DS, Collis CM, Watt F, Grigg GW, Molloy PL, Paul CL. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. PNAS 1992; 89:1827–1831.
Green PHR, Jabri B. Celiac disease. Annual Review of Medicine 2006; 57:207–221.
Grolleau-Julius A, Ray D, Yung RL. The role of epigenetics in aging and autoimmunity.
Clinical Reviews in Allergy & Immunology 2009.
Grunau C, Clark SJ, Rosenthal A. Bisulfite genomic sequencing: systemic investigation of critical experimental parameters. Nucleic Acids Research 2001; 29(13):e65.
Heap GA, van Heel DA. Genetics and pathogenesis of coeliac disease. Seminars in Im-munology 2009; 21:346–354.
Heijmans BT, Tobi EW, Stein AD, Putter H, Blauw GJ, Susser ES, Slagboom PE, Lumey LH. Persistent epigenetic differences associated with prenatal exposure to fam-ine in humans. PNAS 2008; 105(44):17046–17049.
Hernandez L, Green PH. Extraintestinal manifestations of celiac disease. Current Gas-troenterology Reports 2006; 8:383–389.
Hewagama A, Richardson B. The genetics and epigenetics of autoimmune diseases.
Journal of Autoimmunity 2009; 33:3–11.
Hirst M, Marra MA. Epigenetics and human disease. The International Journal of Bio-chemistry & Cell Biology 2009; 41:136–146.
Hubé F, Reverdiau P, Iochmann S, Gruel Y. Improved PCR method for amplification of GC-rich DNA sequences. Molecular Biotechnology 2005; 31:81–84.
Hunt KA, Zhernakova A, Turner G, Heap GAR, Franke L, Bruinenberg M, Romanos J, Dinesen LC, Ryan AW, Panesar D, Gwilliam R, Takeuchi F, McLaren WM, Holmes GKT, Howdle PD, Walters JRF, Sanders DS, Playford RJ, Trynka G, Mulder CJJ, Mearin ML, Verbeek WHM, Trimble V, Stevens FM, O’Morain C, Kennedy NP, Kel-leher D, Pennington DJ, Strachan DP, McArdle WL, Mein CA, Wapenaar MC, Delou-kas P, McGinnis R, McManus R, Wijmenga C, van Heel DA. Newly identified genetic risk variants for celiac disease related to the immune response. Nature Genetics 2008;
40:395–402.
Illingworth RS, Bird AP. CpG islands – ‘A rough guide’. FEBS Letters 2009;
583:1713–1720.
Jabri B, Sollid LM. Tissue-mediated control of immunopathology in coeliac disease.
Nature Reviews Immunology 2009; 9(12):858–870.
Jiang Y, Bressler J, Beaudet AL. Epigenetics and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics 2004; 5:479–510.
Jones PA, Takai D. The role of DNA methylation in mammalian epigenetics. Science 2001; 293: 1068–1070.
Jones PA. The DNA methylation paradox. Trends in Genetics 1999; 15:34–37.
Kaukinen K. Miten keliakia todetaan? Kirjassa: Mäki M, Collin P, Kekkonen L, Visa-korpi J, Vuoristo M, toim. Keliakia. Duodecim. Keliakialiitto. Helsinki; 2006, s. 56.
Kumánovics A, Takada T, Fischer Lindahl K. Genomic organization of the mammalian MHC. Annual Review of Immunology 2003; 21:629–657.
Lennartsson A, Ekwall K. Histone modification patterns and epigenetic codes. Bio-chimica et Biophysica Acta 2009; 1790:863–868.
Li LC, Dahiya R. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics 2002; 18(11):1427–1431.
Lorincz M, Dickerson DR, Schmitt M, Groudine M. Intragenic DNA methylation alters chromatin structure and elongation efficiency in mammalian cells. Nature Structural &
Molecular biology 2004; 11(11):1068–1075.
Louka AS, Sollid LM. HLA in coeliac disease: Unravelling the complex genetics of a complex disorder. Tissue Antigens 2003; 61:105–117.
Megiorni F, Mora B, Bonamico M, Barbato M, Nenna R, Maiella G, Lulli P, Mazzili M.C. HLA-DQ and risk gradient for celiac disease. Human Immunology 2009; 70:55–
59.
Morris AC, Spangler WE, Boss JM. Methylation of class II trans-activator promoter IV:
A novel mechanism of MHC class II gene control. The Journal of Immunology 2000;
164:4143–4149.
Murayama A, Sakura K, Nakama M, Fujita E, Tateishi Y, Wang Y, Ushijima T, Baba T, Shibuya K, Shibuya A, Kawabe Y-I, Yanagisawa J. A specific CpG site demethylation in the human interleukin 2 gene promoter is an epigenetic memory. The EMBO Journal 2006; 25:1081–1092.
Murphy SP, Choi JC, Holtz R. Regulation of major histocompatibility complex class II gene expression in trophoblast cells. Reproductive Biology and Endocrinology 2004; 2:
52.
Murray JA, Moore SB, van Dyke CT, Lahr BD, Dierkhising RA, Zinsmeister AR, Mel-ton III LJ, Kroning CM, El-Yousseff M, Czaja AJ. HLA DQ gene dosage and risk and severity of celiac disease. Clinical Gastroenterology and Hepatology 2007; 5:1406–
1412.
Mäki M. Kuinka keliakia syntyy? Kirjassa: Mäki M, Collin P, Kekkonen L, Visakorpi J, Vuoristo M, toim. Keliakia. Duodecim. Keliakialiitto. Helsinki; 2006, ss. 17–24.
Qiao S-W, Sollid LM, Blumberg RS. Antigen presentation in celiac disease. Current Opinion in Immunology 2009; 21:111–117.
Radosevich M, Ono SJ. Novel mechanisms of class II major histocompatibility complex gene regulation. Immunologic Research 2003; 27(1):85–105.
Reith W, Siegrist C-A, Durand B, Barras E, Mach B. Function of major histocompati-bility complex class II promoters requires cooperative binding between factors RFX and NF-Y. PNAS 1994; 91:554–558.
Renaudineau Y. The revolution of epigenetics in the field of autoimmunity. Clinical Reviews in Allergy & Immunology 2009.
Richardson B. Primer: epigenetics of autoimmunity. Nature Clinical Practice Rheuma-tology 2007; 3:521–527.
Shen L, Kondo Y, Guo Y, Zhang J, Zhang L, Ahmed S, Shu J, Chen X, Waterland RA, Issa J-PJ. Genowide profiling of DNA methylation reveals a class of normally me-thylated CpG island promoters. PLoS Genetics 2007; 3(10):e181.
Shiina T, Hosomichi K, Inoko H, Kulski JK. The HLA genomic loci map: expression, interaction, diversity and disease. Journal of Human Genetics 2009; 54:15–39.
Sollid LM. Coeliac disease: Dissecting a complex inflammatory disorder. Nature Re-views Immunology 2002; 2:647–655.
Vaissière T, Sawan C, Herceg Z. Epigenetic interplay between histone modification and DNA methylation in gene silencing. Mutation Research 2008; 659:40–48.
Warnecke PM, Stirzaker C, Song J, Grunau C, Melki JR, Clark SJ. Identification and resolution of artefacts in bisulfite sequencing. Methods 2002; 27:101–107.
Weber M, Hellmann I, Stadler MB, Ramos L, Pääbo S, Rebhan M, Schübeler D. Distri-bution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation in the human genome. Nature Genetics 2007; 39(4):457–466.
Wilson AG. Epigenetic regulation of gene expression in the inflammatory response and relevance to common diseases. Journal of Periodontology 2008; 79(8):1514–1519.
Wolfe AP, Matzke MA. Epigenetics: regulation through repression. Science 1999; 286:
481–486.
Wolff GL, Kodell RL, Moore SR, Cooney CA. Maternal epigenetics and methyl sup-plements affect agouti gene expression in Avy/a mice. The FASEB Journal 1998;
12:949–957.
Wolters VM, Wijmenga C. Genetic backround of celiac disease and its clinical implica-tions. American Journal of Gastroenterology 2008; 103:190–195.
Zhao J, Sun BK, Erwin JA, Song J-J, Lee JT. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X-chromosome. Science 2008; 322(5902): 750–756.
Zhao Z, Han L. CpG islands: Algorithms and applications in methylation studies. Bio-chemical and Biophysical Research Communications 2009; 382:643–645.