DNA:n metylaatio

Nisäkkäillä suurin osa genomin CpG-dinukleotideista on kemiallisesti modifioitunut siten, että metyyliryhmä on kovalenttisesti kiinni sytosiinirenkaan C5-asemassa. (Kuva 2.5.) Metyylisytosiineja löytyy kaikkialta genomista; proteiineja koodaavilta alueilta, endogeenisistä toistojaksoalueilta sekä transposoneista, ja ne aiheuttavat transkription repressiota. Metyylisytosiinit kuitenkin deaminoituvat spontaanisti tymiineiksi, mikä on johtanut dinukleotidien mutatoitumisen TpG:ksi ja CpA:ksi. Tämän vuoksi CpG-dinukleotidien määrä genomissa on pienempi, mitä odotusarvon perusteella voisi olettaa (21 % odotusarvosta). (Cross & Bird, 1995; Illingworth & Bird, 2009.)

Kuva 2.5. DNA:n metylaatiossa CG-dinukleotidin sytosiinin 5’-asemaan on kovalentti-sesti liittynyt metyyliryhmä. (Mukaillen Barros & Offenbacher, 2009.)

DNA:n metylaatiosta vastaavat de novo- ja ylläpitometyylitransferaasit. Alkionkehityk-sen aikaisessa vaiheessa DNA:n metylaatiopohjan muodostumisesta vastaavat de novo-metyylitransferaasit Dnmt3a ja -3b. Ylläpitometyylitransferaasi Dnmt1 sen sijaan vastaa metylaation levityksestä ja ylläpidosta solusukupolvien välillä. (Vaissière ym., 2008.) DNA:n metylaatio on suorin epigeneettinen mekanismi, jolla solut pystyvät säilyttä-mään geenirepression solujen jakautuessa. Symmetrisesti metyloituneilla CpG-dinukleotideilla on yksi metyylisytosiini kummassakin DNA-kaksoisjuosteessa repli-kaation jälkeen. DNA-synteesin jälkeen hemimetyloitunut CpG-dinukleotidi metyloi-daan nopeasti noin minuutissa. (Wolfe & Matzke, 1999.) (Kuva 2.6.) Synteesin jälkei-nen metyyliryhmän lisäys sytosiineihin muuttaa DNA:n isomman uurteen (major groo-ve) muotoa ja nämä DNA:n epigeneettiset markkerit kopioituvat edelleen syntetisoidun DNA:n kromatiinirakenteeseen. (Jones & Takai, 2001.) DNA:n metylaatiolla on tärkeä rooli normaalissa solun toiminnassa ja poikkeava metylaatioprofiili voi osaltaan vaikut-taa eri sairauksien syntyyn ihmisillä (Wilson, 2008).

Kuva 2.6. DNA:n metylaatiostatuksen periytyminen. (Mukaillen www.web-books.com/MoBio/Free/Ch7F2.htm, 6.10.2009.)

Metylaatio vaikuttaa proteiinien ja DNA:n vuorovaikutukseen, mikä johtaa kromatiinin rakenteen muutoksiin. Lopputuloksen kannalta kriittisintä on se, missä kohtaa geenise-kvenssiä metylaatiomuutos tapahtuu suhteessa transkription aloituskohtaan. (Docherty

ym., 2009; Jones & Takai, 2001.) Geenien säätelyalueilla olevat metyloituneet sytosiinit häiritsevät transkriptiotekijöiden sitoutumista promoottorialueelle sekä saavat aikaan metyyliryhmiä sitovien proteiinien sitoutumisen metyloituneisiin CpG-dinukleotideihin.

Nämä metyyliryhmiä sitovat proteiinit houkuttelevat paikalle histonideasetylaaseja, jot-ka deasetyloivat histoniproteiineja, jolloin nukleosomit tiivistyvät ja geenien toiminta hiljenee. (Docherty ym., 2009; Wilson, 2008.)

2.4.3.1 CpG-saarekkeet

CpG-saarekkeet ovat tavallisesti metyloitumattomia 1-2 kiloemäksen pituisia alueita DNA:ssa, jotka yhdessä kattavat noin 2 % genomista. Kaikki geenit huomioon ottaen, 60–70 % sisältää niiden 5’-puolella CpG-saarekkeita, jotka useimmiten kattavat pro-moottorin, transkription aloituskohdan sekä ensimmäisen eksonin. CpG-saarekkeiden G+C-pitoisuus (60–70 %) on suurempi kuin muualla genomissa (40 %) ja niissä CpG-dinukleotidien tiheys on suurempi. (Cross & Bird, 1995; Illingworth & Bird, 2009.) Kaikkien jatkuvasti ilmennettävien ylläpitogeenien promoottoreissa on CpG-saarekkeita ja lisäksi noin puolet kudosspesifisten geenien promoottereista sisältää CpG-saarekkeita (Antequera, 2003).

CpG-saarekkeita löytyy promoottorialueiden lisäksi myös geenien koodaavilta alueilta.

Esimerkiksi geenissä APOE on sisäinen CpG-saareke, joka kattaa eksonin 4. Intrageeni-siä CpG-saarekkeita on yleensä niissä geeneissä, joiden ekspressio on rajoittuneempaa.

(Jones, 1999.) Intrageeniset CpG-saarekkeet voivat itse asiassa sisältää sellaisia tran-skription aloituskohtia, joita ei ole vielä identifioitu. On mahdollista, että näitä ”ylimää-räisiä” promoottoreita hyödynnetään hyvin kudosspesifisellä tavalla. Useat transkriptit alkavat intrageenisistä CpG-saarekkeista, ja niiden on huomattu ilmentyvän tiettyjen kehitysvaiheiden aikana. (Illingworth & Bird, 2009.)

Suurin osa CpG-saarekkeita sisältävistä promoottoreista pysyy metyloitumattomana jopa niissä solutyypeissä, joissa kyseisiä geenejä ei ilmennetä ollenkaan (Weber ym., 2007). Syytä, miksi useimmat promoottorialueiden CpG-saarekkeet pysyvät metyloitu-mattomina laajamittaisesta de novo -metylaatiosta huolimatta varhaisen alkionkehityk-sen aikana, ei täysin tiedetä. Todennäköisin selitys on se, että sitoutuneet perustran-skriptiotekijät vievät tilan eli muodostavat steerisen esteen Dnmt:n sitoutumiselle.

(Ku-va 2.7.) Tätä vaihtoehtoa tukevat tutkimustulokset globiinigeenien ilmentymisestä hii-ren alkionkehityksen aikana. α-globiinia, jonka promoottori sisältää CpG-saarekkeen, transkriptoidaan alkiossa, kun taas transkriptionaalisesti hiljainen β-globiini, jonka pro-moottori ei sisällä CpG-saareketta, ei ilmenny alkiossa. Hiiren embryogeneesin tarkem-pi analyysi osoitti, että 93 % tutkituista ekspressoiduista geeneistä sisälsivät promootto-reissaan CpG-saarekkeen. Näin ollen CpG-saarekkeet voivat olla transkriptiomekanis-min aikaansaamia jälkiä alkionkehityksen de novo -metylaation aikana. (Illingworth &

Bird, 2009.)

Kuva 2.7. Potentiaalinen mekanismi CpG-saarekkeiden hypometylaatiolle. Perustran-skriptiotekijät (RNA polymeraasi II ja TF) sekä yleensä aktiivisiin geeneihin

assosioitu-va histoniproteiinin metylaatio (H3K4me3) estävät metyylitransferaasien sitoutumisen transkription aloituskohtaan. Mustat pallot kuvaavat metyloituneita CpG-dinukleotideja

ja valkoiset metyloitumattomia. (Mukaillen Illingworth & Bird, 2009.) Metyloituneet CpG-saarekkeet

Promoottorialueilla olevien CpG-saarekkeiden de novo-metylaatiota tapahtuu genomi-sessa leimautumigenomi-sessa, X-inaktivaatiossa, kehityksellisissä sairauksissa sekä syövässä.

(Shen ym., 2007.) Metyloituneen DNA:n transkription hiljentämiseen osallistuvat MeCP-proteiinit (methyl-CpG-binding protein), jotka sitoutuvat spesifisesti metyloitu-neisiin CpG-dinukleotideihin ja houkuttelevat paikalle histonien deasetylaaseja ja muita transkriptionaalisia repressoreita. CpG-dinukleotidit aiheuttavat vahvan MeCP-proteiinien sitoutumisen ja saavat aikaan hyvin tehokkaan ja stabiilin transkription rep-ression kromatiinirakenteen muutosten seurauksena. (Antequera, 2003; Weber ym., 2007.)

Nykyään on yleisesti hyväksytty, että CpG-saarekkeet ylläpitogeeneissä sekä kudoss-pesifisissä geeneissä lukuun ottamatta edellä mainittuja leimautumisgeenejä sekä X-inaktivaatioon liittyviä geenejä eivät ole metyloituneita missään vaiheessa. Suurin osa CpG-saarekkeista on siis metyloitumattomia normaaleissa kudoksissa, mutta muutaman saarekkeen tiedetään olevan metyloitunut. Nämä saarekkeet eivät liity leimautumiseen eivätkä X-inaktivaatioon, ja niillä on todennäköisesti rooli kudosspesifisten geenien ohjatussa ekspressiossa erilaistumisprosessissa. (Shen ym., 2007.)

Monien geenien kohdalla CpG-saarekkeen metylaation on todettu korreloivan transkrip-tion hiljentymisen kanssa normaaleissa soluissa. Useimmissa tapauksissa korrelaatioon liittyvät kuitenkin intrageeniset CpG-saarekkeet eivätkä promoottorialueen saarekkeet.

Kuitenkin myös muutaman promoottorialueen saarekkeen metylaation on todettu korre-loivan transkription hiljentymisen kanssa, mutta näissä CpG-dinukleotidien tiheys on ollut alhainen. (Shen ym., 2007.) Onkin todennäköistä, että geenirepression voimakkuus riippuu paikallisesta CpG- ja metylaatiotiheydestä promoottorialueella (Boyes & Bird, 1992).

2.4.3.2 Intrageeninen metylaatio

Toisin kuin promoottorialueen tavallisesti metyloitumattomat CpG-saarekkeet, geeneis-sä sijaitsevat liikkumis- ja kopioitumiskykyiset elementit eli transposonit, kuten LINEt (usean kiloemäksen pituiset genomiset toistojaksot), SINEt (lyhyet genomiset toistojak-sot) ja endogeeniset retrovirustyyppiset transposonit ovat hyvin metyloituneita somaat-tisissa kudoksissa. Nämä elementit kattavat enemmän kuin 45 % ihmisen genomista ja vastaavat suurilta osin genomin kaikista metyloituneista CpG-dinukleotideista. Useim-miten näitä liikkuvia elementtejä löytyy intronisilta alueilta, joten intrageeninen CpG-metylaatio on yleistä transkription aloituskohdasta alavirtaan. (Lorincz ym., 2004.)

Epigenomiset tutkimukset ovat osoittaneet, että transkription etenemisen (elongation) epigeneettinen kontrollointi on laajalle levinnyt säätelymekanismi. Intrageenistä DNA:n metylaatiota tapahtuu enemmän, ja sillä on laajempi vaikutus geenien ekspressiotasoon kuin promoottorialueen metylaatiolla. Metylaatio proteiineja koodaavilla alueilla voikin yksinään inhiboida geeniekspressiota. Choi ym. (2009) on tutkinut erityisesti koodaavi-en sekvkoodaavi-enssikoodaavi-en raja-alueidkoodaavi-en nukleosomikoodaavi-en rakkoodaavi-ennetta ja niissä esiintyvää DNA:n

mety-laatiota. Raja-alueiden rooli on ilmeisesti RNA:n pilkkomisen kontrolloinnissa. Ensim-mäisen ja viimeisen eksonin pitää transkriptoitua mRNA:han, jotta saadaan aikaan toi-miva proteiini. Kun transkription eteminen hidastuu näiden epigeneettisten markkerei-den kohdalla, välttämättömien eksonien mukaan saaminen tehostuu. (Choi ym., 2009.) Lorincz ym. (2004) puolestaan on osoittanut, että metylaatio alavirtaan aktiivisesta promoottorista voi vaikuttaa negatiivisesti transkription etenemiseen nisäkässoluissa.

Intrageeninen metylaatio ei kokonaan estä transkription etenemistä, mutta on mahdollis-ta, että tällainen metylaatio kuitenkin vähentää sen tehokkuutta. Tämä johtuu siitä, että intrageeninen metylaatio indusoi tiiviin kromatiinirakenteen muodostumista histonien hypoasetylaation kautta. (Lorincz ym., 2004.)

2.4.4 Ympäristötekijät, epigeneettiset muutokset ja autoimmuniteetti