HLA-DQ2-geenien promoottorialueiden metylaatio keliakiassa

(1)

HLA-DQ2-geenien promoottorialueiden metylaatio keliakiassa

Pro gradu -tutkielma Tampereen yliopisto

Lääketieteellisen teknologian instituutti Huhtikuu 2010

Saija Kukkola

(2)

KIITOKSET

Tämä pro gradu -tutkielma tehtiin Tampereen yliopiston Lääketieteellisen teknologian instituutissa (IMT). Tutkimuksen kokeellinen osa tehtiin Tampereen yliopiston Lääke- tieteen laitoksen Lastentautien tutkimuskeskuksen keliakiatutkimusryhmässä.

Haluan kiittää työn ohjaajia Keijo Viiriä ja Katri Lindforsia ohjauksesta ja neuvoista.

Kiitän myös keliakiatutkimusryhmän johtajaa Markku Mäkeä mahdollisuudesta tehdä tämä tutkielma. Lisäksi haluan kiittää dosentti, erikoislääkäri Katri Kaukista, Anne Heimosta, Marja-Terttu Oksasta ja Laura Airaksista, jotka mahdollistivat näytteiden saamisen tähän tutkimukseen. Kiitokset kuuluvat myös kaikille keliakiaryhmäläisille avusta ja neuvoista. Kiitän myös professori Markku Kulomaata tutkielman tarkastami- sesta.

Lopuksi haluan osoittaa kiitokset perheelleni sekä erityisesti Dinis Kyllöselle kaikesta opiskelujeni aikana saamasta tuesta ja kannustuksesta.

Tampere, Huhtikuu 2010

Saija Kukkola

(3)

PRO GRADU -TUTKIELMA

Paikka: TAMPEREEN YLIOPISTO Lääketieteellinen tiedekunta

Lääketieteellisen teknologian instituutti Tekijä: KUKKOLA, SAIJA SUSANNA

Otsikko: HLA-DQ2-geenien promoottorialueiden metylaatio keliakiassa Sivumäärä: 55 s.

Ohjaajat: FT Keijo Viiri ja FT Katri Lindfors

Tarkastajat: Professori Markku Kulomaa ja FT Keijo Viiri Aika: Huhtikuu 2010

___________________________________________________________________

Tiivistelmä

Tutkimuksen tausta ja tavoitteet: Keliakia on perinnöllinen autoimmuunisairaus, jos- sa vehnän, ohran ja rukiin gluteeni aiheuttaa kroonisen tulehduksen ohutsuolessa. Ym- päristötekijöiden lisäksi keliakian puhkeamiseen vaikuttavat geneettiset tekijät, joista ihmisen leukosyyttiantigeeni (HLA)-molekyylit DQ2 ja DQ8 ovat parhaiten tunnettuja.

Näitä molempia heterodimeerisiä molekyylejä koodaavat kaksi geeniä: DQA1 ja DQB1.

Suurin osa DQ2/DQ8-positiivisista henkilöistä ei kuitenkaan koskaan sairastu keliakiaan. Geenien promoottorialueiden CpG-dinukleotidien poikkeava metylaatioprofiili voi osaltaan vaikuttaa eri sairauksien syntyyn. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää DQ2-geenien promoottorien metylaatiota keliakiassa vertaamalla metylaatiostatusta DQ2-positiivisten keliaakikkojen ja ei-keliaakikkojen kesken sekä hoidolla olevien ja gluteenille altistettujen keliaakikkojen kesken. Lisäksi tavoitteena oli tutkia, voiko metylaatiostatuksen selvittää kokoverestä pelkkien lymfosyyttien sijaan.

Tutkimusmenetelmät: DQ2-geenien promoottorialueiden sekvenssit sekä niissä olevien CpG-dinukleotidien määrä ja mahdolliset CpG-saarekkeet määritettiin in silico.

Näytteet olivat seitsemältä henkilöltä ja analysoitavia sekvenssejä oli yhteensä kolme- toista. Promoottorialueiden metylaatiostatus selvitettiin bisulfiittisekvensointimenetel- mällä.

Tutkimustulokset: DQB1-geenin promoottori sisältää yhden 204 emäsparin pituisen CpG-saarekkeen, jossa on kahdeksan CpG-dinukleotidia. DQA1-geenin promoottori puolestaan ei sisällä yhtään CpG-saareketta. Bisulfiittisekvensointimenetelmä pystytet- tiin onnistuneesti vain DQB1-promoottorille. Kahdessa näytteessä kolmestatoista oli yksi metyloitunut CpG-dinukleotidi transkription aloituskohdan suhteen asemassa +103.

Nämä olivat keliaakikon lymfosyyttinäyte ja gluteenialtistuksen jälkeinen näyte.

Tulosten tarkastelu: Ei-keliaakikon ja keliaakikkojen vertailussa DQB1-promoottorin metylaatiostatuksen suhteen tuli ilmi yksi eroavaisuus, samoin kuin lymfosyytti- ja ve- rinäytteiden vertailussa. Lisäksi gluteenialtistuksen jälkeisissä näytteissä yhdessä havaittiin yksi metyloitunut CpG, mutta tälle näytteelle ei ollut käytettävissä vertailunäy- tettä ennen altistusta. Näin ollen ei voida sanoa, johtuuko ero gluteenialtistuksesta. Li- säksi näytteiden määrä oli liian pieni, jotta tulokset olisivat tilastollisesti merkitseviä.

Johtopäätökset: On mahdollista, että DNA:n metylaatiolla on jonkinlainen epigeneet- tinen rooli keliakiassa, koska metyloitunut CpG oli havaittavissa samassa kohdassa kahdessa eri näytteessä. Tätä voisi tutkia tulevaisuudessa isommalla näytelukumäärällä, jotta tulokset olisivat tilastollisesti analysoitavissa. Näytteinä olisi parempi käyttää lym- fosyyttejä kokoveren sijaan.

(4)

MASTER’S THESIS

Place: UNIVERSITY OF TAMPERE Faculty of Medicine

Institute of Medical Technology, IMT Author: KUKKOLA, SAIJA SUSANNA

Title: Methylation of promoter regions of HLA-DQ2 genes in celiac disease Pages: 55 pp.

Supervisors: Keijo Viiri Ph.D, Katri Lindfors Ph.D.

Reviewers: Professor Markku Kulomaa, Keijo Viiri Ph.D.

Date: April 2010

______________________________________________________________________

Abstract

Background and aims: Celiac disease is a hereditary autoimmune disease in which gluten from wheat, barley and rye causes a chronic inflammation in the small intestine.

In addition to environmental factors, the onset of the disease is affected by genetic factors, the human leukocyte antigen (HLA) molecules DQ2 and DQ8 being the most well- known. Both of these heterodimeric molecules are encoded by two genes: DQA1 and DQB1. Although almost all celiac patients are either DQ2 or DQ8 positive, the presence of these molecules is not sufficient for the development of the disease as the majority of DQ2/DQ8 positive people never have the disease. Aberrant DNA methylation profile of promoter regions of genes can contribute to the emergence of various diseases. The aim of this study was to study the DNA methylation status of promoter regions of DQ2 genes in celiac disease by comparing the methylation between DQ2 positive celiac and non-celiac subjects and between celiac patients on gluten-free diet and after exposed to gluten. In addition, the aim was to explore whether the methylation status could be ex- amined using whole blood instead of purified lymphocytes.

Methods: The sequences and the presence of CpG dinucleotides and possible CpG is- lands in DQ2 gene promoters were studied in silico. The samples used were from seven subjects and there were thirteen samples in total to be analysed. The methylation status was studied by bisulfite sequencing.

Results: The promoter of DQB1 gene contains one CpG island which is 204 bp long and contains eight CpGs. The promoter of DQA1 gene does not contain any CpG island.

The bisulfite sequencing method was successfully set up for studying only the methylation status of DQB1 promoter. There was one methylated CpG at a same position in two samples: a celiac lymphocyte sample and a sample after gluten exposure.

Discussion: There was one difference in methylation status of DQB1 gene promoter between nonceliac and celiac subjects and between whole blood and lymphocyte samples. Also, it was found that one sample after exposed to gluten had one methylated CpG but there was no reference sample before the exposure available. Therefore, it can- not be concluded whether the difference results from the gluten exposure. In addition, the number of samples studied was too small to draw any statistical conclusions.

Conclusions: It is possible that DNA methylation has some epigenetic role in celiac disease because the methylated CpG was found at a same position in two different samples. However, it should be studied further with more samples so the results could be statistically analysed. It would be better to use lymphocyte samples instead of whole blood.

(5)

SISÄLLYSLUETTELO

1 JOHDANTO ... 7

2 KIRJALLISUUSKATSAUS... 9

2.1 KELIAKIA... 9

2.1.1 Yleistä keliakiasta ... 9

2.1.2 Keliakian patogeneesi ... 10

2.2 HLA-KOMPLEKSI... 12

2.2.1 Luokan I HLA-geenit ... 12

2.2.2 Luokan III HLA-geenit ... 13

2.2.3 Luokan II HLA-geenit ja transkription säätely ... 13

2.2.4 Luokan II HLA-molekyylit ... 15

2.3 KELIAKIAN GENETIIKKA... 15

2.3.1 HLA-alleelit ... 15

2.3.2 Muut keliakiaan vaikuttavat geenit ... 17

2.4 EPIGENETIIKKA... 18

2.4.1 Yleistä epigenetiikasta ... 18

2.4.2 Histoniproteiinien translaation jälkeinen muokkaus ... 19

2.4.3 DNA:n metylaatio ... 20

2.4.4 Ympäristötekijät, epigeneettiset muutokset ja autoimmuniteetti ... 25

2.5 BISULFIITTISEKVENSOINNIN PERIAATE... 27

3 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET ... 29

4 MATERIAALIT JA MENETELMÄT... 30

4.1 DQ2-GEENIEN CPG-SAAREKKEIDEN MÄÄRITTÄMINEN IN SILICO... 30

4.2 NÄYTTEET... 30

4.2.1 Pakastettujen lymfosyyttien sulatus... 31

4.2.2 Lymfosyyttien eristäminen tuoreista kokoverinäytteistä ... 31

4.3 DNA:N ERISTYS... 31

4.4 PCR ... 32

4.5 BISULFIITTIKONVERSIO JA PCR KONVERTOIDULLE DNA:LLE... 34

4.6 TRANSFORMAATIO, KLOONAUS JA PLASMIDIEN ERISTYS... 35

4.7 SEKVENSOINTI... 36

4.8 SEKVENSSI- JA METYLAATIOANALYYSIT... 37

5 TULOKSET ... 38

5.1 DQ2-GEENIEN PROMOOTTORIALUEIDEN CPG-SAAREKKEET... 38

5.2 PCR ... 39

5.3 PCR BISULFIITTIKONVERTOIDULLE DNA:LLE... 40

5.4 SEKVENSOINTIREAKTIOIDEN JA BISULFIITTIKONVERSION ONNISTUNEISUUS... 40

5.5 DQB1-GEENIN PROMOOTTORIN METYLAATIOANALYYSI... 40

6 POHDINTA... 44

(6)

6.1 DQ2-GEENIEN CPG-SAAREKKEIDEN IDENTIFIOIMINEN IN SILICO... 44

6.2 MENETELMÄT... 45

6.2.1 PCR... 46

6.3 SEKVENSOINTIREAKTIOIDEN JA BISULFIITTIKONVERSION ONNISTUNEISUUS... 46

6.4 DQB1-GEENIN PROMOOTTORIN METYLAATIO... 48

6.4.1 Metylaatiostatus lymfosyytti- vs. kokoverinäytteet... 48

6.4.2 Metylaatiostatus ei-keliaakikko vs. keliaakikko ... 49

6.4.3 Muutokset metylaatiossa gluteenialtistuksen jälkeen... 49

7 JOHTOPÄÄTÖKSET ... 50

LÄHDELUETTELO ... 51

(7)

LYHENTEET

APC Antigen presenting cell, antigeenin esittelijäsolu

bp Base pair, emäspari

CIITA Class II transactivator, luokan II transaktivaattori DMSO Dimethyl sulfoxide, dimetyylisulfoksidi

HLA Human leukocyte antigen, ihmisen leukosyyttiantigeeni IEL Intraepithelial lymphocyte, intraepiteelinen lymfosyytti LINE Long interspersed nuclear element, usean kiloemäksen pi-

tuinen genominen toistojakso

MHC Human major histocompatibility complex

PBS Phosphate-buffered saline, fosfaatti-puskuroitu suolaliuos SINE Short interspersed nuclear element, lyhyt genominen toisto-

jakso

TG2 Transglutaminase-2, transglutaminaasi 2

(8)

1 JOHDANTO

Keliakia on perinnöllinen autoimmuunisairaus, jossa elimistön immuunijärjestelmä reagoi vehnän gluteeniin sekä ohran ja rukiin samantyyppisiin proteiineihin ohutsuolessa.

Sitä sairastaa arviolta 1 % maailman väestöstä. Keliakian puhkeamiseen vaikuttavat perinnöllisten tekijöiden ohella myös ympäristötekijät, kuten imetyksen puute, gluteenin suuri määrä maidonvastikkeissa sekä tulehdukset. Keliakia on polygeeninen sairaus, jossa MHC (human major histocompatibility complex) -molekyylit DQ2 ja DQ8 ovat keskeisiä perinnöllisiä tekijöitä keliakian puhkeamiselle. Kumpikin molekyyli muodostuu ihmisen leukosyyttiantigeeni (human leukocyte antigen, HLA) -kompleksiin kuulu- vista DQA1- ja DQB1-geeneistä, jotka kuuluvat HLA-geenien II luokkaan. Nämä HLA- geenit muodostavat noin 50 % keliakian geneettisestä riskistä. (Green & Jabri, 2006.) Noin 90 % keliaakikoista ilmentää DQ2-molekyylejä ja noin 10 % DQ8-molekyylejä.

Kuitenkin myös ei-keliaakikot ilmentävät näitä molekyylejä, esimerkiksi suomalaisista noin 35 % on joko DQ2- tai DQ8-positiivisia. (Mäki, 2006.)

Nykyään on yhä enemmän tullut ilmi viitteitä siitä, että epigenetiikalla on merkittävä rooli eri sairauksissa, kuten syövässä, tulehduksellisissa oireyhtymissä ja autoimmuuni- sairauksissa (Wilson, 2008). Epigeneettinen muutos tarkoittaa perinnöllistä muutosta geenien ilmentymisessä, johon ei liity DNA-sekvenssin muutoksia, ja ne ovat välttämät- tömiä normaalille solujen kehitykselle ja erilaistumiselle (Docherty ym., 2009; Jiang ym., 2004). Epigeneettisiä muutoksia voivat aiheuttaa myös ympäristötekijät koko elä- män ajan. Kaksi suurinta epigeneettistä mekanismia on kromatiinin histoniproteiinien translaation jälkeinen muokkaus sekä DNA:n metylaatio. (Wilson, 2008.) DNA:n metylaatiota tapahtuu CpG-dinukleotidien sytosiineissa. Monien geenien promoottorialueen säätelyalueilla CpG-dinukleotideja on paljon, jolloin ne muodostavat CpG-saarekkeita.

Näillä säätelyalueilla olevat metyylisytosiinit voivat häiritä transkriptiotekijöiden sitoutumista promoottorialueelle ja houkutella paikalle muita tekijöitä, jotka saavat aikaan kromatiinin tiivistymistä sekä geenien hiljenemistä. Poikkeava metylaatioprofiili voi osaltaan vaikuttaa eri sairauksien syntyyn ihmisillä. (Docherty ym., 2009.)

(9)

Epigeneettisten muutosten vaikutuksesta keliakiaan ei ole tähän mennessä julkaistu tuloksia. Tämän tutkielman tavoitteena olikin pystyttää menetelmä keliakian kannalta keskeisten DQ2-geenien promoottorialueiden metylaatiostatuksen tutkimiseksi sekä alustavasti selvittää, liittyykö näiden geenien promoottorialueisiin DNA:n metylaatiota keliakiassa.

(10)

2 KIRJALLISUUSKATSAUS 2.1 Keliakia

2.1.1 Yleistä keliakiasta

Keliakia on krooninen suolistotulehdussairaus, joka johtaa ohutsuolen nukkalisäkkeiden eli villusten surkastumiseen, kuopakkeiden eli kryptien kasvamiseen (kryptahyperplasia) sekä limakalvon tasaistumiseen. Sairauden puhkeamiseen vaikuttaa perinnöllinen alttius sekä ravinnon mukana saatu vehnän gluteeni ja samankaltaiset proteiinit rukiissa ja oh- rassa. Nykyään keliakian ainoa hoitomuoto on elinikäinen gluteeniton ruokavalio, joka johtaa taudin lievenemiseen sekä estää monien pitkäaikaisten komplikaatioiden ilme- nemisen. (Megiorni ym., 2009.)

Keliakian kliininen luokitus perustuu ruuansulatuskanavan oireisiin. Klassisella keliaki- alla viitataan oireistoon, johon kuuluu ripuli joko ravintoaineiden imeytymishäiriön kanssa tai ilman. Epätyypillisessä tai hiljaisessa keliakiassa ruuansulatuskanavan oireet puuttuvat tai ovat vähäisiä. Vielä ei tiedetä, miksi oireisto on niin vaihtelevaa. Pikkulap- silla oireisiin kuuluu ripuli, kun taas vanhemmilla lapsilla voi olla anemiaa, neurologisia ongelmia, pienikokoisuutta ja muita epätyypillisiä oireita, kuten ummetusta. Yleensä ottaen keliaakikoilla yleisin oire on ripuli, mutta myös raudanpuutosta, osteoporoosia, ataksiaa ja epilepsiaa voi esiintyä. Keliakia voi ilmetä myös ihokeliakiana, jossa oireena on voimakkaasti kutiava rakkulainen ihottuma. (Hernandez & Green, 2006.)

Alun perin keliakia miellettiin harvinaiseksi lastentaudiksi, mutta nykyään tiedetään, että sairaus on yleinen ja voi puhjeta millä iällä hyvänsä. Diagnoosimäärät ovat kasvus- sa aikuisväestössä ja myös niillä potilailla, joilla ei ole suolisto-oireita. Keliakian esiin- tyvyys on suurempi niillä potilailla, joilla on anemia, jokin autoimmuunisairaus tai Downin, Turnerin tai Williamsin oireyhtymä. Lisäksi keliakian todennäköisyyttä (esiin- tyvyyttä) nostaa se, jos ensimmäisen asteen sukulaisilla on sairaus. Iso osa keliakiatapa- uksista jää kuitenkin diagnosoimatta. Syy tähän voi olla se, että monilla potilailla on epätyypillisiä oireita tai ei oireita ollenkaan. (Megiorni ym., 2009.)

(11)

Keliakiadiagnoosi tehdään ohutsuolen histologisten näytteiden perusteella, mutta myös vasta-aineet tutkitaan (Qiao ym., 2009). Jos potilaan ohutsuolen yläosan koepalassa havaitaan nukkalisäkkeiden surkastumista, kryptien liikakasvua ja lymfosyyttien runsa- utta epiteelisoluissa, ja jos potilaan vaste gluteenin poisjättämiseen ruokavaliosta on yksiselitteinen, diagnoosina on keliakia. Koepalat otetaan, kun tautia epäillään kliinisten oireiden perusteella, serologiset testit ovat positiivisia tai, kun havaitaan vaurioita pohjukaissuolessa tähystyksen yhteydessä. (Green & Jabri, 2006.) Diagnoosia tukee verestä mitattavien keliakian autovasta-aineiden, endomysium- ja transglutaminaasi 2 (TG2)- vasta-aineiden (EmA ja anti-TG2) esiintyminen. Jos tilanne on diagnostisesti epäselvä, voidaan apuna käyttää keliakian perintötekijöiden HLA DQ2- tai DQ8-molekyylien määrittämistä. Jos potilas on näiden molekyylien suhteen negatiivinen eikä histologinen löydös ole täysin selvä, on keliakia hyvin epätodennäköinen. (Kaukinen, 2006.)

2.1.2 Keliakian patogeneesi

Ihmisen elimistö ei hajota gluteenia täydellisesti, ja gluteenin alkoholiliukoinen osa, gliadiini, saa aikaan tulehdusreaktion ohutsuolessa keliaakikoilla. Gliadiinin indusoima T-soluvaste sisältää sekä spesifisen että synnynnäisen komponentin. Spesifisessä vas- teessa ohutsuolen epiteelin lamina propriassa olevat antigeeniä esittelevät solut (antigen presenting cell, APC) ilmentävät DQ2- tai DQ8-molekyyliä ja stimuloivat CD4⁺ T- solujen lisääntymistä limakalvossa. Tietyt gliadiini-peptidit (ns. immunogeeniset peptidit) ovat TG2:n substraatteja, joiden glutamiiniaminohappoja entsyymi pystyy muuttamaan negatiivisesti varautuneiksi glutamaateiksi. Tässä prosessissa gliadiini-peptideistä tulee negatiivisesti varautuneita, mikä edesauttaa niiden sitoutumista DQ2- ja DQ8- molekyylien uurteeseen antigeenejä esittelevien solujen pinnalla. (Green & Jabri, 2006.) (Kuva 2.1.) TG2 pystyy muuttamaan paljon glutamiinia sisältävät gliadiini-peptidit hyvin immunogeenisiksi epitoopeiksi (Caillat-Zucman, 2008). TG2-entsyymiä tuotetaan normaalistikin pohjukaissuolessa, mutta keliaakikoilla sitä tuotetaan enemmän (Louka

& Sollid, 2003). T-solujen tunnistaessa DQ2/DQ8-molekyylien ja gliadiini-peptidien muodostaman kompleksin keliakiaa sairastavan henkilön suolen limakalvon tulehdusre- aktio käynnistyy, ja samalla myös limakalvon B-solut tuottavat paikallisesti oman ku- doksen TG2:ta tunnistavaa vasta-ainetta, IgA:ta (Mäki, 2006). Lisäksi myös proinflam- matoristen sytokiinien eritys alkaa (Megiorni ym., 2009).

(12)

Kuva 2.1.Keliakian patogeneesi. (Mukaillen Sollid, 2002.)

Synnynnäinen immuunivaste puolestaan liittyy toksisiin gliadiinipeptideihin sekä CD8⁺ T-soluihin, joiden vaste epiteelissä kohdistuu suoraan stressaantuneita epiteelisoluja kohtaan (Green & Jabri, 2006). Lamina propriassa aikaisemmin aktivoitujen CD4+- solujen tuottama sytokiini interleukiini-21 (IL-21) on todennäköisesti linkki adaptiivi- sen ja synnynnäisen immuunivasteen välillä. IL-21 vaikuttaa sekä muihin CD4+- soluihin saaden ne tuottamaan lisää interferoni-:aa (IFN-) lamina propriassa että interleukiini-15:ta (IL-15), joka stimuloi IFN-:n tuottoa soluista epiteelissä. (Heap & van Heel, 2009.) IL-15 myös indusoi intraepiteelisiä lymfosyyttejä (intraepithelial lymphocyte, IEL) ekspressoimaan NKG2D-reseptoria ja epiteelisoluja ekspressoimaan MICA- molekyyliä, joka on puolestaan NKG2D:n ligandi. Tämä johtaa siihen, että IEL:t tulevat sytotoksisiksi ja tappavat epiteelisoluja. (Jabri & Sollid, 2009.) Nämä tulehdukseen liit- tyvät tapahtumat johtavat tyypilliseen nukkalisäkkeiden atrofiaan keliakiassa (Heap &

van Heel, 2009).

(13)

2.2 HLA-kompleksi

Alue kromosomin 6 lyhyessä varressa, lokuksessa 6p21.3, on nimeltään HLA- kompleksi, jossa on yli 200 geenilokusta kattaen noin 0,5 % proteiineja koodaavista geeneistä. Monet HLA-geenituotteet ovat ligandeja, reseptoreja, vuorovaikuttavia proteiineja, signalointiproteiineja ja transkription säätelijöitä, jotka ovat keskeisessä asemassa tulehdusreaktioihin sisältyvissä antigeenien esittelyssä ja prosessoinnissa eli ne ovat keskeisiä tekijöitä adaptiivisessa immuunijärjestelmässä. Lisäksi ne vuorovaikuttavat luonnollisten tappajasolujen (NK-solut) sekä sytokiinien kanssa, ja ovat näin ollen osana myös synnynnäisen immuunisysteemin prosesseissa. Geenien lisäksi HLA-alue sisäl- tää retrotransposoneja, transposoneja, säätelyelementtejä, pseudogeenejä sekä muutamia määrittelemättömiä sekvenssejä. HLA-alue jaetaan kolmeen luokkaan, joista luokka II on sentromeerisin, luokka I telomeerisin ja luokka III sijaitsee luokkien I ja II välissä.

(Louka & Sollid, 2003; Shiina ym., 2009.) (Kuva 2.2.)

Kuva 2.2. HLA-kompleksi. (Mukaillen Louka & Sollid, 2003.)

2.2.1 Luokan I HLA-geenit

Suurinta osaa luokan I HLA-geeneistä ilmennetään melkein kaikissa soluissa. Luokan I klassisilla geeneillä (HLA-A, HLA-B ja HLA-C) on tärkeä rooli virusten infektoimien solujen tunnistamisessa ja niiden tuhoamisessa sekä luonnollisten tappajasolujen vastei- den kontrolloinnissa. Luokan I ei-klassiset HLA-geenit (HLA-E, HLA-F ja HLA-G), jotka eroavat klassisista rajallisemmalla polymorfismilla osallistuvat tiettyihin im- muunisäätelytoimintoihin. Luokassa I on lisäksi 12 ei-koodaavaa geeniä tai pseudo- geeniä. HLA luokan I molekyylit esittelevät endogeenistä alkuperää olevia peptidejä CD8+ T-solujen reseptoreille. (van den Elsen ym., 2004; Shiina ym., 2009.)

(14)

2.2.2 Luokan III HLA-geenit

Luokassa III sijaitsee 55 proteiinia koodaavaa geeniä ja 5 pseudogeeniä. Geenit koodaavat mm. sytokiinejä ja monilla ei ole ilmeistä roolia immuunijärjestelmän toiminnassa tai tulehdusreaktioissa. Sen sijaan monet geenituotteet ovat mukana solujensisäisissä prosesseissa, kuten transkription säätelyssä, ylläpidossa (housekeeping), biosynteesissä ja elektronikuljetuksessa sekä proteiinien välisissä vuorovaikutustapahtumissa. (Shiina ym., 2009.)

2.2.3 Luokan II HLA-geenit ja transkription säätely

Luokan II HLA-geenit ovat polymorfisia, ja niiden ilmentäminen on tiukasti säädeltyä.

Näitä geenejä ilmennetään jatkuvasti ammattimaisissa antigeenejä esittelevissä soluissa, joihin kuuluvat dendriittisolut, makrofagit, kateenkorvan epiteelisolut ja kypsät B-solut.

Lisäksi niitä ilmennetään sytokiinien, etenkin interferoni-:n, indusoimana aktivoitu- neissa T-soluissa, fibroblasteissa sekä endoteelistä ja epiteelistä alkuperää olevissa soluissa. Luokan II HLA-geenien säätelyssä tapahtuvat häiriöt, kuten yliekspressointi tai ekspressio tietyissä kudoksissa, vaikuttavat edesauttavasti useiden autoimmuunisairauksien puhkeamiseen. Geeninsäätely tapahtuu pääasiassa transkriptiotasolla luokan II HLA-geenien kohdalla. (van den Elsen ym., 2004; Kumanovics ym., 2003; Murphy ym., 2004; Radosevich & Ono, 2003.)

Ensimmäisestä eksonista 160 emäsparia ylävirtaan kattavat säätelyalueen, joka on vält- tämätön sekä kudosspesifille että indusoituvalle ekspressiolle. Tämä proksimaalinen promoottori sisältää kolme elementtiä, jotka ovat X-, Y- ja S- (tai W-, H-, tai Z-) laatikko. Nämä säätelyelementit löytyvät kaikista luokan II geeneistä, joissa niiden sijainti on sama suhteessa toisiinsa. Y-laatikko, joka sisältää käänteisen CCAAT-elementin, on 10 emäsparin pituinen ja se sijaitsee normaalisti 50–80 emäsparia ylävirtaan transkription aloituskohdasta. Y-laatikosta 12–14 emäsparia ylävirtaan sijaitsee X-laatikko, joka voidaan jakaa edelleen X1- ja X2-laatikoihin. S-laatikko sijaitsee puolestaan 15–20 emäs- paria ylävirtaan X-laatikosta ja sisältää seitsemän emäsparin pituisen konservoituneen alueen. (Beaty ym., 1995; Radosevich & Ono, 2003.)

(15)

X-laatikon tunnistavat monet tekijät, jotka voivat sitoutua joko X1- tai X2-osaan. X1- elementtiin sitoutuu RFX-tekijä (regulatory factor X), ja X2-elementtiin sitoutuvat proteiinit X2BP (X2 binding protein) ja CREB (cAMP response element binding protein), jotka myös lisäävät RFX-tekijän sitoutumista X1-elementtiin. Repressoivana tekijänä X1-elementtiin sitoutuva proteiini on NFX.1. Y-säätelyelementin sekvenssiin sitoutuvat transkriptiotekijät NF-Y (nuclear factor-Y) ja YB-1. NF-Y on välttämätön, mutta ei- spesifinen tekijä, ja YB-1 on puolestaan negatiivinen säätelijä luokan II HLA-geenien transkriptiossa. Y-elementtiä vaaditaan luokan II HLA-geenien maksimaaliseen eks- pressioon. Sekä X- että Y-elementti pystyvät sitomaan transkriptiotekijöitä, jotka voivat olla sekä ekspressiota lisääviä että vähentäviä. X-elementit ovat sekä välttämättömiä että riittäviä luokan II HLA-geenien ekspressiossa, mutta niihin sitoutuvat tekijät FRX ja CREB eivät yksistään riitä aktivoimaan geeniekspressiota. (Morris ym., 2000; Ra- dosevich & Ono, 2003.)

Koska S- ja X-elementtien sekvensseissä on homologiaa, samat proteiinit voivat sitoutua niihin kumpaankin. Esimerkiksi S-elementti voi sitoa RFX-tekijän ja sitoutuminen on voimakkaampaa, jos NF-Y on sitoununeena Y-elementtiin. (Radosevich & Ono, 2003.) Lisäksi NF-Y:n sitoutuessa Y-elementtiin myös RFX-kompleksin sitoutuminen X-elementtiin on voimakkaampaa. Luokan II HLA-geenien promoottorien aktiivisuus riippuu siis eri tekijöiden ko-operatiivisesta sitoutumisesta promoottorien eri säätely- elementteihin. (Reith ym., 1994.)

Edellisten transkriptiotekijöiden lisäksi luokan II HLA-geenejä säätelee myös tekijä, joka ei itse sitoudu DNA:han. Tämä säätelytekijä on nimeltään luokan II transaktivaattori (class II transactivator, CIITA) ja toisin kuin DNA:han sitoutuvat proteiinit, CII- TA:n ekspressio on tiukasti säädeltyä. CIITA:n ekspressio korreloi täsmälleen luokan II geenien ekspression kanssa sekä antigeenejä esittelevissä soluissa että IFN-γ- indusoituvissa soluissa. Tämän vuoksi CIITA:a pidetään luokan II HLA-geenien tär- keimpänä säätelijänä. CIITA on sekä välttämätön että riittävä säätelemään kyseisiä gee- nejä, ja tiedetään myös, että niiden jatkuvaa ekspressiota ammattimaisissa antigeenejä esittelevissä soluissa, kuten dendriittisoluissa sekä IFN-γ:n indusoimissa B-soluissa yl- läpitää nimenomaan CIITA. Koska CIITA ei itse sitoudu DNA:han, se vaikuttaa sitou- tumalla suoraan S-, X- tai Y-elementteihin sitoutuneisiin tekijöihin tai yleisiin transkrip- tiotekijöihin. (Brown ym., 1998; Radosevich & Ono, 2003.) (Kuva 2.3.)

(16)

Kuva 2.3. Malli luokan II HLA-geenien transaktivaatiosta CIITA:n avulla. (Mukaillen Brown ym., 1998.)

2.2.4 Luokan II HLA-molekyylit

Luokan II HLA-geenien koodaamat molekyylit ovat heterodimeerisiä solukalvon läpäi- seviä glykoproteiineja. Ne muodostuvat kahdesta ketjusta (α ja β), joissa kummassakin on kaksi solun ulkopuolista domeenia yhdistyneenä solukalvossa olevaan alueeseen ja sytoplasmiseen alueeseen. Näin ollen molekyyleillä on neljä solun ulkopuolista domeenia. (Radosevich & Ono, 2003.) Luokan II HLA-molekyylien peptidejä sitova uurre muodostuu β-levyjen muodostamasta pohjasta sekä α-kierteiden muodostamista seinistä.

Uurteessa on pieniä onkaloita, joissa on peptidien sitovuudesta vastuussa olevia amino- happoja. Luokan II molekyylien ensisijainen tehtävä on sitoa solun endosomaalisista osastoista tulevia antigeenejä ja esitellä ne CD4⁺ T-solujen pinnalla oleville T- solureseptoreille. (Kumánovics ym., 2003; Louka & Sollid, 2003.) Jotta ne saavat aikaan immuunireaktion, luokan II molekyylien täytyy siis sitoutua T-solureseptoriin.

CD4 on koreseptori, joka löytyy niistä T-soluista, jotka ovat vuorovaikutuksessa luokan II molekyylien kanssa. CD4-koreseptori saa aikaan T-solureseptorien dimerisaation, mikä johtaa T-solujen signaalinvälitykseen ja aktivaatioon. (Radosevich & Ono, 2003.)

2.3 Keliakian genetiikka

2.3.1 HLA-alleelit

Keliakian geneettisestä alttiudesta noin 50 % selittyy HLA-geeneillä. Yli 90 % keliaakikoista ilmentää DQ2-molekyyliä, jota koodaa alleelit DQA1*0501 ja DQB1*0201, jotka ovat samassa kromosomissa tai DQA1*0505 ja DQB1*0202, jotka ovat eri kro- mosomeissa. Suurimmalla osalla lopuista potilaista alleelit ovat DQA1*0301 ja

(17)

DQB1*0302, jotka koodaavat molekyyliä DQ8. (Caillat-Zucman, 2008; Louka & Sollid, 2003.) (Kuva 2.4.) Näiden alleelien tiivis yhteys keliakiaan voidaan selittää sillä, että APC:den ilmentämät DQ2- ja DQ8-molekyylit välittävät gluteeni-reaktiivisten CD4⁺ T- solujen aktivaatiota ohutsuolessa sitomalla spesifisesti gluteenista peräisin olevia gliadiini-peptidejä, joita TG2 on modifioinut, ja esittelemällä peptidit ohutsuolen T-soluille (Megiorni ym., 2009).

Kuva 2.4. DQ2- ja DQ8-molekyylien muodostuminen haplotyyppien perusteella. (Mu- kaillen Qiao ym., 2009.)

DQ2-molekyylin liittyminen keliakiaan on seurausta yksinomaan DQ2.5 (DR3-DQ2) haplotyypin kautta. Toisen DQ2-molekyylin, DQ2.2:n (DR7-DQ2), ei ole yksistään havaittu altistavan keliakialle. (Heap & van Heel, 2009.) Tämä selittyy sillä, että DQ2.5-molekyylejä ilmentävät APC:t sitovat gliadiinista peräisin olevia epitooppeja paljon herkemmin sekä esittelevät niitä T-soluille pidemmän aikaa kuin DQ2.2- molekyyli (Fallang ym., 2009). Koska jokainen haplotyyppi on läsnä vain yhdessä kromosomissa, on mahdollista tuottaa DQ2.5- ja DQ2.2 -molekyylien yhdistelmiä, jotka ilmenevät solujen pinnalla riippuen vanhemmilta peritystä genotyypistä. DQ2.5- haplotyyppiä on kahdenlaista, cis-tyyppi, jossa sekä -ketju että -ketjun geenit ovat samassa kromosomissa ja trans-tyyppi, jossa ketjuja koodaavat geenit ovat eri kro- mosomeissa, jolloin alleelit ovat peräisin kummaltakin vanhemmalta. (Heap & van Heel, 2009.)

(18)

Perittyjen HLA-DQ-alleelien kokoonpano vaikuttaa suoraan siihen, millä todennäköi- syydellä keliakia puhkeaa. Sisaruksilla, joilla on kummallakin DQ2.5-haplotyyppi, on isompi riski sairastua keliakiaan kuin mitä sisaruksilla yleensä. Myös geenien kopioluku vaikuttaa sairastumisriskiin. Potilailla, jotka ovat homotsygootteja alleelin DQB1*02 suhteen, on viisinkertainen riski sairastua, mutta sairastumisikään tai keliakian vakavuu- teen se ei vaikuta. (Heap & van Heel, 2009; Murray ym., 2007.) Myös potilailla, jotka ovat heterotsygootteja DR7-DQ2- ja DR5-DQ7 -haplotyyppien suhteen, on merkittäväs- ti suurempi riski sairastua keliakiaan. Tämä selittyy sillä, että näiden henkilöiden vas- tinkromosomeissa sijaitsevat DQA1- ja DQB1-alleelit tuottavat DQ2.5-molekyyliä.

DQ2.5- ja DQ2.2-molekyylit eroavat DQA1-alleelin suhteen, joten voidaankin olettaa, että DQA1-alleelin variaatiolla on merkittävä vaikutus keliakiariskiin. (Fallang ym., 2009.)

2.3.2 Muut keliakiaan vaikuttavat geenit

Eurooppalaista alkuperää olevista ei-keliaakikoista noin 20–30 % kantaa DQ2-geenejä, joten on ilmeistä, että DQ2/DQ8-positiivisuus ei yksin selitä keliakiaan sairastumista.

Vain noin 3 % DQ2-molekyyliä ilmentävästä väestöstä sairastuu keliakiaan. Lisäksi konkordanssi monotsygoottisilla kaksosilla on paljon korkeampi kuin HLA-identtisillä ditsygoottisilla kaksosilla. Nämä tiedot viittaavat siihen, että HLA-alueen ulkopuolella on olemassa tärkeitä geenejä, jotka liittyvät keliakian patogeneesiin. (Adamovic ym., 2007; Wolters & Wijmenga, 2008.) Geneettiset kytkentäanalyysit tai assosiaatiotutki- mukset ovat paljastaneet, että mahdollisia keliakiaan liittyviä geenejä on kromosomi- alueilla 2q33 (Djilali-Saiah ym., 1998), 5q32 (Adamovic ym., 2007), 6q21-22, (van Belzen ym., 2003) 6q25.3 (van Belzen ym., 2004), 9p21-13 (van Belzen ym., 2004), 15 ja 19p13.1 (van Belzen ym., 2003). Lisäksi muissa geneettisissä assosiaatiotutkimuksis- sa on löydetty kahdeksan muuta lokusta (4q27, 1q31, 2q11-2q12, 3p21, 3q25-3q26, 3q28, 6q25 ja 12q24), joissa sijaitsevien immuunipuolustukseen liittyvien geenien vari- aatiot vaikuttavat riskiin sairastua keliakiaan (Hunt ym., 2008).

(19)

2.4 Epigenetiikka

2.4.1 Yleistä epigenetiikasta

Epigenetiikalla viitataan geenien ilmentymistason periytyvien muutosten tutkimukseen.

Epigeneettiset mekanismit liittyvät geenien toiminnan säätelyyn, eikä DNA- sekvenssissä itsessään tapahdu muutoksia. Geenien ilmentymisen säätelyn epigeneettinen kontrollointi periytyy solun jakautuessa tytärsoluihin kromatiinin rakenteen mukana.

Kaksi tärkeintä epigeneettistä mekanismia on kromatiinin histoniproteiinien translaation jälkeinen muokkaus sekä DNA:n metylaatio, jota tapahtuu pääasiassa CpG- dinukleotideissa. Nisäkkäillä noin 80 % sytosiineista, jotka ovat osana CpG- dinukleotideja, ovat metyloituneita. Suurin osa ei-metyloituneista sytosiineista sijaitsee CG-rikkaissa sekvensseissä eli CpG-saarekkeissa, joita löytyy erityisesti geenien pro- moottorialueilta. Histonien muokkausta, kuten metylaatiota ja asetylaatiota sekä DNA:n metylaatiota säädellään eri tavalla, mutta mekanismit ovat kytkeytyneitä toisiinsa. Epi- geneettiset muutokset ovat vakaita, mutta palautuvia prosesseja, jotka ovat välttämättö- miä normaalille solujen kehitykselle ja erilaistumiselle. (Curradi ym., 2002; Docherty ym., 2009; Jiang ym., 2004; Wilson, 2008.)

Epigeneettisillä mekanismeilla on tärkeä rooli eukaryoottien geeninsäätelyssä ja epige- neettisen kontrolloinnin avulla sellaisia geenejä pystytään hiljentämään solutyypeissä, joissa niiden tuotteita ei tarvita. Epigeneettistä kontrollointia tapahtuu erityisesti nisäk- käiden kehitysvaiheessa. Esimerkkinä tästä on X-kromosomin inaktivaatio, joka tasaa siinä olevien geenien toimintaa eri sukupuolten välillä sekä genominen leimautuminen, jossa alleeleja ilmennetään eri tavalla riippuen siitä, kummalta vanhemmalta alleeli on peritty. Kumpaankin tapahtumaan liittyy DNA:n metylaatiota sekä histonien deasetylaa- tiota ja esimerkiksi histonin H3 lysiinin 27 trimetylaatiota (H3-K27me3), jotka kaikki hiljentävät geenien toimintaa. (Hewagama & Richardson, 2009; Wolfe & Matzke, 1999;

Zhao ym., 2008.) Transkriptionaalisesti aktiivisessa kromatiinissa DNA on metyloitu- maton ja histonit ovat asetyloituneita, ja päinvastoin. Kun DNA on metyloitunut, metyylisytosiineja sitovat proteiinit sitoutuvat siihen ja houkuttelevat paikalle kromatiinin inaktivaatiokomplekseja sisältäen myös histonideasetylaaseja. Histonideasetylaasit pois- tavat asetyyliryhmiä histoneista, mikä edesauttaa tiiviin, transkriptionaalisesti inaktiivi- sen kromatiinirakenteen muodostumisen. (Richardson, 2007.)

(20)

Epigenetiikan ala on nopeasti kasvava kuin myös ymmärrys sen kliinisestä merkitykses- tä. Nykyään on yhä enemmän tullut ilmi viitteitä siitä, että epigenetiikalla on merkittävä rooli erilaisissa sairauksissa, kuten syövässä ja tulehduksellisissa oireyhtymissä. Epige- neettisiä muutoksia voivat aiheuttaa myös ympäristötekijät koko elämän ajan. Esimer- kiksi ravinnosta peräisin olevilla tekijöillä voi olla merkittäviä vaikutuksia tiettyjen geenien ilmentymiseen juuri epigeneettisten modifikaatioiden kautta. Nämä muutokset voivat sitten periytyä seuraaville sukupolville. (Richardson, 2007; Wilson, 2008.)

2.4.2 Histoniproteiinien translaation jälkeinen muokkaus

Histonit ovat DNA:n pakkausproteiineja, ja yhdessä DNA ja histonit muodostavat nuk- leosomeja, kromatiinin alayksiköitä. Nukleosomaalisia histoniproteiineja on neljää pää- tyyppiä: H3, H4, H2A ja H2B, joita kutakin on kaksi kopiota yhdessä nukleosomissa.

Kromatiinirakenteen avulla DNA saadaan pakattua tiiviimmäksi, mutta sen avulla myös säädellään transkriptiotekijöiden pääsyä DNA:n lähelle ja sitoutumista siihen. Histonien aminoterminaalisten päiden translaation jälkeisiä kovalenttisia modifikaatioita on yli 60 erilaista ja yleisimpiä niistä ovat asetylaatio, metylaatio, fosforylaatio sekä ubikitinaatio.

(Hirst & Marra, 2009; Richardson, 2007.)

Histonien asetylaatio on palautuva muutos, joka kohdistuu tiettyihin aminohappoihin histoniproteiineissa. Sitä kontrolloivat histoniasetylaasit (HAT) ja histonideasetylaasit (HDAC), jotka tyypillisesti toimivat transkriptionaalisina ko-aktivaattoreina ja ko- repressoreina. Histonien asetylaatio on parhaiten ymmärretty histonimodifikaatiomuoto, ja sen epänormaali säätely voi johtaa poikkeavaan geeniekspressioon sekä tuumori- geneesiin. Asetylaatio voi säädellä geeniekspressiota kahdella tasolla: yleisellä tai pro- moottorikohtaisella. Yleinen asetylaatio korreloi yleisen transkriptionaalisen aktiivisuu- den kanssa, mutta promoottorikohtainen on tärkeä mekanismi tiettyjen geenien aktiivi- suuden säätelyssä. Histonien asetylaatio vaikuttaa kromatiinirakenteen lisäksi myös transkriptiota sääteleviin proteiineihin ja niiden vuorovaikutukseen DNA:n kanssa.

Esimerkiksi, jos HDAC poistaa asetyyliryhmiä, siitä seuraa kromatiinin tiivistymistä ja transkription repressiota. Se voi myös indusoida muita epigeneettisiä mekanismeja, kuten DNA:n metylaatiota, mikä johtaa pysyvään geenin hiljenemiseen. (Vaissière ym., 2008.)

(21)

Histonien metylaatio kohdistuu suurilta osin histonien H3 ja H4 aminoterminaalisiin lysiiniaminohappoihin. Metylaation vaikutus geeniaktiivisuuteen riippuu kohteena ole- vasta lysiinistä sekä siitä, missä kohtaa geeniä kyseinen histoni sijaitsee. Esimerkiksi alkionkehityksen aikana normaalin kehityksen kannalta tärkeitä geenejä repressoiva tekijä on histonin 3 lysiinin 27 trimetylaatio (H3K27me3). Myös histonin 4 lysiinin 20 metylaatio (H4K20me) liittyy transkriptionaaliseen hiljentämiseen ja sen metylaatiostatus vaihtelee solujen erilaistumisen aikana. Transkription aktivaatioon puolestaan liittyy esimerkiksi histonin 3 lysiinin 4 trimetylaatio (H3K4me3), joka on yleistä etenkin tran- skriptoitavien geenien 5’-päässä. (Hirst & Marra, 2009; Lennartsson & Ekwall, 2009.)

2.4.3 DNA:n metylaatio

Nisäkkäillä suurin osa genomin CpG-dinukleotideista on kemiallisesti modifioitunut siten, että metyyliryhmä on kovalenttisesti kiinni sytosiinirenkaan C5-asemassa. (Kuva 2.5.) Metyylisytosiineja löytyy kaikkialta genomista; proteiineja koodaavilta alueilta, endogeenisistä toistojaksoalueilta sekä transposoneista, ja ne aiheuttavat transkription repressiota. Metyylisytosiinit kuitenkin deaminoituvat spontaanisti tymiineiksi, mikä on johtanut CpG-dinukleotidien mutatoitumisen TpG:ksi ja CpA:ksi. Tämän vuoksi CpG- dinukleotidien määrä genomissa on pienempi, mitä odotusarvon perusteella voisi olettaa (21 % odotusarvosta). (Cross & Bird, 1995; Illingworth & Bird, 2009.)

Kuva 2.5. DNA:n metylaatiossa CG-dinukleotidin sytosiinin 5’-asemaan on kovalentti- sesti liittynyt metyyliryhmä. (Mukaillen Barros & Offenbacher, 2009.)

(22)

DNA:n metylaatiosta vastaavat de novo- ja ylläpitometyylitransferaasit. Alkionkehityk- sen aikaisessa vaiheessa DNA:n metylaatiopohjan muodostumisesta vastaavat de novo- metyylitransferaasit Dnmt3a ja -3b. Ylläpitometyylitransferaasi Dnmt1 sen sijaan vastaa metylaation levityksestä ja ylläpidosta solusukupolvien välillä. (Vaissière ym., 2008.) DNA:n metylaatio on suorin epigeneettinen mekanismi, jolla solut pystyvät säilyttä- mään geenirepression solujen jakautuessa. Symmetrisesti metyloituneilla CpG- dinukleotideilla on yksi metyylisytosiini kummassakin DNA-kaksoisjuosteessa repli- kaation jälkeen. DNA-synteesin jälkeen hemimetyloitunut CpG-dinukleotidi metyloi- daan nopeasti noin minuutissa. (Wolfe & Matzke, 1999.) (Kuva 2.6.) Synteesin jälkei- nen metyyliryhmän lisäys sytosiineihin muuttaa DNA:n isomman uurteen (major groo- ve) muotoa ja nämä DNA:n epigeneettiset markkerit kopioituvat edelleen syntetisoidun DNA:n kromatiinirakenteeseen. (Jones & Takai, 2001.) DNA:n metylaatiolla on tärkeä rooli normaalissa solun toiminnassa ja poikkeava metylaatioprofiili voi osaltaan vaikuttaa eri sairauksien syntyyn ihmisillä (Wilson, 2008).

Kuva 2.6. DNA:n metylaatiostatuksen periytyminen. (Mukaillen www.web- books.com/MoBio/Free/Ch7F2.htm, 6.10.2009.)

Metylaatio vaikuttaa proteiinien ja DNA:n vuorovaikutukseen, mikä johtaa kromatiinin rakenteen muutoksiin. Lopputuloksen kannalta kriittisintä on se, missä kohtaa geenise- kvenssiä metylaatiomuutos tapahtuu suhteessa transkription aloituskohtaan. (Docherty

(23)

ym., 2009; Jones & Takai, 2001.) Geenien säätelyalueilla olevat metyloituneet sytosiinit häiritsevät transkriptiotekijöiden sitoutumista promoottorialueelle sekä saavat aikaan metyyliryhmiä sitovien proteiinien sitoutumisen metyloituneisiin CpG-dinukleotideihin.

Nämä metyyliryhmiä sitovat proteiinit houkuttelevat paikalle histonideasetylaaseja, jotka deasetyloivat histoniproteiineja, jolloin nukleosomit tiivistyvät ja geenien toiminta hiljenee. (Docherty ym., 2009; Wilson, 2008.)

2.4.3.1 CpG-saarekkeet

CpG-saarekkeet ovat tavallisesti metyloitumattomia 1-2 kiloemäksen pituisia alueita DNA:ssa, jotka yhdessä kattavat noin 2 % genomista. Kaikki geenit huomioon ottaen, 60–70 % sisältää niiden 5’-puolella CpG-saarekkeita, jotka useimmiten kattavat promoottorin, transkription aloituskohdan sekä ensimmäisen eksonin. CpG-saarekkeiden G+C-pitoisuus (60–70 %) on suurempi kuin muualla genomissa (40 %) ja niissä CpG- dinukleotidien tiheys on suurempi. (Cross & Bird, 1995; Illingworth & Bird, 2009.) Kaikkien jatkuvasti ilmennettävien ylläpitogeenien promoottoreissa on CpG-saarekkeita ja lisäksi noin puolet kudosspesifisten geenien promoottereista sisältää CpG-saarekkeita (Antequera, 2003).

CpG-saarekkeita löytyy promoottorialueiden lisäksi myös geenien koodaavilta alueilta.

Esimerkiksi geenissä APOE on sisäinen CpG-saareke, joka kattaa eksonin 4. Intrageeni- siä CpG-saarekkeita on yleensä niissä geeneissä, joiden ekspressio on rajoittuneempaa.

(Jones, 1999.) Intrageeniset CpG-saarekkeet voivat itse asiassa sisältää sellaisia transkription aloituskohtia, joita ei ole vielä identifioitu. On mahdollista, että näitä ”ylimää- räisiä” promoottoreita hyödynnetään hyvin kudosspesifisellä tavalla. Useat transkriptit alkavat intrageenisistä CpG-saarekkeista, ja niiden on huomattu ilmentyvän tiettyjen kehitysvaiheiden aikana. (Illingworth & Bird, 2009.)

Suurin osa CpG-saarekkeita sisältävistä promoottoreista pysyy metyloitumattomana jopa niissä solutyypeissä, joissa kyseisiä geenejä ei ilmennetä ollenkaan (Weber ym., 2007). Syytä, miksi useimmat promoottorialueiden CpG-saarekkeet pysyvät metyloitu- mattomina laajamittaisesta de novo -metylaatiosta huolimatta varhaisen alkionkehityksen aikana, ei täysin tiedetä. Todennäköisin selitys on se, että sitoutuneet perustran- skriptiotekijät vievät tilan eli muodostavat steerisen esteen Dnmt:n sitoutumiselle. (Ku-

(24)

va 2.7.) Tätä vaihtoehtoa tukevat tutkimustulokset globiinigeenien ilmentymisestä hiiren alkionkehityksen aikana. α-globiinia, jonka promoottori sisältää CpG-saarekkeen, transkriptoidaan alkiossa, kun taas transkriptionaalisesti hiljainen β-globiini, jonka promoottori ei sisällä CpG-saareketta, ei ilmenny alkiossa. Hiiren embryogeneesin tarkem- pi analyysi osoitti, että 93 % tutkituista ekspressoiduista geeneistä sisälsivät promootto- reissaan CpG-saarekkeen. Näin ollen CpG-saarekkeet voivat olla transkriptiomekanis- min aikaansaamia jälkiä alkionkehityksen de novo -metylaation aikana. (Illingworth &

Bird, 2009.)

Kuva 2.7. Potentiaalinen mekanismi CpG-saarekkeiden hypometylaatiolle. Perustran- skriptiotekijät (RNA polymeraasi II ja TF) sekä yleensä aktiivisiin geeneihin assosioitu-

va histoniproteiinin metylaatio (H3K4me3) estävät metyylitransferaasien sitoutumisen transkription aloituskohtaan. Mustat pallot kuvaavat metyloituneita CpG-dinukleotideja

ja valkoiset metyloitumattomia. (Mukaillen Illingworth & Bird, 2009.) Metyloituneet CpG-saarekkeet

Promoottorialueilla olevien CpG-saarekkeiden de novo-metylaatiota tapahtuu genomi- sessa leimautumisessa, X-inaktivaatiossa, kehityksellisissä sairauksissa sekä syövässä.

(Shen ym., 2007.) Metyloituneen DNA:n transkription hiljentämiseen osallistuvat MeCP-proteiinit (methyl-CpG-binding protein), jotka sitoutuvat spesifisesti metyloituneisiin CpG-dinukleotideihin ja houkuttelevat paikalle histonien deasetylaaseja ja muita transkriptionaalisia repressoreita. CpG-dinukleotidit aiheuttavat vahvan MeCP- proteiinien sitoutumisen ja saavat aikaan hyvin tehokkaan ja stabiilin transkription repression kromatiinirakenteen muutosten seurauksena. (Antequera, 2003; Weber ym., 2007.)

(25)

Nykyään on yleisesti hyväksytty, että CpG-saarekkeet ylläpitogeeneissä sekä kudoss- pesifisissä geeneissä lukuun ottamatta edellä mainittuja leimautumisgeenejä sekä X- inaktivaatioon liittyviä geenejä eivät ole metyloituneita missään vaiheessa. Suurin osa CpG-saarekkeista on siis metyloitumattomia normaaleissa kudoksissa, mutta muutaman saarekkeen tiedetään olevan metyloitunut. Nämä saarekkeet eivät liity leimautumiseen eivätkä X-inaktivaatioon, ja niillä on todennäköisesti rooli kudosspesifisten geenien ohjatussa ekspressiossa erilaistumisprosessissa. (Shen ym., 2007.)

Monien geenien kohdalla CpG-saarekkeen metylaation on todettu korreloivan transkription hiljentymisen kanssa normaaleissa soluissa. Useimmissa tapauksissa korrelaatioon liittyvät kuitenkin intrageeniset CpG-saarekkeet eivätkä promoottorialueen saarekkeet.

Kuitenkin myös muutaman promoottorialueen saarekkeen metylaation on todettu korreloivan transkription hiljentymisen kanssa, mutta näissä CpG-dinukleotidien tiheys on ollut alhainen. (Shen ym., 2007.) Onkin todennäköistä, että geenirepression voimakkuus riippuu paikallisesta CpG- ja metylaatiotiheydestä promoottorialueella (Boyes & Bird, 1992).

2.4.3.2 Intrageeninen metylaatio

Toisin kuin promoottorialueen tavallisesti metyloitumattomat CpG-saarekkeet, geeneis- sä sijaitsevat liikkumis- ja kopioitumiskykyiset elementit eli transposonit, kuten LINEt (usean kiloemäksen pituiset genomiset toistojaksot), SINEt (lyhyet genomiset toistojaksot) ja endogeeniset retrovirustyyppiset transposonit ovat hyvin metyloituneita somaat- tisissa kudoksissa. Nämä elementit kattavat enemmän kuin 45 % ihmisen genomista ja vastaavat suurilta osin genomin kaikista metyloituneista CpG-dinukleotideista. Useim- miten näitä liikkuvia elementtejä löytyy intronisilta alueilta, joten intrageeninen CpG- metylaatio on yleistä transkription aloituskohdasta alavirtaan. (Lorincz ym., 2004.)

Epigenomiset tutkimukset ovat osoittaneet, että transkription etenemisen (elongation) epigeneettinen kontrollointi on laajalle levinnyt säätelymekanismi. Intrageenistä DNA:n metylaatiota tapahtuu enemmän, ja sillä on laajempi vaikutus geenien ekspressiotasoon kuin promoottorialueen metylaatiolla. Metylaatio proteiineja koodaavilla alueilla voikin yksinään inhiboida geeniekspressiota. Choi ym. (2009) on tutkinut erityisesti koodaavi- en sekvenssien raja-alueiden nukleosomien rakennetta ja niissä esiintyvää DNA:n mety-

(26)

laatiota. Raja-alueiden rooli on ilmeisesti RNA:n pilkkomisen kontrolloinnissa. Ensim- mäisen ja viimeisen eksonin pitää transkriptoitua mRNA:han, jotta saadaan aikaan toi- miva proteiini. Kun transkription eteminen hidastuu näiden epigeneettisten markkereiden kohdalla, välttämättömien eksonien mukaan saaminen tehostuu. (Choi ym., 2009.) Lorincz ym. (2004) puolestaan on osoittanut, että metylaatio alavirtaan aktiivisesta promoottorista voi vaikuttaa negatiivisesti transkription etenemiseen nisäkässoluissa.

Intrageeninen metylaatio ei kokonaan estä transkription etenemistä, mutta on mahdollista, että tällainen metylaatio kuitenkin vähentää sen tehokkuutta. Tämä johtuu siitä, että intrageeninen metylaatio indusoi tiiviin kromatiinirakenteen muodostumista histonien hypoasetylaation kautta. (Lorincz ym., 2004.)

2.4.4 Ympäristötekijät, epigeneettiset muutokset ja autoimmuniteetti DNA:n ja histonien epigeneettiset muutokset muodostavat linkin genotyypin ja fenotyypin välille. Periytyvät epigeneettiset markkerit muodostuvat alkionkehityksen aikana ja niiden syntyyn vaikuttavat sisäisten tekijöiden lisäksi myös ympäristötekijät. Näin muodostuu epigenotyyppi, joka määrittää eri geenien aktivaation tai repression kautta yksilön fenotyypin. Ikääntyessä erilaiset ympäristö-, toksikologiset sekä ravitsemuksel- liset tekijät vaikuttavat epigeneettisten markkereiden somaattiseen ylläpitoon ja sitä kautta epigenotyyppiin ja lopulta fenotyyppiin. (Feil, 2006.) (Kuva 2.8.)

Kuva 2.8. Genotyypin, epigenotyypin ja fenotyypin linkittyminen toisiinsa. (Mukaillen Feil, 2006.)

(27)

Tekijät, joiden tiedetään vaikuttavan DNA:n metylaatioon, ovat karsinogeenit, tulehdukset sekä ruokavalio. Karsinogeeneista ainakin tupakan, alkoholin, arseenin ja asbes- tin on todettu liittyvän metylaatiomuutoksista aiheutuvaan geeniaktivaatioon monissa syövissä. Tämän vuoksi voidaan olettaa, että erilaisille ympäristötekijöille altistuminen elämän aikana voi vaikuttaa suoraan tai epäsuorasti metylaatiomuutoksiin ja edistää muidenkin sairauksien syntyä. (Christensen ym., 2009.)

Geenien epigeneettinen tila on altis muutoksille ympäristötekijöiden vaikutuksesta koko aikuiselämän ajan ja yleisesti ottaen genomin metylaatio vähenee iän mukana (Grolleau- Julius ym., 2009.). Toisaalta taas CpG-saarekkeiden metylaation on todettu lisääntyvän ikääntyessä (Christensen ym., 2009). Ikään liittyvä DNA:n metylaation muutos on hyvin dokumentoitua, mutta histonien modifikaatioista on sen sijaan vain vähän tietoa. On arvioitu, että epigeneettisten muutosten toistumistiheys eliniän aikana olisi yksi tai kaksi kertaa nopeampi kuin somaattisilla mutaatioilla. Yksi selitys tähän voi olla eroavaisuu- det ympäristötekijöille altistumisen kestossa. Myös identtisten kaksosten epigenetiikas- sa on sitä enemmän eroja, mitä vähemmän aikaa he ovat kasvaneet yhdessä samassa ympäristössä. (Grolleau-Julius ym., 2009.)

Ympäristötekijöille altistuminen voi saada aikaan epigeneettisiä muutoksia, jotka periy- tyvät myös jälkeläisille. Tutkimustuloksia tästä on saatu erityisesti hiirikokeilla. Esi- merkiksi hiirien ruokavalion sisältämä metyylilisäravinne raskauden aikana vaikuttaa jälkeläisten epigeneettiseen vaihtelevuuteen ja DNA:n metylaatioon, ja sitä kautta jälke- läisten terveyteen sekä eliniän pituuteen. Näiden tutkimustulosten valossa voidaan sanoa, että hiirillä ruokavalio ja/tai metaboliset vaikutukset säätelevät endogeenisten ret- rovirustyyppisten transposonien (IAP) pitkien terminaalisten toistojaksojen (LTR, long terminal repeats) ilmentymistä, maternaalista epigeneettistä periytyvyyttä sekä leimau- tumista. Myös ihmisillä on samanlaisia endogeenisiä transposoneita (HIAP), jotka liit- tyvät moniin immunologisiin sairauksiin. (Cooney ym., 2002; Wolff ym., 1998.)

Heijmans ym. (2008) osoittivat ensimmäisenä, että alkion varhaisessa kehitysvaiheessa tietyille tilapäisille ympäristötekijöille altistuminen voi aiheuttaa epigeneettisiä muutoksia, jotka ovat pysyviä koko elämän ajan. Tutkimuksessa verrattiin Hollannissa vuosien 1944–1945 aikana nälänhädälle altistuneiden raskaana olevien naisien jälkeläisiä heidän samaa sukupuolta oleviin sisaruksiin sekä ei sukua oleviin, jotka olivat syntyneet ennen

(28)

nälänhätäjaksoa. Tutkimuksessa havaittiin, että hedelmöitymisen aikaan nälänhädälle altistuneilla IFG2-geeni oli vähemmän metyloitunut kuin verrokeilla vielä kuuden vuo- sikymmenen jälkeenkin. IFG2-geeni on tärkeä tekijä ihmisen kasvu- ja kehitystapahtu- missa, ja se on maternaalisesti leimautunut ja metyloitunut. IFG2-geenin hypometylaa- tio saa aikaan sen, että geenin molemmat alleelit ilmentyvät, vaikka normaalisti vain toisen alleelin pitäisi ilmentyä. (Heijmans ym., 2008.)

Immunologinen toleranssi on välttämätön normaalille immuunijärjestelmän toiminnalle ja sen menettäminen voi johtaa autoimmuniteettiin. Epigeneettiset mekanismit voivat häiriintyä tiettyjen ympäristötekijöiden vuoksi, mikä voi johtaa poikkeavaan geeniekspressioon tietyissä soluissa. Seurauksena on, että nämä solut menettävät immunologisen toleranssinsa ja edistävät autoimmuunisairauden syntyä henkilöillä, jotka ovat sille ge- neettisesti alttiita. (Hewagama & Richardson, 2009.)

Epigeneettiset mekanismit ovat osoittautuneet liittyvän syöpien, synnynnäisten ja perin- nöllisten sairauksien lisäksi myös eräiden autoimmuunisairauksien patogeneesiin. Näitä ovat mm. reumaattiset sairaudet, kuten nivelreuma sekä etenkin SLE (systemic lupus erythematosus, perhosreuma), jossa DNA:n metylaation osuutta sairauteen on eniten tutkittu. (Richardson, 2007.) Lisäksi epigeneettiset häiriöt voivat vaikuttaa lupuksen (ihohukka), MS-taudin (multiple sclerosis, pesäkekovettumatauti) ja tyypin 1 diabetek- sen syntyyn. (Hewagama & Richardson, 2009.) Epigeneettiset muutokset ovat solu- tyyppispesifisiä. Esimerkiksi SLE:ssä muutoksia DNA:n metylaatiossa ja histoniproteiinien modifikaatioissa tapahtuu CD4⁺ T-soluissa ja B-soluissa. Nivelreumassa puolestaan muutoksia histoniasetylaatiossa tapahtuu lymfosyyteissä sekä nivelpussin sisäker- roksen (synovial) fibroblasteissa ja MS-taudissa aivosoluissa retroviraalisten elementtien ekspressio on häiriintynyt. (Renaudineau, 2009.)

2.5 Bisulfiittisekvensoinnin periaate

Bisulfiittisekvensointi on yleisin menetelmä, jolla voidaan tutkia DNA:n metylaatiostatusta yhden emäksen tarkkuudella. Menetelmän kehitti Frommer ym. (1992), koska pe- rinteisellä Sangerin dideoksisekvensoinnilla ei voi erottaa sytosiineja ja metyylisytosiineja toisistaan. (Grunau ym., 2001.) Metylaatiostatusten tutkimiseen on yritetty käyttää myös Maxam-Gilbertin menetelmää yhdistettynä erilaisiin lisätoimenpiteisiin

(29)

signaalin vahvistamiseksi, mutta tulosten tulkinta oli vaikeaa. Bisulfiittisekvensointi perustuu siihen, että yksijuosteisen DNA:n metyloitumattomat sytosiinit konvertoituvat (deaminoituvat) urasiileiksi natriumbisulfiitin avulla. Modifioitu DNA monistetaan PCR:n avulla ja sekvensoidaan suoraan tai subkloonauksen kautta. Koska 5- metyylisytosiinit eivät reagoi bisulfiitin kanssa toisin kuin metyloitumattomat sytosiinit, lopullisessa sekvensointituloksessa kaikki alkuperäiset sytosiinit ilmenevät tymiineinä, kun taas metyylisytosiinit ilmenevät sytosiineina. (Frommer ym., 1992; Grunau ym., 2001.)

(30)

3 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET

Koska suurin osa DQ2-positiivisista henkilöistä ei sairastu keliakiaan, pro gradu - tutkielman tarkoituksena oli alustavasti selvittää DQ2-geenien promoottorien metylaatiostatusta keliakiassa. Tarkemmat tavoitteet olivat:

1. tutkia in silico DQ2-geenien promoottorialueita mahdollisten CpG-saarekkeiden identifioimiseksi sekä CpG-dinukleotidien määrän analysoimiseksi

2. pystyttää bisulfiittisekvensointimenetelmä, jolla voidaan analysoida DQ2- geenien promoottorialueiden metylaatiostatusta

3. selvittää, poikkeaako DQ2-geenien promoottorien metylaatiostatus DQ2- positiivisten keliaakikkojen ja ei-keliaakikkojen kesken; verrata hoidolla olevien ja gluteenille altistettujen DQ2-positiivisten keliaakikkojen DQ2-geenien promoottorien metylaatiostatusta; ja tutkia, voiko metylaatiostatuksen selvittää ko- koverestä pelkkien lymfosyyttien sijaan vai häiritsevätkö veren granulosyytit saatuja tuloksia.

(31)

4 MATERIAALIT JA MENETELMÄT

4.1 DQ2-geenien CpG-saarekkeiden määrittäminen in silico

DQ2-geenien promoottorialueilla olevat mahdolliset CpG-saarekkeet ja niiden sekvenssit määritettiin National Center for Biotechnology Information (NCBI) -sivuston Entrez Gene-tietokannassa (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/mapview/) olevien tietojen avulla.

4.2 Näytteet

Tutkittavat näytteet olivat peräisin seitsemältä eri henkilöltä, joista yksi oli DQ2- positiivinen ei-keliaakikko ja loput kuusi DQ2-positiivisia keliaakikkoja. Näytteet olivat joko pakastettuja tai tuoreita kokoverinäytteitä tai pakastettuja lymfosyyttinäytteitä. Ei- keliaakikon ja yhden hoidolla olevan keliaakikon tuoreet verinäytteet saatiin vapaaeh- toisilta, ja niitä käytettiin sellaisenaan ja lisäksi niistä eristettiin lymfosyytit.

Muiden keliaakikkojen näytteet saatiin tutkimuksesta, johon oli eettisen lautakunnan suostumus (PSHP R07107). Hoidolla olevat tutkimukseen osallistuneet potilaat olivat oireettomia, seerumin keliakiavasta-aineiden suhteen negatiivisia ja heidän ohutsuolen limakalvonsa olivat terveet. Näistä potilaista saatuja näytteitä oli kaksi pakastettua ko- koverinäytettä ja yksi pakastettu lymfosyyttinäyte, joita tässä tutkimuksessa käytettiin.

Potilaat oli altistettu kolmen vuorokauden ajan gluteenille ja kolme päivää gluteenialtistuksen päättymisen jälkeen potilaista oli kerätty verinäytteet. Verinäytteistä osa oli pakastettu sellaisenaan ja osasta oli eristetty lymfosyytit, jotka oli myös pakastettu. Näistä näytteistä tähän tutkimukseen saatiin viisi kokoverinäytettä ja yksi lymfosyyttinäyte.

(Taulukko 4.1.)

Taulukko 4.1. Tutkimuksessa käytetyt näytteet.

Kokoveri Tuoreet lymfosyytit Pakastetut lymfosyytit

Ei-keliaakikko, n=1 1 1 –

Hoidolla oleva keliaakikko, n=4 3 1 1

Gluteeni-altistettu keliaakikko, n=5 5 – 1

(32)

4.2.1 Pakastettujen lymfosyyttien sulatus

Pakastetut lymfosyyttinäytteet, jotka olivat RPMI-mediumissa ja 10 % DMSO:ssa, sula- tettiin laittamalla putket heti nestetypestä vesihauteeseen, 37 C. Kun näytteet olivat sulaneet, putket desinfioitiin 70 % etanolilla kontaminaatioiden estämiseksi ja näytteet suspensoitiin 9 ml:aan PBS:ää (1 X phosphate-buffered saline). Tämän jälkeen näytteet sentrifugoitiin (Sigma 4-10) 250 x g, 10 minuuttia, poistettiin supernatantti ja suspensoitiin pelletti 5 ml:aan PBS:ää. Solususpensiot säilytettiin +4 C:ssa.

4.2.2 Lymfosyyttien eristäminen tuoreista kokoverinäytteistä

Tuoreista kokoverinäytteistä eristettiin lymfosyytit käyttämällä Accuspin™ System- Histopaque®-1077 -putkia (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA). Ennen varsinais- ta eristystä, +4 °C:ssa säilytettävien Accuspin-putkien annettiin olla huoneenlämmössä noin 30 minuuttia valolta suojattuna. Verinäytteitä applikoitiin 4 ml/putki ja sentrifugoitiin (Sigma 4K15) huoneenlämmössä 1000 x g, 10 minuuttia. Tämän jälkeen plasmaker- rokset poistettiin pasteurpipetillä ja kerättiin mononukleaaristen solujen muodostamat kerrokset (MNC-fraktiot) talteen 15 ml:n putkiin. MNC-fraktiot pestiin 10 ml:lla PBS:ää (1 X phosphate-buffered saline), sekoitettiin varovasti ja sentrifugoitiin (Sigma 4-10) huoneenlämmössä 250 x g, 10 minuuttia. Toistettiin PBS-pesu ja sentrifugointi.

Lopuksi solut resuspensoitiin 5 ml:aan PBS:ää ja laskettiin solut. Solususpensiot säily- tettiin +4 °C:ssa.

4.3 DNA:n eristys

DNA:n eristyksessä käytettiin EZ DNA Methylation Direct -kitin (Zymo Research Corp., Orange, CA, USA) protokollaa B näytteiden proteinaasi K -käsittelyssä sekä so- vellettiin kitin protokollaa sen jälkeisessä näytteiden puhdistuksessa. Proteinaasi K - käsittelyyn käytetty lymfosyyttimäärä oli noin 20 000 solua ja verimäärä 0,5 µl sekä muut reagenssit 13 µl M-Digestion puskuria, 1 µl proteinaasi K:ta ja steriiliä vettä 26 µl:aan asti. Näytteitä inkuboitiin 20 minuuttia +50 °C:ssa, minkä jälkeen niitä sekoitettiin ja sentrifugoitiin (Eppendorf 5417R) 10 000 x g, 5 minuuttia, RT. Supernatantista jatkokäsittelyyn otettiin 20 µl näytettä, joka laitettiin yhdessä 600 µl sitojapuskurin (M- Binding Buffer) kanssa Zymo-Spin™ IC kolumniin kerääjäputkessa. Näytteitä sekoitettiin kääntelemällä ja sentrifugoitiin 20 800 x g, 30 s. Tämän jälkeen kolumnin matrik-

(33)

siin sidottu DNA pestiin lisäämällä ensin 100 µl pesupuskuria (M-Wash Buffer), sentrifugoimalla ja lisäämällä vielä 200 µl pesupuskuria ja sentrifugoimalla kuten aikaisemmin. Lopuksi DNA eluoitiin siirtämällä kolumnit 1,5 ml:n sentrifuugiputkiin, lisäämällä 10 µl eluointipuskuria (M-Elution Buffer) suoraan kolumnien matriksiin sekä sentrifugoimalla, kuten edellä. Eluoitu DNA säilytettiin -20 °C:ssa.

4.4 PCR

DQB1-geenin promoottorille oli käytettävissä neljä eri aluketta (Sigma-Aldrich Finland Oy, Helsinki, Suomi), kaksi forward- ja kaksi reverse-aluketta. PCR:n toimivuutta kokeiltiin forward- ja reverse-alukkeiden eri yhdistelmillä. DQA1-geenin promoottorille oli vain yksi alukepari (Sigma-Aldrich). Taulukkoon 4.2. on merkitty käytetyt alukeyh- distelmät, niiden sekvenssit, alukkeiden kiinnittymislämpötilat (Ta) sekä PCR-tuotteiden oikeat koot (bp). Alukkeiden nimissä olevat lukuarvot tarkoittavat etäisyyttä (- ja +) transkription aloituskohdasta. Nimistä käy ilmi myös niiden suunta (fwd / rev) ja koh- degeeni.

Taulukko 4.2. PCR:n optimoinnissa käytetyt alukeyhdistelmät. (Ta-arvot laskettu kaa- valla 3 x (C+G) + 2 x (AT).)

Alukepari Sekvenssi (5’ -> 3’) Ta

PCR-tuotteen koko (bp)

-158 Fwd DQB1 +247 Rev DQB1

CAGTACAATTTGAAGACGTC CAAGGAGAGCCTGTTCCC

48

47 405

GCTCTTCTATAATCGAGAGG GATGAAAGATTGTGTCCAAG

47

48 502

CAGTACAATTTGAAGACGTC GATGAAAGATTGTGTCCAAG

48

48 458

GCTCTTCTATAATCGAGAGG CAAGGAGAGCCTGTTCCC

47

47 449

-435 Fwd DQA1 +154 Rev DQA1

CGTCAGGGTCGATGAACCCTCC GGAGTGAGTACGTGAGTG

58

46 589

(34)

Tärkein huomioon otettava seikka PCR:n optimoinnissa on alukkeiden optimaaliset kiinnittymislämpötilat, jotka arvioitiin karkeasti laskemalla ne kaavan 3 x (C+G) + 2 x (A+T) avulla. Tutkimuksessa kokeiltiin ensin kiinnittymislämpötilaa 47 C kaikille alu- kepareille. Lisäksi DQA1-alukeparin optimaalisen kiinnittymislämpötilan määrittämi- seksi kokeiltiin 12 reaktion gradientti-PCR:ta, jossa T_a-arvona oli 50 C ja gradienttina 10 . Gradientti-PCR:n etu on, että voidaan samanaikaisesti kokeilla useita eri T_a-arvoja.

DQA1-alukeparin toimivuutta kokeiltiin myös touchdown-PCR:n avulla. Touchdown- PCR:n periaate on, että syklit aloitetaan ensin laskettua T_a-arvoa korkeammalta ja läm- pötilaa lasketaan jokaisen tai joka toisen syklin jälkeen esimerkiksi yhdellä asteella, kunnes saavutetaan laskettu kiinnittymislämpötila tai muutaman asteen alempi. Näin saadaan vähennettyä epäspesifisten tuotteiden monistumista. Tässä tutkimuksessa T_a- arvona oli ensin 57 C, joka laski 0,5 C 20 syklin ajan, minkä jälkeen oli vielä 20 syk- liä saavutetulla 47 C:n Ta-arvolla.

Monistettavan DQA1-geenin promoottorialueen korkean CG-pitoisuuden vuoksi PCR:n toimivuutta kokeiltiin lopuksi myös käyttämällä reaktioseoksissa DMSO:ta (5 %) sekä formamidia (2 % ja 5 %). Tulokset eri PCR-menetelmistä on esitetty kappaleessa 5.2.

Tutkimuksessa käytetty PCR-reaktioseos oli seuraavanlainen:

Zymo-Taq DNA-polymeraasi (Zymo Research) 0,5 l

dNTP-seos (Zymo Research) 0,5 l

2X reaktiopuskuri (Zymo Research) 25 l

Forward-aluke (20 M) 1 l

Reverse-aluke (20 M) 1 l

DNA-templaatti 4 l

ddH₂O 18 l

Yht. 50 l

(35)

Optimoinneista saatujen tulosten perusteella kaikki PCR-reaktiot ajettiin PCR-laitteessa (Eppendorf Mastercycler) seuraavanlaisella ohjelmalla:

95 C 10 min 95 C 30 s

47 C 40 s x 40 72 C 1 min

72 C 7 min 4 C 

PCR-tuotteet detektoitiin agaroosigeelielektroforeesin (BioRad POWER PAC 300) avulla. Käytetty agaroosigeeli oli 1,5-prosenttinen, ja se valmistettiin 0,5 X TBE- puskuriin. Oikean kokoiset tuotteet eristettiin geeliltä ja puhdistettiin QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) -ohjeiden mukaisesti.

4.5 Bisulfiittikonversio ja PCR konvertoidulle DNA:lle

Näytteiden bisulfiittikonversio tehtiin EZ DNA Methylation Direct -kitin ohjeiden mukaisesti. Proteinaasi K-käsittelyn jälkeen näytteistä otettiin 20 l supernatanttia, johon lisättiin 130 l CT konversioreagenssia (CT Conversion Reagent). Bisulfiittikonversios- sa käytettiin PCR-laitetta (Eppendorf Mastercycler) ja ohjelmana oli 98 C, 8 minuuttia ja 64 C, 3,5 tuntia. Tämän jälkeen konvertoitu DNA puhdistettiin kitin protokollan mukaisesti ja DNA:ta säilytettiin -20 C:ssa.

PCR:n optimoinnissa käytetty alukepari suunniteltiin Li & Dahiya (2002) kehittämän MethPrimer-ohjelman (http://www.urogene.org/methprimer/index1.html) avulla. Oh- jelma suunnittelee alukkeet sitoutumaan DNA:han sellaisille kohdille, joissa ei ole CpG-dinukleotidejä, mutta joiden tuottama tuote kuitenkin kattaa mahdollisimman suu- ren osan CpG-saarekkeesta. Taulukossa 4.3. on kerrottu alukkeiden nimet, sekvenssit, kiinnittymislämpötilat (T_a), PCR-tuotteen koko sekä tuotteeseen tulevien CpG- dinukleotidien määrä.