MÄÄRITYSMENETELMÄT

4.6.1 Määritysten valmistelu

Määritykset suoritettiin epästeriilisti huoneenlämpöisessä tilassa. Kaikkia määrityksissä käytettyjä fluoresoivia koettimia säilytettiin pakastimessa (-20 ºC), josta ne otettiin

huoneenlämpöön lämpenemään valolta suojattuna puoli tuntia ennen diuronialtistuksen loppumista. DCFH-DA ja DHE olivat valmiita laimennettavaksi sellaisenaan. Kohdassa 4.6.3.

kuvataan MitoSOX -jauheen esikäsittely käyttövalmiiksi liuokseksi. Koettimien laimentamiseen

käytettiin HBSS -puskuria (Hank’s Balanced Salt Solution) joka lämmitettiin vesihauteessa +37 ºC:een. Myös määrityksiin käytetty fluorometri (Infinite F200 Pro, Tecan, Grödig, Itävalta) ja siihen kytketty tietokone käynnistettiin käyttövalmiuteen.

Kemikaalialtistuksen loputtua magneettikenttäaltistetut ja sham-altistetut kuoppalevyt otettiin ulos inkubaattorista. Levyjä käsiteltiin samanaikaisesti. Kuopissa ollut diuronialtistus tai

kasvatusmedium imettiin pois kuopista Pasteur-pipettiä ja imuletkua käyttäen rivi kerrallaan.

Molemmista levyistä tyhjennettiin ensin yksi rivi kuoppia, joihin pipetoitiin heti 0,5 ml HBSS -puskuria niiden pesemiseksi diuronista. Näin edettiin rivi kerrallaan, kunnes kaikki kuopat oli tyhjennetty ja täytetty HBSS puskurilla. Ennen koettimien lisäämistä kuopat tyhjennettiin HBSS -puskurista rivi kerrallaan. Koettimien lisäys levyille ja määritysten suorittaminen on kuvattu seuraavaksi kohdissa 4.6.2 ja 4.6.3.

4.6.2 Yleisen happiradikaalituotannon määrittäminen SH-SY5Y -soluista

Solujen yleistä happiradikaalituotantoa määritetään DCFH-DA:n avulla. DCFH-DA eli 2’,7’-diklorodihydrofluoreskiinidiasetaatti on fluoresoiva väriaine, joka mittaa eri reaktiivisia

happiradikaaleja soluissa. Se läpäisee solujen solukalvon, minkä seurauksena solun esteraasit deasetyloivat sen fluoresoimattomaksi yhdisteeksi. Solun reaktiiviset happiradikaalit hapettavat yhdisteen 2’,7’-diklorofluoreskiiniksi (DCF), joka on taas erittäin fluoresoiva. DCF:lle käytettiin filtteriä, jonka aallonpituudet olivat 485 nm (eksitaatio) ja 535 nm (emissio) ja

valomonistinputken herkkyys oli 86.

DCF-HBSS -seosta tarvittiin 22 ml yhdelle levylle. 5 mM DCF laimennettiin 40 µM pitoisuuteen pipetoimalla koeputkeen 21,824 ml HBSS -puskuria, jonka jälkeen siihen pipetoitiin 176 µl 5 mM DCF:ia. DCF-HBSS -seosta sekoitettiin Vortex -sekoittajan avulla ja pipetoitiin 0,5 ml kaikkiin HBSS -puskuripesusta tyhjennettyihin kuoppiin. Myös aiemmin tyhjiin blank-kuoppiin pipetoitiin 0,5 ml DCF-HBSS -seosta. Koettimen lisäämisen jälkeen levyt laitettiin inkuboitumaan puoleksi tunniksi valolta suojattuna. Määrityksiä tehtiin yhden tunnin ajan aloittaen aikapisteestä 0 heti

inkuboinnin jälkeen. Määritysten aikana levy, joka ei ollut fluorometrissä luettavana pidettiin valolta suojattuna, jotta DCF ei pääsisi reagoimaan valon kanssa. Yhden levyn määritysajaksi

saatiin esikokeissa 1,5 minuuttia, joten kaikissa DCF-määrityksissä kumpaakin levyä luettiin 15 kertaa tunnin aikana. Tämän jälkeen suoritettiin solujen elävyysmittaukset, jotka on kuvattu kohdassa 4.6.4.

4.6.3 SH-SY5Y -solujen sytosolisen ja mitokondrionaalisen superoksidituotannon määrittäminen

DHE ja MitoSOX mittaavat superoksidituotantoa soluissa ja ne toimivat samoilla aallonpituuksilla, joten ne voitiin määrittää samanaikaisesti. DHE:n avulla mitataan solujen sytosolista

superoksidituotantoa ja MitoSOX:in avulla mitokondrionaalista superoksidituotantoa. DHE eli dihydroetidium on solun läpäisevä fluoresoiva väriaine, joka ilmenee sytosolissa sinisenä, mutta hapettuessaan värjää solun DNA:n fluoresoivan punaiseksi. DHE:n fluoresenssi aktivoituu

superoksidiradikaalien läsnä ollessa. Se havaitsee erityisesti superoksideja. MitoSOX -määrityksiin käytettiin MitoSOX™ Red -reagenssia, joka tunkeutuu solujen mitokondrioihin.

Mitokondrion superoksidit hapettavat MitoSOX™:n nopeasti eikä se reagoi muihin reaktiivisiin happi- tai typpiradikaaleihin. Hapettunut lopputuote on erittäin fluoresoivaa. Määrityksissä käytettiin filtteriä, jonka aallonpituudet olivat 485 nm (eksitaatio) ja 595 nm (emissio) ja valomonistinputken herkkyys oli 110.

MitoSOX™ -jauheesta valmistettiin 1 mM vahvuinen liuos pipetoimalla siihen 65,8 µl DMSO:ta.

Valmistettu MitoSOX -liuos jaettiin kahteen Eppendorf-putkeen niin, että kumpaankin putkeen liuosta pipetoitiin 32 µl. Käsittely suoritettiin laminaarikaapissa ilman laminaarin valoa

MitoSOX™:in valoarkuuden vuoksi. Laminaari, MitoSOX™ jauheputki, DMSO pullo, Eppendorf -putket ja pipetit pyyhittiin 70 % etanolilla ennen käyttöä. Putket merkittiin

valmistuspäivämäärällä ja laitettiin pakastimeen säilytykseen (-20 ºC) jossa ne olivat

käyttövalmiina MitoSOX -määrityksiin. Esikäsitelty MitoSOX -liuos säilyy pakastimessa noin kaksi viikkoa.

Sekä DHE-HBSS -seosta että MitoSOX-HBSS -seosta valmistettiin 22 ml yhtä levyä kohden. 10 mM DHE laimennettiin niin että sen pitoisuudeksi saatiin 10 µM. Tämä tehtiin pipetoimalla 21,978 ml HBSS -puskuriin 22 µl 10 mM DHE:ia. Aiemmin valmistettu 1 mM MitoSOX -seos laimennettiin 1

µM pitoisuuteen pipetoimalla 22 µl 1 mM MitoSOX-seosta 21,978 ml HBSS -puskuriin. Seoksia sekoitettiin Vortex -sekoittajassa ennen niiden pipetointia kuoppalevyille. DHE-HBSS -seosta pipetoitiin 0,5 ml kaikkiin DHE:lle varattuihin, HBSS-puskuripesusta tyhjennettyihin kuoppiin, ja MitoSOX-HBSS -seosta pipetoitiin 0,5 ml MitoSOX:ille varattuihin pestyihin kuoppiin. Seoksia pipetoitiin 0,5 ml myös aiemmin tyhjiin blank-kuoppiin. Blank-kuoppia oli kuusi, joista kolmeen pipetoitiin DHE-HBSS -seosta ja kolmeen MitoSOX-HBSS -seosta. Koettimien lisäämisen jälkeen levyt laitettiin inkuboitumaan puoleksi tunniksi valolta suojattuna huoneenlämpöön. Määrityksiä tehtiin yhden tunnin ajan aloittaen aikapisteestä 0 heti inkuboinnin jälkeen. Määritysten aikana levy, joka ei ollut fluorometrissä luettavana pidettiin valolta suojattuna, jotta koettimet eivät pääsisi reagoimaan valon kanssa. Koska sytosolinen ja mitokondrionaalinen superoksituotanto määritettiin samalla kerralla, levyillä oli kaksinkertainen määrä kuoppia DCF-määritykseen verrattuna. Määritysaika yhdelle levylle oli 3 minuuttia, joten molempia levyjä luettiin 10 kertaa tunnin aikana. Määritysten jälkeen suoritettiin solujen elävyysmittaukset (ks. 4.6.4.).

4.6.4 SH-SY5Y -solujen elävyysmääritykset

Solujen elävyysmäärityksiin käytettiin propidiumjodidia (PI) ja digitoniinia. PI on fluoresoiva värjäysaine, joka pääsee kulkeutumaan soluihin, joiden solukalvo on vahingoittunut nekroosin takia. Myöhemmin lisättävä digitoniini hajottaa solujen solukalvon ja PI pääsee näin

kulkeutumaan kaikkiin soluihin. Sekä PI:ia että digitoniinia säilytettiin Eppendorf-putkissa jääkaapissa (+4 ºC), josta ne otettiin huoneenlämpöön valolta suojattuna puoli tuntia ennen happiradikaali- tai superoksidimääritysten loppua. PI- ja digitoniinimäärityksiin käytettiin samaa filtteriä, jonka eksitaatioaallonpituus oli 540 nm ja emissioaallonpituus oli 612 nm ja

valomonistinputken herkkyys oli 95.

Happiradikaali- tai superoksidituotantomääritysten loputtua levyjen kaikkiin kuoppiin (myös blankoihin) pipetoitiin 20 µl 1,25 mM PI:ia, jolloin PI:n pitoisuus yhdessä soluviljelmäkuopassa oli noin 34 µM. Tämän jälkeen levyt laitettiin pimeään inkuboitumaan 20 minuutiksi. Inkuboinnin aikana digitoniiniputket laitettiin lämpenemään kuivahauteeseen +80 ºC:een. Inkuboinnin jälkeen suoritettiin yksi mittaus molemmille levyille. Seuraavaksi kuoppiin pipetoitiin 20 µl 4 mM digitoniinia per kuoppa, jolloin digitoniin pitoisuudeksi yhdessä kuopassa saatiin 112 µM. Levyt

suojattiin valolta käärimällä ne folioon ja ne laitettiin kuoppalevyravistelijaan (Labsystems Wellmix, Marshall Scientific, Saksa) 20 minuutiksi, jotta digitoniini ja PI pääsisivät tunkeutumaan kaikkiin soluihin. Ravistelun jälkeen molemmille levyille suoritettiin toinen mittaus.

Saaduista fluoresenssiarvoista laskettiin keskiarvot blankoille sekä jokaiselle soluviljelykuopalle.

Fluoresenssiarvoista vähennettiin blankot, ja ensimmäisestä mittauksesta saadut fluoresenssiarvot suhteutettiin digitoniinilisäyksen jälkeisen mittauksen arvoihin.

Solujen elävyysprosentit laskettiin kaavalla:

100 − (_𝐹^{𝐹−𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘1}

𝑚𝑎𝑥−𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘2) ∗ 100 (1)

F = fluoresenssiarvo PI:n lisäyksen jälkeen

blank1= tausta soluttomista blank-kuopista PI:n lisäyksen jälkeen

blank2 = tausta soluttomista kuopista digitoniinin lisäyksen jälkeen

Fmax = fluoresenssiarvo digitoniinin lisäyksen jälkeen