HYVIN PIENTAAJUISTEN MAGNEETTIKENTTIEN JA DIURONIN YHTEISVAIKUTUS OKSIDATIIVISEEN STRESSIIN IHMISEN
SH-SY5Y -NEUROBLASTOOMASOLUISSA
Milla Hätönen Ympäristötiede Itä-Suomen yliopisto
Luonnontieteiden ja metsätieteiden tiedekunta
Ympäristö- ja biotieteiden laitos 16.9.2021
Itä-Suomen yliopisto, Luonnontieteiden ja metsätieteiden tiedekunta Ympäristö- ja biotieteiden laitos
Ympäristötiede
Hätönen, Milla M.: Hyvin pientaajuisten magneettikenttien ja diuronin yhteisvaikutus oksidatiiviseen stressiin ihmisen SH-SY5Y -neuroblastoomasoluissa
Opinnäytetutkielma, 54 sivua
Tutkielman ohjaajat: FT, yliopistonlehtori Jukka Luukkonen ja FT, apulaisprofessori Jonne Naarala Syyskuu 2021
____________________________________________________________________________________________________
Asiasanat: pientaajuiset magneettikentät, diuroni, SH-SY5Y, oksidatiivinen stressi, happiradikaalit
TIIVISTELMÄ
Altistumisen hyvin pientaajuisille magneettikentille on eräissä tutkimuksissa yhdistetty erilaisiin terveysvaikutuksiin, ja Kansainvälinen syöväntutkimusjärjestö (IARC) on luokitellut ne ihmiselle mahdollisesti karsinogeenisiksi. Hyvin pientaajuisten magneettikenttien on lisäksi havaittu tietyissä tutkimuksissa vaikuttavan oksidatiivisen stressin kehittymiseen soluissa.
Todennäköisimpänä selityksenä hyvin pientaajuisten magneettikenttien aiheuttamille biologisille vaikutuksille pidetään radikaaliparimekanismi-ilmiötä. Tässä tutkielmassa tutkittiin hyvin
pientaajuisten magneettikenttien ja diuronin yksittäisiä ja yhteisvaikutuksia oksidatiiviseen stressiin ihmisen SH-SY5Y -neuroblastoomasoluissa. Soluja altistettiin ensin 24 tunnin ajan 50 Hz magneettikentälle (magneettivuontiheys 200 µT), jonka jälkeen niitä altistettiin 24 tuntia kuudelle diuronikonsentraatiolle (0–500 µM) 24 tunnin ajan. Altistusten jälkeen soluista määritettiin
solujen yleistä happiradikaalituotantoa sekä mitokondrionaalista ja sytosolista
superoksidituotantoa. Määritykset suoritettiin välittömästi altistusten jälkeen ja ne jatkuivat yhtäjaksoisesti yhden tunnin ajan, jonka jälkeen mitattiin myös solujen elävyys. Tutkimuksessa saatiin muutamia tilastollisesti merkittäviä tuloksia hyvin pientaajuisten magneettikenttien ja diuronin vaikutuksista yleiseen happiradikaalituotantoon ja superoksidituotantoon SH-SY5Y - soluissa, mutta tulosten varmentamiseksi olisi hyvä suorittaa lisää samankaltaisia tutkimuksia.
University of Eastern Finland, Faculty of Science and Forestry Department of Environmental and Biological Sciences
Environmental Science
Hätönen, Milla M.: The Combined Effect of Extremely Low-Frequency Magnetic Field and Diuron Exposure on Oxidative Stress in SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cells
Thesis, 54 pages
Supervisors: PhD, university lecturer Jukka Luukkonen and PhD, associate professor Jonne Naarala
September 2021
____________________________________________________________________________________________________
Keywords: Extremely low-frequency magnetic fields, diuron, SH-SY5Y, oxidative stress, reactive oxygen species
ABSTRACT
Extremely low-frequency magnetic fields (ELF MFs) are widely present in our everyday lives. IARC has classified them as possibly carcinogenic to humans, and several studies have associated them with many biological effects, such as oxidative stress in cells. The mechanism of action of ELF MFs is still unclear, but the most likely explanation is currently thought to be the radical-pair mechanism, according to which ELF MFs could increase or decrease the amount of reactive oxygen species in the cell. The purpose of this study was to examine whether an exposure to either ELF MFs, diuron, or both, could have effects on oxidative stress in SH-SY5Y human neuroblastoma cells. The cells were first exposed to a 200 µT and 50 Hz magnetic field for 24 hours, after which they were exposed for 24 hours to six different concentrations (0-500 µM) of diuron, a widely used herbicide. The intracellular production of general reactive oxygen species, mitochondrial superoxides and cytosolic superoxides were measured immediately after the exposure for one hour consecutively, after which cell viability was studied. The results showed some connection between ELF MF exposure, diuron exposure and an increased production of reactive oxygen species and superoxides, but more research is needed to confirm the effects an exposure to ELF MFs and diuron can have on oxidative stress in SH-SY5Y cells.
ESIPUHE
Tämä pro gradu -tutkielma suoritettiin Itä-Suomen yliopiston fysikaalisten ja kemiallisten riskien tutkimusryhmässä. Kandidaatintutkielmastani alkunsa saanut kiinnostukseni ympäristöterveyttä ja etenkin kemikaaleja kohtaan sai jatkoa, kun sain aiheekseni tutkia myös hyvin pientaajuisia magneettikenttiä ja niiden mahdollisia syöpään johtavia vaikutuksia. Suoritin tutkielman kokeelliset vaiheet kesän 2018 aikana, jonka jälkeen tutkielman teko oli suurimmaksi osaksi tauolla yli vuoden ajan vaihto-opintojeni ja ulkomaan työharjoittelun vuoksi. Tutkielman kirjallinen osuus alkoi loppuvuodesta 2019 ja valmistui vihdoin syksyllä 2021 töiden ja pandemiatilanteen aiheuttamien viivästysten jälkeen.
Haluan kiittää perhettäni ja ystäviäni heidän tarjoamastaan arvokkaasta, jatkuvasta tuesta ja tsemppauksesta. Lisäksi osoitan suuret kiitokset ohjaajilleni Jukka Luukkoselle ja Jonne Naaralalle hyvästä ja kärsivällisestä ohjauksesta ja ymmärryksestä tämän pitkän työn aikana.
Helsingissä 16.9.2021
Milla Hätönen
Sisällys
1 JOHDANTO ... 8
2 KIRJALLISUUSKATSAUS ... 9
2.1 OKSIDATIIVINEN STRESSI ... 9
2.1.1 Happiradikaalit ... 10
2.1.2 Antioksidantit radikaaleja vastaan ... 11
2.2 SÄHKÖMAGNEETTINEN SPEKTRI ... 14
2.2.1 Hyvin pientaajuiset magneettikentät ... 15
2.3 HYVIN PIENTAAJUISET MAGNEETTIKENTÄT JA OKSIDATIIVINEN STRESSI ... 17
2.4 DIURONI ... 22
2.4.1 Diuroni ja oksidatiivinen stressi ... 23
3 TYÖN TAVOITTEET ... 25
4 MATERIAALIT JA MENETELMÄT ... 26
4.1 ESIKOKEET ... 26
4.2 KOEASETELMA ... 29
4.3 SH-SY5Y -SOLUJEN KASVATUS JA SIIRROSTAMINEN KUOPPALEVYILLE ... 30
4.4 MAGNEETTIKENTTÄALTISTUS ... 31
4.5 DIURONIALTISTUS ... 32
4.6 MÄÄRITYSMENETELMÄT ... 33
4.6.1 Määritysten valmistelu ... 33
4.6.2 Yleisen happiradikaalituotannon määrittäminen SH-SY5Y -soluista ... 34
4.6.3 SH-SY5Y -solujen sytosolisen ja mitokondrionaalisen superoksidituotannon määrittäminen ... 35
4.6.4 SH-SY5Y -solujen elävyysmääritykset ... 36
4.7 TILASTOLLISET MENTELMÄT ... 37
5 TULOKSET... 38
5.1 HAPPIRADIKAALI- JA SUPEROKSIDITUOTANTO ... 38
5.1.1 Yleinen happiradikaalituotanto ... 38
5.1.2 Sytosolinen superoksidituotanto ... 40
5.1.3 Mitokondrionaalinen superoksidituotanto ... 42
5.2 SOLUJEN ELÄVYYS ... 44
6 TULOSTEN TARKASTELU ... 45
6.1 VIRHELÄHTEET ... 47
7 YHTEENVETO JA JOHTOPÄÄTÖKSET ... 48
1 JOHDANTO
Oksidatiivinen stressi tarkoittaa solun hapetus-pelkistystilan epätasapainoa, joka johtuu solun liiallisesta happiradikaalituotannosta tai sen antioksidanttijärjestelmän pettämisestä. Solut puolustautuvat happiradikaalihyökkäyksiä vastaan antioksidanttien avulla, jotka poistavat soluista happiradikaaleja. Oksidatiivisen stressin on tutkittu olevan yhteydessä useiden sairauksien, kuten syövän, Alzheimerin taudin, astman tai diabeteksen kehittymiseen.
Hyvin pientaajuiset (>0–300 Hz) magneettikentät syntyvät laitteiden tai johtimien läpi kulkevan sähkövirran seurauksena. Kansainvälinen syöväntutkimusjärjestö (IARC) on luokitellut ne ihmiselle mahdollisesti syöpää aiheuttaviksi, mutta toistaiseksi selkeää vaikutusmekanismia ei ole löydetty. Empiirisen tutkimuksen ja teoreettisen tiedon perusteella voidaan todeta, etteivät hyvin pientaajuiset magneettikentät aiheuta suoraan DNA:n vaurioitumista.
Karsinogeenisuustutkimusten lisäksi hyvin pientaajuisten magneettikenttien on tutkittu vaikuttavan solujen oksidatiiviseen stressiin liittyviin toimintoihin. Lisäksi niiden on osoitettu muuttavan solujen antioksidanttitasapainoa välittömästi altistuksen jälkeen, joka voi aiheuttaa solun genomin epävakautumista. Todennäköisimpänä selityksenä hyvin pientaajuisten
magneettikenttien aiheuttamille biologisille vaikutuksille pidetään radikaaliparimekanismi- ilmiötä.
Diuronia käytetään useassa maassa rikkakasvien torjunta-aineena tai teollisuudessa.
Diuronialtistuksen uskotaan voivan esimerkiksi vahingoittaa sisäelimiä, aiheuttaa syöpää ja vaarantaa sikiön kehityksen. Sillä epäillään myös olevan hormonitoimintaa häiritseviä
vaikutuksia. Diuronin vaikutusta oksidatiiviseen stressiin ei ole toistaiseksi paljoa tutkittu, mutta tähän mennessä suoritetut in vitro- ja ¬in vivo-tutkimukset viittaavat siihen, että diuronilla voisi olla vaikutuksia myös oksidatiiviseen stressiin.
Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia hyvin pientaajuisten magneettikenttien ja diuronin vaikutuksia, sekä niiden mahdollista yhteisvaikutusta oksidatiiviseen stressiin ihmisen SH-SY5Y - neuroblastoomasoluissa.
2 KIRJALLISUUSKATSAUS
2.1 OKSIDATIIVINEN STRESSI
Oksidatiivisella stressillä tarkoitetaan epätasapainoa solun hapetus-pelkistystilassa siten, että happiradikaaleja on liikaa antioksidantteihin nähden (Sies 1997). Liian suurina pitoisuuksina happiradikaalit voivat puolestaan aiheuttaa oksidatiivista stressiä ja vahingoittaa soluja. (Valko ym. 2006) Oksidatiivinen stressi voi olla akuuttia tai kroonista. Jos happiradikaalien määrä solussa lisääntyy äkillisesti ja sen antioksidanttijärjestelmä kykenee palauttamaan niiden tason normaaliksi, puhutaan akuutista oksidatiivisesta stressistä. Kroonista oksidatiivista stressiä tapahtuu, jos solu ei kykene vähentämään happiradikaalien määrää niiden alkuperäiselle tasolle vaan niiden pitoisuus solussa jää tavallista korkeammalle ja solun sisäinen tasapaino häiriintyy.
Happiradikaalituotanto voi myös pysyvästi jäädä korkeammalle tasolle, jolloin koko solun on tasapainotuttava uudelleen. Oksidatiivinen stressi voi myös olla seurausta solun
antioksidanttipitoisuuden heikentymisestä. (Lushchak 2014) Erityisen alttiita oksidatiiviselle stressille ovat happea paljon kuluttavat elimet kuten esimerkiksi aivot ja hermosto (Halliwell 2006).
Oksidatiivinen stressi voi aiheuttaa erilaisia vaurioita kohteen mukaan.
Happiradikaalihyökkäykset vaurioittavat solua joko suoraan tai välillisesti luoden välituotteita hapettamalla lipidejä tai proteiineja (Forman ja Boveris 1982) Näin ne voivat vahingoittaa solua ja reagoida DNA:n kanssa, jonka seurauksena solun geneettinen perimä voi muuttua pysyvästi (Valko ym. 2006). Solu pyrkii korjaamaan tapahtuneita vaurioita, mutta
antioksidanttipuolustuksesta huolimatta jatkuvat happiradikaalihyökkäykset ja niistä johtuvat vauriot voivat kertyä ajan mittaan DNA:han, lipideihin ja proteiineihin. (Valko ym. 2004)
Mitokondrion suuri hapenkulutus ja happiradikaalien tuotanto, histonien puute sekä heikompi korjaustehokkuus tarkoittavat, että sen kyky korjata DNA:ta on paljon heikompi kuin tumalla (Richter ym. 1988). Mitokondrionaalisen DNA:n vaurioitumisella voi olla tuhoisia vaikutuksia mitokondrion ja sen säätelemien geenien toimintaan (Hauptmann ym. 1996). Solun DNA:han syntyneet mutaatiot voivat edelleen johtaa esimerkiksi syövän syntyyn sekä solujen
vanhenemiseen ja kuolemaan.
Oksidatiivisen stressin on havaittu olevan yhteydessä useiden sairauksien, kuten Alzheimerin taudin, Parkinsonin taudin, kaihin, reuman, diabeteksen, ruuansulatuselimistön kroonisten tulehdussairauksien ja astman syntyyn sekä ihon ikääntymiseen (Abdollahi ym. 2004, Lushchak 2014). Sen on lisäksi ehdotettu vaikuttavan vuorokausirytmiin (Wilking ym. 2013) ja sen epäillään olevan osatekijänä monen muun sairauden, kuten skitsofrenian kehittymisessä (Sertan Copoglu ym. 2015).
Happiradikaaleilla voi olla myös hyödyllisiä vaikutuksia solun toimintoihin. Niillä on esimerkiksi tärkeä rooli fysiologisissa soluvasteissa haittoja vastaan, kuten auttamalla solua
puolustautumaan taudinaiheuttajia vastaan tai edistämällä soluviestinnällisten systeemien toimintaa. Urheilun tai muun fyysisen rasituksen aiheuttama lyhytkestoinen oksidatiivinen stressi voi olla elimistölle hyödyksi esimerkiksi edistämällä mitokondrion muodostumista, mutta voimakkaampi ja pitkäkestoisempi oksidatiivinen stressi on selvästi haitallista (Cadenas ja Davies 2000).
2.1.1 Happiradikaalit
Happiradikaalit (reactive oxygen species, ROS) ovat radikaaleja, ioneja tai molekyylejä, joilla on pariton elektroni niiden uloimmalla elektronikuorella. Happiradikaalit voidaan luokitella kahteen ryhmään: reaktiiviset happiradikaalit ja ei-reaktiiviset happiradikaalit. Reaktiivisia
happiradikaaleja ovat esimerkiksi superoksidi (O2•−) ja hydroksyyliradikaali (•OH) (Liou ja Storz 2010), joista superoksidi on yleisin happiradikaali biologisissa systeemeissä (Valko ym. 2004). Ei- reaktiivisia happiradikaaleja ovat puolestaan esimerkiksi vetyperoksidi (H2O2), otsoni (O3) ja singletti happi (1O2) (Liou ja Storz 2010).
Happiradikaaleja muodostuu soluissa joko endogeenisesti, eli normaalin aerobisen aineenvaihdunnan tuotteena tai eksogeenisesti ulkoisille vaikutteille, kuten lääkeaineille, ionisoivalle säteilylle tai saasteille altistuttaessa (Abdollahi ym. 2004). Happiradikaalien elinikä vaihtelee nanosekunneista sekunteihin riippuen niiden reaktiivisuudesta sekä solun
antioksidanttipitoisuudesta (Dikalov ja Harrison 2014). Aitotumaisilla soluilla reaktiivisia happiradikaaleja muodostuu eniten solujen mitokondrioissa oksidatiivisen fosforylaation
sivutuotteina, jossa elektroninsiirtoketjusta vuotaa elektroneja, jotka reagoivat hapen kanssa muodostaen superoksideja (Cadenas ja Davies 2000, Lushchak 2014). Elektroninsiirtoketjusta vuotavien elektronien määrä vaihtelee suuresti ja riippuu organismin fysiologisesta tilasta.
Happiradikaaleja muodostuu lisäksi myös pieniä määriä solulimakalvostossa, plasmassa ja tumakalvossa. (Nordberg ja Arnér 2001) Happiradikaalien muodostumista voidaan kuvata reaktioyhtälöllä:
𝑂2 𝑒
−
→ 𝑂2▪−𝑒
−+2𝐻+
→ 𝐻2𝑂2 𝑒
−
→ 𝑂𝐻 + 𝑂𝐻− 𝑒
−+2𝐻+
→ 2𝐻2𝑂 (1)
jossa happi ja vapaat elektronit reagoivat muodostaen superoksidia, vetyperoksidi ja hydroksyyliradikaalia (Nordberg ja Arnér 2001).
Happiradikaalien kyvyissä reagoida muiden yhdisteiden kanssa on suuri eroja. Mitokondriossa ja solulimassa muodostuva superoksidi ei ole kaikista reaktiivisimpia happiradikaaleja, eikä se kykene läpäisemään lipidikalvostoja, joten sen vaikutukset rajoittuvat lähinnä siihen solunosaan, jossa sitä muodostuu. Vetyperoksidi ei ole reaktiivinen, mutta se kykenee läpäisemään biologisia kalvostoja ja reagoimaan muiden yhdisteiden kanssa muodostaen uusia radikaaleja.
Hydroksyyliradikaali on puolestaan erittäin reaktiivinen ja voi aiheuttaa enemmän vaurioita soluissa kuin mikään muu happiradikaali. (Nordberg ja Arnér 2001) Hydroksyyliradikaalia ei poisteta elimistöstä muiden happiradikaalien tavoin, mutta antioksidanttijärjestelmä pystyy kuitenkin tehokkaasti estämään sen muodostumisen ja näin ehkäisee sen suurempaa tuotantoa (Lushchak 2014).
2.1.2 Antioksidantit radikaaleja vastaan
Antioksidantit ovat yhdisteitä, jotka hidastavat tai estävät happiradikaalien aiheuttamaa hapettumista soluissa. Ne voivat myös osallistua happiradikaalien aiheuttamien vaurioiden korjaamiseen. Antioksidanttijärjestelmät voivat olla entsymaattisia tai ei-entsymaattisia.
Antioksidanttientsyymit ovat sisäsyntyisiä eli endogeenisia, kun taas ei-entsymaattiseen
antioksidanttijärjestelmään kuuluvat yhdisteet voivat olla joko endogeenisia tai eksogeenisia eli ulkosyntyisiä. Endogeenisia antioksidantteja ovat esimerkiksi glutationi, metallia sitovat proteiinit
tioli-antioksidantit, thioredoksiini. Askorbiinihappo (C-vitamiini), E-vitamiini, flavonoidit ja karotenoidit ovat puolestaan eksogeenisia antioksidantteja. Glutationi on solulimassa, mitokondriossa ja tumassa esiintyvä yhdiste, jonka tärkein rooli solussa on toimia
antioksidanttina. Se toimii tehokkaasti happiradikaaleja vastaan mutta sillä on myös tärkeä osa vaurioituneiden proteiinien, nukleiinihappojen ja lipidien korjaamisessa. (Matés ym. 1999, Mironczuk-Chodakowska ym. 2018)
Antioksidanttientsyymit ovat pääosin valikoivia, eli ne toimivat vain tiettyjä happiradikaaleja vastaan. Entsymaattinen järjestelmä eli antioksidanttientsyymit jaetaan edelleen kolmeen pääluokkaan: superoksididismutaasit, katalaasi ja glutationiperoksidaasit (Sies 1997).
Superoksididismutaasientsyymit (SOD) ovat metalliosan sisältäviä entsyymejä eli
metalloentsyymejä. Ne suojelevat soluja oksidatiiviselta stressiltä muuntamalla superoksidin ei- radikaaliksi vetyperoksidiksi (Turrens 2003). Ihmisillä ja muilla nisäkkäillä on havaittu kolmea eri superoksididismutaasientsyymiä: Cu/Zn-SOD, solunulkoinen SOD (EC-SOD) ja Mn-SOD. Cu/Zn- SOD:n ja EC-SOD:n toiminta perustuu niiden sisältämään kupariin ja sinkkiin. Cu/Zn-SOD on pääosin sytosolinen eli solulimassa esiintyvä superoksididismutaasi (Sturtz ym. 2001), kun taas suurin osa EC-SOD:sta sijaitsee solunulkoisessa nesteessä estämässä solu- ja kudosvaurioita, joita solun ulkopuolella tuotetut happiradikaalit voivat aiheuttaa. EC-SOD:a ei muiden
superoksididismutaasientsyymeiden tavalla muodostu yksittäisten solujen vasteena hapettaville yhdisteille, vaan sen säätely tapahtuu pääsääntöisesti sytokineesin määräämänä. (Sandström ym. 1994) Mitokondriossa toimiva Mn-SOD puolestaan estää hapettumista mangaanin avulla.
Mn-SOD:lla on erittäin tärkeä rooli solun puolustautumisessa happiradikaaleja vastaan, sillä jopa 90 % happiradikaaleista muodostuu mitokondriossa (Richter ym. 1988).
Katalaasi ja glutationiperoksidaasi ovat erikoistuneet solujen puolustamiseen vetyperoksidilta.
Katalaasi on solujen peroksisomeissa oleva entsyymi, jota esiintyy sekä eläimillä, kasveilla ja aerobisilla bakteereilla. Katalaasi suojelee soluja vetyperoksidilta muuntamalla sen vedeksi ja hapeksi. (Matés ym. 1999) Katalaasin toimintaa voidaan kuvata reaktioyhtälöllä:
2𝐻2𝑂2𝐾𝑎𝑡𝑎𝑙𝑎𝑎𝑠𝑖→ 2𝐻2𝑂 + 𝑂2 (2)
Glutationiperoksidaasientsyymit voivat olla joko seleenistä riippumattomia (glutationi-S-
transferaasi; GST) tai seleeniriippuvaisia (glutationiperoksidaasi, GPX). Seleeniriippuvainen GPX katalysoi vetyperoksidin vähentämisen käyttämällä glutationia (GSH) ja näin suojelee soluja oksidatiivista stressiä vastaan. Vaikka GPX on myös vetyperoksidispesifi entsyymi, se voi
reagoida tehokkaasti myös lipidien ja muiden orgaanisten hydroperoksidien kanssa, ollen näin erittäin merkittävä suojelija matalatasoista oksidatiivista stressiä vastaan (Matés ym. 1999).
2.2 SÄHKÖMAGNEETTINEN SPEKTRI
Säteily voidaan luokitella joko ionisoivaksi tai ionisoimattomaksi säteilyksi. Ionisoivasta säteilystä puhutaan, kun säteily (sähkömagneettinen tai hiukkasluonteinen) on korkeanergistä. Tällöin säteilyn aiheuttama energia johtaa atomien ionisoitumiseen väliaineessa, mikä voi aiheuttaa esimerkiksi DNA:n vaurioitumista. Ionisoimatonta säteilyä taas syntyy matalaenergisimmistä sähkö- ja magneettikentistä. Ionisoimattoman säteilyn spektri on esitetty kuvassa 1. Myös mekaanisesta aaltoliikkeestä syntyvä ultraääni luokitellaan usein ionisoimattomaksi säteilyksi.
Vaikka ionisoimaton säteily ei aiheuta ionisoitumista, se voi vaikuttaa muilla tavoin elävään kudokseen. Vaikutusten laatu riippuu altistuksen kestosta sekä kenttien voimakkuudesta, taajuudesta ja pulssimuodosta. Ionisoimattoman säteilyn alaluokkia ovat ultraviolettisäteily, näkyvä valo, infrapunasäteily, radioaallot välitaajuiset kentät sekä pientaajuiset ja staattiset sähkö- ja magneettikentät. (Jokela 2006) Sähkö- ja magneettikentille altistuminen on päivittäistä sekä luonnollisista että keinotekoisista lähteistä. Keinotekoiset kentät voivat olla erittäin
voimakkaita luonnollisiin kenttiin verrattuna. Esimerkiksi maan muodostamalle staattiselle magneettikentälle altistutaan jatkuvasti. (Kansainvälinen syöväntutkimuslaitos, IARC 2002) Sähkömagneettiset kentät voivat aiheuttaa epäsuoria terveyshaittoja, jos kentät häiritsevät esimerkiksi sydämentahdistimen tai muun turvallisuuden kannalta tärkeän laitteen toimintaa (Jokela 2006).
Kuva 1. Ionisoimattoman säteilyn spektri (muokattu Jokela 2006, Luukkonen 2011).
2.2.1 Hyvin pientaajuiset magneettikentät
Magneettikentät luokitellaan hyvin pientaajuisiksi, kun niiden taajuus on >0–300 Hz. Laitteissa ja johtimissa kulkeva sähkövirta saa aikaan magneettikentän, jonka suuruutta kuvataan
magneettivuon tiheytenä. Magneettivuon tiheyden yksikkönä on tesla (T). (Jokela 2006) Hyvin pientaajuisia sähkö- ja magneettikenttiä syntyy esimerkiksi sähköenergian tuotannon, jakelun ja käytön yhteydessä. Voimakkaille magneettikentille altistuminen tapahtuu pääsääntöisesti metalliteollisuudessa, jossa tietyissä olosuhteissa työntekijät voivat altistua yli 1000 µT
magneettikentälle. Kotitalouksissa esiintyvät 50 Hz magneettikentät ovat normaalisti alle 0,1 µT vahvuisia, joskin esimerkiksi lattianalainen kiinteistömuuntamo voi aiheuttaa lattian tasalle altistuksen raja-arvon 200 µT (STM 1045/2018) ylittävän magneettikentän. Kodinkoneiden aiheuttamat magneettikentät ovat yleensä magneettivuontiheydeltään 0,1–100 µT. (Jokela 2006) Magneettikentän voimakkuus heikkenee nopeasti etäisyyden kasvaessa (IARC 2002).
Hyvin pientaajuisten magneettikenttien aiheuttamat mahdolliset terveysvaikutukset ja etenkin niiden mahdolliset karsinogeeniset vaikutukset ovat olleet sekä tieteellisten tutkimusten että yleisen huolen kohteena viimeisten vuosikymmenten aikana. Suurimpana tutkimuskohteena on ollut lapsuusiän leukemia, jonka useat epidemiologiset tutkimukset ovat yhdistäneet
altistumiseen hyvin pientaajuisille magneettikentille. Kansainvälinen syöväntutkimuslaitos IARC on luokitellut hyvin pientaajuiset sähkömagneettikentät ihmiselle mahdollisesti syöpää
aiheuttaviksi (luokka 2B), mutta mekanismia niiden karsinogeenisille vaikutuksille ei ole vielä löydetty. (IARC 2002) Hyvin pientaajuisten magneettikenttien on myös epäilty lisäävän riskiä neurologisiin sairauksiin, kuten Alzheimerin tai Parkinsonin tautiin. (Benassi ym. 2015). Useat tutkimukset hyvin pientaajuisten magneettikenttien ja DNA:ta vahingoittavien aineiden yhteisvaikutuksista ovat kuitenkin ehdottaneet magneettikenttäaltistuksen lisäävän tai vähentävän aineen vahingoittavaa vaikutusta happiradikaalien määrään vaikuttamalla. (IARC 2002, Juutilainen ym. 2006) Tätä ilmiötä kutsutaan radikaaliparimekanismiksi, ja se vaikuttaa tällä hetkellä olevan yksi todennäköisimmistä selityksistä hyvin pientaajuisten magneettikenttien aiheuttamille biologisille vaikutuksille. Mekanismi kuvaa, kuinka ulkoinen magneettikenttä voi muuntaa kemiallisen reaktion kinetiikkaa muokkaamalla radikaaliparin elektronispinien dynamiikkaa (Adams ym. 2018).
Hyvin pientaajuisten magneettikenttien vaikutuksia on tutkittu in vitro -kokeilla jo
vuosikymmenten ajan. Tässä katsauksessa keskitytään kuvaamaan hyvin pientaajuisten
magneettikenttien mahdollisia syöpään johtavia vaikutuksia solutasolla. In vitro -kokeita hyvin pientaajuisten magneettikenttien vaikutuksista on tehty esimerkiksi ihmisen SH-SY5Y -
neuroblastoomasoluilla, leukemiasoluilla ja rintasyöpäsoluilla sekä eläinten soluilla, kuten rotan fibroblasteilla. SH-SY5Y -soluilla tehdyissä kokeissa hyvin pientaajuisten magneettikenttien todettu aiheuttavan solujen mikrotumien määrän lisääntymistä, jota pidetään merkkinä genomiin aiheutetusta epävakaisuudesta (Kesari ym. 2015, Luukkonen ym. 2014). Wolf ym.
(2005) tutkivat 50 Hz magneettikentän vaikutuksia solujen proliferaatioon, solusykliin ja DNA:n vaurioitumiseen HL-60 -leukemiasoluilla, rotan fibroblasteilla ja WI-38 -diploidifibroblasteilla. He havaitsivat magneettikenttäaltistuksen lisäävän soluissa tapahtuvia DNA -vaurioita ja solujen proliferaatiota. Markkanen ym. (2008) altistivat hiiren L929 -soluja 50 Hz magneettikentälle 24 tai 48 tunnin ajan yhdessä. Lisäksi soluja altistettiin ultraviolettisäteilylle tai menadionille ennen magneettikenttäaltistusta tai sen jälkeen. Pelkän magneettikenttäaltistuksen ei havaittu
vaikuttavan solusykleihin tai apoptoosiin, eikä lisäävän tai vähentävän UV-säteilyn aiheuttamia vaikutuksia soluissa. Menadionialtistusta edeltävän magneettikenttäaltistuksen puolestaan havaittiin vaikuttavan solusykliin. Luukkonen ym. (2011) eivät havainneet pelkän 50 Hz
magneettikenttäaltistuksen vaikuttavan SHSY5Y -neuroblastoomasolujen DNA:n vaurioitumiseen tai mikrotumien määrään. Solujen altistaminen ensin magneettikentälle ja seuraavaksi
menadionille puolestaan lisäsi DNA -vaurioita, mikrotumien muodostumista ja kiihdytti DNA:n korjaamista. Kesari ym. (2015) tutkivat 24 tunnin 50 Hz magneettikenttäaltistuksen aiheuttamia vaikutuksia genomin epävakaisuuteen SH-SY5Y -neuroblastoomasoluissa. He altistivat soluja sekä magneettikentälle että menadionille, ja havaitsivat mikrotumien määrän lisääntyneen 15 ja 30 päivää altistuksen jälkeen. Magneettikentän aiheuttamat vaikutukset eivät olleet riippuvaisia menadionista, mutta tutkimuksessa käytetty antioksidantti N-asetyylikystiini vähensi menadionin haittavaikutuksia soluissa. Lee ym. (2015) huomasivat, että ihmisen rintakudoksen MCF7 -
rintasyöpäsolujen ja MCF10A -rintaepiteelisolujen altistaminen 60 Hz magneettikentälle 16 tunnin ajan saattaa viivästyttää solujen solusyklin etenemistä.
2.3 HYVIN PIENTAAJUISET MAGNEETTIKENTÄT JA OKSIDATIIVINEN STRESSI
Hyvin pientaajuisten magneettikenttien aiheuttamia vaikutuksia solujen
happiradikaalituotantoon ja oksidatiiviseen stressiin on tutkittu useissa in vitro -tutkimuksissa.
Tutkimuksissa soluja on altistettu joko ainoastaan hyvin pientaajuiselle magneettikentälle tai samanaikaisesti toiselle altisteelle, kuten kemikaalille tai UV -valolle. Pelkän
magneettikenttäaltistuksen on tutkittu aiheuttavan oksidatiivista stressiä kohdesoluissa.
(Mattsson ja Simko 2014). Tämän tutkimuksen koeasetelman takia tässä osuudessa keskitytään ainoastaan yhteisaltistustutkimuksiin. In vitro -tutkimuksia hyvin pientaajuisten
magneettikenttien ja muiden altisteiden yhteisvaikutuksista oksidatiiviseen stressiin on koottu tarkemmin taulukkoon 1.
Hong ym. (2012) altistivat ihmisen MCF10A -rintaepiteelisoluja 60 Hz taajuiselle ja tiheydeltään 1 mT olevalle magneettikentälle neljän tunnin ajan. He eivät havainneet merkittävää muutosta solujen happiradikaalitasoissa tai superoksididismutaasientsyymin aktiivisuudessa. Cho ym.
(2014) altistivat lymfosyyttisoluja 24 tunnin ajan sekä gadoliniumille, että magneettikentälle, jonka taajuus oli 60 Hz ja tiheys 0,8 mT. He havaitsivat magneettikentän korostavan gadolinium- altistuksen aiheuttamia sytotoksisia ja perimää vahingoittavia vaikutuksia, mutta eivät
havainneet yhteisaltistuksen lisäävän soluissa oksidatiivista stressiä. Mannerling ym. (2010) altistivat ihmisen K562 -leukemiasoluja tunnin ajan 50 Hz magneettikentälle
(magneettivuontiheyksillä 0,025; 0,05 ja 0,10 mT) yhdessä melatoniinin ja ferantroliinin kanssa.
Tutkimuksessa magneettikenttäaltistuksen huomattiin lisäävän happiradikaalien tuotantoa, kun taas melatoniini ja ferantroliini laskivat magneettikentän aiheuttamaa happiradikaalituotantoa. . Akbarnejad ym. (2017) altistivat ihmisen U87 - ja T98G -glioblastoomasoluja 100 Hz taajuiselle ja 10 mT magneettikentälle sekä syöpähoidoissa käytettävälle temotsolomidille 72–144 tunnin ajan. He havaitsivat pelkän temotsolomidialtistuksen lisäävän solujen happiradikaalituotantoa ja apoptoosia, kun taas temotsolomidin ja magneettikentän yhteisaltistus lisäsi solujen
happiradikaalituotantoa ja temotsolomidin aiheuttamaa sytotoksisuutta.
Markkanen ym. (2010) puolestaan tutkivat magneettikentän (taajuus 50 Hz, tiheys 100 ja 300 µT) ja UV-säteilyn vaikutuksia happiradikaalireaktioihin hiiren L929 -soluissa. Soluja altistettiin joko samanaikaisesti molemmille altisteille yhden tunnin ajan, tai ensin 24 tunnin ajan
magneettikentälle minkä jälkeen niitä altistettiin tunnin ajan UV -säteilylle. He eivät havainneet altistuksen aiheuttavan muutoksia solujen happiradikaalireaktioihin. Buldak ym. (2012) altistivat hiiren AT478 -okasolusyöpäsoluja syöpähoidoissa käytettävälle sisplatiinille 24 ja 27 tunnin ajan sekä samanaikaisesti 50 Hz taajuiselle ja 1,0 mT magneettikentälle 16 minuutin ajan.
Yhteisaltistuksen havaittiin laskevan happiradikaalien tuotantoa ja Cu/Zn-SOD:in, MnSOD:in ja glutationiperoksidaasin aktiivisuutta pelkkään sisplatiinialtistukseen verrattuna.
Höytö ym. (2017) puolestaan tutkivat ovatko hyvin pientaajuisen magneettikentän (50 Hz ja 100 μT) vaikutukset SH-SY5Y -solujen superoksiditasoihin riippuvaisia samanaikaisesta altistumisesta siniselle valolle. Suoraa yhteyttä näiden välillä ei havaittu, mutta sinisen valon ja
magneettikenttien havaittiin kuitenkin vuorovaikuttavan toisin tavoin. Sinisen valon havaittiin esimerkiksi tasapainottavan magneettikenttäaltistuksen aiheuttamaa superoksidituotannon lisäystä solulimassa. Falone ym. (2007) havaitsivat SH-SY5Y -solujen olevan haavoittuvaisempia happiradikaalihyökkäyksille 96 tuntia kestäneen magneettikenttäaltistuksen (50 Hz ja 1,0 mT) jälkeen, mutta altistuksen ei havaittu lisäävän solujen happiradikaalituotantoa.
Glutationiperoksidaasin ja glutationi-S-transferaasin määrän puolestaan havaittiin kohonneen.
Magneettikenttäaltistus yhdistettynä H2O2- altistukseen puolestaan lisäsi soluissa sekä DNA- vaurioita että happiradikaalien tuotantoa. Luukkonen ym. (2014) altistivat SH-SY5Y -soluja 50 Hz ja 100 µT kentälle 24 tunnin ajan ja menadionille kolmen tunnin ajan. He havaitsivat altistuksen lisäävän solujen happiradikaalituotantoa ja mitokondrionaalista superoksidituotantoa sekä laskevan niiden glutationitasoja välittömästi altistusten jälkeen. Kahdeksan tai 15 päivää altistuksen päättymisestä soluissa havaittiin lisääntynyttä happiradikaalituotantoa sekä
lipidiperoksidaatiota. Solujen hapetustasapainossa ei kuitenkaan havaittu muutoksia välittömästi altistuksen päätyttyä, vaan vasta menadionialtistuksen tai inkuboinnin jälkeen. Kesari ym. (2016) altistivat SH-SY5Y -soluja ja rotan C6- glioomasoluja 50 Hz taajuiselle ja 10 tai 30 µT tiheälle magneettikentälle 24 tunnin ajan ja havaitsivat sekä sytosolisen että mitokondrionaalisen superoksidituotannon lisääntyneen C6 -glioomasoluissa kolme tuntia altistuksen päättymisen jälkeen. Tilastollisesti merkittäviä vaikutuksia ei havaittu välittömästi altistuksen jälkeen.
Aiemmassa tutkimuksessaan Kesari ym. (2015) havaitsivat pelkän magneettikenttäaltistuksen (50 Hz ja 100 μT) aiheuttavan lipidiperoksidaation vähentymistä 30 ja 45 päivää altistuksen loputtua, mutta reaktiivisten happiradikaalien tuotanto lisääntyi 45 päivää altistuksen jälkeen. Benassi ym.
(2015) altistivat SH-SY5Y -soluja 50 Hz taajuiselle ja 1,0 mT tiheälle magneettikentälle 6-75 tunnin ajan ja 1-metyyli-4-fenyylipyridiniumille (MPP+) 6–24 tunnin ajan. He havaitsivat
magneettikenttäaltistuksen lisäävän solujen proteiinikarbonylaatiota ja häiritsevän solujen hapetus-pelkistys-tasapainoa lisäämällä niissä tapahtuvaa happiradikaalituotantoa. Lisääntynyt happiradikaalituotanto ja mahdolliset oksidatiiviset vauriot tekivät lisäksi yhteisaltistuksen saaneista soluista alttiimpia MPP+:n aiheuttamille toksisille vaikutuksille
Taulukko 1. In vitro -tutkimuksia hyvin pientaajuisten magneettikenttien ja muiden altisteiden yhteisvaikutuksista oksidatiiviseen stressiin ja happiradikaalituotantoon. Taulukon lyhenteet: ↑ (lisääntyy), ↓ (laskee), ↔ (ei muutosta), ROS (happiradikaalituotanto), GPX (glutationiperoksidaasi), GST (glutationi-S-transferaasi), GSH (pelkistynyt glutationi), SOD (superoksididismutaasi), sO2– (sytosolinen superoksidituotanto), mO2– (mitokondrionaalien superoksidituotanto), TMZ (temotsolomidi), MPP+ (1-metyyil-4-fenyylipyridinium), CP (sisplatiini), GD (gadolinium), H2O2 (vetyperoksidi), SV (sininen valo), MQ (menadioni), NAC (N-asetyylikysteiini).
Tutkimus Taajuus Tiheys Yhteisaltiste Altistusten kesto Kohde Tulokset
Akbarnejad
ym. (2017) 100 Hz 10 mT Temotsolomidi 72, 96, 120, 144 h Ihmisen U87 - ja T98G - glioblastoomasolut
TMZ: solujen elävyys ↓, ROS ↑, apoptoosi ↑
MK+TMZ: ROS ↑, apoptoosi ↑, TMZ:n aiheuttama sytotoksisuus
↑ Benassi ym.
(2015) 50 Hz 1,0 mT MPP+
24 h MK-altistus, jonka jälkeen 6-24 h MPP+ -altistus
Ihmisen SH-SY5Y - neuroblastoomasolut
MK: ROS ↑, apoptoosi ↔ MK+MPP+: MPP+ aiheuttama sytotoksisuus ↑
Buldak ym.
(2012) 50 Hz 1,0 mT Sisplatiini 16 min MK, 24 ja 72 h CP
Hiiren AT478 - okasolusyöpäsolut
MK+CP: ROS ↓,
antioksidanttientsyymit ↓ CP: ROS ↑,
antioksidanttientsyymit ↑ Cho ym.
(2014) 60 Hz 0,8 mT Gadolinium 24 h Ihmisen
lymfosyyttisolut
MK+GD: DNA-vauriot ↑, apoptoosi ↑
GD: solujen elävyys ↓, ROS ↑, apoptoosi ↑
Falone ym.
(2007) 50 Hz 1,0 mT Vetyperoksidi
96 h MK-altistus, jonka jälkeen 4 h H2O2 -altistus
Ihmisen SH-SY5Y - neuroblastoomasolut
MK: ROS ↔, SOD ↔, GPX ↑, GST
↑, apoptoosi ↔, solujen elävyys ↑ MK+H2O2: ROS ↑
Höytö ym.
(2017) 50 Hz 100 μT Sininen valo ja
menadioni 24 h Ihmisen SH-SY5Y -
neuroblastoomasolut
MK: sO2– -tuotanto ↑, mO2– - tuotanto ↓
MK+SV: sO2– -tuotanto ↓, SV: mO2– -tuotanto ↓
Taulukko 2. (Jatkuu) In vitro -tutkimuksia hyvin pientaajuisten magneettikenttien ja muiden altisteiden yhteisvaikutuksista oksidatiiviseen stressiin ja happiradikaalituotantoon. Taulukon lyhenteet: ↑ (lisääntyy), ↓ (laskee), ↔ (ei muutosta), ROS (happiradikaalituotanto), GPX (glutationiperoksidaasi), GST (glutationi-S-transferaasi), GSH (pelkistynyt glutationi), SOD (superoksididismutaasi), sO2– (sytosolinen superoksidituotanto), mO2– (mitokondrionaalien superoksidituotanto), TMZ (temotsolomidi), MPP+ (1-metyyil-4-fenyylipyridinium), CP (sisplatiini), GD (gadolinium), H2O2 (vetyperoksidi), SV (sininen valo), MQ (menadioni), NAC (N-asetyylikysteiini).
Tutkimus Taajuus Tiheys Yhteisaltiste Altistusten kesto Kohde Tulokset Kesari ym.
(2015) 50 Hz 100 μT Menadioni ja N- asetyylikysteiini
3 h MQ-altistus, 1 h NAC-altistus, 24 h MK-altistus
Ihmisen SH-SY5Y - neuroblastoomasolut
ROS 45 d ↑, lipidiperoksidaatio 30 ja 45 d ↓, NAC ei estänyt MK:n vaikutuksia
Kesari ym.
(2016) 50 Hz 10 ja
30 μT Menadioni
24 h MK-altistus, jonka jälkeen 3 h MQ-altistus
Ihmisen SH-SY5Y - neuroblastoomasolut ja rotan C6 -
glioomasolut
MK: sO2– ja mO2– ↑ (C6)
MQ: mO2– ↑ (SH-SY5Y) solujen elävyys ↓
Luukkonen
ym. (2014) 50 Hz 100 µT Menadioni
24 h MK-altistus, jonka jälkeen 3 h MQ-altistus
Ihmisen SHSY5Y - neuroblastoomasolut
Heti altistuksen jälkeen: ROS ↑, GSH ↓, lipidiperoksidaatio ↔, mO2– -tuotanto ↑
8/15 d altistuksen jälkeen: ROS ↑, lipidiperoksidaatio ↑, solujen elävyys ↔
Mannerling
ym. (2010) 50 Hz
0,025;
0,05 ja 0,10 mT
Melatoniini ja
fenantroliini 1 h Ihmisen K562 -
leukemiasolut
MK: ROS ↑
Melatoniini ja fenantroliini: MK- altistuksen aiheuttama ROS ↓
Markkanen
ym. (2010) 50 Hz 100 ja 300 µT
Ultraviolettisäte ily
1 h MK+UV - altistus tai 24 h MK -altistus ennen 1 h UV -altistusta
Hiiren L929 -solut Happiradikaalireaktiot ↔
2.4 DIURONI
Diuroni (3-(3,4-dikloorifenyyli) -1,1-dimetyyliurea) on valkoinen, kiderakenteen omaava kiinteä aine (National Center for Biotechnology Information). Diuronin kemiallinen rakenne on esitetty kuvassa 2. Euroopan talousalueella diuronia tuotetaan tai maahantuodaan 100–1000 tonnia vuosittain (European Chemicals Agency, ECHA). Sen käyttö on rajoittunut teollisuusalueille ja esimerkiksi Suomessa diuronia on käytetty muun muassa maalien valmistuksessa. Diuronia ei ole käytetty Suomessa teollisuuden ulkopuolella (Suomen ympäristökeskus 2013), mutta
monessa maassa sen käyttäminen rikkakasvien torjunta-aineena on yleistä (National Center for Biotechnology Information). Esimerkiksi Yhdysvalloissa diuronin käyttö kasvimyrkkynä alkoi vuonna 1954 sen tullessa markkinoille (Australian Pesticides and Veterinary Medicine Authority, APVMA 2011) ja nykyisin sitä käytetään maatalouden ulkopuolella esimerkiksi junaratojen sivualueiden kunnossapitoon (United States Environmental Protection Agency, EPA 2003).
Diuroni on erittäin pysyvää sekä vesiympäristöissä että maaperässä (APVMA 2011, Guardiola ym.
2012).
Kuva 2. Diuronin kemiallinen rakenne (ECHA).
Diuronille altistuminen voi tapahtua hengityksen, ruuansulatuksen sekä iho- tai silmäkontaktin kautta. Altistuminen voi aiheuttaa esimerkiksi silmien, ihon, nenän tai kurkun ärsytystä. (Centers for Disease Control and Precention, CDC) Ihmiset altistuvat diuronille useimmiten juomaveden välityksellä (APVMA 2011). Pitkittynyt tai toistuva altistuminen diuronille voi vahingoittaa
sisäelimiä ja sen epäillään myös aiheuttavan syöpää, ja sillä saattaa olla myös hormonitoimintaa häiritseviä ominaisuuksia (ECHA). Työperäisestä altistumisesta aiheutuvia terveysvaikutuksia ei ole toistaiseksi havaittu. (APVMA 2011). Sosiaali- ja terveysministeriö (STM 2018) on asettanut
diuronille haitalliseksi tunnetun pitoisuuden arvon eli HTP-arvon 10 mg/m3 8 tunnin altistumisajalle ja 20 mg/m3 15 minuutille.
Tutkimuksia diuronin vaikutuksista ihmissoluihin on tehty toistaiseksi vähän. Vinggaard ym.
(1999) altistivat MCF-7 -rintasyöpäsoluja diuronille kuuden päivän ajan eivätkä havainneet sen vaikuttavan solujen proliferaatioon. Huovinen ym. (2015) tutkivat diuronin perimää
vahingoittavia ja sytotoksisia vaikutuksia MCF-7 -rintasyöpäsoluissa ja istukkasoluissa (BeWo).
DNA:n vahingoittumista havaittiin vain MCF-7 -soluissa, ja sytotoksisuutta havaittiin enemmän BeWo-soluissa, viitaten siihen, että diuronilla voi olla haitallisia vaikutuksia sikiön kehitykseen.
Diuronin vaikutuksia on tutkittu koe-eläimillä akuutin, lyhytaikaisen, sub-kroonisen ja kroonisen altistumisen yhteydessä. Diuronin aineenvaihduntatuotteiden on havaittu aiheuttavan
karsinogeenisiä solumuutoksia rottien virtsarakoissa (Da Rocha ym. 2013. Akcha ym. (2012) huomasivat, ettei diuroni aiheuta sytotoksisia vaikutuksia ostereiden siittiösoluille, mutta sen havaittiin olevan niiden perimää vahingoittavaa. Grassi ym. (2011) eivät puolestaan havainneet diuronin vaikuttavan syövän kehittymiseen naaraspuolisten Sprague-Dawley -rottien
maitorauhasissa, kun niitä oli altistettu diuronille 25 viikon ajan. Lisäksi on tutkittu diuronin vaikutuksia mm. koe-eläinten lisääntymistoimintoihin ja elinten kehittymiseen (Domingues ym.
2011, Fernandes ym. 2012, Orton ym. 2009).
2.4.1 Diuroni ja oksidatiivinen stressi
In vitro -tutkimuksia diuronin vaikutuksia oksidatiiviseen stressiin on toistaiseksi vain vähän.
Huovinen ym. (2015) altistivat ihmisen rintakudoksen MCF-7 -rintasyöpäsoluja ja istukkasoluja (BeWo) diuronille. Altistuksen havaittiin lisäävän happiradikaalien tuotantoa 24 tunnin jälkeen MCF-7 -soluissa ja 72 tunnin jälkeen BeWo -soluissa diuronikonsentraation ollessa 200 μM. Kao ym. (2019) puolestaan havaitsivat oksidatiivista stressiä ihmisen HepG2 -maksasyöpäsoluissa.
Soluja altistettiin diuronille 24 ja 48 tunnin ajan, minkä huomattiin lisäävän kontrolliin verrattuna happiradikaalituotantoa soluissa, jotka olivat altistuneet diuronin konsentraatioille 215 μM, 107 μM tai 53 μM.
Eläimillä suoritetuissa tutkimuksissa esimerkiksi Ihlaseh ym. (2011) havaitsivat, että jatkuva altistuminen korkeille pitoisuuksille diuronia saa aikaan oksidatiivista stressiä urospuolisissa Wistar -rotissa. Barranger ym. (2016) altistivat Crassostrea gigas -ostereita diuronille ja
huomasivat oksidatiiviseen stressiin viittaavia muutoksia sekä altistetuissa ostereissa että näiden sukusoluissa. Felicio ym. (2018) huomasivat, että diuroni voi aiheuttaa muutoksia oksidatiivisesta stressistä kertoviin merkkiaineisiin Oreochromis niloticus -kaloissa.
3 TYÖN TAVOITTEET
Tämän työn tavoitteena oli tutkia, kuinka altistus hyvin pientaajuiselle magneettikentälle ja diuronille vaikuttaa SH-SY5Y -neuroblastoomasolujen oksidatiiviseen stressiin. Työssä
havainnointiin myös pelkän magneettikenttäaltistuksen tai pelkän diuronialtistuksen vaikutuksia solujen oksidatiiviseen stressiin. Oksidatiivista stressiä tutkittiin mittaamalla solujen yleistä happiradikaalituotantoa sekä sytosolista ja mitokondrionaalista happiradikaalituotantoa altistusten jälkeen.
4 MATERIAALIT JA MENETELMÄT
4.1 ESIKOKEET
Ennen varsinaista tutkimusta suoritettiin esikokeita. Tutkimuksessa käytettävän magneettikentän voimakkuus, taajuus ja altistuksen kesto oli ennalta päätetty eikä
magneettikenttäaltistusta käytetty esikokeissa. Esikokeiden tavoitteena oli siten määrittää tutkimuksessa käytettävä kemikaali, sen konsentraatiot, rinnakkaisten soluviljelmäkuoppien määrä, mittalaitteiden herkkyys ja mittaustiheys. Altistettavina soluina käytettiin ihmisen SH- SY5Y -neuroblastoomasoluja. Kemikaalialtisteena kokeiltiin diuronia (Supelco, Sigma -Aldrich, München, Saksa) ja parakvattia (Supelco, Sigma -Aldrich, München, Saksa). Sekä diuronista että parakvatista valmistettiin kuusi konsentraatiota; diuronille välillä 0–1000 µM, ja parakvatille välillä 0-2 mM, ja jokaista konsentraatiota kohden tehtiin kolme rinnakkaista
soluviljelmäkuoppaa. Kontrolleina käytettiin korkeimman kemikaalikonsentraation
dimetyylisulfoksidi -pitoisuutta (DMSO, Sigma -Aldrich, Dorset, UK). Määrityskoettimina käytettiin 2’,7’-diklorodihydrofluoreskiinidiasetaattia (DCFH-DA), dihydroetidiumia (DHE) ja MitoSOX™ Red mitochondrial superoxide- indikaattoria (MitoSOX). Ensimmäinen määritys tehtiin välittömästi altistuksen loputtua, toinen 15 minuutin kuluttua altistuksen loppumisesta ja kolmas 30 minuuttia altistuksen loppumisesta.
Seuraavaksi suoritetut parakvatti- ja diuronialtistukset kestivät 24 tuntia, jonka jälkeen soluista määritettiin mitokondrionaalista superoksidituotantoa. Kuvissa 3 ja 4 on esitetty parakvatin ja diuronin aiheuttama mitokondrionaalinen superoksidituotanto 24 tunnin altistuksen jälkeen mitattuna. Esikokeissa diuroni aiheutti paremman annosvasteen, joten se valittiin käytettäväksi kemikaaliksi varsinaiseen tutkimukseen.
Kuva 3. Parakvatin aiheuttama mitokondrionaalinen superoksidituotanto SH-SY5Y -
neuroblastoomasoluissa 24 tunnin altistuksen jälkeen mitattuna MitoSOX -menetelmällä 0, 15 ja 30 minuutin kuluttua altistuksen päättymisestä. Tulokset ja keskihajonta (SEM) ilmoitetaan suhteellisena fluoresenssiyksikkönä (relative fluorescence unit, RFU) suhteutettuna suhteelliseen solumäärään (relative cell number, RCN). n=2.
Kuva 4. Diuronin aiheuttama mitokondrionaalinen superoksidituotanto SH-SY5Y -
neuroblastoomasoluissa 24 tunnin altistuksen jälkeen mitattuna MitoSOX-menetelmällä 0, 15 ja 30 minuutin kuluttua altistuksen päättymisestä. Tulokset ja keskihajonta (SEM) ilmoitetaan suhteellisena fluoresenssiyksikkönä (relative fluorescence unit, RFU) suhteutettuna suhteelliseen solumäärään (relative cell number, RCN). n=2.
Esikokeiden ja aiempien tutkimusten perusteella käytettäväksi kemikaaliksi valittiin diuroni.
Esikokeiden vahvin konsentraatio (1000 µM) jätettiin pois ja sen tilalle otettiin pienempi konsentraatio (10 µM). Käytettäviksi konsentraatioiksi saatiin siten kontrolli (0 µM), 10 µM, 50 µM, 100 µM, 200 µM ja 500 µM, ja jokaista konsentraatiota kohden tehtiin kolme rinnakkaista soluviljelmäkuoppaa. Kemikaalialtistuksen pituudeksi päätettiin 24 tuntia. Määrityskoettimiksi valittiin DCFH-DA, DHE ja MitoSOX. 48-kuoppalevyjä (Corning Costar, USA) joista määritettiin yleistä happiradikaalituotantoa (DCFH-DA) mitattiin kolmen minuutin välein. DHE - ja MitoSOX - määrityksiä varten soluviljelmäkuopat tehtiin yhdelle kuoppalevylle koska niitä voidaan
määrittää samanaikaisesti. DHE - ja MitoSOX -määritysten levyjä mitattiin kuuden minuutin välein. Määrityksiä suoritettiin yhden tunnin ajan välittömästi altistusten jälkeen, koska tarkoituksena oli määrittää muutoksia solujen happiradikaalituotannossa, jotka tapahtuivat lyhyen aikavälin sisällä altistusten päättymisestä.
4.2 KOEASETELMA
Tutkimuksessa altistettiin ihmisen SH-SY5Y -neuroblastoomasoluja 24 tunnin ajan ensin 200 µT 50 Hz magneettikentälle, jonka jälkeen niitä altistettiin 24 tuntia diuronille. Solujen
happiradikaali- ja superoksidituotantoa mitattiin välittömästi altistusten loputtua tunnin ajan, jonka jälkeen määritettiin solujen elävyyttä. Koeasetelma on kuvattu kuvassa 5.
Kuva 5. Koeasetelma aikajanalla. 24 tunnin magneettikenttäaltistus (MK) ja diuronialtistus, jonka jälkeen solujen happiradikaali- ja superoksidituotantoa määritettiin välittömästi tunnin ajan.
Lopuksi suoritettiin solujen elävyysmääritykset.
Tutkimuksessa käytettiin kahta 48-kuoppalevyä jokaisen altistuksen aikana, joista molemmat altistuivat diuronille mutta vain toinen altistui ensin myös magneettikentälle. Näin saatiin tutkittua, vaikuttaako SH-SY5Y -solujen altistaminen ensin magneettikentälle ja seuraavaksi diuronille solujen happiradikaali- ja superoksidituotantoon. Diuronialtistusta varten diuronista laimennettiin viisi konsentraatiota (10 µM, 50 µM, 100 µM, 200 µM ja 500 µM), joiden lisäksi DMSO:sta valmistettiin altistamaton kontrolli korkeimman diuronikonsentraation (500 µM) mukaisesti niin, että 0,5 % DMSO:n pitoisuus soluviljelmäkuopalla oli 70,5 mM. Soluista
määritettiin niiden yleistä happiradikaalituotantoa (DCFH-DA), sytosolista superoksidituotantoa (DHE) ja mitokondrionaalista superoksidituotantoa (MitoSOX). Tämän jälkeen solujen elävyyttä määritettiin propidiumjodidin ja digitoniinin avulla. Kaikkiin määrityksiin käytettiin samaa fluorometriä (Infinite F200 Pro, Tecan, Grödig, Itävalta).
4.3 SH-SY5Y -SOLUJEN KASVATUS JA SIIRROSTAMINEN KUOPPALEVYILLE
Tutkimuksessa käytettiin ihmisen neuroblastoomasoluja (SH-SY5Y), koska tutkimusryhmän aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet niiden soveltuvan hyvin tämänkaltaisiin kokeisiin (Höytö ym. 2017, Luukkonen ym. 2014). SH-SY5Y -soluja säilytettiin nestetypessä ampulleissa, jotka sisälsivät 10 % DMSO:ta ja 90 % kasvatusmediumia. Soluja kasvatettiin 75 cm2
soluviljelypulloissa (Thermo Fisher, Kiina), ja niiden kasvatusmediumina käytettiin Dulbecco's Modified Eagle Mediumia (4,5 g/l D-Glucose, High glucose DMEM, Gibco, Iso-Britannia), johon lisättiin 50 U/ml penisilliiniä (Gibco, Iso-Britannia) ja 50 µg/ml streptomysiiniä (Gibco, Iso- Britannia) sekä 10 % inaktivoitua Fetal Bovine Serumia (FBS, Gibco, Etelä-Amerikka). Soluja säilytettiin soluviljelyinkubaattorissa (MCO-170AICUV-PE, Panasonic, Jakarta, Indonesia), jonka lämpötila oli +37 ºC ja hiilidioksidipitoisuus 5 %.
SH-SY5Y-solujen siirrostaminen uusiin soluviljelypulloihin ja kuoppalevyille suoritettiin
laminaarikaapissa steriilissä tilassa suojakäsineitä käyttäen. Laminaari pyyhittiin 70 % etanolilla ennen siirrostamista. Myös käytettävät välineet ja uudet soluviljelypullot pyyhittiin 70 % etanolilla ennen niiden asettamista laminaariin. Valmis kasvatusmedium ja irrotusliuos (0,02 %
etyleenidiamiinitetra-asetaattihappo fosfaatilla puskuroidussa suolaliuoksessa (PBS)), lämmitettiin vesihauteessa (Grant Instruments Y22, Shepreth, Englanti) +37 ºC:een.
Soluviljelypullot otettiin inkubointikaapista laminaariin, jonka jälkeen pulloissa ollut
kasvatusmedium imettiin pois Pasteur-pipetin ja imuletkun avulla. Jokaiseen pulloon pipetoitiin 5 ml irrotusliuosta ja pulloja ravisteltiin kevyesti pöydän tason mukaisesti solujen irtoamisen varmistamiseksi. Irrotusliuoksen annettiin vaikuttaa noin 5 minuuttia, jonka jälkeen liuosta suspensoitiin pullojen pohjia myöten. Saatu solususpensio pipetoitiin liuoksen määrän mukaan joko 15 ml tai 50 ml Falcon-putkeen (Cellstar, Greiner Bio-One, Frickenhausen, Saksa), joka suljettiin ja asetettiin sentrifugiin (Biofuge primo, Heraeus Instruments, Kendro Laboratory Products, Saksa) 8 minuutiksi 311 x g.
Sentrifugoinnin jälkeen putkessa oleva irrotusliuos imettiin pois Pasteur-pipettiä ja imuletkua käyttäen. Putken pohjalle jääneen solupelletin päälle pipetoitiin 1 ml kasvatusmediumia, jonka jälkeen seosta suspensoitiin solupelletin rikkomiseksi. Muodostunutta solususpensiota ja PBS - liuosta pipetoitiin Eppendorf -putkeen (1,5 ml, Eppendorf, Oldenburg, Saksa) niin, että saatiin
1:100 laimennos. Putkea sekoitettiin Vortex -sekoittajassa, jonka jälkeen liuosta pipetoitiin 75 µl automaattiseen solulaskuriin (Moxi Z, Orflo, USA), joka mittasi solujen hyvinvoinnin, koon ja lukumäärän. Tämän pohjalta laskettiin altistukseen tarvittava soluliuosmäärä, joka pipetoitaisiin kuoppalevyihin, jotta jokaiseen kuoppaan tulisi 105 solua. Jäljelle jäänyttä soluliuosta pipetoitiin uusiin soluviljelypulloihin, joihin oli pipetoitu 20 ml kasvatusmediumia. Pullot suljettiin ja niitä liikuteltiin pöydän tasossa niin, että liuos jakaantui tasaisesti pullojen pohjille. Solujen
siirrostaminen tehtiin noin kolme kertaa viikossa solujen kasvun ja käytettävyyden optimoimiseksi.
Altistukset suoritettiin kahta 48-kuoppalevyä käyttäen. Jokaiselle konsentraatiolle (kontrolli (0), 10, 50, 100, 200, 500 µM) varattiin kolme kuoppaa per levy, joihin annosteltiin 0,5 ml soluliuoksen ja kasvatusmediumin seosta. Näiden viereen varattiin lisäksi kolme tyhjää blank-kuoppaa, joita käytettiin määritysten tausta-arvojen saamiseksi. Pipetoinnin jälkeen kuoppalevyjä liikuteltiin kevyesti pöydän tason myötäisesti, jotta solut jakaantuisivat tasaisesti kuoppien pohjille.
Kuoppalevyjen kansiin merkittiin siirrostamispäivä ja solujen määrä kuopissa. Levyjen sivuihin merkittiin numero 1 tai 2 osoittamaan kumpaan inkubaattoriin levy laitettiin
magneettikenttäaltistuksen aikana. Magneettikenttäaltistus on kuvattu tarkemmin kohdassa 4.4.
Lopuksi levyt laitettiin soluviljelyinkubaattoriin esikasvamaan 20 tunnin ajaksi.
4.4 MAGNEETTIKENTTÄALTISTUS
Magneettikenttäaltistus suoritettiin soluviljelyinkubaattoreissa (MCO-170AICUV-PE, Panasonic, Jakarta, Indonesia) joiden lämpötila oli +37 ºC ja hiilidioksidipitoisuus 5 %.
Soluviljelyinkubaattoreiden sisälle asennetut altistuslaitteistot olivat 36 cm korkeat, 36 cm leveät ja 26 cm syvät. Altistuslaitteistoa kiersi kolme kelaa 13 cm etäisyydellä toisistaan. Etummaisilla ja taaimmaisilla keloilla oli ympärillään 12 kierrosta kuparilankaa, jonka halkaisija oli 1,5 mm, kun taas keskimmäisillä keloilla kuparilankaa oli viisi kierrosta. Inkubaattoreissa olevat kelat oli kytketty tietokoneeseen, signaaligeneraattoriin (4052 5 MHz Dual Channel Function/Arbitrary Waveform Generator, B&K Precision, USA) ja vahvistimeen (Europower EP4000, Behringer, Kiina), joiden avulla magneettikentän ominaisuuksia voitiin säätää ja altistus käynnistää.
Magneettivuontiheys oli 200 µT (Hirst GM08 ja Hirst Axial Fluxgate Probe AFG100, Hirst Magnetic
Instruments Ltd., Cornwall, UK) ja kentän taajuus oli 50 Hz homogeenisyys 2 %.
Altistusjärjestelmään kytketyn tietokoneen sokkoutusohjelmisto valitsi satunnaisesti, kumpaan inkubaattoriin magneettikenttä tuotettiin. Näin altistus suoritettiin sokkona, jolloin levyjen jatkokäsittely ja tulosten tarkastelu pysyi puolueettomana. Tutkimuksen jälkeen tietokoneelta tarkistettiin, kumpaan inkubaattoriin järjestelmä oli tuottanut magneettikentän kunkin kokeen aikana. Numerolla 1 merkityt levyt laitettiin aina ylempään inkubaattoriin ja levyt numerolla 2 laitettiin aina alempaan inkubaattoriin, jotta saataisiin jälkikäteen selville, kumpi levy oli ollut inkubaattorissa, johon magneettikenttä tuotettiin. Koska magneettikenttä muodostui vain yhteen inkubaattoriin, toinen inkubaattori pysyi normaalina ja sen sisällä olevat solut saivat sham-altistuksen magneettikenttäaltistuksen sijaan. Magneettikenttäaltistus kesti 24 tuntia, jonka jälkeen suoritettiin diuronialtistus.
4.5 DIURONIALTISTUS
Diuroni laimennettiin haluttujen konsentraatioiden saamiseksi steriilisti laminaarikaapissa ennen magneettikenttäaltistuksen loppua. Diuronia (100 mM, DMSO:ssa) säilytettiin jääkaapissa (+4 ºC).
Diuronin annettiin lämmetä huoneenlämmössä valolta suojatussa paikassa puoli tuntia ennen sen käyttämistä. Tänä aikana myös kasvatusmedium lämmitettiin vesihauteessa ja laminaari sekä tarvittavat työvälineet pyyhittiin 70 % etanolilla. Diuronin valoherkkyyden vuoksi laminaarin valoa ei käytetty laimennosten valmistuksen aikana.
Laimennokset valmistettiin 15 ml koeputkiin. Huoneenlämpöinen diuroni ja laimennettiin 100 mM vahvuudesta 1000 µM vahvuuteen pipetoimalla koeputkeen diuronia ja kasvatusmediumia.
Saatua 1000 µM konsentraatiota pipetoitiin edelleen viiteen koeputkeen, ja niihin lisättiin
kasvatusmediumia haluttujen konsentraatioiden saamiseksi. Laimennosten valmistus ja käytetyt laimennossuhteet on kuvattu kuvassa 6. Koeputkia sekoitettiin Vortex -sekoittajassa sekä
laimennosten valmistuksen jälkeen että juuri ennen niiden pipetointia soluviljelmiin.
Kuva 6. Diuronin laimentaminen koeputkissa suurimmasta konsentraatiosta pienimpään.
Magneettikenttäaltistuksen päätyttyä soluviljelmiä tutkittiin lyhyesti mikroskoopilla mahdollisten kontaminaatioiden ja poikkeavuuksien varalta. Kuoppalevyjen käsittely aloitettiin aina imemällä varovasti molempien levyjen kontrollikuopista kasvatusmedium pois Pasteur-pipetillä ja
imuletkulla, jonka jälkeen tyhjiin kontrollikuoppiin pipetoitiin tuore kasvatusmedium. Molempien levyjen 10 µM diuronille varatut kuopat tyhjennettiin vanhasta kasvatusmediumista edellä
kuvatulla tavalla, jonka jälkeen niihin pipetoitiin 0,5 ml 10 µM diuronia. Seuraavat kuopat
käsiteltiin samalla tavalla mutta lisäämällä 50 µM diuronia tyhjennettyihin kuoppiin. Näin edettiin pienimmistä konsentraatiosta suurempiin käsittelemällä levyjen rinnakkaiset kuopat
samanaikaisesti samalla diuroni-konsentraatiolla. Jokaista konsentraatiota kohden käytettiin omaa pipetinkärkeä, joka poistettiin ja korvattiin uudella siirryttäessä seuraavaan
konsentraatioon, jotta konsentraatiot pysyisivät puhtaina eivätkä sekoittuisi keskenään. Kaikkien kuoppien käsittelyn jälkeen soluviljelmiä altistettiin inkubaattorissa24 tunnin ajan.
4.6 MÄÄRITYSMENETELMÄT
4.6.1 Määritysten valmistelu
Määritykset suoritettiin epästeriilisti huoneenlämpöisessä tilassa. Kaikkia määrityksissä käytettyjä fluoresoivia koettimia säilytettiin pakastimessa (-20 ºC), josta ne otettiin
huoneenlämpöön lämpenemään valolta suojattuna puoli tuntia ennen diuronialtistuksen loppumista. DCFH-DA ja DHE olivat valmiita laimennettavaksi sellaisenaan. Kohdassa 4.6.3.
kuvataan MitoSOX -jauheen esikäsittely käyttövalmiiksi liuokseksi. Koettimien laimentamiseen
käytettiin HBSS -puskuria (Hank’s Balanced Salt Solution) joka lämmitettiin vesihauteessa +37 ºC:een. Myös määrityksiin käytetty fluorometri (Infinite F200 Pro, Tecan, Grödig, Itävalta) ja siihen kytketty tietokone käynnistettiin käyttövalmiuteen.
Kemikaalialtistuksen loputtua magneettikenttäaltistetut ja sham-altistetut kuoppalevyt otettiin ulos inkubaattorista. Levyjä käsiteltiin samanaikaisesti. Kuopissa ollut diuronialtistus tai
kasvatusmedium imettiin pois kuopista Pasteur-pipettiä ja imuletkua käyttäen rivi kerrallaan.
Molemmista levyistä tyhjennettiin ensin yksi rivi kuoppia, joihin pipetoitiin heti 0,5 ml HBSS - puskuria niiden pesemiseksi diuronista. Näin edettiin rivi kerrallaan, kunnes kaikki kuopat oli tyhjennetty ja täytetty HBSS -puskurilla. Ennen koettimien lisäämistä kuopat tyhjennettiin HBSS - puskurista rivi kerrallaan. Koettimien lisäys levyille ja määritysten suorittaminen on kuvattu seuraavaksi kohdissa 4.6.2 ja 4.6.3.
4.6.2 Yleisen happiradikaalituotannon määrittäminen SH-SY5Y -soluista
Solujen yleistä happiradikaalituotantoa määritetään DCFH-DA:n avulla. DCFH-DA eli 2’,7’- diklorodihydrofluoreskiinidiasetaatti on fluoresoiva väriaine, joka mittaa eri reaktiivisia
happiradikaaleja soluissa. Se läpäisee solujen solukalvon, minkä seurauksena solun esteraasit deasetyloivat sen fluoresoimattomaksi yhdisteeksi. Solun reaktiiviset happiradikaalit hapettavat yhdisteen 2’,7’-diklorofluoreskiiniksi (DCF), joka on taas erittäin fluoresoiva. DCF:lle käytettiin filtteriä, jonka aallonpituudet olivat 485 nm (eksitaatio) ja 535 nm (emissio) ja
valomonistinputken herkkyys oli 86.
DCF-HBSS -seosta tarvittiin 22 ml yhdelle levylle. 5 mM DCF laimennettiin 40 µM pitoisuuteen pipetoimalla koeputkeen 21,824 ml HBSS -puskuria, jonka jälkeen siihen pipetoitiin 176 µl 5 mM DCF:ia. DCF-HBSS -seosta sekoitettiin Vortex -sekoittajan avulla ja pipetoitiin 0,5 ml kaikkiin HBSS -puskuripesusta tyhjennettyihin kuoppiin. Myös aiemmin tyhjiin blank-kuoppiin pipetoitiin 0,5 ml DCF-HBSS -seosta. Koettimen lisäämisen jälkeen levyt laitettiin inkuboitumaan puoleksi tunniksi valolta suojattuna. Määrityksiä tehtiin yhden tunnin ajan aloittaen aikapisteestä 0 heti
inkuboinnin jälkeen. Määritysten aikana levy, joka ei ollut fluorometrissä luettavana pidettiin valolta suojattuna, jotta DCF ei pääsisi reagoimaan valon kanssa. Yhden levyn määritysajaksi
saatiin esikokeissa 1,5 minuuttia, joten kaikissa DCF-määrityksissä kumpaakin levyä luettiin 15 kertaa tunnin aikana. Tämän jälkeen suoritettiin solujen elävyysmittaukset, jotka on kuvattu kohdassa 4.6.4.
4.6.3 SH-SY5Y -solujen sytosolisen ja mitokondrionaalisen superoksidituotannon määrittäminen
DHE ja MitoSOX mittaavat superoksidituotantoa soluissa ja ne toimivat samoilla aallonpituuksilla, joten ne voitiin määrittää samanaikaisesti. DHE:n avulla mitataan solujen sytosolista
superoksidituotantoa ja MitoSOX:in avulla mitokondrionaalista superoksidituotantoa. DHE eli dihydroetidium on solun läpäisevä fluoresoiva väriaine, joka ilmenee sytosolissa sinisenä, mutta hapettuessaan värjää solun DNA:n fluoresoivan punaiseksi. DHE:n fluoresenssi aktivoituu
superoksidiradikaalien läsnä ollessa. Se havaitsee erityisesti superoksideja. MitoSOX - määrityksiin käytettiin MitoSOX™ Red -reagenssia, joka tunkeutuu solujen mitokondrioihin.
Mitokondrion superoksidit hapettavat MitoSOX™:n nopeasti eikä se reagoi muihin reaktiivisiin happi- tai typpiradikaaleihin. Hapettunut lopputuote on erittäin fluoresoivaa. Määrityksissä käytettiin filtteriä, jonka aallonpituudet olivat 485 nm (eksitaatio) ja 595 nm (emissio) ja valomonistinputken herkkyys oli 110.
MitoSOX™ -jauheesta valmistettiin 1 mM vahvuinen liuos pipetoimalla siihen 65,8 µl DMSO:ta.
Valmistettu MitoSOX -liuos jaettiin kahteen Eppendorf-putkeen niin, että kumpaankin putkeen liuosta pipetoitiin 32 µl. Käsittely suoritettiin laminaarikaapissa ilman laminaarin valoa
MitoSOX™:in valoarkuuden vuoksi. Laminaari, MitoSOX™ -jauheputki, DMSO -pullo, Eppendorf - putket ja pipetit pyyhittiin 70 % etanolilla ennen käyttöä. Putket merkittiin
valmistuspäivämäärällä ja laitettiin pakastimeen säilytykseen (-20 ºC) jossa ne olivat
käyttövalmiina MitoSOX -määrityksiin. Esikäsitelty MitoSOX -liuos säilyy pakastimessa noin kaksi viikkoa.
Sekä DHE-HBSS -seosta että MitoSOX-HBSS -seosta valmistettiin 22 ml yhtä levyä kohden. 10 mM DHE laimennettiin niin että sen pitoisuudeksi saatiin 10 µM. Tämä tehtiin pipetoimalla 21,978 ml HBSS -puskuriin 22 µl 10 mM DHE:ia. Aiemmin valmistettu 1 mM MitoSOX -seos laimennettiin 1
µM pitoisuuteen pipetoimalla 22 µl 1 mM MitoSOX-seosta 21,978 ml HBSS -puskuriin. Seoksia sekoitettiin Vortex -sekoittajassa ennen niiden pipetointia kuoppalevyille. DHE-HBSS -seosta pipetoitiin 0,5 ml kaikkiin DHE:lle varattuihin, HBSS-puskuripesusta tyhjennettyihin kuoppiin, ja MitoSOX-HBSS -seosta pipetoitiin 0,5 ml MitoSOX:ille varattuihin pestyihin kuoppiin. Seoksia pipetoitiin 0,5 ml myös aiemmin tyhjiin blank-kuoppiin. Blank-kuoppia oli kuusi, joista kolmeen pipetoitiin DHE-HBSS -seosta ja kolmeen MitoSOX-HBSS -seosta. Koettimien lisäämisen jälkeen levyt laitettiin inkuboitumaan puoleksi tunniksi valolta suojattuna huoneenlämpöön. Määrityksiä tehtiin yhden tunnin ajan aloittaen aikapisteestä 0 heti inkuboinnin jälkeen. Määritysten aikana levy, joka ei ollut fluorometrissä luettavana pidettiin valolta suojattuna, jotta koettimet eivät pääsisi reagoimaan valon kanssa. Koska sytosolinen ja mitokondrionaalinen superoksituotanto määritettiin samalla kerralla, levyillä oli kaksinkertainen määrä kuoppia DCF-määritykseen verrattuna. Määritysaika yhdelle levylle oli 3 minuuttia, joten molempia levyjä luettiin 10 kertaa tunnin aikana. Määritysten jälkeen suoritettiin solujen elävyysmittaukset (ks. 4.6.4.).
4.6.4 SH-SY5Y -solujen elävyysmääritykset
Solujen elävyysmäärityksiin käytettiin propidiumjodidia (PI) ja digitoniinia. PI on fluoresoiva värjäysaine, joka pääsee kulkeutumaan soluihin, joiden solukalvo on vahingoittunut nekroosin takia. Myöhemmin lisättävä digitoniini hajottaa solujen solukalvon ja PI pääsee näin
kulkeutumaan kaikkiin soluihin. Sekä PI:ia että digitoniinia säilytettiin Eppendorf-putkissa jääkaapissa (+4 ºC), josta ne otettiin huoneenlämpöön valolta suojattuna puoli tuntia ennen happiradikaali- tai superoksidimääritysten loppua. PI- ja digitoniinimäärityksiin käytettiin samaa filtteriä, jonka eksitaatioaallonpituus oli 540 nm ja emissioaallonpituus oli 612 nm ja
valomonistinputken herkkyys oli 95.
Happiradikaali- tai superoksidituotantomääritysten loputtua levyjen kaikkiin kuoppiin (myös blankoihin) pipetoitiin 20 µl 1,25 mM PI:ia, jolloin PI:n pitoisuus yhdessä soluviljelmäkuopassa oli noin 34 µM. Tämän jälkeen levyt laitettiin pimeään inkuboitumaan 20 minuutiksi. Inkuboinnin aikana digitoniiniputket laitettiin lämpenemään kuivahauteeseen +80 ºC:een. Inkuboinnin jälkeen suoritettiin yksi mittaus molemmille levyille. Seuraavaksi kuoppiin pipetoitiin 20 µl 4 mM digitoniinia per kuoppa, jolloin digitoniin pitoisuudeksi yhdessä kuopassa saatiin 112 µM. Levyt
suojattiin valolta käärimällä ne folioon ja ne laitettiin kuoppalevyravistelijaan (Labsystems Wellmix, Marshall Scientific, Saksa) 20 minuutiksi, jotta digitoniini ja PI pääsisivät tunkeutumaan kaikkiin soluihin. Ravistelun jälkeen molemmille levyille suoritettiin toinen mittaus.
Saaduista fluoresenssiarvoista laskettiin keskiarvot blankoille sekä jokaiselle soluviljelykuopalle.
Fluoresenssiarvoista vähennettiin blankot, ja ensimmäisestä mittauksesta saadut fluoresenssiarvot suhteutettiin digitoniinilisäyksen jälkeisen mittauksen arvoihin.
Solujen elävyysprosentit laskettiin kaavalla:
100 − (𝐹𝐹−𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘1
𝑚𝑎𝑥−𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘2) ∗ 100 (1)
F = fluoresenssiarvo PI:n lisäyksen jälkeen
blank1= tausta soluttomista blank-kuopista PI:n lisäyksen jälkeen
blank2 = tausta soluttomista kuopista digitoniinin lisäyksen jälkeen
Fmax = fluoresenssiarvo digitoniinin lisäyksen jälkeen
4.7 TILASTOLLISET MENTELMÄT
Tilastolliset analyysit suoritettiin GraphPad Prism-ohjelmalla (versio 8.4.0). Tulosten tilastollisen merkitsevyyden määrittämiseksi käytettiin kaksisuuntaista varianssianalyysiä (two-way ANOVA).
Sham-altistusten vertailuun käytettiin lisäksi Bonferroni-testiä. Tilastollisesti merkittäviksi katsottiin tulokset, joiden p-arvo oli pienempi kuin 0,05. Analyysin muuttujina olivat magneettikenttä- ja sham-altistus jokaista diuronin konsentraatiota kohden aikapisteiden suhteen. Kuvat tehtiin käyttämällä Pythonia (versio 3.7.) ja GraphPad Prism- ohjelmaa (versio 8.4.0).
5 TULOKSET
5.1 HAPPIRADIKAALI- JA SUPEROKSIDITUOTANTO
5.1.1 Yleinen happiradikaalituotanto
SH-SY5Y -soluista mitattu yleinen happiradikaalituotanto on esitetty kuvassa 7. Yleinen
happiradikaalituotanto lisääntyi mittaustunnin kuluessa kaikilla diuronin konsentraatioilla (p <
0,0001). Yleinen happiradikaalituotanto oli suurempaa magneettikentälle altistetuilla SH-SY5Y - soluilla kuin sham-altistetuilla SH-SY5Y- soluilla diuronin konsentraatioilla 50 µM ja 100 µM (p <
0,05). Konsentraatiolla 500 µM puolestaan havaittiin enemmän happiradikaalituotantoa sham- altistetuilla SH-SY5Y -soluilla kuin magneettikenttäaltistetuilla SH-SY5Y -soluilla (p < 0,05). Eri konsentraatioilla havaittiin myös eroja happiradikaalituotannossa (sham-altistetut solut).
Konsentraatiolla 500 µM havaittiin enemmän happiradikaalituotantoa verrattuna kontrollikonsentraatioon 0 µM (p < 0,05).
Kuva 7. Yleinen happiradikaalituotanto ihmisen SH-SY5Y -neuroblastoomasoluissa mitattuna 24 tunnin magneettikenttäaltistuksen ja 24 tunnin diuronialtistuksen jälkeen. Katkoviiva kuvaa soluja, joita ei altistettu magneettikentälle (Sham) ja yhtenäinen viiva kuvaa soluja, joita altistettiin magneettikentälle (MK). Tulokset ja keskihajonta (SEM) ilmoitetaan suhteellisena fluoresenssiyksikkönä (relative fluorescence unit, RFU) suhteutettuna suhteelliseen solumäärään (relative cell number, RCN). n=3. *** = p < 0,05.
5.1.2 Sytosolinen superoksidituotanto
SH-SY5Y -soluista mitattu sytosolinen superoksidituotanto on esitetty kuvassa 8. Sytosolinen superoksidituotanto ei lisääntynyt ajan kuluessa yhdenkään konsentraation kohdalla.
Sytosolinen superoksidituotanto oli suurempaa sham-altistetuilla SH-SY5Y -soluilla kuin
magneettikentälle altistetuilla soluilla ilman yhteisaltistusta (p < 0,05). Diuronin konsentraation ollessa 500 µM sytosolinen superoksidituotanto oli suurempaa magneettikenttäaltistetuilla SH- SY5Y –soluilla kuin sham-altistetuilla soluilla (p < 0,05). Pelkän diuronin ei havaittu aiheuttavan sytosolista superoksidituotantoa.
Kuva 8. Sytosolinen superoksidituotanto ihmisen SH-SY5Y -neuroblastoomasoluissa mitattuna 24 tunnin magneettikenttäaltistuksen ja 24 tunnin diuronialtistuksen jälkeen. Katkoviiva kuvaa soluja, joita ei altistettu magneettikentälle (Sham) ja yhtenäinen viiva kuvaa soluja, joita altistettiin magneettikentälle (MK). Tulokset ja keskihajonta (SEM) ilmoitetaan suhteellisena fluoresenssiyksikkönä (relative fluorescence unit, RFU) suhteutettuna suhteelliseen solumäärään (relative cell number, RCN). n=3. *** = p < 0,05.
5.1.3 Mitokondrionaalinen superoksidituotanto
SH-SY5Y -soluista mitattu mitokondrionaalinen superoksidituotanto on esitetty kuvassa 9.
Mitokondrionaalinen superoksidituotanto ei lisääntynyt ajan kuluessa yhdenkään
konsentraation kohdalla. Mitokondrionaalista superoksidituotantoa havaittiin enemmän sham- altistetuilla SH-SY5Y -soluilla kuin magneettikenttäaltistetuilla SH-SY5Y -soluilla diuronin
konsentraatioilla 10 µM ja 100 µM (p < 0,05). Pelkän diuronin ei havaittu aiheuttavan mitokondrionaalista superoksidituotantoa.
Kuva 9, Mitokondrionaalinen superoksidituotanto ihmisen SH-SY5Y -neuroblastoomasoluissa mitattuna 24 tunnin magneettikenttäaltistuksen ja 24 tunnin diuronialtistuksen jälkeen.
Katkoviiva kuvaa soluja, joita ei altistettu magneettikentälle (Sham) ja yhtenäinen viiva kuvaa soluja, joita altistettiin magneettikentälle (MK). Tulokset ja keskihajonta (SEM) ilmoitetaan
suhteellisena fluoresenssiyksikkönä (relative fluorescence unit, RFU) suhteutettuna suhteelliseen solumäärään (relative cell number, RCN). n=3. ***= p < 0,05.
5.2 SOLUJEN ELÄVYYS
SH-SY5Y -solujen elävyys yleisen happiradikaalituotannon määritysten jälkeen mitattuna on esitetty kuvassa 10. Solujen elävyys mitattiin kaikkien määritysten jälkeen, mutta kuvaan on valittu vain yleisen happiradikaalituotannon määritysten jälkeiset mittaukset koska yleisen happiradikaalituotannon määritykseen käytettiin eri filtteriä kuin elävyyden ja
superoksidituotantojen määrityksiin. Solujen elävyydessä ei havaittu tilastollisesti merkittävää eroa magneettikenttäaltistettujen ja sham-altistettujen solujen välillä.
Kuva 10. Solujen elävyys mitattuna heti yleisen happiradikaalituotannon määritysten jälkeen.
Solujen elävyys lasketuista keskiarvoista ja keskihajonta (SEM) ilmoitetaan prosentteina jokaiselle diuronin konsentraatiolle. Sham-altistus on kuvattu vaalealla, kuviollisella pylväällä ja
magneettikenttäaltistus (MK) on kuvattu tummemmalla punaisella. n=3.
