EURO 6 HENKILÖAUTOJEN E10, E85 JA DIESEL
PÄÄSTÖHIUKKASTEN AIHEUTTAMAT TOKSIKOLOGISET VAIKUTUKSET HIIREN MAKROFAGI-SOLULINJASSA
Maija Sainio Euro 6 henkilöautojen E10, E85 ja diesel päästöhiukkasten aiheuttamat toksikologiset vaikutukset hiiren makrofagi-solulinjassa
Pro Gradu -tutkielma Ympäristötiede Itä-Suomen yliopisto, Ympäristö- ja biotieteiden laitos
Helmikuu 2020
Maija Sainio: Euro 6 henkilöautojen E10, E85 ja diesel päästöhiukkasten aiheuttamat toksikologiset vaikutukset hiiren makrofagi-solulinjassa
Pro Gradu -tutkielma 51 sivua
Tutkielman ohjaaja: FT, Dos., Akatemiatutkija, apulaisprofessori Pasi Jalava Helmikuu 2020
________________________________________________________________________
avainsanat: (bensiini, diesel, päästöhiukkaset, terveysvaikutukset, in vitro -menetelmä) TIIVISTELMÄ
Ilmansaasteet ovat globaalisti merkittävä kansanterveydellinen ongelma, sillä niiden tiedetään aiheuttavan lukuisia haitallisia vaikutuksia ihmisten terveydelle. Henkilöautoista peräisin olevat päästöhiukkaset ovat yksi merkittävimmistä ilmansaasteiden lähteistä erityisesti kaupunkialueilla. Päästöhiukkaset sisältyvät polttoaineen palamisessa syntyviin pakokaasuihin, ja monet tutkimukset ovat osoittaneet niiden yhteyden vakaviin terveyshaittoihin, kuten ennenaikaisiin kuolemiin, sekä lisääntyneeseen hengityselinsairauksien, sydän- ja verisuonitautien, sekä syöpien esiintyvyyteen.
Yksi merkittävä keino päästöjen vähentämiseksi on kehittää moottori- ja jälkikäsittelyteknologiaa vähäpäästöisemmäksi, ja parantaa käytettävien polttoaineiden laatua ja koostumusta. Euroopassa pakokaasupäästöjä alettiin rajoittaa vuonna 1992 Euro 1 lainsäädännön astuessa voimaan. Tällä hetkellä voimassa oleva Euro 6 standardi korvasi edeltäjänsä vuonna 2014. Euro standardien tarkoituksena on hyödyntää uusinta mahdollista moottoritekniikkaa raja-arvojen toteuttamiseksi.
Toinen tärkeä keino päästöjen vähentämiseksi on muuttaa polttoaineen koostumusta.
Markkinoille onkin tullut useita eri vaihtoehtoja biopolttoaineperäisistä ratkaisuista, joiden tarkoituksena on vähentää uusiutumattomien fossiilisten polttoaineiden tarvetta, sekä vähentää pakokaasujen aiheuttamia haitallisia terveysvaikutuksia. Eräs käytetyimpiä biopolttoaineita on etanoli, jota lisätään nykyään moniin bensiinin tai dieselin seospolttoaineisiin eri tilavuusprosentteina riippuen käytetystä moottoriratkaisusta.
Tämän pro gradu -työn tarkoituksena oli tutkia kolmesta erityyppisestä Euro 6 lainsäädännön mukaisesta henkilöautosta peräisin olevia tosielämän päästöhiukkasia. Tavallisessa E10 henkilöautossa käytettiin polttoaineena etanolin ja bensiinin seosta suhteessa 10/90%, biopolttoaine E85 henkilöauton etanolin ja bensiinin suhde oli 83/17% ja tutkitussa diesel henkilöautossa käytettiin tavallista diesel polttoainetta. Tutkimuksissa käytettiin hiiren makrofagi soluja (RAW264.7), joita altistettiin kerätyille päästöhiukkasille. Altistuksen jälkeen soluille tehtiin yleisesti tutkimuskäytössä olevia solutoksikologisia tutkimuksia, joiden perusteella analysoitiin päästöhiukkasten aiheuttamaa solutoksisuutta ja oksidatiivista stressiä.
Solutoksisuuden määrittämiseen käytettiin solujen metabolista aktiivisuutta mittaavaa MTT- testiä, solukalvon eheyttä mittaavaa PI-testiä, sekä solujen elävyyttä mittaavaa DAPI-testiä.
Oksidatiivista stressiä mitattiin DCF- ja tioli-testeillä.
Tulokset osoittivat kaikkien tutkittujen päästöhiukkasten aiheuttavan annos - vasteista akuuttia solutoksisuutta RAW264.7 soluissa. Tämän tutkimuksen tulosten perusteella Euro 6 lainsäädännön mukaisen tavallisen E10 henkilöauton päästöhiukkaset aiheuttivat merkittäviä toksikologisia vaikutuksia verrattuna muihin uuden teknologian henkilöautojen päästöihin.
Etanolin lisääminen bensiiniin näyttäisi vähentävän haitallisia toksikologisia vaikutuksia.
Tutkitut diesel päästöhiukkaset eivät aiheuttaneet haitallisia toksisuusvasteita. Tässä tutkimuksessa tarkasteltiin vain hiukkasten aiheuttamaa toksisuutta, joten lisää tutkimuksia tarvitaan selvittämään pakokaasujen aiheuttamia toksikologisia kokonaisvaikutuksia.
Maija Sainio: Toxicological effects of Euro 6 passenger cars E10, E85 and diesel exhaust particles in the macrophage cell line of murine RAW264.7
Master of Science thesis 51 pages
Supervisor: Ph. D., Academy Research Fellow, Associate professor Pasi Jalava February 2020
________________________________________________________________________
Keywords: (gasoline, diesel, exhaust particles, health effects, in vitro method) ABSTRACT
Air pollution is known to cause globally major adverse health effects to humans. Emissions from passenger cars are one of the main sources of air pollution, especially in urban areas.
Exhaust particles are the main components of exhaust gas, and numerous studies have shown their association to serious adverse health effects, such as premature deaths, respiratory and cardiovascular diseases, and cancers, especially lung cancer.
One important way to reduce emissions is to develop engine technology and improve the quality and composition of the fuels. In Europe, the exhaust emissions began to be restricted in 1992 with the Euro 1 legislation. The current Euro 6 legislation replaced its predecessor in 2014. The purpose of the Euro legislations is to utilize the latest available engine technology to compliance of the standard limit values.
Another important way to reduce emissions is to improve the composition of the fuel. There are several options on the market for renewable biofuel-based solutions to reduce the reliance for non-renewable fossil fuels, and also to reduce the adverse health effects of exhaust emissions of the diesel and gasoline vehicles. One of the most widely used biofuel is ethanol, which is currently used blended in all gasoline fuels in different volumes depending on the engine technology used.
The purpose of this Master’s thesis was to investigate the real-life exhaust particles from exhaust fumes of three different types of Euro 6 passenger cars. The standard E10 passenger car used fuel of blended ethanol gasoline in the ratio of 10/90%, the biofuel E85 passenger car blended ethanol gasoline fuel in the ratio of 83/17% and the Euro 6 diesel passenger car fuel used was regular diesel fuel. In this in vitro study was used the murine macrophage cell line RAW264.7 which was exposed to collected exhaust particles in submerged conditions. After the exposure, the commonly used cellular toxicological studies were conduct to the exposed cells to analyze the cytotoxicity and oxidative stress caused by exhaust particles. Cytotoxicity was determined using the MTT assay for cellular metabolic activity, PI assay for cell membrane integrity and DAPI assay for cell viability. Oxidative stress was measured by DCF and thiol tests.
The results showed dose - response acute cytotoxicity in RAW264.7 cells exposed to all studied real-life exhaust particles. Based on the results of this research, the exhaust particles from the standard E10 passenger car caused significant toxicological effects compared to other tested modern passenger car PM emissions. Increasing the ethanol concentration of the gasoline fuel seems to reduce PM mass concentration and the harmful toxicological effects of exhaust particles. Numerous previous studies also confirm these observations based on the current study. Exhaust particles form modern diesel engine did not induce any remarkable toxic responses in this kind of study set-up. Further studies are needed to determine the overall effects of the exhaust fumes, because in the current study was observed only PM emissions, and numerous studies have shown that also gas phase of the exhaust emissions have impacts to human health.
Tämän pro gradu -tutkielman toksikologiset analyysit suoritettiin Itä-Suomen yliopiston Ympäristö- ja biotieteiden laitoksen Inhalaatiotoksikologian laboratoriossa 1.6.-31.7.2019.
Työn ohjaajana toimi apulaisprofessori, filosofian tohtori Pasi Jalava. Työ tehtiin osana Inhalaatiotoksikologian tutkimusryhmän projektia.
Tässä työssä käytetyt päästöhiukkaset kerättiin VTT:n henkilöautojen päästöjen mittauskampanjan yhteydessä huhtikuussa 2016 VTT:n toimesta.
Kiitän opinnäytetyöni ohjaajaa Pasi Jalavaa asiantuntevasta ohjauksesta. Haluan kiittää myös filosofian maisteri Henri Hakkaraista altistuskokeiden suorittamisen avustamisesta. Lisäksi kiitän koko Inhalaatiotoksikologian tutkimusryhmää mukavasta ja kannustavasta työilmapiiristä sekä toksikologisten analyysien suorittamisen opastuksesta.
Lopuksi haluan kiittää perhettäni ja puolisoani Markusta tuesta ja kannustuksesta koko tutkielman teon ajalta.
Kuopiossa 22.1.2020 Maija Sainio
AFR Ilman ja polttoaineen suhde (air-fuel ratio)
AUC Käyrän alapuolelle jäänyt pinta-ala (area under curve) CMA Solujen metabolinen aktiivisuus (cellular metabolic activity) CVC Vakiotilavuus näytteenotin (constant volume sampler) DAPI 4′,6-diamidino-2-phenylindole
DCF 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein
DEP Diesel päästöhiukkaset (diesel exhaust particles) DMSO Dimetyylisulfoksidi
DPF Diesel hiukkassuodatin (diesel particulate filter)
DOC Dieselin hapettumiskatalysaattori (diesel oxidation catalyst)
EGR Pakokaasun takaisinkierrätysjärjestelmä (Exhaust gas recirculation)
EPA Yhdysvaltain ympäristönsuojelu virasto (Environmental Prtotection Agency) E10 Polttoaine, joka sisältää enintään 10% etanolia ja vähintään 90% bensiiniä E85 Polttoaine, joka sisältää enintään 85% etanolia ja vähintään 15% bensiiniä
FBS Lehmän alkion seerumi (fetal bovine serum) H2DCF-DA 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diasetaatti
IARC Kansainvälinen syöväntutkimuskeskus (International Agency for Research on Cancer)
MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromidi
PBS Fosfaattipuskuroitu suolaliuos (phosphate-buffered saline)
PM0,1 Ultrapienet hiukkaset/nanohiukkaset (aerodynaamiselta halkaisijaltaan 1-100 nm hiukkasia)
PM2,5 Pienhiukkaset (aerodynaamiselta halkaisijaltaan alle 2,5 µm hiukkasia)
PM10 Hengitettävät hiukkaset (aerodynaamiselta halkaisijaltaan alle 10 µm hiukkasia)
PI Propidium jodidi
RAW264.7 Hiiren makrofagi solulinja
ROS Reaktiiviset happiradikaalit (reactive oxygen species) SEM Keskiarvon keskivirhe (standard error of mean)
SCR Selektiivinen katalyyttinen vähennys (selective catalytic reduction) SDS Natriumlauryylisulfaatti (sodium dodecyl sulfate)
SOA Sekundääriset orgaaniset aerosolit (secondary organic aerosols) TDI Turboahdettu suora injektio (turbocharged direct injection) THC Kokonaishiilivedyt (total hydrocarbons)
TNF-α Tuumorinekroositekijä α
TSI Turboahdettu kerrostettu injektio (turbocharged stratified injection) TWC Kolmitoimikatalysaattori (three-way catalyst)
VOC Haihtuvat orgaaniset yhdisteet (volatile organic compounds)
VTT Teknologian tutkimuskeskus VTT Oy (VTT Technical Research Centre of Finland Ltd)
2. KIRJALLISUUSKATSAUS ... 10
2.1. LIIKENTEENPÄÄSTÖHIUKKASET ... 10
2.2. MOOTTORITEKNOLOGIANJAPOLTTOAINEENVAIKUTUKSETPÄÄSTÖIHIN ... 14
2.3. PÄÄSTÖHIUKKASTENAIHEUTTAMATTOKSIKOLOGISETVAIKUTUKSET ... 17
2.4. EURO6LAINSÄÄDÄNTÖ ... 20
2.5. SOLUTOKSIKOLOGISETTUTKIMUKSET ... 23
2.5.1. Solutoksisuus ... 25
2.5.2. Oksidatiivinen stressi ... 25
3. TYÖN TAVOITTEET ... 27
4. AINEISTO JA MENETELMÄT ... 28
4.1. TESTIAUTOTJAPOLTTOAINEET ... 28
4.2. HIUKKASTENKERÄYS ... 29
4.3. PAKOKAASUNKOOSTUMUS ... 31
4.4. SOLUTOKSIKOLOGISETTUTKIMUKSET ... 33
4.4.1. Solulinja ... 33
4.4.2. Hiukkasnäytteiden esikäsittely ja solujen altistukset ... 33
4.4.3. Solujen irrottaminen ja hiukkaslevyjen käsittely ... 34
4.4.4. Solujen metabolinen aktiivisuus ... 35
4.4.5. Oksidatiivinen stressi (DCF-testi) ... 35
4.4.6. Solukalvon eheys ... 36
4.4.7. Solujen elävyys ... 36
4.4.8. Oksidatiivinen stressi (Tioli-testi) ... 37
4.4.9. Tulosten käsittely ... 38
4.4.10. Tilastollinen analyysi ... 39
5. TULOKSET ... 39
5.1. SOLUJENMETABOLINENAKTIIVISUUS ... 40
5.2. OKSIDATIIVINENSTRESSI... 40
5.3. SOLUKALVONEHEYS ... 42
5.4. SOLUJENELÄVYYS ... 43
6. TULOSTEN TARKASTELU ... 44
7. YHTEENVETO ... 46
LÄHDELUETTELO ... 47
1. JOHDANTO
Ilmansaasteet ovat globaalisti eniten kuolemia ja sairauksia aiheuttavia ympäristöaltisteita, sillä noin 4,2 miljoonan ennenaikaisen kuoleman arvioidaan johtuvan ilmansaasteiden vaikutuksesta (Barraud ym. 2017, WHO, 2019). Euroopassa ilmansaasteista johtuvia ennenaikaisia kuolemia arvioidaan olevan noin 500 000 vuosittain, ja keskimääräisen eliniän arvioidaan lyhenevän noin 9 kuukautta (WHO 2019). Paikalliset ilmansaasteet pysyttelevät ongelmana kaikkialla Euroopassa riippumatta lukuisista ilmanlaadun parantamiseen pyrkivistä toimenpiteistä (Weber ym. 2019). Ilmansaasteille altistumisen tiedetään lisäävän sairastumisen riskiä useisiin keuhkosairauksiin, sydän- ja verisuonitauteihin, sekä syöpiin (Cao ym. 2015, Cui ym. 2019, Durga ym. 2014, Lawal ym. 2016, Zhang ym. 2019). Tutkimukset ovat yhdistäneet ilmansaasteet myös neurologisiin ja immunologisiin sairauksiin. Nämä ilmansaasteiden vaikutukset ovat johtaneet myös haitallisiin taloudellisiin vaikutuksiin, johtuen esimerkiksi lisääntyneistä sairaalakäynneistä pahentuneiden hengityselinsairauksien oireiden vuoksi.
(Jalava ym. 2016, Zhang ym. 2019).
Ilmansaasteilla tarkoitetaan haitallisia hiukkasmaisia tai kaasumaisia aineita, sekä näiden yhdistelmiä, jotka voivat olla peräisin luonnosta tai ihmisen toiminnasta (Jalava ym. 2016, Lawal ym. 2016). Kaasumaisista aineista hiilimonoksidilla (CO), otsonilla (O3), typen oksideilla (NOX) ja rikkidioksidilla (SO2) tiedetään olevan eniten haitallisia vaikutuksia ihmisten terveyteen. Hiukkasmaiset aineet (PM) ovat dominoiva ilmansaasteiden komponentti ja tutkimukset ovat osoittaneet niiden olevan merkittävin syy ilmansaasteisiin yhdistetyissä haitallisissa terveysvaikutuksissa (Kim ym. 2014, Lawal ym. 2016). Suomessa ulkoilman hiukkaset aiheuttavat noin 1800 ennenaikaista kuolemaa vuosittain (THL 2019).
Kansainvälinen syöpäjärjestö IARC on luokitellut ilmansaasteet, sekä erillisinä ilmansaasteiden komponentteina hiukkasmaiset aineet, karsinogeenisiksi. Ilmansaasteiden muodostumiseen, koostumukseen ja konsentraatioon vaikuttavat sääolosuhteet, kuten vuodenaika, tuuli, sade, auringonpaiste ja lämpötila. Ilmansaasteiden pitoisuus, saasteen koostumus ja erilaisissa ympäristöissä vietetty aika ovat ilmansaasteille altistumisen ja niiden aiheuttamien terveysriskien määrittäviä tekijöitä. Kaikki altistuvat ilmansaasteille, sillä niitä on kaikkialla ympäröivässä hengitysilmassa. (EEA 2018, THL 2019, WHO 2019).
Merkittävimmät ilmansaasteiden päästölähteet kehittyneissä maissa ovat tieliikenne, puun pienpoltto, sekä energiantuotanto- ja teollisuuslaitokset. Erityisesti kaupunkialueilla tieliikenne on usein yksi merkittävimmistä ilmansaasteiden, erityisesti hiukkasmaisten aineiden, lähteistä.
Liikenteen sektorin päästöistä noin 80% on peräisin tieliikenteestä (THL 2019). Tieliikenteestä peräisin olevat ilmansaasteet voidaan jakaa pakokaasupäästöihin ja katupölyyn. Katupölyllä tarkoitetaan yleensä PM10 hiukkasia, jotka voivat olla esimerkiksi autojen jarruista, renkaiden nastoista tai moottorista peräisin olevia metalleja, ajoneuvojen renkaiden kumihiukkasia tai hiekoitushiekasta ja tienpinnasta irronneita mineraaleja. Pakokaasut taas koostuvat monista kaasumaisista ja hiukkasmaisista yhdisteistä, kuten typen oksideista ja ultrapienistä hiukkasista.
(THL 2019). Henkilöautot ovat pääasiallinen liikkumisväline monissa kehittyneissä kulttuureissa ja arvioiden mukaan tieliikennekäyttöisiä ajoneuvoja on tällä hetkellä käytössä noin 1,3 miljardia, ja määrän odotetaan kasvavan entisestään (Kumar ym. 2018).
Kaupungistumisen ja autojen määrän lisääntyessä myös katupölyn ja pakokaasujen osuus ilmansaasteista kasvaa, mutta pakokaasujen määrää on mahdollista pienentää kehittämällä ajoneuvojen moottori- ja jälkikäsittelytekniikoita vähäpäästöisemmiksi (Che ym. 2007).
Tällä hetkellä suurin osa liikenteen pakokaasupäästöistä on peräisin diesel ja bensiini käyttöisistä ajoneuvoista. Liiallinen fossiilisten polttoaineiden käyttäminen kuluttaa näitä uusiutumattomia luonnonvaroja loppuun, jonka lisäksi niiden käyttö tuottaa runsaasi haitallisia pakokaasupäästöjä ilmakehään kiihdyttäen samalla ilmastonmuutosta. Ainoa kestävä mahdollisuus tähän ongelmaan on korvata uusiutumattomat energianlähteet uusiutuvilla ratkaisuilla, ja biopolttoaineet ovat osoittautuneet potentiaaliseksi vaihtoehdoksi (Jalava ym.
2010, Kumar ym. 2018). Biopolttoaineiden, kuten etanolin, käyttö polttoaineena tai osana polttoaineseosta vaatii kuitenkin uudenlaisia ajoneuvojen teknologiaratkaisuja. Kaikki uusi teknologia pyritään valmistamaan siten, että haitallisia vaikutuksia ympäristölle tai ihmisten terveydelle ei aiheutuisi. Vaikka uusien ratkaisujen kokeellinen testaaminen ja lainsäädäntö ovat erittäin tarkasti säädeltyä, on myös mahdollista, että uuden teknologian myötä syntyy uusia tuntemattomia pakokaasujen komponentteja, joiden todelliset vaikutukset selviävät vasta myöhemmän käyttöönoton yhteydessä (Aakko-Saksa ym. 2017).
Tämän pro gradu -työn tarkoituksena oli tutkia kolmesta erilaisesta uuden Euro 6 lainsäädännön mukaisen henkilöauton (bensiini, etanoli - bensiini ja diesel) tosielämän pakokaasuista kerättyjä päästöhiukkasia. Tämä in vitro tutkimus suoritettiin altistamalla hiiren makrofagi-solulinjan RAW264.7 soluja tutkittaville päästöhiukkasille.
2. KIRJALLISUUSKATSAUS
2.1. LIIKENTEEN PÄÄSTÖHIUKKASET
Erityisesti monilla kaupunkialueilla tieliikenne ja henkilöautot ovat merkittäviä ilmansaasteiden lähteitä. Tieliikenteen päästöistä merkittävästi suuremmat hiukkaspitoisuudet ovat peräisin muista lähteistä kuin pakokaasupäästöistä, kuten katupölystä, mutta tämän tutkielman kirjallisuuskatsauksen tarkoituksena on keskittyä moottoripäästöjen vaikutuksiin.
Pakokaasut ovat palamistuotteita, joita muodostuu ajoneuvon moottorissa polttoaineen palamisreaktioissa. Suurin osa polttoaineen palamisesta muodostaa täydellisen palamisen tuotteita, eli typpeä, happea, hiilidioksidia ja vettä. Näitä tuotteita ei pidetä varsinaisina päästöinä, vaan pakokaasupäästöihin luokitellaan epätäydellisen palamisen seurauksena muodostuneet saasteet, joita syntyy kuitenkin vain alle 0,5 % kokonaispäästöistä sekä diesel- että bensiinipolttoaineiden palaessa (kuva 1). Moottorissa polttoaineen ja voiteluöljyn palamisprosessin sivutuotteina syntyy hiukkasmaisia ja kaasumaisia epäpuhtauksia, sekä näiden yhdistelmiä. Hiukkasmaisiin pakokaasuihin eli päästöhiukkasiin sisältyy monia orgaanisia ja epäorgaanisia yhdisteitä, kuten PAH-yhdisteitä, metalliyhdisteitä, anioneja (esim.
sulfaatteja ja nitriittejä), ultrapieniä hiukkasia ja mustaa hiiltä (Cui ym. 2019). Tällä tavalla syntyneitä hiukkasia kutsutaan primäärisiksi hiukkasiksi. Primääriset hiukkaset muodostavat sekundäärisiä orgaanisia aerosoleja (SOA) ilmakehän reaktioissa. Kaasumaisessa muodossa esiintyviin haitallisiin pakokaasuihin luokitellaan CO, NOX, karbonyylit (esim. asetaldehydi ja formaldehydi) ja VOC-yhdisteet (esim. bentseeni ja metaani). Lisäksi typen oksidit ja sen hapetustuotteet voivat muodostaa hiukkasia reagoidessaan esimerkiksi ammoniakin kanssa.
(Aakko-Saksa ym. 2017, THL 2019).
Liikenteen polttoperäisistä pienhiukkasista suurin osa on diesel- ja bensiinikäyttöisissä moottoreissa syntyneitä päästöhiukkasia (Atkinson ym. 2016, Che ym. 2007, Park ym. 2018 Zheng ym. 2019). Moottoripäästöt aiheuttavat noin 25-40% ulkoilman ultrapienistä hiukkasista (IARC 2013). Molemmissa moottorityypeissä polttoaine, voiteluöljy ja moottorin kuluminen aiheuttavat päästöjä. Polttoaineen palamisessa syntyviä päästöjä ovat alkuainehiili, orgaaninen hiili ja PAH-yhdisteet. VOC-yhdisteitä muodostuu palamattomasta polttoaineesta ja aldehydejä etanolista. Moottorin kulumisen ja voiteluöljyn päästöjä ovat metallit, PAH-yhdisteet ja muut lisäaineet. (Wu ym. 2019).
Kuva 1. Dieselin ja bensiinin palamistuotteet. Polttoaineiden palamisreaktioissa syntyy pakokaasupäästöjä alle 0,5 % (Aakko-Saksa ym. 2017).
Merkittävä osa haitallisiin terveysvaikutuksiin yhdistetyistä liikenteen päästöistä koostuu hiukkasmaisista aineista, joten merkittävä osa haitallisista pakokaasupäästöistä on päästöhiukkasia (Durga ym. 2014). Päästöhiukkaset koostuvat pääasiassa pienhiukkasista (PM2,5) ja ultrapienistä tai nanohiukkasista, eli alle 100 nm kokoluokan hiukkasista (Gehr ja Heyder 2000). Tutkimukset ovat antaneet vahvaa näyttöä siitä, että kaikki pienhiukkaset eivät ole yhtä toksisia keskenään, vaan niiden aiheuttamat haitalliset terveysvaikutukset riippuvat useista eri tekijöistä, kuten hiukkasten koosta, pinta-alasta, muodosta, pinta-aktiivisuudesta, lukumäärästä, kemiallisesta koostumuksesta, sekä hapettavista ominaisuuksista, jotka taas riippuvat niiden muodostumisprosesseista ja alkuperästä (Jalava ym. 2012, Jalava ym. 2016, Park ym. 2018, THL 2019, WHO 2019). Liikenteen päästöt ovat tunnetusti merkittävimpiä toksisten pienhiukkasten lähteitä (Durga ym. 2014, Kashyap ym. 2019, Yang ym. 2019).
Lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet, että pienempien kokoluokkien hiukkaset aiheuttavat eniten haitallisia terveysvaikutuksia ihmisissä, sillä ne pystyvät kulkeutumaan syvälle hengityselimiin, sekä verenkiertoon (Lawal ym. 2016, Zhang ym. 2019). Lisäksi, erityisesti ultrapienillä hiukkasilla on suhteellisen suuri pinta-ala niiden kokoon nähden, jonka vuoksi niiden pintaan voi adsorboitua muita haitallisia aineita, kuten PAH-yhdisteitä, jotka voivat kulkeutua elimistöön hiukkasten pintaan kiinnittyneinä. PAH-yhdisteet voivat reagoida erittäin voimakkaasti elimistön solujen kanssa aiheuttaen monia haitallisia vaikutuksia eri mekanismien kautta (Kim ym. 2014, Luo ym. 2015). Monet tutkimukset ovat yhdistäneet kroonisen ja akuutin altistumisen pienhiukkasille lisääntyneeseen kuolleisuuteen ja
sairasteluun, johtuen erityisesti sydän- ja verisuonitaudeista, sekä hengityselinten sairauksista (Campagnolo ym. 2019, Cao ym. 2015, Kim ym. 2014). Pienhiukkasten aiheuttamat sydän- ja verisuonitaudit ovat yhteydessä useiden tutkimusten mukaan todennäköisesti oksidatiiviseen stressiin ja tulehdukseen (Cao ym. 2015).
PAH-yhdisteet ovat kahdesta tai useammasta fuusioituneesta aromaattisesta renkaasta muodostuneita molekyylejä, joita syntyy esimerkiksi moottoreissa polttoaineen palamisen riittämättömästä hapesta johtuvassa epätäydellisessä palamisreaktiossa (IARC 2013). Diesel pakokaasut ovat tunnettuja PAH päästöjen lähteitä, mutta myös bensiini pakokaasut voivat sisältää korkeita PAH pitoisuuksia erityisesti kylmissä lämpötiloissa. Monet PAH-yhdisteet ovat tunnetusti karsinogeenisia ja mutageenisiä, joten niiden tiedetään aiheuttavan haitallisia vaikutuksia ihmisten terveydelle. EPA on määrittänyt tarkkailtavaksi 16 ilmansaasteisiin yhdistettyä PAH-yhdistettä perustuen niiden aiheuttamiin haitallisiin vaikutuksiin.
Bentso(a)pyreeni on tunnetuin ja tutkituin PAH-yhdiste (Ilmatieteen laitos 2020), ja sen metaboliittien tiedetään olevan mutageenisia ja voimakkaasti ihmiselle karsinogeenisia (IARC 2013). Muita EPA:n tarkkailemia PAH-yhdisteitä ovat naftaleeni, antraseeni, asenafteeni, asenaftyleeni, fluoreeni, fenantreeni, fluoranteeni, pyreeni, kryseeni, bentso(a)antraseeni, bentso(b)fluoranteeni, bentso(k)fluoranteeni, indeno(1,2,3-cd)pyreeni, bentso(g,h,i)peryleeni ja dibenz(a,h)antraseeni. Monet näistä on luokiteltu ryhmään 2B, eli ihmiselle mahdollisesti karsinogeeniseksi (IARC 2013). Pakokaasupäästöt saattavat myös sisältää haitallisia ja mahdollisesti ihmiselle karsinogeenisia nitro-PAH ja oxy-PAH yhdisteitä (Aakko-Saksa ym.
2017).
Dieselmoottorista peräisin olevat pakokaasut sisältävät pääasiassa ultrapieniä hiukkasia, alkuainehiiltä, mustaa hiiltä, hiilimonoksidia, aldehydejä ja typen oksideja (Atkinson ym. 2016, Bai ym. 2001, Barraud ym. 2017). Useat tutkimukset ovat arvioineet, että 50-90%
dieselmoottorista peräisin olevista hiukkasmaisista aineista eli DEP-hiukkasista kuuluu ultrapienten hiukkasten kokoluokkaan (Kim ym. 2014). Erityisesti vanhan teknologian dieselmoottorista peräisin olevat päästöhiukkaset ovat tunnetusti kaikista toksisimpia pienhiukkasia (Lawal ym. 2016, Park ym. 2018). Vanhan teknologian dieselmoottorit tuottavat huomattavasti enemmän hiukkasia ja NOX päästöjä kuin bensiinimoottorit. Nykyisin liikennekäytössä on edelleen suuri määrä vanhan teknologian mukaisia diesel ajoneuvoja, joten myös näiden tuottamia päästöjä on tärkeää tutkia (Che ym. 2007). Modernien dieselmoottoreiden hiukkaspäästöjä ei voida vertailla laadullisesti eikä määrällisesti
vanhempien moottoreiden päästöihin (Fiebig ym. 2014). Kansainvälinen syöpäjärjestö IARC on luokitellut diesel pakokaasupäästöt ryhmään 1, eli ihmiselle syöpää aiheuttavaksi (Barraud ym. 2017, IARC 2013). Tämä luokittelu perustuu tutkimuksiin, jotka on tehty ennen Euro 5 ja 6 päästöluokituksia. Kuitenkin nykyisellä Euro 6 päästötekniikalla dieselmoottoreiden päästöt on rajoitettu erityisesti hiukkasten osalta hyvin matalalle tasolle, joten dieselin aiheuttamat haitalliset vaikutukset ovat laskeneet huomattavasti uuden tekniikan myötä (Jalava ym. 2012).
Bensiinimoottorin pakokaasuja ovat pääasiassa ultrapienet hiukkaset, CO, NOX ja VOC- yhdisteet (Atkinson ym. 2016). Bensiinin pakokaasupäästöt on luokiteltu ryhmään 2B, eli mahdollisesti ihmiselle karsinogeeniseksi, vaikka bensiinimoottorin pakokaasut sisältävät monia karsinogeenisia yhdisteitä, kuten bentseeniä, 1,3-butadieeniä ja bentso(a)pyreeniä (IARC 2013). Uuden teknologian moottoreissa bensiinimoottorin pakokaasujen on havaittu sisältävän enemmän hiukkasia kuin uusista dieselmoottoreista peräisin olevien pakokaasujen.
Tutkimukset ovat osoittaneet, että varsinkin uusista bensiinimoottoreista päätyy ilmaan muiden päästöjen lisäksi suuria määriä ultrapieniä hiukkasia. Diesel hiukkassuodattimien tapaan myös uusiin bensiini käyttöisiin ajoneuvoihin on suunnitteilla hiukkassuodattimet, jotta päästöt saataisiin minimoitua (Aakko-Saksa ym. 2017).
Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että ajoneuvojen kylmäkäynnistys ja moottorin käyttö pakkasolosuhteissa lisää merkittävästi pakokaasupäästöjä, erityisesti päästöhiukkasia (Weber ym. 2019). Ajoneuvojen kylmäkäynnistyksestä aiheutuneita päästöjä erityisesti Euro 6 lainsäädännön mukaisilla ajoneuvoilla on toistaiseksi tutkittu vielä hyvin vähän. Monet tutkimukset ovat antaneet viitteitä siitä, että Euro 6 ajoneuvot eivät noudata Euro 6 raja-arvoja kylmissä olosuhteissa, erityisesti päästöhiukkasten ja typen oksidien osalta.Tutkimukset ovat osoittaneet, että matalat lämpötilat vaikuttavat enemmän uusiin bensiinikäyttöisiin ajoneuvoihin kuin uusiin dieseleihin (Platt ym. 2017). Esimerkiksi Yusuf ja Inambao (2019) tutkimus osoitti, että kylmäkäynnistys on merkittävä ajoneuvon päästöihin vaikuttava tekijä, sillä testiolosuhteiden ollessa uuden eurooppalaisen ajosyklin (UN ECE R83) mukaiset, PM päästöt lisääntyivät noin 150-200% lämpötilan muuttuessa +22 C:sta -7 C:een. Lämpötilan lasku lisäsi myös polttoaineen kulutusta. Tutkimuksen tulosten mukaan hiukkasten lukumäärä oli korkeampi kylmässä moottorissa, mutta lukumäärä väheni koneen lämmitessä normaaliin toimintalämpötilaan.
2.2. MOOTTORITEKNOLOGIAN JA POLTTOAINEEN VAIKUTUKSET PÄÄSTÖIHIN
Henkilöautoissa eniten käytettyjä polttomoottoreita ovat dieselmoottorit ja bensiinikäyttöiset moottorit eli ottomoottorit. Polttomoottorin tarkoituksena on tuottaa mekaanista liikettä polttoaineen kemiallisten sidosten energiasta polttoprosessissa. Dieselmoottori toimii puristussytytyksellä, kun taas ottomoottorissa polttoaineseos sytytetään mekaanisesti sähköisellä kipinällä (Aakko-Saksa ym. 2017). Henkilöautojen diesel- ja bensiinimoottoreissa käytetään tyypillisesti 4-tahtista kiertoa. Dieselmoottorissa ensimmäisen tahdin aikana koneen sisään otetaan puhdasta ilmaa, joka toisen tahdin aikana puristetaan polttokammioon.
Puristuksen loppuvaiheessa polttoaine injektoidaan polttokammioon, jolloin polttoaineesta ja ilmasta koostuva seos syttyy palamaan korkeassa puristuslämpötilassa. Tämän jälkeen alkaa tahti 3, jolloin kaasu laajenee polttokammiossa johtaen männän liikkeeseen, joka taas johtaa tuotannon syntyyn. Viimeisessä vaiheessa tahdin 4 aikana palanut seos vapautuu, jolloin syntyy energiaa. (Fiebig ym. 2014). Ottomoottorissa ensimmäisen tahdin aikana ilma ja höyrystynyt polttoaine injektoidaan polttokammion sisään, toisen tahdin aikana ilman ja polttoaineen seos puristetaan ja sytytetään palamaan sähköisellä kipinällä, 3-tahdin aikana polttoaine palaa johtaen männän liikkeeseen ja vastaavasti 4 tahdin aikana palanut seos vapautuu johtaen energian syntyyn ja pakokaasun vapautumiseen. Sytytystavan vuoksi dieselmoottorin tehokkuus on yleensä parempi kuin ottomoottorin (Fiebig ym. 2014).
Dieselmoottorin päästöt ovat pääasiassa typpeä, happea, vettä ja hiilidioksidia, kun taas ottomoottorin päästöt eivät sisällä happea juuri lainkaan. Diesel- ja ottomoottoreissa käytetään erilaisia ilman ja polttoaineen polttoainesuhteita (AFR), joka on yksi polttomoottorien pakokaasupäästöihin vaikuttava parametri (Ribeiro ym. 2018). Dieselmoottorissa ilman ja polttoaineen polttoainesuhde on suurempi kuin 1 (AFR > 1), jolloin pakokaasuun jää happea, mutta ottomoottorissa suhde on noin 1, jolloin lähes kaikki syntynyt happi käytetään loppuun palamisreaktiossa. Dieselmoottori tuottaa enemmän NOX päästöjä johtuen ylimääräisestä ilmasta. Polttomoottoreiden tavallisten palamistuotteiden lisäksi syntyy myös ei- tarkoituksenmukaisia saasteita, kuten hiukkasia, hiilimonoksidia (CO), palamattomat hiilivetyjä (HC) ja typen oksideja (NOx). (Aakko-Saksa ym. 2016, Fiebig ym. 2014). Syntyneet päästöt ovat yhteydessä lukuisiin haitallisiin vaikutuksiin, jonka vuoksi niiden muodostumisen ja vapautumisen ehkäisemiseen tai vähentämiseen on tärkeää kehittää uusia ja tehokkaita ratkaisuja.
Dieselmoottorista peräisin olevat päästöt ovat perinteisesti yhdistetty vakavimpiin haittoihin, jonka vuoksi niiden teknologian parantamiseksi on tehty lukuisia tutkimuksia ja toimenpiteitä (Bai ym. 2001, Barraud ym. 2017). Viimeisten 30 vuoden aikana dieselmoottorit ovatkin kehittyneet nopeasti, sillä vaikka niiden tehokkuutta on lisätty, niin samalla niiden ympäristöystävällisyyttä on parannettu päästöjä vähentämällä. Tekniikkaa on kehitetty muun muassa muuttamalla polttoaineen syöttöjärjestelmä optimoiduksi, tehostamalla palamisprosessia, parantamalla latausjärjestelmää ja kehittämällä pakokaasun jälkikäsittelysysteemeitä. Uuden teknologian koneissa on tehty monia sisäisiä muutoksia, joiden vuoksi erityisesti hiukkasmaisten aineiden ja typen oksidien päästöjä on saatu merkittävästi vähennettyä (Bisig ym. 2016). Merkittävimmät pakokaasujen jälkikäsittelysysteemit ovat vuonna 2007 käyttöönotetut DPF hiukkassuodattimet, EGR eli pakokaasun takaisinkierrätyssysteemit, DOC eli dieselin hapettumiskatalysaattorit ja vuonna 2010 käyttöön otettu SCR eli selektiivinen katalyyttinen vähennyssysteemi. Katalyyttien avulla päästöjä voidaan vähentää, mutta ne saattavat lisätä päästöjen oksidatiivista potentiaalia.
Hiukkassuodattimen lisääminen on vähentänyt merkittävästi hiukkaspäästöjä. Typen oksidien päästöjä on saatu vähennettyä EGR ja SCR-järjestelmillä (Aakko-Saksa ym. 2017, Wu ym.
2019, Yang ym. 2015). EGR-järjestelmän tarkoituksena on viilentää sylinterin palamisen huippulämpötilaa kierrättämällä osa pakokaasuista uudelleen sylinteriin, jolloin NOX-päästöt vähenevät. DOC-katalysaattorin tarkoituksena on muuttaa pakokaasuja vähemmän haitalliseen muotoon. Tutkimukset ovat osoittaneet, että DPF-, EGR- ja DOC-järjestelmillä varustettujen dieselmoottorien PM päästöt ovat vähentyneet noin 90%, ja VOC-yhdisteiden määrä väheni yli 90% verrattuna vanhempiin moottoreihin. SCR teknologian myötä NOX päästöjä saatiin vähennettyä vielä 90% verrattuna vuoden 2007 teknologiaan (Aakko-Saksa ym. 2017, Barraud ym. 2017, Fiebig ym. 2014).
Bensiini pakokaasupäästöjen ongelmina on perinteisesti pidetty hiilimonoksidia, hiilivetyjä (THC) ja typen oksideja. Uusissa ottomoottoreissa käytetään kolmitoimikatalysaattoria (TWC), jonka tarkoituksena on vähentää näitä päästöjä. Päästöjä voidaan myös vähentää parantamalla moottorin termistä tehokkuutta, jolloin hiilidioksidipäästöjä ja polttoaineen kulutusta saadaan pienennettyä. Ottomoottorissa polttoaineseos syötetään polttoainekammioon, jossa se sytytetään. Polttoaineen syöttöön voidaan käyttää uutta GDI eli suoraruiskutustekniikkaa, jolloin suoran polttoaineen syötön avulla voidaan kontrolloida polttoaineen määrää ja ajoitusta, jolloin polttoaineen käyttö on taloudellisempaa ja vähäpäästöisempää. PFI eli polttoaineen porttisyöttö edustaa tavanomaista tekniikkaa, joka on edelleen käytössä monissa kevyissä
ajoneuvoissa. Uuden GDI teknologian haittapuolena on sen suuremmat PM ja NOX päästöt verrattuna perinteiseen PFI teknologiaan. Uusimmat tutkimukset ovat kuitenkin antaneet viitteitä siitä, että etanolin käyttö polttoaineseoksessa GDI teknologian moottoreissa vähentäisi päästöjä. (Yang ym. 2019, Yusuf ja Inambao 2019).
Useiden tutkimusten perusteella fossiilisten polttoaineiden korvaaminen uusiutuvilla energianlähteillä saattaisi vähentää toksisia pakokaasupäästöjä entisestään (Barraud ym. 2017, Ribeiro ym. 2018). Biopolttoaineiden käyttöä onkin lisätty viimeisten vuosikymmenten aikana merkittävästi, ja niitä voidaan käyttää sekä diesel- että bensiinimoottoreissa (Aakko-Saksa ym.
2017, Ribeiro ym. 2018). Euroopassa ja Yhdysvalloissa tavoitteena vähentää liikenteen sektorin haitallisia päästöjä, sekä niistä aiheutuvia terveys- ja ympäristövaikutuksia. Etanoli on eniten autoissa käytetty biopolttoaine. (Ribeiro ym. 2018). Yhdysvalloissa etanolin käyttö on edelleen lisääntymässä, sillä EPA on hyväksynyt 15% etanolipitoisuuden sisältävän bensiinin (E15) myyntiin (Yuan ym. 2019). Etanolia voidaan käyttää myös korkeimpina pitoisuuksina (51% - 85% etanolia) flexifuel eli joustavan polttoaineratkaisun autoissa (Bisig ym. 2016, Yang ym. 2019). E85 tarkoittaa etanolin ja bensiinin seospolttoainetta, jossa etanolia on enintään 85%
ja bensiiniä vähintään 15%.
Biopolttoaneiden on havaittu potentiaalisesti vähentävän pakokaasujen aiheuttamia terveyshaittoja. Esimerkiksi Roth ym. (2017) tutkimuksessa havaittiin, että altistuminen E85 biopolttoainekäyttöisen henkilöauton pakokaasulle aiheutti vähemmän oksidatiivisia DNA vaurioita kuin tavallisesta bensiinimoottorista peräisin olevalle pakokaasulle altistumisen.
Tämän arvioidaan johtuvan pienemmästä hiilivetyjen pitoisuudesta, tai PAH-yhdisteiden genotoksisen potentiaalinen vähenemisestä (Roth ym. 2017). Etanolin käyttö polttoaineena näyttäisi vähentävän myös muita syntyneitä päästöjä, kuten 1,3-butadieeniä, bentseeniä, päästöhiukkasia ja PAH-yhdisteitä (Fiebig ym. 2014, IARC 2013, Roth ym. 2017). Etanolin käyttö lisää polttoon käytettävän hapen määrää, jolloin pakoputkesta vapautuvien päästöjen määrä vähenee. Tällä hetkellä ei ole riittävästi tutkimustietoa siitä, kuinka etanoli - bensiiniseoksen käyttö vaikuttaa kylmissä olosuhteissa (Yusuf ja Inambao 2019). Tutkimukset ovat antaneet viitteitä myös siitä, että etanolin käytöllä saattaa olla haitallisia vaikutuksia, sillä etanoli voi hapettua asetaldehydiksi, formaldehydiksi, etaanihapoksi ja akroleiiniksi (IARC 2013, Yuan ym. 2019). Tämän hetkiset tutkimukset ovat osoittaneet, että pakokaasujen haitallisten aldehydien ja etanolin määrä lisääntyvät E85 ajoneuvojen käytöllä (Aakko-Saksa ym. 2017).
2.3. PÄÄSTÖHIUKKASTEN AIHEUTTAMAT TOKSIKOLOGISET VAIKUTUKSET
Hiukkasille altistuminen tapahtuu pääasiassa inhalaationa, eli hengityselimistö on merkittävin reitti, jota pitkin hiukkaset päätyvät elimistöön. Hengityselimistön pääasiallinen tarkoitus on kuljettaa happea sydämen kautta soluille ja kudoksille, sekä uloshengityksen kautta kuljettaa soluhengityksessä syntynyt hiilidioksidi ulos elimistöstä. Kuvassa 2 on kuvattu tarkemmin ihmisen hengityselinten rakenne, sekä keuhkorakkulan rakenne, jossa kaasujen vaihto tapahtuu.
Hengityselimistö toimii myös elimistöön pääsyn rajapintana, joten hengityselimistön epiteelikudokset ovat ensimmäinen paikka, jossa hengitetyt vierasaineet, kuten hiukkaset, pääsevät kosketuksiin keuhkojen kanssa. Keuhkojen epiteelissä on monia immuunipuolustukseen kuuluvia soluja, jotka aktivoituvat vierasaineiden vaikutuksesta (Cui ym. 2019). Hiukkasten kulkeutuminen elimistöön on esitetty kuvassa 3. Suurin osa hengitysilman mukana tulleista karkeista hiukkasista eliminoidaan ylemmissä hengitysteissä, mutta pienhiukkaset ja ultrapienet hiukkaset pystyvät läpäisemään keuhkot alveolaariselle tasolle asti, missä ne pääsevät kosketuksiin keuhkoja ympäröivän nesteen peittämän keuhkokudoksen kanssa aiheuttaen haitallisia vaikutuksia keuhkojen ja alveolien normaalille toiminnalle (kuva 3). Ultrapienet hiukkaset pystyvät lisäksi kulkeutumaan alveolien kautta diffuusion avulla verenkiertoon, ja verenkierron mukana ne voivat levittäytyä kaikkialle elimistöön ja kudoksiin, kuten aivoihin (Gehr ja Heyder 2000, Kashyap ym. 2019, Kim ym.
2014, Weldy ym. 2011).
Kuva 2. Ihmisen hengityselimistön osat ja keuhkorakkuloissa tapahtuva kaasujen vaihto. Kuvaa
on muokattu perustuen alkuperäiseen lähteeseen. (Lähde:
https://www.nanopartikel.info/en/nanoinfo/body-barriers/2388-nanoparticles-and-the-lung)
Pienhiukkaset kulkeutuvat keuhkojen ilmatiehyihin eli bronchioluksiin ja alveolaariselle tasolle, josta niitä ei saada enää tehokkaasti poistettua limakalvojen puhdistusmekanismeilla värekarvatoiminnon avulla. Tällöin keuhkojen ensisijaiset puolustussolut eli makrofagit aktivoituvat poistaen hiukkasia solunsyönnillä eli fagosytoosilla. Alveolien makrofagit ovat siis ensisijaisia puolustussoluja keuhkoihin joutuneita hiukkasia vastaan. Makrofagit käynnistävät samalla tulehdusreaktion (Cao 2015). Solusyöntiin voi osallistua myös muita solusyöntiin erikoistuneita valkosoluja. Makrofagit eivät tunnista ultrapienen kokoluokan hiukkasia, joten niitä pyritään poistamaan elimistöstä hengitysteiden epiteelisolujen avulla. Verenkiertoon päätyneet ultrapienet hiukkaset voivat olla elimistössä jopa kuukausia ennen kuin ne saadaan lopulta poistettua munuaisten kautta virtsaan. (Gehr ja heyder 2000).
Kuva 3. Hiukkasten kulkeutuminen elimistöön. Kuvaa on muokattu perustuen alkuperäiseen lähteeseen (Lähde: http://www.health.utah.gov/utahair/pollutants/PM/).
Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että hiukkasmaisille aineille altistuminen aiheuttaa eniten vakavia terveyshaittoja ihmisille (Lawal ym. 2016, Luo ym. 2015). Ulkoilman PM2,5 hiukkaset ovat merkittävä tutkimuskohde, sillä niiden tiedetään aiheuttavan monia merkittäviä haitallisia vaikutuksia ihmisten terveydelle. Lukuisat epidemiologiset ja toksikologiset tutkimukset ovat havainneet vahvan yhteyden pienhiukkasille altistumisen ja vakavien terveysongelmien, kuten hengityselinsairauksien, sydän- ja verisuonitautien, keuhkosyövän ja ennenaikaisten kuolemien välillä. IARC on vuonna 2013 luokitellut hiukkaset keuhkosyövän aiheuttajaksi. (Weldy ym.
2019, WHO 2019). Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että lyhytaikainen PMpitoisuuksien nousu ilmassa lisää käyntejä ensiapuasemilla johtuen useista akuuteista sydän-ja verisuoniongelmista, kuten sydäninfarktista ja sepelvaltimotaudista, sekä sairauksien oireiden vaikeutumisesta (Bazyar ym. 2019, Zhang ym. 2019). Hiukkasmaisille aineille altistumisen on monissa tutkimuksissa osoitettu aiheuttavan myös neurologisia sairauksia, haitallisia vaikutuksia syntymiin, sekä syöpiä (Jalava ym. 2010, Kashyap ym. 2019). Taulukossa 1 on
esitetty tarkemmin sairauksia, joiden arvioidaan nykyisen tutkimustiedon perusteella olevan yhteydessä erityisesti liikenteen päästöistä peräisin oleville hiukkasille altistumisen kanssa.
Taulukko 1. Päästöhiukkasille altistumisesta aiheutuneita haitallisia vaikutuksia. (Bazyar ym.
2019, Cui ym. 2019, Kashyap ym. 2019, Lawal ym. 2016, Luo ym. 2015, Zhang ym. 2019).
Sydän- ja verisuonitaudit
Hengityselin- sairaudet
Syövät Neurologiset sairaudet
Vaikutukset syntymiin ateroskleroosi,
eteisvärinä, rytmihäiriö, sepelvaltimotauti, sydänhalvaus, sydäninfarkti, sydämen vajaatoiminta
astma, COPD, keuhkofibroosi, keuhkokuume, keuhkopöhö, krooninen alveoliitti
aivokasvain, keuhkosyöpä, maksasyöpä
aivohalvaus, aivoverenkier- tohäiriö dementia
ennenaikainen syntymä, matala
syntymäpaino
Vakavien terveysvaikutusten lisäksi hiukkasten tiedetään aiheuttavan moninkertaisen määrän lievempiä haittoja erityisesti hengityselimistölle. Lievempiä haittoja ovat esimerkiksi ärsytysoireet, kuten silmien ja kurkun kutina, sekä lievät hengityselinoireet, kuten yskä ja nuha.
Erityisen herkkiä pienhiukkasten vaikutuksille ovat lapset ja vanhukset, sekä kroonisia sydän- ja verisuonitauteja, sekä kroonisia hengityselinsairauksia sairastavat henkilöt. Pienhiukkasille altistuminen voi pahentaa tai lisätä oireita esimerkiksi sydämen vajaatoimintaa, astmaa tai keuhkoahtaumatautia sairastavilla henkilöillä. Myös matalien hiukkaspitoisuuksien on todettu olevan terveydelle haitallisia, joten pitoisuutta, jonka alapuolella ei esiintyisi terveyshaittoja, ei olla pystytty määrittämään. (Jalava ym. 2012, THL 2019, WHO 2019).
2.4. EURO 6 LAINSÄÄDÄNTÖ
Huonon ilmanlaadun aiheuttamat haitalliset terveys- ja ympäristövaikutukset ovat johtaneet liikenteen sektorin pakokaasupäästöjen raja-arvojen määrittämiseen ja lainsäädännön tiukennuksiin. Euro lainsäädäntö on eurooppalainen sääntely ajoneuvojen päästöjen
kontrolloimiseksi. Lainsäädäntö koostuu kuudesta tasosta, joissa päästöjen kontrollointien vaatimukset lisääntyvät tasoja ylöspäin noustessa (icct 2016). Euro standardit esiteltiin 1990- luvun alussa, jolloin yksittäisten päästöjen raja-arvoja alettiin tiukentaa (Fiebig ym. 2014), alkaen varsinaisesti Euro 1 standardin voimaan astumisesta vuonna 1992 (icct 2016). Euro 5 korvattiin Euro 6 lainsäädännöllä vuonna 2014 (Fiebig ym. 2014). Euro 6 lainsäädäntö on tällä hetkellä voimassa oleva ja uusinta teknologiaa hyödyntävä standardi. Euro standardien aikana käyttöön on otettu useita uuden teknologian myötä kehittyneitä päästöjen vähentämiseen tarkoitettuja järjestelmiä, kuten pakokaasujen jälkikäsittelysysteemeitä ja hiukkassuodattimia (kuva 4). Henkilöautoja koskevat Euro 6 raja-arvot ja niiden vertailu edellisiin Euro 5 raja- arvoihin esitellään taulukossa 2.
Taulukko 2. Henkilöautoja koskevat Euro 6 raja-arvot verrattuna Euro 5 raja-arvoihin.
Korostetut raja-arvot tarkoittavat Euro 6 säädettyjä parannuksia verrattuna Euro 5 raja-arvoihin.
Taulukkoa on muokattu alkuperäiseen lähteeseen perustuen. (icct 2016).
Euro 5 Euro 6
Päästö Bensiini Diesel Bensiini Diesel PM (g/km) 0,005 0,005 0,005 0,005 PN (#/km) 6,0 * 1011 6,0 * 1011 6,0 * 1011
CO (g/km) 1 0,5 1 0,5
HC (g/km) 0,1 0,1
HC + NOX (g/km) 0,23 0,17
NOX (g/km) 0,06 0,18 0,06 0,08
Kuva 4. Euro lainsäädännön kehitys vuosien 1990-2014 aikana (Fiebig ym. 2014).
Hiilimonoksidin, palamattomien hiilivetyjen, hiukkasten ja typen oksidien päästöjä on rajoitettu siitä lähtien kun Euro 1 lainsäädäntö astui voimaan Euroopassa. Euro 1 ja Euro 6 välissä päästöt ovat vähentyneet noin 98% (Fiebig ym. 2014). Diesel käyttöisten autojen hiukkasmassan osalta päästöt ovat vähentyneet 96% Euro 1 ja Euro 6 kehityksen aikana (icct 2016). Nykyiset raja-arvot hiukkasmassalle ovat niin pieniä, että tarkkojen mittaustulosten saaminen tuottaa ongelmia. Tähän ongelmaan ratkaisuksi alettiin mitata hiukkasten lukumäärää, joiden mittaus kertoo enemmän modernien tekniikoiden päästöistä kuin massaperusteiset mittaukset. Mittauskäytännön muuttamisen myötä hiukkasten lukumäärää alettiin rajoittaa Euro 5b standardissa, jolloin myös esiteltiin ensimmäisen kerran raja-arvo hiukkasten lukumäärälle. Tutkimukset ovat tämän myötä osoittaneet korkean hiukkasten lukumäärän aiheuttavan haitallisia terveysvaikutuksia, joten raja-arvojen voimaantulo on edesauttanut monia tutkimuksia Euroopassa. Tutkimusten mukaan päästöt ovat jääneet selvästi raja-arvojen alapuolelle, kun käytössä on ollut hiukkassuodatin (DPF). Pienimmät koskaan mitatut hiukkaspäästöt diesel autosta on saatu käyttämällä hiukkassuodatinta ja SCR katalysaattoria. Pakokaasujen jälkikäsittelysysteemien kehittyminen on myös ollut merkittävää,
sillä niiden avulla hiukkasmaisia PAH-yhdisteitä on saatu vähennettyä yli 95%. (Fiebig ym.
2014, icct 2016). Pakokaasujen jälkikäsittelysysteemien toiminnan kannalta on oleellista, että ajoneuvossa käytetty polttoaine sisältää vain hyvin matalan rikkipitoisuuden (< 10 ppm rikkiä).
Samalla liikenteen sektorin sulfaattipäästöt ovat käytännössä kokonaan kadonneet. Euro standardien kehityksen myötä myös polttoaineen laatustandardia on tiukennettu, eikä Euro standardien mukaisten päästöjen raja-arvojen käyttöönotto olisi ollut mahdollista, mikäli polttoaineen laatua ei olisi onnistuttu parantamaan. (icct 2016).
2.5. SOLUTOKSIKOLOGISET TUTKIMUKSET
Hengitysteiden puolustussolujen, kuten makrofagien, yhtenä tärkeänä päätehtävänä on poistaa vierasaineita hengityselimistöstä ja käynnistää tulehdusreaktio. Tämän puolustusreaktion häiriintyminen aiheuttaa erilaisia solureaktioita, kuten solukuolemaa monenlaisten mekanismien kautta. Solureaktioiden tarkoituksena on suojella soluja ja kudoksia, mutta usein krooninen altistuminen ja solureaktioiden toistuva ilmaantuminen ovat osasyynä haitalliseen lopputulokseen. Solutoksikologiset tutkimukset perustuvat erilaisten välttämättömien solupahatumien häiriöihin ja muutoksiin. (Hiemstra ym. 2017). Erityisesti diesel- ja bensiinimoottoreista peräisin olevien päästöhiukkasten tiedetään aiheuttavan lisääntynyttä sairastelua ja kuolleisuutta johtuen erityisesti sydän- ja verisuonitaudeista, monista keuhkosairauksista ja syövistä. Näihin haitallisiin lopputuloksiin johtavina pääasiallisina mekanismeina lukuisten tutkimusten perusteella pidetään solutoksisuutta, oksidatiivista stressiä, tulehdusreaktioita ja genotoksisuutta (kuva 5).
Kuva 5. Pääasialliset päästöhiukkasten aiheuttamat mekanismit, jotka johtavat erilaisten solureaktioiden kautta haitallisiin terveysvaikutuksiin.
In vitro solutoksikologiseen tutkimukseen käytettävä solulinja tulee valita tarkoituksenmukaiseksi riippuen tutkimuksesta, jolloin oikeanlainen solulinja indikoi solujen luonnollisia puolustusreaktioita ja vasteita toksisille aineille altistuessaan. Erityisesti hiukkasten tutkimuksessa myös keuhkodepositio on otettava huomioon valittaessa sopivaa solulinjaa. Fysikaaliset tekijät, kuten inkuboinnin lämpötila, kaasun koostumus ja suhteellinen kosteus ovat tärkeitä seurattavia parametreja soluviljelyn onnistumiselle. Nisäkässolujen tyypilliset inkuboinnin olosuhteet ovat +37C lämpötila, 5 % hiilidioksidipitoisuus ja 95 % suhteellinen kosteus (Stanley 2014). Solut viljellään soluviljelypulloihin, ja niitä kasvatetaan upotettuina solujen kasvatukseen tarkoitettuun soluviljelynesteeseen. Solut voivat kasvaa kiinnittyneinä soluviljelypullon pohjaan tai solususpensiona soluviljelynesteessä.
Toksisuusvasteiden tutkimuksissa käytetään tavallisesti päättymättömiä solulinjoja, joilla tarkoitetaan kuolemattomia tuumori- eli kasvainsoluja, joita on kaupallisesti saatavilla tutkimuskäyttöön. Päättymättömien solulinjojen käytön etuina niitä on helposti saatavilla, niiden ylläpitäminen on suhteellisen halpaa ja helppoa, jonka lisäksi niillä on myös pitkä elinikä. Tuumorisoluilla on suuri proliferatiivinen kapaasiteetti, eli niiden toiminta ja kasvu on tehokkaampaa kuin normaaleilla soluilla. Tuumorisolujen geneettinen epänormaalius voi kuitenkin haitata tutkimustuloksia. Solulinjat ovat peräisin yhdeltä luovuttajalta, joten niissä ei
PÄÄSTÖHIUKKASET
Oksidatiivinen stressi
Tulehdus
Solutoksisuus Genotoksisuus
Sydän- ja verisuonisairaudet Krooniset keuhkosairaudet Syöpä
Sairastuvuus ja kuolleisuus
esiinny luovuttajien välistä variaatiota, jolloin tulosten keskinäinen vertailu on helpompaa. Tätä voidaan pitää myös haittapuolena, sillä saatuja tuloksia voi olla hankala yleistää. (Hiemstra ym.
2017, Stanley 2014). In vitro tutkimuksissa on perinteisesti käytetty nestepinnan alla tapahtuvaa (submerged) altistusta, jossa solut kasvavat solumediumin sisällä myös altistuksen aikana.
2.5.1. Solutoksisuus
Solutoksisuuden testaaminen on erittäin laajasti tutkimuskäytössä oleva keino selvittää solujen kuntoa in vitro tutkimuksissa, ja sen käytännön toteuttamiseen on kehitetty useita eri menetelmiä. Käytettävästä menetelmästä riippumatta solutoksisuus kertoo solujen elinkykyisyydestä altistuksen jälkeen. Solutoksisuuden keskeisimpiä parametreja ovat solun elinkykyisyyden ja soluorganellien aktiivisuuden väheneminen, sekä solujen hajoamiseen johtavat muutokset solukalvossa eli membraanissa. Ilmansaasteiden aiheuttama solutoksisuus on yhdistetty kroonisiin keuhkosairauksiin ja mahdollisesti myös erilaisten sydänsairauksien kehittymiseen. Solutoksisuuden pääasialliset mekanismit apoptoosi ja nekroosi ovat tapahtumia, joiden seurauksesta solut kuolevat. Apoptoosi tarkoittaa ohjelmoitua solukuolemaa, joka kuuluu tavallisesti normaalien solujen elinkaareen. Apoptoosin tarkoitus on hajottaa solun rakenteita itsenäisesti ja kontrolloidusti aiheuttamatta tulehdusreaktiota.
Toksiset aineet voivat häiritä tätä sisäistä apoptoositasapainoa johtaen erilaisten sairauksien kehittymiseen. Nekroosilla tarkoitetaan kontrolloimatonta solukuolemaan johtavaa prosessia, joka aiheuttaa elimistöön tulehdustiloja ja on monien sairauksien kehittymisen mekanismina.
(Stanley 2014). Solutoksisuutta voidaan testata useilla eri menetelmillä, kuten MTT-, PI-, ja DAPI-testeillä.
2.5.2. Oksidatiivinen stressi
Oksidatiivinen stressi eli hapetusstressi tarkoittaa solun tai kudoksen tilaa, jossa reaktiivisten happiradikaalien (ROS) pitoisuus ei ole tasapainossa. Reaktiiviset happiradikaalit, kuten hydroksyyliradikaali, vetyperoksidi ja alkoksiradikaali, ovat hyvin pieniä ja reaktiivisia molekyylejä (Chen ym. 2010, Wang ym. 2014). Ihmisen hengitysteiden immuunipuolustuksen solut tuottavat reaktiivisia happiradikaaleja normaalina puolustusmekanismina monia vierasaineita vastaan. Happiradikaalien tuotannon tarkoituksena on tuhota vierasaineita, sekä
houkutella lisää immuunipuolustuksen soluja paikalle. Tämä on erittäin tarkasti säädelty ja lyhytkestoinen toimintamekanismi, sillä tuotetut ROS yhdisteet ovat vaarallisia myös solujen omille komponenteille. Elimistön tasapainotilan siirtyminen liian happamiin olosuhteisiin voi johtaa muun muassa solukuolemiin, tulehdustiloihin, mutaatioihin tai DNA:n vaurioihin. ROS yhdisteet saattavat myös käynnistää elimistöön tulehdusreaktion, jolloin paikalle ilmaantuu esimerkiksi interleukiineja, kuten IL-6, IL-8 ja TNF-. Erityisesti pitkään jatkunut oksidatiivinen stressireaktio voi myös käynnistää proinflammatoristen sytokiinien tuotannon ja vapautumisen. Oksidatiivinen stressi on useiden ympäristökemikaalien ja ilmansaasteiden, kuten päästöhiukkasten, toksisuusmekanismien sekä lukuisten soluvaurioiden ja sairauksien taustalla. (Durga ym. 2014, Stanley 2014). Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että hiukkasiin kiinnittyneet metallit ja PAH-yhdisteet aiheuttavat reaktiivisten happiradikaalien muodostumisen keuhkojen puolustussoluissa. Erityisesti dieselmoottorista peräisin olevien päästöhiukkasten, NOX ja VOC-yhdisteiden tiedetään monien tutkimusten perusteella lisäävän ROS tuotantoa, joka voi johtaa solujen oksidatiiviseen stressiin ja moniin oksidatiivisiin vaurioihin, kuten neurogeneratiivisten sairauksien, esimerkiksi Parkinsonin taudin, puhkeamiseen (Barraud ym. 2017, Kim ym. 2014). Solun sisäistä oksidatiivista stressiä voidaan mitata esimerkiksi DCF- ja tioli-testeillä.
DCF-testi ei ole kovin spesifinen, sillä se mittaa useita eri solun sisäisiä reaktiivisia happiradikaaleja, jolloin menetelmällä ei saada tarkkaa tietoa solun hapetus- pelkistysreaktioiden tilasta (Wang ym. 2014). Esimerkiksi Zheng ym. (2019) tutkimuksessa käytettiin DFC-testiä määrittämään hiirien keuhkosolujen muodostamaa oksidatiivista stressiä diesel päästöhiukkasille altistumisen jälkeen. Tutkimuksen tulosten perusteella yksittäinen altistuminen hiukkasille aiheutti vain ohimenevän oksidatiivisen stressin keuhkosoluissa. ROS tasot nousivat merkittävästi kuuden tunnin altistusajan jälkeen, jonka jälkeen ne palautuivat normaalille tasolle 12 tunnin kohdalla, ja alkoivat jopa laskea kontrollitasoja matalammaksi 24 tunnin kohdalla. Mahdollinen mekanismi ROS tasojen vaihteluille on, että normaaliolosuhteissa ROS pitoisuuksien ollessa tasapainossa, antioksidantit estävät ROS tuotantoa ylläpitäen normaaleja elimistön fysiologisia olosuhteita. Hiukkasille altistuminen horjuttaa tätä sisäistä tasapainoa, jolloin pitoisuudet alkavat vaihdella. Tulokset viittaavat siihen, että ensin ROS pitoisuuksien noustessa merkittävästi muutaman tunnin altistusajan jälkeen, elimistö tuottaa reaktiivisia happiradikaaleja normaalina puolustusreaktiona vierasaineita vastaan. Antioksidanttien tarkoituksena on pitää sisäisiä hapetus – pelkistys reaktioita tasapainossa, joten antioksidanttien alkaessa vaikuttaa ROS pitoisuudet alkavat
laskea (Kashyap ym. 2019). 24 tunnin altistusajan jälkeen ROS pitoisuudet ovat laskeneet jopa normaalitasoa alemmaksi, eli oksidatiivisuus on korjaantunut liiallisesti, joka saattaisi johtua siitä, että antioksidantit eivät erota patologisia ja fysiologisia ROS-yhdisteitä toisistaan (Zheng ym. 2019). Myös Cao ym. (2015) tutkimuksessa oksidatiivista stressiä ei muodostunut altistettaessa THP-1 johdettuja makrofagi soluja DEP-hiukkasille. Tutkimuksessa havaittiin, että oksidatiivista stressiä ilmeni kolmen tunnin altistusajan jälkeen, mutta ei enää 24 tunnin kohdalla (Cao ym. 2015).
3. TYÖN TAVOITTEET
Tämän pro gradu -tutkielman tavoitteena oli vertailla kolmen erilaisen Euro 6 lainsäädännön mukaisen henkilöauton (E10, E85 ja diesel) tosielämän pakokaasuista kerättyjen päästöhiukkasten aiheuttamia toksikologisia vaikutuksia yleisesti tutkimuskäytössä olevaan hiiren makrofagi-solulinjaan (RAW264.7). Tässä tutkimuksessa soluja altistettiin tutkittaville päästöhiukkasille, jonka jälkeen soluille tehtiin yleisesti tutkimuskäytössä olevia solutoksikologisia tutkimuksia. Solutoksikologisten tutkimusten tarkoituksena oli selvittää päästöhiukkasten aiheuttamaa solutoksisuutta ja oksidatiivista stressiä tutkituissa soluissa.
Soluista määritettiin päästöhiukkasten aiheuttamaa solutoksisuutta MTT-, PI- ja DAPI-testien avulla, sekä oksidatiivista stressiä DCF- ja tioli-testeillä. Tavoitteena oli selvittää, millä tutkitulla moottoritekniikalla ja polttoaineella aiheutuisi vähiten haitallisia vaikutuksia tässä tutkimuksessa käytetyillä menetelmillä.
Hiukkasten keräysmenetelmien yksityiskohtainen käsittely ei sisälly tämän tutkimuksen menetelmiin, sillä tässä tutkimuksessa käytetyt päästöhiukkaset saatiin valmiiksi kerättyinä VTT:n henkilöautojen mittauskampanjasta. Tämän tutkielman aineisto ja menetelmät -osiossa on esitelty lyhyesti VTT:n mittauskampanja, mittausolosuhteet ja pakokaasun koostumusmittauksen tulokset. Tarkemmat hiukkasten keräykseen liittyvät menetelmät ovat luettavissa VTT:n mittausraportista (Aakko-Saksa ym. 2017).
4. AINEISTO JA MENETELMÄT
4.1. TESTIAUTOT JA POLTTOAINEET
Tässä tutkimuksessa käytetyt päästöhiukkaset ovat peräisin VTT:n henkilöautojen mittauskampanjasta. Hiukkasten keräys suoritettiin VTT:n toimesta. Tähän tutkimukseen valitut henkilöautot olivat Euro 6 lainsäädännön mukaisia vuoden 2015 henkilöautoja.
Tavallisen E10 henkilöauton polttoaineen etanolin ja bensiinin suhde oli 10/90%, E85 flexifuel henkilöauton polttoaineen etanoli - bensiini suhde oli 83/17% ja tutkitussa diesel autossa käytettiin tavallista diesel polttoainetta. Polttoaineiden koostumus ja ominaisuudet analysoitiin ennen varsinaista kampanjaa, ja kaikki käytetyt polttoaineet läpäisivät standardilaadulle tyypilliset ominaisuudet (Aakko-Saksa ym. 2017). Testattavat henkilöautot olivat vuokra- autoja Europcar autovuokraamosta (kuva 6). Testiautojen tarkemmat ominaisuudet on esitelty taulukossa 3. Tutkituissa henkilöautoissa oli käytössä TSI (bensiini) ja TDI (diesel), eli Volkswagen-konsernin valmistamat moottorityypit.
Kuva 6. Testiautot mittausolosuhteissa VTT:n kevyiden ajoneuvojen testitiloissa (Aakko-Saksa ym. 2017).
Taulukko 3. Testiautojen ominaisuudet. Muokattu perustuen VTT:n raporttiin (Aakko-Saksa ym. 2017).
Testiauto E10 E85 DI
Euroluokitus Euro 6 Euro 6 Euro 6
Vuosimalli 2015 2015 2015
Tyyppi 1.4 TSI, 110 kW 1.4 TSI, 92 kW 1.6 TDI, 88 kW Polttoaine E10 E85 Diesel (tavanomainen) Jälkikäsittely TWC TWC
NOx adsorptiokatalyytti, 2*EGR
4.2. HIUKKASTEN KERÄYS
Tutkittavien henkilöautojen päästöhiukkaset kerättiin kaksi viikkoa kestävän mittauskampanjan aikana huhtikuussa 2016 VTT:n toimesta. Keräys suoritettiin VTT:n kevyiden ajoneuvojen testitilassa alustadynamometrin avulla -7 C lämpötilassa.
Testiolosuhteet noudattivat uutta eurooppalaista pakokaasumittauksen ajokiertoa (UN ECE R83) kuvan 7 mukaisesti. Keräyksen aikana jokaisella tutkittavalla henkilöautolla ajettiin yhteensä 11,007 km, joka jaettiin kolmeen testijaksoon. Ensimmäisen ja toisen testijakson aikana ajettiin 2,026 km (urban driving cycle, ECE15). Tarkoituksena oli mallintaa tavallista kaupunkiajoa, kun taas kolmannen testijakson aikana ajettiin 6,955 km (extra-urban driving cycle, EUDC) mallintaen kaupunkiajoa suhteellisen suurilla nopeuksilla ja äkkinäisillä jarrutuksilla. Yhden testiajon kesto oli yhteensä 20 minuuttia. Testiin sisältyi moottorin kylmäkäynnistyksestä syntyneet päästöt, kylmissä olosuhteissa syntyneet ajamisen päästöt, sekä lämmenneen moottorin päästöt.
Kuva 7. VTT:n henkilöautojen mittauskampanjan testiolosuhteet Euroopan pakokaasupäästöjen ajokierron mukaisesti (Aakko-Saksa ym. 2017).
Testiajossa syntyneet päästöt kerättiin kuvan 8 mukaisesti. Käsittelemätön pakokaasu johdettiin auton pakoputkesta laimentimeen, jonka tarkoituksena oli laimentaa pakokaasu vastaamaan todellisia olosuhteita ottaen huomioon pakokaasun normaali levittäytyminen ilmakehän olosuhteissa. Laimennettu pakokaasu johdatettiin suodattimen läpi virtauksella 200 – 1500 l/min. Keräyksessä käytettiin CVC vakiotilavuus näytteenotinta ja korkean kapasiteetin PM suodatinta. Laimennettu pakokaasu ajettua etäisyyttä kohden henkilöautoissa oli E10: 9,68 m3/km, E85: 9,70 m3/km ja DI: 9,73 m3/km. Päästökuutioiden määrä oli siis vertailukelpoinen ajettua etäisyyttä kohden. Myöhemmin keräyksen jälkeen PM irrotettiin suodattimilta koeputkiin metanolin ja ultraäänivesihauteessa sonikoinnin (alle +35 C lämpötilassa) avulla VTT:n toimesta, ja säilöttiin pakastimeen tämän tutkimuksen toksikologisia analyysejä varten.
Kuva 8. Kaavakuva VTT:llä suoritetuista autojen päästöjen mittausmenetelmistä. Tämän työn kannalta oleellinen osa mittauksesta, eli päästöhiukkasten keräys, on merkitty punaisella.
(Aakko-Saksa ym. 2017).
4.3. PAKOKAASUN KOOSTUMUS
Tutkimuksissa käytetyt henkilöautot ovat vuosimallia 2015, joten niiden tulisi noudattaa Euro 6 lainsäädäntöä. Testattavien autojen pakokaasun koostumus ja ominaisuudet tutkittiin VTT:n toimesta, mutta osa saaduista tuloksista ei vastannut Euro 6 lainsäädännön raja-arvoja. Osa henkilöautojen pakokaasuista mitatuista arvoista on esitelty taulukossa 4. Hiukkasmassan osalta kaikki tutkitut autot noudattivat Euro 6 raja-arvoja, mutta hiukkasten lukumäärän osalta saadut mittaustulokset ylittyivät E10 ja E85 päästöhiukkasissa. Hiilimonoksidin osalta E85 pakokaasu ylittää bensiinille suunnatun raja-arvon, mutta tämä on selitettävissä suuremmalla etanolipitoisuudella, jota ei ole huomioitu raja-arvoissa. Hiilivedyistä saadut mittaustulokset ylittävät myös Euro 6 raja-arvot. Typen oksidien mittausarvot ovat tutkitussa diesel henkilöautossa merkittävästi raja-arvoja korkeammat. 16 PAH-yhdisteen summa ja bentso(a)pyreenin pitoisuus on korkein E10 päästöhiukkasissa ja matalin dieselissä (taulukko 4). Päästöhiukkasista määritetyt PAH-yhdisteet ovat tarkemmin esitetty kuvassa 9.
Taulukko 4. Tutkittujen henkilöautojen päästöistä mitattuja arvoja. Vahvennetulla tekstillä merkityt arvot kertovat Euro 6 lainsäädännön raja-arvojen ylittymisestä. Taulukkoa on muokattu perustuen VTT:n raporttiin (Aakko-Saksa ym. 2017).
Mitattu päästö E10 E85 DI
PM (g/km) 0,00135 0,00092 0,00064
PN (#/km) 7,63 * 1011 7,49 * 1011 5,62 * 109
CO (g/km) 0,81 2,674 0,097
HC (g/km) 0,149 0,478 0,015
NOX (g/km) 0,031 0,016 0,463
16 PAH-yhdisteen summa (g/km)
5,8 4,7 0,8
bentso(a)pyreeni (g/km)
0,5 0,4 0,006
Kuva 9. 16 PM sitoutunutta PAH-yhdistettä E10, E85 ja diesel päästöhiukkasissa. Kuvaa on muokattu perustuen alkuperäiseen lähteeseen (Aakko-Saksa ym. 2017).
4.4. SOLUTOKSIKOLOGISET TUTKIMUKSET
4.4.1. Solulinja
Altistuskokeissa käytettiin hiiren makrofagi-solulinjaa RAW264.7 (American Type Culture Collection, ATCC, Rockville, MD), joka on yleisesti tutkimuskäytössä oleva jatkuva solulinja.
Makrofagit toimivat keuhkojen pääasiallisina puolustussoluina, joiden toiminta käynnistyy hiukkasille altistuttaessa. Tutkimukset ovat osoittaneet, että keuhkojen altistuessa hiukkasille elimistön puolustusreaktiot alkavat alveolaaristen makrofagien reagoidessa, jolloin makrogafit aloittavat ja edistävät tulehdusreaktioita (Durga ym. 2014). Tämän vuoksi makrofagi solut ovat perusteltu valinta tutkittaessa hiukkasille altistumisesta aiheutuvia vaikutuksia. RAW264.7 solulinja johdettiin vuonna 1978 aikuisen uroshiiren (BAB/14, hiirikanta BALB/c IgH) kasvaimesta, joka käynnistettiin Abelson murine leukemiavirusvektorilla. (ATCC 2019, Hartley ym. 2008). Solujen kasvatukseen käytettiin RPMI-1640 mediumia, joka sisälsi 10%
lämpö-inaktivoitua FBS:ää, 1% L-glutamiinia ja 1% penisilliini/streptomysiiniä (Gibco®, Life Technologies, CA, USA). Soluja ylläpidettiin soluviljelypullossa inkubaattorissa (Sanyo CO2
incubator), +37°C lämpötilassa ja 5% CO2 -pitoisuudessa.
Solususpensio laimennettiin kokeita varten pitoisuuteen 5 × 105 solua/ml, jonka jälkeen ne viljeltiin 12-kuoppalevyille (Corning Incorporation, NY, USA). Ennen altistusta solujen annettiin kiinnittyä 24 tuntia. Kuoppalevyjen medium vaihdettiin tuoreeseen mediumiin 1h ennen altistusta. Mediumin vaihdon yhteydessä tehtiin hiukkaslevyksi 12-kuoppalevy siten, että kuoppiin lisättiin 1ml tuoretta mediumia ilman soluja.
4.4.2. Hiukkasnäytteiden esikäsittely ja solujen altistukset
Hiukkasnäytteet esikäsiteltiin ennen altistusta. Koeputket sisälsivät yhteensä 2,3 m3 hiukkasnäytettä. Blank näyte (PM suodattimen näyte ilman hiukkasia) käsiteltiin vastaavalla tavalla samanaikaisesti näytteiden kanssa. Blank näyte oli mukana varmistamassa testien luotettavuutta. Koeputkiin lisättiin 7 l 6%:sta DMSO-liuosta hiukkasten irrottamista varten.
Irrottamisen apuna käytettiin lasisauvaa. Lasisauva huuhdeltiin endotoksiinitestatulla vedellä (Sigma Aldrich Corp., W1503, St. Louis, MO, USA), jota käytettiin 108 l kutakin koeputkea
kohden. Hiukkasten irrottamisen jälkeen koeputkia sonikoitiin ultraäänivesihauteessa (FinnSonic M03, Finnsonic Oy, Lahti, Suomi) 30 minuuttia alle +35C lämpötilassa.
Solut altistettiin kolmelle eri annokselle (12,5 l, 25 l ja 50 l) hiukkasia, jotka vastasivat näytteiden pitoisuuksia 0,25 m3, 0,5 m3 ja 1 m3. Päästökuutioiden määrä ajettua etäisyyttä kohden oli vertailukelpoinen eri ajoneuvojen välillä. Tutkimuksen kontrolleina käytettiin altistamattomia soluja, jotka käsiteltiin altistettujen solujen kanssa vastaavilla tavoilla.
Altistukset suoritettiin dublikaatteina, ja testi toistettiin neljä kertaa erillisinä tutkimuksina.
Hiukkassuspensioiden voimakkaat värierot E10, E85 ja diesel päästöhiukkasten, sekä blank näytteen välillä näkyvät kuvassa 10.
Kuva 10. E10, E85 ja diesel pakokaasuhiukkasia sisältävät altistuskokeissa käytetyt koeputket, sekä blank näytteen koeputki (© Maija Sainio).
4.4.3. Solujen irrottaminen ja hiukkaslevyjen käsittely
Mediumit kerättiin talteen 12-kuoppalevyjen kuopista ja säilöttiin -80 C syväjäähän tähän tutkimukseen sisältymättömiä analyysejä varten. Tämän jälkeen solut irrotettiin kuopista PBS:n ja soluraapimen avulla. Kuopat huuhdeltiin aluksi kaksi kertaa käyttäen kummallakin kerralla 1 ml PBS:ää. Tämän jälkeen kuoppiin lisättiin 1,5 ml PBS:ää ja solut raavittiin irti pohjasta soluraapimen avulla. Irrotetut solut jaettiin eppendorf-putkiin siten, että yhden kuopan solut jaettiin kahteen eri eppendorf-putkeen. MTT-testiä varten tarvittavaan eppendorf-putkeen
