RINTASYÖPÄSOLUJEN JA IMUSUONISTON ENDOTEELISOLU- JEN INTERAKTION VAIKUTUS SYÖPÄSOLUJEN KASVUUN JA INVASIIVISUUTEEN
SOFIANNA OJALA TUTKIELMA LÄÄKETIETEEN KOULUTUSOHJELMA ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO TERVEYSTIETEIDEN TIEDEKUNTA LÄÄKETIETEEN LAITOS TOUKOKUU 2020
ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, Terveystieteiden tiedekunta Lääketieteen laitos
Lääketieteen koulutusohjelma
OJALA, SOFIANNA: Rintasyöpäsolujen ja imusuoniston endoteelisolujen interaktion vaiku- tus syöpäsolujen kasvuun ja invasiivisuuteen
Opinnäytetutkielma, 34 sivua
Tutkielman ohjaajat: Syöpäsolubiologian professori Päivi M. Ojala, Helsingin yliopisto, ja dosentti Reijo Sironen, Itä-Suomen yliopisto
Toukokuu 2020
Asiasanat: rintasyöpä, imusuonisto, invaasio, metastaasi
Rintasyöpä on naisilla diagnosoitu yleisin syöpä, joka kärsii noin 1,7 miljoonaan ihmiseen vuosittain. Se on yleisin syöpää aiheuttava tauti naisilla ympäri maailmaa (Custódio-Santos et al., 2017). Mitä aikaisemmin rintasyöpä diagnosoidaan, sitä paremmat mahdollisuudet sen hoitamiseen ovat ja sitä helpompaa parantuminen. (Redig ym., 2013).
Tutkielmassa tutkitaan rinnan adenokarsinoomasta peräisin olevien rintasyöpäsolujen ja imusuoniston primaaristen endoteelisolujen (LEC) yhteiskasvatuksen vaikutusta rinta- syöpäsolujen kasvuun ja invasiivisuuteen in vitro -olosuhteissa.
Tutkimus pohjautuu Pekkonen et al (2018) julkaisemaan artikkeliin melanoomasolujen ja imusuoniston endoteelisolujen yhteiskasvatuksen vaikutuksista melanoomasolujen kasvuun ja invasiivisuuteen. Edellä mainitusta melanoomatutkimuksesta saadut tulokset osoittivat, että imusuoniston endoteelisolujen ja melanoomasolujen kontaktit ja interaktio johtivat me- lanoomasolujen MMP14:n määrän lisääntymiseen ja sen siirtymiseen solukalvolle sekä MMP14-riippuvaiseen Notch3:n ja b1-integriinin (ITGB1) aktivaatioon. Nämä molekyylitason muutokset johtivat melanoomasolujen lisääntyneeseen invaasioon ja metastaaseihin in vivo -olosuhteissa.
Tässä tutkielmassa kasvatettiin vatsaontelon metastaasista eristettyjä MCF7-linjan rinta- syöpäsoluja sekä yksin että yhdessä LEC:n kanssa soluviljelyolosuhteissa. Rintasyöpäsolut lei- mattiin transduktion avulla vihreää fluoresoivaa proteiinia ilmentäviksi, jotta ne pystyttiin kuvausvaiheessa erottamaan LEC:sta. LEC:n kanssa yhteiskasvatetut rintasyöpäsolut erotel- tiin yhteiskasvatuksen jälkeen magneettierottelijalla. Näillä erotetuilla soluilla tutkittiin inva- siivisuudessa tapahtuneita muutoksia 3D-fibriinimatriksissa. Yhteiskasvatuksen seurauksena tapahtuneita molekyylitason muutoksia tutkittiin värjäämällä yksin kasvaneita rintasyöpäso- luja ja LEC:n kanssa yhdessä kasvaneita rintasyöpäsoluja kyseisille molekyyleille soveltuvilla primaarisilla ja sekundaarisilla vasta-aineilla. Värjätyt soluviljelmät kuvattiin konfokaalimik- roskoopilla.
Saadut tulokset osoittivat, että MCF7-solulinja kommunikoi LEC:n kanssa, mistä osoituksena etenkin MCF7-solujen morfologian muuttuminen yhteiskasvatuksen myötä. Joidenkin tar- kasteltujen proteiinien ilmentymisessä ja signaalin voimakkuudessa havaittiin muutoksia ja näiden tutkimista voidaan vielä jatkaa pidemmälle.
UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND, Faculty of Health Sciences School of Medicine
Medicine
OJALA, SOFIANNA: The effect of the interaction of breast cancer cells and lymphatic endothelial cells on the growth and invasiveness of cancer cells
Thesis, 34 pages
Tutors: Päivi M. Ojala, Professor of cancer cell biology, University of Helsinki, and Reijo Si- ronen, docent, University of Eastern Finland
May 2020
Keywords: breast cancer, lymphatic system, invasion, metastasis
According to Custódio-Santos et al. (2017) breast cancer is the most common cancer diagnosed in women, affecting about 1.7 million people each year. It is the most common cancer-causing disease in women worldwide. The earlier a breast cancer is diagnosed, the better the chances of treating it are and the easier the healing (Redig et al., 2013).
This study examines the effect of co-culture of breast cancer cells from breast adenocarcinoma and primary lymphatic endothelial cells (LEC) on the growth and invasiveness of breast cancer cells in vitro.
This study is based on an article published by Pekkonen et al (2018). They examined the growth and invasiveness of melanoma cells, when co-culturing them with lymphatic endothelial cells. The results of this melanoma study showed that the contacts and interaction between lymphatic endothelial cells and melanoma cells resulted in an increase in the amount of MMP14 of melanoma cells and its transfer to the cell membrane and MMP14-dependent activation of Notch3 and b1 integrin (ITGB1). These molecular changes led to increased invasion of melanoma cells and metastases under in vivo conditions.
In this study, MCF7 breast cancer cells isolated from abdominal metastasis were grown alone and then together with LEC under cell culture conditions. Breast cancer cells were labeled by transduction to express the green fluorescent protein to be separated from the LECs at the recording stage. Breast cancer cells co-cultured with LEC were separated by a magnetic separator after co-culture. These separated cells were examined for changes in invasiveness in the 3D fibrin matrix. Molecular changes that occurred as a result of co- culture were studied by staining breast cancer cells grown alone and breast cancer cells co- cultured with LECs with primary and secondary antibodies suitable for those molecules. The stained cell cultures were photographed with a confocal microscope.
The results showed that the MCF7 cell line communicates with LECs, as evidenced in particular by the change in MCF7 cell morphology after co-culture. Changes in the expression of some of the proteins examined have been observed and further investigation may be continued in future.
S ISÄLTÖ
JOHDANTO ... 5
1 TEOREETTINEN TAUSTA ... 6
1.1 Rintasyöpä ... 6
1.1.1 Rintasyövän luokittelu ... 6
1.1.2 Rintasyövän metastasointi ... 7
1.2 Imusuonisto ja syöpä ... 8
1.2.1 Imusuonisto ... 8
1.2.2 Lymfangiogeenisten kasvutekijöiden ja niiden reseptorien signalointi ... 9
1.2.3 Syöpäsolujen invaasio imusuonistoon ... 9
1.3 Notch ... 10
1.3.1 Notch-signalointireitti ... 10
1.3.2 Notch ja syöpä ... 10
1.4 Integriinit ... 11
1.4.1 b1-integriini ... 11
1.4.2 A5-integriini ... 11
1.5 MMP14 ... 11
1.5.1 MMP14 ja rintasyöpä ... 12
1.6 EphA2 ... 12
2 TUTKIELMAN TAVOITE ... 13
3 MATERIAALIT JA MENETELMÄT ... 14
3.1 Solulinjat ... 14
3.2 Transduktio ... 14
3.3 MCF7-solujen ja LEC:n yhteiskasvatus ... 15
3.4 Peitinlaseille fiksattujen solujen värjäys ... 16
3.5 MCF7-solujen erottelu yhteiskasvatuksen jälkeen ... 17
3.6 96-kuoppalevyjen värjäys ... 17
3.7 3D-invaasiokoe ... 18
3.8 3D-fibriinigeelien värjäys ... 18
4 TULOKSET ... 20
4.1 MCF7-solujen ja LEC:n yhteiskasvatus ja erottelu ... 20
4.2 LEC-yhteiskasvatuksen aiheuttamat muutokset MCF7-soluissa ... 21
4.2.1 Aktiini ... 22
4.2.2 Notch3 ... 23
4.2.3 MMP14 ... 24
4.2.4 ITGA5 ... 25
4.2.5 ITGB1 (12G10 JA P5D2) ... 26
4.2.6 EphA2 ... 27
4.3 Invaasion vertailu yksinkasvaneiden ja LEC:n kanssa kasvaneiden MCF7-solujen välillä . 28 5 POHDINTA ... 29
LÄHTEET ... 33
JOHDANTO
Rintasyöpä on yleisin naisilla diagnosoitu syöpä ja se on maailmanlaajuisesti yleisin naisten syöpäkuolleisuutta aiheuittava tauti (Custódio-Santos et al., 2017; Redig et al., 2013). Rinta- syöpä metastasoi kudosinvaasion, verisuonien tai imusuonien kautta (Xie et al., 2007) ja me- tastaasit ovat suurin syy rintasyöpäpotilaiden kuolemaan (Redig et al., 2013). Tuumorisolu- jen ja imusuoniston endoteelisolujen vuorovaikutuksella on suuri rooli tuumorisolujen in- vaasiossa imusuoniin ja sitä kautta tuumorisolujen leviämisessä imusuoniston kautta eri puolille elimistöä (He et al., 2005).
Tutkimus pohjautuu aiempaan tutkimustietoon melanoomasolujen ja imusuoniston endo- teelisolujen vuorovaikutuksesta. On osoitettu, että imusuoniston endoteelisolujen ja mela- noomasolujen kontaktit ja interaktio johtaa MMP14:n määrän lisääntymiseen ja ennen kaik- kea sen siirtymiseen solukalvoille sekä MMP14-riippuvaiseen Notch3:n ja b1-integriinin (ITGB1) aktivaatioon. Nämä molekyylitason tapahtumat puolestaan johtavat melanooma- solujen lisääntyneeseen invaasioon ja metastaaseihin. (Pekkonen et al., 2018.) Tässä tutkiel- massa keskitytään erityisesti edellä mainitussa tutkimuksessa tutkittujen migraatioon ja in- vaasioon vaikuttavien proteiinien ilmentymisen muutoksiin rintasyöpäsolujen ja imusuonis- ton endoteelisolujen (LEC) yhteiskasvatuksen seurauksena. Näiden proteiinien lisäksi tutki- taan kahta muuta solujen migraatioon vaikuttavaa proteiinia (EphA2 ja integriini A5), joita ei aiemmassa melanoomatutkimuksessa tutkittu.
Pekkonen et al. (2018) melanoomasolututkimuksesta saatujen merkittävien tulosten poh- jalta haluttiin tutkia, havaitaanko samanlaisia muutoksia myös rintasyöpäsolujen ja imu- suoniston endoteelisolujen yhteiskasvatuksen seurauksena. Vastaavanlainen solutason tut- kimustieto antaa tulevaisuudessa arvokasta pohjaa taistelussa rintasyöpää vastaan.
1 TEOREETTINEN TAUSTA
1.1 RINTASYÖPÄ
Rintasyöpä on yleisin naisilla diagnosoitu syöpä, johon sairastuu vuosittain noin 1,7 miljoo- naa ihmistä. Se on maailmanlaajuisesti naisten yleisin syöpäkuolleisuutta aiheuttava tauti.
Mitä aikaisemmin rintasyöpä saadaan diagnosoitua, sitä paremmat mahdollisuudet sitä on hoitaa ja siitä on parantua. (Custódio-Santos et al., 2017; Redig et al., 2013.)
Rintasyövän on aiemmin ajateltu olevan yksi sairaus vaihtelevin histopatologisin piirtein ja vastein systeemiseen hoitoon, mutta myöhemmin sen on huomattu olevan kokonainen joukko sairauksia erilaisten anatomisten piirteiden, hoitovasteiden ja hoidon lopputulosten suhteen (Taherian-Fard et al., 2015).
1.1.1 RINTASYÖVÄNLUOKITTELU
Rintasyöpä jaetaan histologisesti in situ- karsinoomaan ja erilaisiin invasiivisiin karsinoomiin, kuten duktaaliseen ja lobulaariseen karsinoomaan (Vuong et al., 2014.) Rintasyöpäkas- vaimien erilaistumisaste vaihtelee hyvin organisoituneista rauhasmaisista rakenteista pleo- morfisiin diffuusin kasvutavan omaaviin tuumoreihin. Bloomin ja Richardsonin määrittelemä histologinen erilaistumisaste (gradukset 1-3) perustuu tumien epäsäännölliseen muotoon tai kokoon (tuma-atypian aste), mitoosien määrään sekä muodostuvien duktusmaisten ra- kenteiden määrään. (Sommers et al., 1994.) Histologisen graduksen arvo yksi kuvaa eniten erilaistuneita ja parhaiten organisoituneita kasvaimia, joilla on yleensä hyvä kliininen loppu- tulos. Arvon kolme saaneet kasvaimet ovat vähiten erilaistuneita ja ne koostuvat pleomorfi- sista tumista ja soluista. Niillä on myös voimakkaampi taipumus metastasoida, kuin parem- min erilaistuneilla kasvaimilla. (Vuong et al., 2014.) Määritelty histologinen aste korreloi klii- nisen ennusteen kanssa (Sommers et al., 1994).
Rintasyövän immunohistokemialliseen luokitteluun on kliinisessä käytössä kolme biomark- keria; estrogeenireseptori (ER), progesteronireseptori (PR) ja HER2 (human epidermal
growth factor receptor 2). Rintasyöpiä, joilla on joko estrogeeni- tai progesteroniresepto- reja, kutsutaan hormonireseptoripositiivisiksi. 75 % kaikista rintasyövistä on ER-positiivisia ja 65 % on PR-positiivisia. Rintasyöpää kutsutaan hormonireseptorinegatiiviseksi, jos sillä ei ole lainkaan estrogeeni- tai progesteronireseptoreja. Hormonireseptorinegatiiviset rintasyövät kasvavat nopeammin ja vastaavat hormoniterapiahoitoihin huonommin, kuin hormonire- septoripositiiviset rintasyövät. HER2:n poikkeavan voimakasta ilmentymistä esiintyy noin 20
%:ssa kaikista rintasyövistä ja se ennustaa huonoa kliinistä lopputulosta. Se johtaa solujen nopeaan kasvuun ja aggressiivisempaan leviämiseen. Rintasyöpää, jolla ei ole estrogeeni- eikä progesteronireseptoreita, ja joka ilmentää heikosti HER2-reseptoria, kutsutaan kolmois- negatiiviseksi rintasyöväksi (TNBC; triple-negative breast cancer). Sitä esiintyy useimmiten nuorilla naisilla ja sille on tyypillistä nopeampi kasvaminen ja leviäminen ympäröiviin kudok- siin muihin verrattuna. TNBC myös käyttäytyy aggressiivisemmin, kuin muut tyypit. (Pooro- lajal et al., 2016.)
1.1.2 RINTASYÖVÄNMETASTASOINTI
Rintasyöpä voi metastasoida eri puolille elimistöä, kuten keuhkoihin, maksaan, luustoon ja aivoihin. Kasvainsolujen leviäminen tapahtuu paikallisen kudosinvaasion, verisuonien tai imusuonien kautta (Xie et al., 2017). Rintasyöpäkasvaimen lähettämät metastaasit ovatkin suurin syy rintasyöpäpotilaiden kuolemaan, joten metastaasiprosessien ja -signaalien ym- märtäminen kasvaimen ja kasvaimen mikroympäristön välillä on ensisijaisen tärkeää (Redig et al., 2013). Metastasointi on monimutkainen prosessi, joka on merkittävä ongelma syövän hoidon kannalta. Sen tekee vieläkin monimutkaisemmaksi se, että syöpäpotilaille voi kehit- tyä metastaaseja jopa vuosikymmeniä syöpädiagnoosin saamisen ja primaarikasvaimen poistonkin jälkeen. Metastasointiin vaaditaan useampia peräkkäisiä vaiheita, joista jokaisen on onnistuttava metastaasin muodostumiseksi. Niin kutsuttu progressiomalli on ollut yli 30 vuoden ajan yleisimmin hyväksytty ja käytetty metastasointimalli. Mallin mukaan sarja mu- taatioita tapahtuu joko primaarituumorin soluissa tai sieltä levinneissä soluissa. Tämän seu- rauksena pieni joukko soluja saa täyden metastaattisen potentiaalin kohdistuen tiettyyn kohde-elimeen. (Hunter et al., 2008.)
Karsinoomien metastaasiprosessi alkaa tuumorisolujen invaasiolla alla olevan tyvikalvon läpi ympäröiviin kudoksiin. Tuumorisolujen solu-solu adheesion ja solu-soluväliaineadheesion (ECM, extra cellular matrix) adheesion on ensin muututtava tietyllä tapaa, jotta invaasio voi alkaa. Muun muassa kadheriiniperheellä on merkittävä rooli solu-solu adheesion säätelyssä ja sillä on merkitystä myös rintasyövän metastasoinnissa. E-kadheriini ylläpitää soluliitoksia ja sen mutaatioilla ja toimimattomuudella on huomattu olevan vaikutusta sekä rintasyövän kehittymiseen että metastasointiin, ja näiden lisäksi myös huonoon ennusteeseen. (Scully et al., 2012.)
1.2 IMUSUONISTOJASYÖPÄ
1.2.1 IMUSUONISTO
Imusuonisto on tärkeä elimistön immuunijärjestelmän toiminnalle, kudosnesteen ho- meostaasille ja ravinnon rasvojen imeytymiselle. Imusuonet alkavat pieninä umpinaisina suonina, jotka absorboivat nestettä ja soluja perifeerisistä kudoksista. Perifeeriset suonet yhtyvät lopulta rintatiehyeeseen, josta imuneste päätyy takaisin verenkiertoon. (Paduch, 2016.)
Tuumorin ympärillä olevat imusuonet (PTL, peri-tumoral lymphatics) ovat yhteydessä imusolmukemetastaaseihin sekä kokonaisvaltaiseen kliiniseen lopputulokseen. PTL:t ovat reitti tuumorisolujen invaasiolle ja leviämiselle, kun taas tuumorin sisällä olevat imusuonet (ITL, intra-tumoral lymphtatics) ovat yleensä pieniä ja kasaanpainuneita tuumorin aiheutta- man paineen vuoksi, eivätkä näin ollen voi toimia tuumorisolujen leviämisreittinä. (Paduch, 2016.) Kliinispatologiset tutkimukset ja kokeet ovat osoittaneet, että imusuonisto käy läpi muutoksia, jotka edesauttavat syöpäsolujen invaasiota imusuoniin ja edelleen syöpäsolujen metastasointia. Näitä imusuoniston läpikäymiä muutoksia ovat muun muassa imusuonien laajentuminen imusuoniston seinämän endoteelisolujen (LEC; lymphatic endothelial cell) hy- perplasian vaikutuksesta, kokonaan uusien imusuonien muodostuminen tai uusien imusuo- nien muodostuminen jo olemassa olevista imusuonista. Tuumorisolujen löytyminen paikal- lisista imusolmukkeista tai vartijaimusolmukkeista (SLN) on merkittävin ennustetekijä syö- vän hoidon lopputuloksen kannalta. Imusuonisto onkin hyvä kohde syövän hoitoa ajatellen;
sen kautta voidaan säädellä syöpään kohdistuvia immuunivasteita ja rajoittaa syövän metas- tasointia. (Stacker et al., 2014.)
1.2.2 LYMFANGIOGEENISTENKASVUTEKIJÖIDENJANIIDENRESEPTORIENSIGNALOINTI Lymfangiogeeniset kasvutekijät VEGF-C ja VEGF-D (vascular endothelial growth factor) edis- tävät imusuoniston kautta tapahtuvaa metastasointia edesauttamalla tuumorin sisälle ja tuumorin ympärille kasvavien imusuonien muodostumista. VEGF-C ja VEGF-D ovat niiden reseptorin, VEGFR-3:n (vascular endothelial growth factor receptor 3), ligandeja, ja sen kautta tapahtuvalla signaloinnilla on merkittävä rooli imusuoniston kehittymisessä. VEGFR- 3:n inhiboinnin on huomattu estävän tuumorin lymfangiogeneesia ja imusolmukemetas- taasien muodostumista. (He et al., 2005.)
1.2.3 SYÖPÄSOLUJENINVAASIOIMUSUONISTOON
Tuumorisolujen ja LEC:n läheisellä interaktiolla on aktiivinen rooli tuumorisolujen invaasi- ossa imusuoniin ja edelleen imusuoniston kautta tapahtuvassa tuumorisolujen leviämisessä.
Inhiboimalla VEGFR3:a eräällä proteiinilla saatiin estettyä imusolmukemetastaasien muo- dostuminen hiiressä. Tästä päätellen tuumorin lymfangiogeneesi, johon liittyy imusuonien haaroittumista ja laajentumista, voi olla edistävä tekijä tuumorin metastasoinnissa. VEGFR- 3-Ig ei kuitenkaan toiminut hiirimalleissa, joissa metastasointi oli jo alkanut. Tästä pystyttiin päättelemään inhibition vaikuttavan etenkin tuumorisolujen invaasiovaiheessa imusuoniin.
(He et al., 2005.)
Rintasyöpäsolujen on osoitettu hyödyntävän useita erilaisia solun signalointireittejä leviämi- sessään. Tutkimusryhmässämme on vastikään osoitettu Notch3-, b1-integriini- ja MMP14- proteiinien aktivoituvan melanoomasolujen ja LEC:ien vuorovaikutuksen seurauksena ja li- säävän melanoomasolujen invasiivisuutta ja metastasointia hiiri- ja seeprakalamalleissa (Pekkonen et al. 2018).
1.3 NOTCH
1.3.1 NOTCH-SIGNALOINTIREITTI
Nisäkkäillä on neljä erilaista Notch-reseptoria (Notch 1-4) ja viisi Notch-reseptorien ligandia (Delta-like 1, Delta-like 3, Delta-like 4 ja Jagged 1-2). Notch-ligandit kuuluvat kerran solukal- von läpäisevään DSL-perheeseen (Delta/Serrate/LAG-2). Notch-signalointia tapahtuu solu- solukontakteissa, jossa Notch-ligandit sitoutuvat viereisen solun Notch-reseptorin solun ul- kopuoliseen osaan. Tämä saa aikaan Notch-reseptorin intrasellulaarisen osan (NICD, Notch intracellular domain) proteolyyttisen pilkkoutumisen ja kulkeutumisen tumaan. Tumassa se sitoutuu muihin transkriptiofaktoreihin ja säätelee näin kohdegeeniensä ekspressiota.
(Aithal et al., 2013.)
1.3.2 NOTCHJASYÖPÄ
Notch-signalointireitti on keskeisessä osassa solujen jakaantumisessa, erilaistumisessa ja sel- viytymisessä. Häiriöt Notch-signaloinnissa voivat johtaa muun muassa syövän kehittymi- seen, joten Notch-signalointireitti on mahdollinen kohde uusille syöpähoitomuodoille.
Notch-signaloinnin merkitys on hyvin tapauskohtaista syöpätyypistä riippuen; joissain syö- vissä se toimii onkogeeninä ja joissain kasvurajoitetekijänä. (Aithal et al., 2013.) Onkogeeni- senä Notch-signalointireitti on yksi useimmin aktivoituvista signaalireiteistä syövän kehitty- misen aikana. Muutokset voivat olla esimerkiksi Notch-signalointireittiä vahvistavia mutaa- tioita. On osoitettu, että tämän signalointireitin inhibitiolla olisi mahdollista muun muassa voittaa syövän kemoresistenssi. Notch-inhibiittoreita ollaankin kehittämässä yksittäiseksi syöpähoitomuodoksi tai yhdistelmähoidoksi kemoterapian kanssa. Joillakin Notch-inhibiitto- reilla on jo todettu olevan tehoa prekliinisissä tutkimuksissa. (Yuan et al., 2015.) Kasvurajoi- tetekijänä Notch1:n ja Notch2:n yliekspressio johtaa pienisoluisen keuhkosyövän kasvun ra- joittumiseen pysäyttäen solusyklin vaiheeseen G1. Notch1:n aktivaatio kohdunkaulan syö- vässä johtaa lisääntyneeseen apoptoosiin, solusyklin pysähtymiseen ja estää kasvaimien ke- hittymistä. (Aithal et al., 2013.)
1.4 INTEGRIINIT
1.4.1 b1-INTEGRIINI
b1-integriini (ITGB1, CD29) kuuluu integriiniproteiinien suureen molekyyliperheeseen, joka koostuu solukalvon läpäisevistä 18 alfa- ja 8 beta-alayksikostä. ITGB1 on heterodimeerinen solun pinnan reseptori, joka toimii säätelijänä solun ja soluväliaineen (ECM, extra cellular matrix) välillä ja sitä kautta vaikuttaa solun jakaantumiseen, liikkumiseen, invaasioon ja sel- viytymiseen. Aikaisemmissa tutkimuksissa on osoitettu, että korkea ITGB1:n ekspressio kor- reloi huonon ennusteen kanssa invasiivisissa rinta-, keuhko- ja haimasyövässä. (Liu et al., 2015.)
1.4.2 A5-INTEGRIINI
A5-integriinin (ITGA5) on osoitettu säätelevän erilaisia tärkeitä solun prosesseja, kuten pro- liferaatiota, migraatiota, erilaistumista ja kehitystä. (Xu et al., 2015.) ITGA5 on pääsäätelijä epidermaalisen kasvutekijän indusoimassa retinan pigmentin epiteelisolujen proliferaati- ossa ja migraatiossa (Chen et al., 2010). Soluliman puoleinen osa ITGA5 on välttämätön so- lujen migraatiolle. ITGA5 hiljentäminen aiheuttaa solujen radiaalisen migraatiokapasiteetin häiriintymisen neuraalisten solujen esiasteissa. ITGA5:lla on myös tärkeä rooli eri solutyyp- pien erilaistumisen säätelyssä ja se on mukana säätelemässä monia kehityksellisiä proses- seja, kuten somiittien rajojen ylläpitoa, morfogeneesiä ja elimien kehittymistä. (Xu et al., 2015.)
1.5 MMP14
Matriksin metalloproteinaasit (MMP:t) ovat soluväliainetta (ECM) hajottavia entsyymejä, joilla on monimutkainen ja spesifinen säätelyverkosto, jossa esimerkiksi yksi MMP-perheen jäsen voi aktivoida toista MMP-perheen jäsentä. ECM:n hajoaminen muuttaa sen mekaani- sia ominaisuuksia, mikä puolestaan tehostaa syöpäsolujen metastasointikykyä. (Haage et al., 2014.)
MMP14, joka tunnetaan myös nimellä MT1-MMP (membrane type-1 matrix metalloprotei- nase), on solukalvon pinnalla oleva transmembraaniproteaasi, joka helpottaa paikallista
ECM:n hajoamista ja on yksi solujen migraation, angiogeneesin ja invaasion pääsäätelijöistä.
(Haage et al., 2014.) MMP14 kulkeutuu sille puolelle solua, mihin suuntaan se on vaelta- massa. MMP14 ennen kaikkea prosessoi ja sitä kautta aktivoi muita liukoisina toimivia mo- lekyylejä, kuten MMP2:ta ja MMP13:a. Nämä saavat aikaan ECM:n eri komponenttien ha- joamista tyvikalvoissa ja stroomassa. MMP14 myös hajottaa molekyylejä viereisten solujen pinnalla (esim. CD44) ja kudoksen transglutaminaaseja helpottaakseen solun migraatiota.
(Jiang et al., 2006.)
1.5.1 MMP14JARINTASYÖPÄ
MMP14:n ekspressio on kohonnut rintasyövässä. MMP14 on potentiaalinen prognostinen tekijä rintasyövässä, sillä se on yhdistetty imusolmukemetastaasien määrän lisääntymiseen, huonoon ennusteeseen ja rintasyöpään liittyvään kuolleisuuteen. MMP14:n hiljentäminen johtaa rintasyöpäsolujen invaasion vähenemiseen in vitro-mallissa. (Jiang et al., 2006.)
1.6 EPHA2
Ihmisillä on 14 Eph-perheeseen kuuluvaa tyrosiinikinaasireseptoria, joista kahdeksan ligan- deineen on mukana erilaisissa kehitykseen liittyvissä mekanismeissa, kuten selkärankaisten taka-aivojen kehityksessä, kudosten muodostumisessa ja angiogeneesissa. Nämä reseptori- ligandiparit ovat merkityksellisiä myös syövän syntymisen ja kehittymisen kannalta. (Fox et al., 2004.)
Eph-perheeseen kuuluva EphA2-reseptori sijaitsee solukalvolla ja säätelee solu-solu ja solu- ECM interaktioita toimien reseptorina ephrin-A -ligandeille (Tsouko et al., 2015). Sillä on sekä lisäävä että rajoittava rooli kasvaimen migraatiossa; ligandista riippumaton promootio ja li- gandista riippuvainen inhibitio. Toisin sanoen ephrin-A1-ligandin sitoutuminen EphA2:seen saa aikaan reseptorin hajoamisen, josta seuraa migraation ja proliferaation väheneminen, kun taas ilman ligandia EphA2:n yliekspressio edistää solujen migraatiota. (Miao et al., 2009.)
2 TUTKIELMAN TAVOITE
Ojalan tutkimusryhmä on aiemmassa melanoomatutkimuksessaan (Pekkonen et al., 2018) osoittanut, että imusuoniston endoteelisolujen ja melanoomasolujen kontaktit ja interaktio johtivat MMP14:n määrän lisääntymiseen ja ennen kaikkea sen siirtymiseen solukalvoille sekä MMP14-riippuvaiseen Notch3:n ja b1-integriinin (ITGB1) aktivaatioon. Nämä molekyy- litason tapahtumat puolestaan johtivat melanoomasolujen lisääntyneeseen invaasioon ja metastaaseihin.
Tässä tutkielmassa keskitytään erityisesti aiemmassa melanoomatutkimuksessa (Pekkonen et al., 2018) tutkittujen migraatioon ja invaasioon vaikuttavien proteiinien ekspression muu- toksiin. Näiden lisäksi tutkitaan kahta muuta migraatioon vaikuttavaa proteiinia (EphA2 ja integriini A5), joita ei aiemmassa melanoomatutkimuksessa tutkittu.
Tämän tutkielman tavoitteet:
1. Selvitetään, tapahtuuko rintasyöpäsoluissa niiden kasvuun ja invaasioon liittyviä muu- toksia, kun niitä kasvatetaan yhdessä LEC-solujen kanssa in vitro.
2. Verrataan yksin kasvaneiden rintasyöpäsolujen ja LEC:n kanssa yhdessä kasvaneiden rin- tasyöpäsolujen morfologiassa tapahtuvia muutoksia.
3. Tutkitaan, muuttuuko edellä mainitussa melanoomatutkimuksessa tutkittujen protei- inien ilmentyminen rintasyöpäsoluissa LEC-yhteiskasvatuksen jälkeen.
4. Tutkitaan kahta solujen migraatioon vaikuttavan (EphA2 ja integriini A5) proteiinin il- mentymistä.
3 MATERIAALIT JA MENETELMÄT
3.1 SOLULINJAT
Vatsaontelon metastaasista eristettyjä rintasyöpäsolulinjan (MCF7, peräisin rinnan adeno- karsinoomasta, ATCC) soluja viljeltiin DMEM-kasvatusliuoksessa (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, Lonza), johon oli lisätty 10 % seerumia (FBS, Fetal Bovine Serum, Gibco, US), 50 U/ml penisilliiniä, 50 U/ml streptomysiiniä ja 2 mM L-glutamiinia (DMEM+L- glut+penstrep+FBS).
Imusuoniston primaarisia endoteelisoluja (LEC, Lymphatic Endothelial Cells, Lonza) kasvatet- tiin endoteelisolujen kasvatusmediassa (EBM-2, Endothelial Basal Medium, Lonza), johon oli lisätty valmistajan kasvutekijät (Lonza Cat. #CC-4147) VEGF:aa lukuun ottamatta.
Molempia mainittuja solulinjoja kasvatettiin soluviljelyinkubaattoreissa, jossa oli +37°C 5 % CO2 (Heracell 150, Heraeus).
3.2 TRANSDUKTIO
Transduktiossa bakteerisolun DNA:ta siirretään toiseen soluun bakteriofagien välityksellä.
Transduktiota varten MCF7-linjan rintasyöpäsolut irrotettiin Trypsin-EDTA-käsittelyllä (Lonza) kasvatusmaljoilta ja suspensoitiin DMEM-kasvatusmediaan. Solutiheys laskettiin au- tomaattisella solulaskurilla (TC-20, Bio-Rad). Soluja laitettiin 6-kuoppalevylle kasvamaan 2x105 solua/kuoppa ja niihin siirrettiin lentivirustransduktion avulla vihreää fluoresoivaa pro- teiinia ilmentävä geeni (GFP, green fluorescent protein) syöpäsolujen visualisoimiseksi LEC:sta yhteisviljelmissä. Lentivirus ilmentää myös geeniä, joka tekee solut resistentiksi blas- tisidiinille. Blastisidiinin avulla soluviljelmästä saatiin eroteltua GFP-positiiviset rintasyöpäso- lut transdusoitumattomista soluista.
Transduktioliuos MCF7-linjan soluille sisälsi 2 ml DMEM+L-glut+FBS, 2 µl polybreeniä ja 3 µl lentivirusta (pLenti6-eGFP) yhtä kuoppaa kohden. Transduktioliuosta pipetoitiin kahteen kuoppaan ja kaksi kuoppaa jätettiin kontrollikuopiksi. Transdusoituja soluja inkuboitiin 10
min 37 °C 5 % CO2:ssa, jonka jälkeen niitä sentrifugoitiin 450g 30 min huoneenlämmössä.
Lopuksi soluja inkuboitiin 48 h 37 °C 5 % CO2.
Inkuboinnin jälkeen soluille vaihdettiin kasvatusmediaksi DMEM+L-glut+penstrep+FBS, jo- hon oli lisätty 10 µg/ml blastisidiinia transdusoitumattomien solujen poistamiseksi. Trans- duktion onnistumista seurattiin 6 vuorokauden ajan fluoresoivalla mikroskoopilla, kunnes GFP-positiivisia rintasyöpäsoluja oli viljelmässä tarpeeksi ja transdusoitumattomia soluja ei ollut enää jäljellä. Transdusoidut solut trypsinoitiin irti 6-kuoppalevyltä ja siirrettiin soluvilje- lypulloon kasvamaan.
3.3 MCF7-SOLUJENJALEC:NYHTEISKASVATUS
MCF7-solujen kasvatusmediaksi vaihdettiin EBM-2 1 h ennen solujen irrotusta. MCF7-solut ja LEC:t irrotettiin irti kasvatusmaljoilta ja liuotettiin EBM-2:een. Solumäärät laskettiin auto- maattisella solulaskurilla (TC-20, Bio-Rad). Kaksi solukasvatusmaljaa päällystettiin integrii- nien kiinnittymisalustana toimivalla fibronektiinillä (Human fibronectin, Sigma-Aldrich), josta oli tehty 1:100 laimennos PBS:aan. Maljoja inkuboitiin 30 min +37 °C 5 % CO2. Fibronektii- niliuos pipetoitiin pois ja tilalle vaihdettiin 4 ml PBS-liuosta. PBS pipetoitiin pois ja toiselle fibronektiinillä päällystetylle maljalle laitettiin kasvamaan pelkästään 7,5 x 105 MCF7-solua ja toiselle maljalle 7,5 x 105 kpl MCF7-solua yhdessä 10,0 x 105 kpl LEC:n kanssa. Maljojen EBM-2-kasvatusliuos vaihdettiin solujen kiinnityttyä kuoppien pohjalle, noin 4 tuntia kasva- tuksen aloittamisen jälkeen.
Immunohistokemiallisia värjäyksiä varten 24-kuoppalevyn (Greiner Bio-One) kuoppien poh- jalle laitettiin peitinlasit, ja lasit päällystettiin fibronektiinillä (Human fibronectin, Sigma-Al- drich) kuten yllä. Soluista tehtiin kaksi eri laimennosta. Laimennoksessa yksi oli 7500 MCF7- solua ja laimennoksessa kaksi 10 000 MCF7-solua yhtä kuoppaa kohden. Yhteiskasvatus- kuopissa kasvatettiin MCF7-solujen kanssa yhdessä 10 000 LEC:a kuoppaa kohden.
Soluille vaihdettiin kasvatusmedia niiden kiinnityttyä kuoppien pohjalla oleville peitinlaseille, noin 3-5 tuntia maljaamisen jälkeen. Soluja kasvatettiin 30 h +37 °C 5 % CO2. Solut fiksattiin 4 % PFA-PBS -liuoksessa (paraformaldehydi-phosphate buffered saline) huoneenlämmössä
20 min. Kuoppiin vaihdettiin PFA-PBS:n tilalle pelkkä PBS ja levyä säilytettiin parafilmiin kää- rittynä +4 °C:ssa värjäyksiin asti.
3.4 PEITINLASEILLEFIKSATTUJENSOLUJENVÄRJÄYS
Solujen fiksaamisen jälkeen peitinlasit pestiin PBS:lla, jonka jälkeen solukalvot permeabilisoi- tiin ja tumat värjättiin 0,2 % Triton X-100 + 1 µg/ml Hoechst 33342 -PBS-liuoksella. Tämä tehtiin rintasyöpäsolujen visualisoimiseksi. Soluja inkuboitiin tässä liuoksessa huoneenläm- mössä 5-10 minuuttia, jonka jälkeen peitinlasit pestiin 0,2 % BSA (Bovine Serum Albumin) PBS-liuoksessa. Peitinlaseja inkuboitiin primaaristen vasta-aineiden kanssa huoneenläm- mössä 1 tunti, jonka jälkeen ne pestiin kolme kertaa 0,2 % BSA-PBS -liuoksella. Pesun jälkeen peitinlaseja inkuboitiin sekundaaristen vasta-aineiden kanssa 45 min huoneenlämmössä pi- meässä. Sekundaaristen vasta-aineiden inkuboinnin jälkeen peitinlasit pestiin ensin kaksi kertaa 0,2 % BSA-PBS-liuoksella, jonka jälkeen kerran PBS:ssa ja lopuksi huuhdeltiin tislatulla vedellä. Huuhtelun jälkeen peitinlasit kuivattiin ja kiinnitettiin lesilevyille (Microscope slides, The Greyer Gruppe) Mowiolilla. Värjätyt peitinlasit kuvattiin automatisoidulla mikroskoopilla (3DHistech Pannoramic 250 FLASH II digital slide scanner). Värjäyksissä käytetyt primaariset ja sekundaariset vasta-aineet oli laimennettu 0,2 % BSA-PBS-puskuriin taulukossa 1 maini- tuissa suhteissa.
TAULUKKO 1. Peitinlaseille fiksattujen solujen värjäyksissä käytetyt vasta-aineet (kohta 3.4).
Primaariset vasta-aineet Sekundaariset vasta-aineet Goat anti-EphA2, 1:50 Anti-goat Alexa 594, 1:1000 Mouse anti-ITGB1 (12G10, active), 1:300 Anti-mouse Alexa 594, 1:1000 Mouse anti-ITGB1 (P5D2, total), 1:20 Anti-mouse Alexa 594, 1:1000 Mouse anti-MMP14, 1:500 Anti-mouse Alexa 594, 1:1000 Phalloidin (Texas Red), 1:200 Ei sekundaarista vasta-ainetta Rabbit anti-ITGA5, 1:500 Anti-rabbit Alexa 594, 1:1000 Rabbit anti-MMP14, 1:100 Anti-rabbit Alexa 594, 1:1000 Rabbit anti-Notch3 (M-134), 1:50 Anti-rabbit Alexa 594, 1:1000 Goat anti-Prox1, 1:500 Anti-goat Alexa 594, 1:1000
3.5 MCF7-SOLUJENEROTTELUYHTEISKASVATUKSENJÄLKEEN
Ennen LEC-yhteiskasvatuksen aloittamista MCF7-rintasyöpäsolujen kasvatusmediaan (DMEM) lisättiin magneettisia nanopartikkeleita 1 mg/ml (Fluid-MAG DX beads, Chemicell).
Magneettipartikkeleiden annettiin siirtyä endosytoosin avulla soluihin 24 tunnin ajan +37 °C 5 % CO2.
Solujen erottelu tehtiin magneettisella Miltenyi Biotechin MidiMACS-erottelijalla ja saman valmistajan LS-erottelupylväillä. Solut irrotettiin kasvatusmaljoilta ja suspensoitiin 10 ml EBM-2:een. LS-erottelupylväs asetettiin MidiMACS-erottelijaan ja sitä huuhdeltiin ensin 2 ml EBM-2:lla. Tämän jälkeen pylvääseen laitettiin MCF7:n ja LEC:n yhteiskasvatuksen solusus- pensio ja läpivirtaava, LEC:t sisältävä kasvatusliuos (flow), kerättiin talteen. Flown keräämi- sen jälkeen pylväs huuhdeltiin kolme kertaa 3 ml EBM-2:lla, jotta mahdolliset sinne jääneet LEC:t saataisiin huuhdeltua pois. Pylväs irrotettiin erottelijasta ja siihen magneettisesti kiin- nijääneet MCF7-solut (MCF7*) kerättiin 6 ml EBM-2:een (liuos 2).
3.6 96-KUOPPALEVYJENVÄRJÄYS
Magneettisen erottelun tarkkuutta mitattiin ottamalla näyte yhteiskasvatusliuoksesta en- nen erottelua sekä näytteet flow- ja elute-liuoksista erottelun jälkeen. Näyte otettiin myös yksinkasvaneiden MCF7-solujen suspensiosta. Kaikki otetut näytteet pipetoitiin 96-kuoppa- levylle (View-plate 96 F Tc, Perkin Elmer). Levy fiksattiin, käsiteltiin ja kuvattiin Thermo Scien- tific CellInsight HCS-mikroskoopilla, kuten kuvattu yllä. Värjäyksissä käytetyt vasta-aineet on lueteltu taulukossa 2.
TAULUKKO 2. 96-kuoppalevyjen värjäyksissä käytetyt vasta-aineet (kohta 3.6).
Primaariset vasta-aineet Sekundaariset vasta-aineet GFP (rabbit), 1:2000 Anti-rabbit Alexa 488, 1:1000 PECAM (mouse), 1:500 (PECAM = CD31) Anti-mouse Alexa 594, 1:1000
3.7 3D-INVAASIOKOE
Invaasiokokeella tutkittiin, kuinka MCF7-rintasyöpäsolut tunkeutuvat 3D-fibriinimatriksiin.
Invaasiokoetta varten valmistettiin entsyymiliuos sekoittamalla 4 U/ml trombiinia ja 400 µg/ml aprotiniinia 2 ml HBSS:aa. Trombiini on entsyymi, joka saa aikaan fibrinogeenin muut- tumisen kuitumaiseksi fibriiniksi ja aprotiniini on proteaasi-inhibiittori, joka estää fibriinin degradaation solujen kasvatuksen aikana. Entsyymiliuoksen lisäksi valmistettiin fibrinogee- niliuos, jonka pitoisuus oli 6 mg/ml. Liuos valmistettiin liuottamalla jauhemaista fibrinogee- nia (Calbiochem, #341578) HBSS:aan (Hank’s balanced salt solution, Gibco, #14025), jonka jälkeen fibrinogeeniliuos suodatettiin ruiskun avulla 0,45 µm filtterin läpi.
20 000 MCF7- ja 20 000 MCF7*-solua laitettiin omiin eppendorf-putkiin ja niihin lisättiin 100 µl fibrinogeeni- sekä 100 µl entsyymiliuosta. Kummastakin seoksesta (MCF7 ja MCF7*) teh- tiin neljä 50 µl tippaa 6-kuoppalevylle. Yhdessä tipassa oli 5000 solua. 6-kuoppalevyä inku- boitiin +37 °C 5 % CO2 30 min, jonka jälkeen kuoppiin lisättiin 3 ml 50-100 µg/ml aprotiniinia sisältävää EBM-2:sta. Solujen annettiin kasvaa geelitipoissa neljän päivän ajan +37 °C 5 % CO2, jonka jälkeen ne fiksattiin 4 % PFA-PBS:ssa 30 min huoneenlämmössä. Geelejä säilytet- tiin PBS:ssa +4 °C värjäyksiin asti.
3.8 3D-FIBRIINIGEELIENVÄRJÄYS
MCF7- ja MCF7*-fibriinigeelitipat siirrettiin 48-kuoppalevylle (Greiner Bio One), kumpaakin kaksi tippaa per kuoppa. Kuoppiin lisättiin 500 µl PBS:aa kuivumisen estämiseksi. PBS pois- tettiin ja geelit fiksattiin 0 °C 1:1 asetoni-metanoliliuoksella 1 min ja pestiin uudestaan PBS:lla. Epäspesifinen vasta-aineiden sitoutuminen blokattiin inkuboimalla geelejä 15 % FBS + 0,3 % Triton-X-100 -PBS blokkauspuskurissa huoneenlämmössä 1 tunnin ajan, jonka jäl- keen geelejä inkuboitiin primaarisen vasta-ainelaimennosliuoksen (Phalloidin, Texas Red, 1:200) kanssa +4 °C 24 h. Geelejä pestiin 5 x 15 min 0,3 % Triton-X-100 -PBS pesupuskurilla, jonka jälkeen niitä inkuboitiin samassa pesupuskurissa +4 °C 24 h. Geelejä pestiin 3 x 15 min pesupuskurilla ja tumien värjäämistä varten inkuboitiin 1 µg/ml Hoechst 33342 -PBS -liuok- sessa 15-30 min huoneenlämmössä. Inkuboinnin jälkeen geelejä pestiin 2 x 15 min pesupus- kurilla ja kerran 15 min PBS:lla. Pesun jälkeen geelit asetettiin Mowiolin avulla lasilevyjen väliin (Microscope Slides, The Greyer Gruppe). Lasilevyt kuvattiin ottamalla useita kuvia Zeiss
LSM 780 –konfokaalimikroskoopilla Z-tasossa, jotka lopuksi yhdistettiin yhdeksi kuvaksi käyt- tämällä Zen Black -ohjelman Maximum intensity projection -toimintoa.
4 TULOKSET
4.1 MCF7-SOLUJENJALEC:NYHTEISKASVATUSJAEROTTELU
KUVA 1A. Kuvassa input-näytteet eli ennen erottelua otettu kuva.
Ennen yhteiskasvatuksen aloittamista MCF7-soluille (vihreä) syö- tettiin magneettisia nanopartikkeleja (MCF7*). Ylärivillä yksin kas- vaneet MCF7*-solut ja alarivillä yhdessä kasvaneet LEC:t (punai- nen) ja MCF7*-solut.
KUVA 1B. Erottelun tehokkuus (output-näytteet) eli magneettisen erottelijan (MidiMACS) läpiajetut solut. Ylärivillä flow eli Midi- MACSin läpi virranneet solut ja alarivillä elute eli erottelijaan mag- neettisesti kiinnijääneet solut. Erottelun tavoitteena oli, että Elute- osiossa olisi pelkkiä magneettisen nanopartikkelin sisältäviä MCF7*-soluja (vihreä). Kuten kuvasta näkyy, niin seassa on paljon myös LEC-soluja (punainen), joiden olisi pitänyt virrata erottelijan läpi Flow-liuoksen mukana. Näin ollen magneettinen erottelu ei ol- lut tarpeeksi tehokas.
Tutkielmassa tutkittiin metastaasista eristetyn MCF7-rintasyöpäsolulinjan solujen ja imu- suoniston endoteelisolujen (LEC) välillä tapahtuvia interaktioita in vitro. Ennen yhteiskasva- tuksen aloittamista rintasyöpäsoluihin siirrettiin lentivirustransduktion avulla vihreää fluore- soivaa proteiinia ilmentävä geeni (GFP, green fluorescent protein) syöpäsolujen erotta- miseksi LEC:sta yhteisviljelmissä ja niille syötettiin magneettisia nanopartikkeleita myöhem- pää erottelua varten. Soluja kasvatettiin yhdessä samalla kasvatusmaljalla ja niiden annettiin interaktoida keskenään. Yhteiskasvatuksen jälkeen solut irrotettiin maljalta ja eroteltiin mag- neettisella MidiMACS-erottelijalla. Erottelun tavoite oli, että erottelijasta läpivirtaava EBM- 2 (flow) sisältäisi vain LEC:t ja erottelijaan jäisi kiinni magneettisen nanopartikkelin sisältävät MCF7*-solut (elute).
Magneettisen erottelun tehokkuutta arvioitiin ottamalla näytteet ennen magneettista erot- telua ja sen jälkeen (kuvat 1A ja B). Solut leimattiin GFP:ta ja endoteelimarkkeri PECAM:ia tunnistavilla vasta-aineilla. Tästä tuloksena saatiin selville, että tehty erottelu ei ollut tehokas MCF7-solujen ja LEC:n kohdalla. Erottelun jälkeen LEC:ja jäi liian paljon MCF7-solujen jouk- koon (kuva 1B).
4.2 LEC-YHTEISKASVATUKSENAIHEUTTAMATMUUTOKSETMCF7-SOLUISSA Seuraavaksi tutkimme aktiinin, Notch3:n, integriinien, MMP14:n ja EphA2:n signaalien muuttumista ja rintasyöpäsolujen morfologian muutoksia sen jälkeen, kun GFP-proteiinia il- mentäviä MCF7-soluja oli kasvatettu yhdessä LEC:n kanssa (MCF7*). Kontrollinäytteenä käy- tettiin yksin kasvaneita transdusoituja MCF7-soluja.
4.2.1 AKTIINI
Leimasimme solut fluoresoivalla phalloidinilla, jota käytetään solujen aktiinifilamenttien arkkitehtuurin visualisointiin ja aktiinin määrän laskemiseen. Aktiinifilamenttien signaali hiukan voimistui LEC-yhteiskasvatuksen jälkeen (kuva 2). Yksin kasvaneissa MCF7-soluissa se sijaitsee pääosin siististi juosteena solukalvolla. Yhteiskasvatuksen jälkeen lokalisaatiossa tapahtui muutoksia, jolloin aktiinifilamenttien signaalia nähdään myös solulimassa. Solujen muoto muuttui tasareunaisista ulokkeellisiksi ja reunaltaan epätasaisiksi. Solujen väliset rajat muuttuivat myös epätasaisiksi ja vaikeammin hahmotettaviksi. Kuvan 2 MCF7*-solujen kohdalla oikeassa yläkulmassa näyttää siltä, että rintasyöpäsolujen ulokkeet työntyisivät LEC:n muodostaman solualueen väliin (valkoinen nuoli).
KUVA 2. Immunofluoresenssikuvia MCF7- ja MCF7*-soluista. Solut on leimattu phal- loidinilla (punainen). Tumat on vastavärjätty Hoechst 33342:lla (sininen). GFP edus- taa MCF7*-soluja ja katkoviiva MCF7-LEC -rajapintaa. Yhteiskasvatuksen seurauk- sena aktiinifilamenttien lokalisaatio muuttui ja sitä siirtyi myös solulimaan. Solujen muoto muuttui tasareunaisista ulkolleellisiksi. Valkoinen nuoli osoittaa kohtaa, jossa aktiinisäikeet näyttävät menevät LEC-kerroksen väliin.
4.2.2 NOTCH3
Solujen Notch3 signaalia analysoitiin yksin ja yhdessä LEC:ien kanssa kasvaneista MCF-7 soluista. Notch3:n signaali hiljeni LEC-yhteiskasvatuksen myötä (kuva 3), ja Notch3:n lokalisaatio painottui solulimaan, mutta sitä oli jonkin verran myös solujen pinnalla.
KUVA 3. Immunofluoresenssikuvia MCF7- ja MCF7*-soluista. Solut on leimattu vasta- aineella Notch3:a vastaan (punainen). Tumat on vastavärjätty Hoechst 33342:lla (si- ninen). GFP edustaa MCF7*-soluja ja katkoviiva MCF7-LEC -rajapintaa. Notch3:n sig- naali hiljeni ja painottui enemmän soluliman puolelle LEC-yhteiskasvatuksen myötä.
4.2.3 MMP14
MMP14 proteiinin signaalin voimakkuudessa tai lokalisaatiossa ei tapahtunut muutoksia LEC-yhteiskasvatuksen jälkeen verrattuna yksin kasvaneisiin rintasyöpäsoluihin (kuva 4).
KUVA 4. Immunofluoresenssikuvia MCF7- ja MCF7*-soluista. Solut on leimattu vasta-aineella MMP14:a vastaan (punainen). Tumat on vastavärjätty Hoechst 33342:lla (sininen). GFP edustaa MCF7*-soluja ja katkoviiva MCF7-LEC -rajapintaa.
MMP14 signaalin voimakkuudessa tai lokalisaatiossa ei tapahtunut muutoksia yh- teiskasvatuksen myötä.
4.2.4 ITGA5
A5-integriinin (ITGA5) signaali hieman voimistui LEC:n kanssa yhteiskasvatetuissa rinta- syöpäsoluissa verrattuna yksin kasvaneisiin rintasyöpäsoluihin (kuva 5). ITGA5:n lokalisaatio pysyi kuitenkin samana, pääosin sijoittuneena solukalvolle.
KUVA 5. Immunofluoresenssikuvia MCF7- ja MCF7*-soluista. Solut on leimattu vasta-aineella ITGA5:a vastaan (punainen). Tumat on vastavärjätty Hoechst 33342:lla (sininen). GFP edustaa MCF7*-soluja ja katkoviiva MCF7-LEC -rajapin- taa. ITGA5:n signaali voimistui yhteiskasvatuksen myötä. Lokalisaatiossa ei ta- pahtunut muutoksia.
4.2.5 ITGB1(12G10JAP5D2)
KUVA 6A. Immunofluoresenssikuvia MCF7- ja MCF7*-soluista. Solut on leimattu vasta-aineella (punainen) aktiivista ITGB1:a (ITGB1 12G10) vastaan. Tumat on vas- tavärjätty Hoechst 33342:lla (sininen). GFP edustaa MCF7*-soluja ja katkoviiva MCF7-LEC -rajapintaa. Aktiivisen ITGB1:n signaali heikentyi yhteiskasvatuksen myötä. Lokalisaatiossa ei tapahtunut muutoksia.
KUVA 6B. Immunofluoresenssikuvia MCF7- ja MCF7*-soluista. Solut on leimattu vasta-aineella (punainen) totaali ITGB1:a vastaan (ITGB1 P5D2). Tumat on vasta- värjätty Hoechst 33342:lla (sininen). GFP edustaa MCF7*-soluja ja katkoviiva MCF7- LEC -rajapintaa. Totaali ITGB1:n signaali hieman heikentyi aktiivisen ITGB1:n tapaan yhteiskasvatuksen myötä. Lisäksi totaali ITGB1:n lokalisaatio siirtyi solukalvolta so- luliman puolelle. LEC:n signaali näyttäisi voimistuvan reunoilla, jotka ovat kosketuk- sissa MCF7*-solujen kanssa.
Tutkimme myös ITGB1:n aktivaatiota yhteiskasvatuksen seurauksena. Aktiivisen ITGB1:n tunnistavan vasta-aineen 12G10 signaali hieman väheni LEC-yhteiskasvatuksen jälkeen, mutta muutoksia lokalisaatiossa ei tapahtunut (kuva 6 ylärivi).
Myös totaali ITGB1:n tasot (vasta-aine P5D2) hieman vähenivät LEC-yhteiskasvatuksen jäl- keen (kuva 6 alarivi). ITGB1 P5D2:n signaalin lokalisoitui pääosin solujen solukalvolle solu- solu kontakteihin, mutta yhteiskasvatuksen jälkeen signaalia näkyi selvästi myös muutamien solujen solulimassa. LEC:t ilmentävät voimakkaasti ITGB1 P5D2:sta niissä soluissa, jotka ovat kosketuksissa rintasyöpäsolujen kanssa.
4.2.6 EPHA2
EphA2-proteiinilla on osoitettu olevan tärkeä rooli rintasyövän leviämisessä. Kun leimasimme MCF7-soluja EphA2-vasta-aineella, sen signaali vahvistui voimakkaasti LEC- yhteiskasvatetuissa MCF7-rintasyöpäsoluissa (kuva 7). Myös sen lokalisaatio muuttui suuressa osassa soluja solukalvon pinnalta koko solun kattavaksi.
KUVA 7. Immunofluoresenssikuvia MCF7- ja MCF7*-soluista. Solut on leimattu vasta-aineella EphA2:a vastaan (punainen). Tumat on vastavärjätty Hoechst 33342:lla (sininen). GFP edustaa MCF7*-soluja ja katkoviiva MCF7-LEC -rajapintaa.
Signaalissa tapahtui voimistumista yhteiskasvatuksen myötä ja myös sen lokalisaa- tio siirtyi solukalvon pinnalta koko solun kattavaksi.
4.3 INVAASIONVERTAILUYKSINKASVANEIDENJALEC:NKANSSAKASVANEI- DENMCF7-SOLUJENVÄLILLÄ
Mahdollisia muutoksia MCF7-solujen invaasiossa LEC-yhteiskasvatuksen jälkeen tutkittiin 3D-invaasiokokeella, jossa mitattiin, kuinka MCF7-rintasyöpäsolut tunkeutuvat 3D-fibriini- matriksiin. Yksin kasvaneet MCF7-solut olivat pyöreitä ja suhteellisen tarkkarajaisia. Yhteis- kasvatuksen jälkeen soluihin ilmestyi hentoja pieniä ulokkeita suuntautuen soluja ympäröi- vään fibriinimatriksiin (kuva 8, valkoiset nuolet). Tämä tukee aiempaa havaintoa solujen muodon muuttumisesta (kohta 9.2.1), mutta varsinaisessa invaasiokyvyssä ei merkittäviä muutoksia tapahtunut.
KUVA 8. Konfokaalimikroskooppiokuvia MCF7-soluista yksin (MCF7) ja yhdessä LEC:n kanssa (MCF7*) 3D-fibriinissä kasvaneina. Solut on leimattu phalloidinilla (pu- nainen). Tumat on vastavärjätty Hoechst 33342:lla (sininen). Yhteiskasvatuksen myötä pyöreille ja tarkkarajaisille MCF7*-soluille tuli hentoja ulokkeita, jotka työnt- yivät ympäröivään fibriinimatriksiin (valkoiset nuolet).
5
POHDINTA
Tutkielman tarkoituksena oli tutkia rintasyöpäsolujen ja imusuoniston endoteelisolujen (LEC) yhteiskasvatuksen aiheuttamia vaikutuksia rintasyöpäsolujen invasiivisuuteen in vitro -olosuhteissa. Tutkielmassa tarkasteltiin solujen invasiivisuuteen ja migraatioon vaikuttavien proteiinien ilmentymisen ja lokalisaation muutoksia solujen yhteiskasvatuksen seurauksena.
Tuloksia tarkasteltiin leimaamalla soluja kyseisten proteiinien vasta-aineilla ja kuvaamalla ne konfokaalimikroskoopilla. Solujen invasiivisuuden muutoksia tutkittiin kasvattamalla soluja 3D-fibriinimatriksissa ja kuvaamalla tulokset.
Kohdassa 4.2.1 huomattiin, että yhteiskasvatuksen myötä aktiinin määrä solussa hiukan li- sääntyy ja solujen muoto muuttuu. Lisäksi solut muodostavat eri suuntiin suuntautuvia ulok- keita 3D-fibriinimatriksissa. Nämä määrälliset ja rakenteelliset muutokset voisivat tarkoittaa solun lisääntynyttä migraatiota, todennäköisesti syntyneiden ulokkeiden suuntaisesti. Pek- konen et al. (2018) melanoomatutkimuksessaan osoitti, että syöpäsolujen ja LEC:n yhteis- kasvatuksen myötä melanoomasolujen migraatio ja sitä kautta invaasio lisääntyi. Tämän tut- kimuksen löydös rintasyöpäsolujen osalta on yhtenäinen melanoomasoluilla tehdyn tutki- muksen kanssa.
Notch-signaloinnin tiedetään olevan keskeisessä osassa solujen jakaantumisessa, erilaistumisessa ja selviytymisessä. Häiriöt Notch-signaloinnissa voivat näin ollen johtaa muun muassa syövän kehittymiseen, mutta merkitys on tapauskohtaista riippuen siitä, toimiiko Notch-signalointi onkogeeninä vai kasvurajoitetekijänä. (Aithal et al., 2013.) Tässä tutkimuksessa Notch3:n signaali väheni LEC-yhteiskasvatuksen myötä (kohta 4.2.2). Tämä havainto mahdollisesti indikoi, että MCF7-soluissa Notch3 voisi toimia kasvurajoitetekijänä, joka yli-ilmentyneenä inhiboi tuumorin kasvua. Jos näin on, niin tulevaisuudessa on mahdol- lisuus voittaa MCF7-rintasyöpäsolujen kemoresistenssi (Yuan et al., 2015). On toki mahdol- lista, että Notch3:lla ei ole vaikutusta MCF7-solujen kasvuun.
Integriinit vaikuttavat solun jakaantumiseen, liikkumiseen, invaasioon ja selviytymiseen (Liu et al., 2015). Kohdassa 4.2.5 totaali ITGB1 P5D2:n ja aktiivisen ITGB1 12G10:n signaalit hilje- nivät LEC-yhteiskasvatuksen jälkeen verrattuna yksin kasvaneisiin rintasyöpäsoluihin. Tämä
mahdollisesti on seurausta siitä, että solut saattavat endosytoida osan aktivoituneesta in- tegriinistä tai kierrättää integriiniä endosomeissa paikasta toiseen. Aiemman tutkimustiedon nojassa korkea ITGB1:n ekspressio korreloi huonon ennusteen kanssa invasiivisissa rinta-, keuhko ja haimasyövissä (Liu et al., 2015). Notch3:n tapaan ITGB1:n signaali väheni yhteis- kasvatuksen myötä, joten se voi mahdollisesti vaikuttaa päinvastoin MCF7-solujen kohdalla verrattuna aiemmin tutkittuihin rintasyöpäsolulinjoihin tai toisaalta olla vaikuttamatta lain- kaan.
Poiketen ITGAB1:sta, ITGA5 vaikuttaa pääasiassa solun proliferaatioon, migraatioon, erilais- tumiseen ja kehittymiseen (Xu et al., 2015). Tässä tutkimuksessa LEC:t ilmensivät hyvin voi- makkaasti ITGA5:ta (kohta 4.2.4). Ei kuitenkaan tiedetä, olisiko ITGA5:n ilmentyminen yhtä voimakasta myös yksin kasvaneissa LEC:ssa vai muuttuuko se juurikin MCF7-solujen vaiku- tuksesta. Tämän selvittämiseksi tulisi kasvattaa LEC:ja yksinään ja tehdä niille kyseiset ITGA5:n vasta-ainevärjäykset. Solujen muodon muuttuminen (kohta 4.2.1) ja ITGA5:n eks- pression lisääntyminen voisivat tarkoittaa solujen migraation lisääntymistä LEC-yhteiskasva- tuksen myötä.
EphA2 on aiemman tiedon nojassa merkityksellisessä osassa syövän syntymisen ja kehitty- misen kannalta (Fox et al., 2004). EphA2-reseptori sijaitsee solukalvolla ja säätelee solu-solu ja solu-ektrasellulaarimatriksi interaktioita (Tsouko et al., 2015) ja sillä on sekä rajoittava että lisäävä rooli kasvaimen migraatiossa (Miao et al., 2009). Tässä tutkimuksessa EphA2- signaali vahvistui LEC-yhteiskasvatuksen myötä (kohta 4.2.6). Signaalin vahvistuminen voisi viitata ligandista riippumattomaan migraation lisääntymiseen.
LEC-yhteiskasvatuksen jälkeen tehdyssä 3D-invaasiokokeessa (kohta 4.3) MCF7-solut muo- dostivat ulokkeita, jotka suuntautuvat satunnaisesti ympäröivään fibriinimatriksiin. Havainto tukee aiempaa havaintoa solujen muodon muuttumisesta (kohta 4.2.1). MCF7-rinta- syöpäsolujen invaasiota voisi jatkossa tutkia myös muissa matrikseissa tutkielmassa käytetyn fibriinin lisäksi. Matrigel ja kollageeni ovat yleisimmin käytettyjä matrikseja invaasion tutki- miseen ja näitä käyttämällä voisi saada erilaista lisätietoa invaasiosta. Tällöin solut joutuvat käyttämään erilaisia degradaatioentsyymejä, kuin tutkielmassa käyttämässämme fibriini- matriksissa.
Yhtenä lisävaihtoehtona migraation ja invaasion tutkimiseen on transwell chamber. Sen avulla tutkitaan solujen kykyä migroida tiettyä kemiallista signaalia kohti jonkin fyysisen es- teen läpi. Tällä mekanismilla voidaan tutkia myös solujen invaasiota lisäämällä transwell- membraaniin kerros soluväliainetta tai endoteelisoluja. Näin voidaan matkia soluväliainein- vaasiota ja ekstravasaatiota. Solun tukirangan immunologisella värjäyksellä ja kuvantami- sella fluoresenssimikroskoopilla solujen invasoidessa matriksin läpi voidaan tutkia muutoksia solun morfologiassa invaasion aikana. (Justus et al., 2014.)
Tutkielmassa käytettyjen menetelmien osalta rintasyöpäsolujen ja LEC:n magneettinen erot- telu ei tuottanut toivottua lopputulosta (kohta 4.1). Magneettisella erottelulla pyrittiin erot- telemaan magneettisen nanopartikkelin endosytoineet rintasyöpäsolut LEC:sta, jotta voitiin toteuttaa kohdassa 4.3 tehty invasiivisuustutkimus. Menetelmää voisi optimoida MCF7-so- luille sopivaksi antamalla magneettisten mikropartikkelien endosytoosille enemmän aikaa.
Kokeilun arvoista olisi myös huuhdella erottelupylvästä muutamia kertoja enemmän flow- fraktion keräyksen jälkeen, jotta ylimääräisistä LEC:sta päästäisiin tehokkaammin eroon.
Trypsiinin sijasta voitaisiin kokeilla jotain toista entsyymiä, jos erottelun huono teho johtuu- kin solujen tarttumisesta toisiinsa. Soluja voisi kokeilla erotella myös FACS:lla, jos magneet- tista erottelua ei muutoksista huolimatta saada toimimaan.
Tutkielman tulosten ja niiden pohdinnan perusteella voidaan todeta, että vatsaontelon me- tastaasista eristetty MCF7-solulinja kommunikoi LEC:n kanssa, mistä osoituksena etenkin MCF7-solujen morfologian muutos yhteiskasvatuksen myötä. Joidenkin tarkasteltujen pro- teiinien ilmentymisessä ja signaalin voimakkuudessa havaittiin myös muutoksia, ja näiden proteiinien jatkotutkimukset voivat mahdollisesti tuottaa hyödyllistä lisätietoa rintasyövän kommunikaatiosta imusuoniston kanssa. Tästä tutkimuksesta saadut tulokset voivat indi- koida solujen lisääntynyttä migraatiota yhteiskasvatuksen seurauksena.
Rintasyöpä on yleisin naisilla diagnosoitu syöpä ja se on maailmanlaajuisesti yleisin naisten syöpäkuolleisuutta aiheuittava tauti (Custódio-Santos et al., 2017; Redig et al., 2013). Rinta- syöpä metastasoi kudosinvaasion, verisuonien tai imusuonien kautta (Xie et al., 2007) ja me-
tastaasit ovat suurin syy rintasyöpäpotilaiden kuolemaan (Redig et al., 2013). Tuumorisolu- jen ja imusuoniston endoteelisolujen vuorovaikutuksella on suuri rooli tuumorisolujen in- vaasiossa imusuoniin ja sitä kautta tuumorisolujen leviämisessä imusuoniston kautta (He et al., 2005). Näin ollen kyseessä on tärkeä tutkimusaihe ja tämä tutkimus toi tärkeää tietoa MCF7-linjan rintasyöpäsolujen kommunikaatiosta imusuoniston kanssa. Saatua tutkimustie- toa voidaan käyttää pohjana jatkotutkimuksiin, ja tulevien tutkimusten avulla on mahdollista löytää täsmähoitoja rintasyöpään.
LÄHTEET
Aithal, M.G.S., and N. Rajeswari. 2013. Role of Notch signaling pathway in cancer and its association with DNA methylation. Journal of Genetics. 92(3):667-675.
Chen, Z., C.Z. Chen, W.R. Gong, J.P. Li, Y.Q. Xing. 2010. Integrin-alpha5 mediates epidermal growth factor-induced retinal pigment epithelial cell proloferation and migration. Pathobiology. 77(2):88- 95. doi: 10.1159/000278290.
Custódio-Santos, T., M. Videira, and M.A. Brito. 2017. Brain metastasization of breast cancer. Biochi- mica et Biophysica Acta (BBA). 1868(1):132-147. doi: 10.1016/j.bbcan.2017.03.004
Fox, B.P., and R.P. Kandpal. 2004. Invasiveness if breast cancer carcinoma cells and transcript profile:
Eph receptors and ephrin ligands as molecular markers of potential diagnostic and prognostic appli- cation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 318(4):882-892. doi:
10.1016/j.bbrc.2004.04.102.
Haage, A., D. Nam, X. Ge, and I.C. Schneider. 2014. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and Biophysical Research Commu- nications. 450(1):213-218. doi: 10.1016/j.bbrc.2014.05.086.
He, Y., I. Rajantie, K. Pajusola, M. Jeltsch, T. Holopainen, S. Ylä-Herttuala, T. Harding, K. Jooss, T. Ta- kahashi, and K. Alitalo. 2005. Vascular endothelial cell growth factor receptor 3-mediated activation of lymphatic endothelium is crucial for tumor cell entry and spread via lymphatic vessels. Cancer Research. 65(11):4739-4746. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-04-4576.
Hunter, K.W., N.P.S. Crawford, and J. Alsarraj. 2008. Mechanisms of metastasis. Breast Cancer Re- search. 10(1):S2. doi: 10.1186/bcr1988.
Jiang, W.G., G. Davies, T.A. Martin, C. Parr, G. Watkins, M.D. Mason, and R.E. Mansel. 2006. Expres- sion of membrane type-1 matrix metalloproteinase, MT1-MMP in human breast cancer and its im- pact on invasiveness of breast cancer cells. International Journal of Molecular Medicine. 17(4):583- 590. doi: 10.3892/ijimm.17.4.583.
Justus, C.R., N. Leffler, M. Ruiz-Echevarria, and L.V. Yang. 2014. In vitro Cell Migration and Invasion Assays. Journal of Visualized Experiments. (88):51046. doi:10.3791/51046.
Liu, Q.Z., X. Gao, W. Chang, H. Gong, C. Fu, W. Zhang, and G. Cao. 2015. Expression of ITGB1 predicts prognosis in colorectal cancer: a large prospective study based on tissue microarray. International Journal of Clinical & Experimental Pathology. 8 (10):12802-12810.
Miao, H., D. Li, A. Mukherjee, H. Guo, A. Petty, J. Cutter, J.P. Basilion, J. Sedor, J. Wu, D. Danielpour, A.E. Sloan, M.L. Cohen, and B. Wang. 2009. EphA2 mediates ligand-dependent inhibition and ligand-
independent promotion of cell migration and invasion via a reciprocal regulatory loop with Akt. Can- cer Cell. 16(1):9-20. doi: 10.1016/j.ccr.2009.04.009.
Paduch, R. 2016. The role of lymphangiogenesis and angiogenesis in tumor metastasis. Cell Oncol.
39:397-410. doi: 10.1007/s13402-016-0281-9.
Pekkonen P., S. Alve, G. Balistreri, S. Gramolelli, O. Tatti-Bugaeva, O. Niiranen, K. Ojala, N. Perälä, A.
Taiwo, N. Zinovkina, P. Repo, K. Icay, J. Ivaska, P. Saharinen, S. Hautaniemi, K. Lehti, and P.M. Ojala.
2018. Crosstalk with lymphatic endothelial cells enhances distant metastasis and MMP14-dependent Notch3 and b1-integrin activation in melanoma cells. eLIFE. May 1:7. pii: e32490. doi:
10.7554/eLife.32490.
Poorolajal, J., N. Nafissi, M.E. Akbari, H. Mahjub, N. Esmailnasab, and E. Rabaee. 2016. Breast cancer survival analysis based on immunohistochemistry subtypes (ER/PR/HER2): a retrospective cohort study. Archives of Iranian Medicine. 19(10):680-686. doi: 0161910/AIM.003.
Redig, A.J. and S.S. McAllister. 2013. Breast cancer as a systemic disease: a view of metastasis. Journal of Internal Medicine. 274(2):113-126. doi: 10.1111/joim.12084.
Scully, O.J., B. Bay, G. Yip, and Y. Yu. 2012. Breast cancer metastasis. Cancer Genomics & Proteomics.
9(5):311-320.
Stacker, S.A., S.P. Williams, T. Karnezis, R. Shayan, S.B. Fox, and M.G. Achen. 2014. Lymphangio- genesis and lymphatic vessel remodelling in cancer. Nature Reviews Cancer. 14:159-172. doi:
10.1038/nrc3677.
Taherian-Fard, A., S. Srihari, and M.A. Ragan. 2015. Breast cancer classification: linking molecular mechanisms to disease prognosis. Briefings in Bioinformatics. 16(3):461-474. doi:
10.1093/bib/bbu020.
Tsouko, E., J. Wang, D.E. Frigo, E. E. Aydoğdu, and C. Williams. 2015. MiR-200a inhibits migration of triple-negative breast cancer cells through direct repression of the EphA2 oncogene. Carcinogenesis.
36(9):1051-1060. doi: 10.1093/carcin/bgv087.
Vuong, D., P.T. Simpson, B. Green, M.C. Cummings, and S.R. Lakhani. 2014. Molecular classification of breast cancer. Virchows Archiv. 465(1):1-14. doi: 10.1007/s00428-014-1593-7.
Xie, H., Z. Shao, and D. Li. 2017. Tumor microenvironment: driving forces and potential therapeutic targets for breast cancer metastasis. Chinese Journal of Cancer. 36(1):1. doi: 10.1186/s40880-017- 0202-y.
Xu, S., L. Cui, D. Ma, W. Sun, and B. Wu. 2015. Effect of ITGA5 down-regulation on the migration capacity of human dental pulp stem cells. Int J Clin Exp Pathology. 8(11):14425-14432.
